ZESZYTY PROBLEMOWE

POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH

Zeszyt 18

EWA LIPIŃSKA

ANTYBIOTYKI W MLECZARSTWIE

Referat niniejszy obejmuje zagadnienia z zakresu mleczarstwa, które

powstały w ciągu ostatnich kilkunastu lat w związku z rozwojem nauki
o antybiotykach.
Omawiane są kolejno: 1) antybiotyki rodzime mleka, 2) właściwości
antybiotyczne bakterii kwasu mlekowego, próby wykorzystania tych
właściwości w celach praktycznych, 3) skutki przechodzenia do mleka
antybiotyków stosowanych w celach terapeutycznych, sposoby przeciw-
działania ich ujemnym skutkom, 4) metody oznaczania antybiotyków
w mleku i jego przetworach.

Antybiotyki własne mleka

Działanie bakteriobójcze mleka świeżo udojonego zaobserwował już

w 1890 r. Fokker (72). Mleko surowe działa bakteriobójczo na szereg
drobnoustrojów, między innymi na wibrio cholery, pałeczki tyfusowe,
pałeczki dyfterytu (83), pałeczki sienne, pałeczki okrężnicy (97) oraz na
bakterie fermentacji mlekowej (66). Działanie to jest zależne od okresu
laktacji i pór roku. Na początku i przy końcu laktacji jest ono silniejsze.
Mleko ogrzane traci właściwości hamowania rozwoju drobnoustrojów.
W roku 1930 (47) Jones i Simms badając wpływ mleka surowego na
Str. pyogenes przypisali hamujące działanie mleka surowego zawartej
w nim substancji, którą wydzielili z serwatki trawionej trypsyną. Pre-
parat ten nazwali lakteniną. Auclair (3) stosując technikę, która umożli-
wiała wyeliminowanie z doświadczeń wpływu zawartych w mleku sub-
stancji pobudzających rozwój bakterii stwierdził, że laktenina składa się
z 2 substancji o odmiennych właściwościach. Substancje te występują
w niejednakowych ilościach w mleku z różnych okresów laktacji. Od-
dzielnie każda z nich wywiera słabe działanie hamujące, obie działają
wielokrotnie silniej. ,
Auclair nazwał te antybiotyki lakteniną 1 (Ly) i lakteniną 2 (Ly).
Laktenina 1 występuje głównie w siarze; jest unieczynniana przez ogrze-
70 E, Lipińska [2]

wanie w 700C przez 20 minut. Laktenina 2 znajduje się w większych

ilościach w mleku i jest odporna na ogrzewanie w wyżej podanych
warunkach.
Auclair i Berridge (4) oddzielili lakteninę 1 od lakteniny 2 przez
wytrącanie acetonem w niskich temperaturach. Dodając do serwatki
wzrastające ilości acetonu przy równoczesnym obniżaniu temperatury
2 0°С do —10”C wytrącili frakcje o różnej aktywności antybiotycznej.
Frakcje uzyskane z roztworem acetonu o stężeniu mniejszym niż 25%
zawierały w przeważającej ilości lakteninę 2. Frakcje uzyskane przez
wytrącanie 30 do 50-procentowym roztworem acetonu zawierały w więk-
szości lakteninę 1.
Spośród innych substancji czynnych w stosunku do drobnoustrojów
występujących w wydzielinach gruczołów ssaków — stwierdzono w mleku
obecność lizozymu (98). Badania Lato i Colucci (53) wykazały, że z mle-
kiem krowim związana też jest właściwość podnoszenia poziomu lizozymu
we krwi; oseski karmione tym mlekiem miały we krwi poziom lizozymu
wyższy niż oseski karmione naturalnie.

Uwagi ogólne o antybiotykach

wytwarzanych przez bakterie kwasu mlekowego
Od dawna już zostało zaobserwowane antagonistyczne działanie bakterii
fermentacji mlekowej na inne drobnoustroje. Do tych zjawisk można
zaliczyć zauważony przez Miecznikowa w 1903 r. hamujący wpływ
Lbc. bulgaricus na-mikroflorę gnilną jelit. W 1928 r. Rogers (81) donosi
o hamującym działaniu Str. lactis na Lbc. bulgaricus. W 1933 r. White-
head (91) zaobserwował, że zakwasy nie rozwijają się w niektórych
próbkach mleka, pozostawionych przez noc. Autor wyizolował z takiego
mleka szczepy paciorkowców mlecznych, które powodowały zahamowanie
rozwoju zakwasów. Whitehead i iego współpracownicy prowadzili dalsze
badania nad tymi szczepami i wykazali, że substancja hamująca była
polipeptydem. Badania te nie zwróciły jednak w swoim czasie większej
uwagi. Dopiero w 1944 r., już w okresie ogromnego zainteresowania
antybiotykami, ukazują się równocześnie publikacje Oxforda (71) i Mat-
ticka (58) o antybiotykach izolowanych z paciorkowców mlecznych.
Oxford nazywa substancję otrzymaną w postaci pikrynianu z hodowli
Str. cremoris — diplokokcyną. Mattick nazywa substancję otrzymaną
z Str. lactis — nizyną. Antybiotyki te różniły się między sobą. Diplo-
kokcyna okazała się ciepłochwiejna, nizyna ciepłoodporna przy niskich
pH. Diplokokcynę unieczynniał 80-procentowy alkohol etylowy, nizyna
zachowywała w tych warunkach aktywność. Diplokokcyna nie znalazła
dalszego zastosowania. Inaczej się stało z nizyną. Jest ona obecnie pro-
[3] Antybiotyki w mleczarstwie 71

dukowana na skalę przemysłową i znalazła już zastosowanie w przemyśle

mleczarskim. Prowadzone obecnie badania wskazują na możliwość zasto-
sowania nizyny także w innych przemysłach spożywczych.
Inne drobnoustroje bytujące w produktach mleczarskich także wytwa-
rzaą substancje antybiotyczne, które mogą działać antagonistycznie w sto-
sunku do drobnoustrojów pożytecznych z punktu widzenia dalszego
przerobu mleka, bądź w stosunku do drobnoustrojów chorobotwórczych
lub saprofitów szkodliwych w mleczarstwie. Binder (12) stwierdził
aktywność antybiotyczną w niektórych niebieskich odmianach Penicillium
cammemberti w stosunku do paciorkowców mlecznych i B. linens. Inne
pleśnie pożyteczne w serówarstwie wykazywały bardzo nieznaczne dzia-
łanie antagonistyczne. W podobnych badaniach Wilkowske (94) w ogóle
nie zaobserwował występowania antybiotyków w pleśniach stosowanych
w serowarstwie. Lbe. lactis, Lbc. helveticus i Lbc acidophilus wytwarzają
substancje hamujące rozwój bakterii fermentacji propionowej (96). Stwier-
dzono także aktywność antybiotyczną joghurtu (27, 87).
Emanuliof (26) stwierdził w kilku gatunkach serów bułgarskich, wy-
produkowanych na zakwasie z Lbc. bulgaricus, aktywność antybiotyczną
w stosunku do B. mesentericus i B. coli. Zahamowanie rozwoju B. coli,
P. fluorescens, Shigelli i Salmonelli przez przesacze z Lbc. acidophilus
uzyskała Polonskaja (77). Wg ostatnich badań Rittera (80) niektóre
szczepy Lbc. lactis i Lbc. helveticus wytwarzają antybiotyki hamujące
rozwój B. coli i A. aerogenes.
Z drożdży fermentujących laktozę Skorodumowa (88) uzyskała prze-
sącze działające bakteriobójczo w rozcieńczeniu 1:400, a bakteriosta-
tycznie w rozcieńczeniu 1:300 w stosunku do B. tuberculosis, B. coli,
pałeczek tyfusu a także i pleśni. Sartory (86) donosi o działaniu anta-
gonistycznym grzybków kefirowych w stosunku do Staph. aureus, ente-
rokoków i niektórych chorobotwórczych szczepów pałeczki okrężnicy
o typie antygenowym 055 i Bu.
Niektóre prace donoszą o zahamowaniu rozwoju drobnoustrojów po-
żytecznych w mleczarstwie przez bakterie chorobotwórcze. I tak Ritter
(79) stwierdził, że Staph. aureus hamuje rozwój Lbc. helveticus, Lbc.
lactis i Str. thermophilus. Winkler (95), ze B. subtilis, B. mesentericus,
B. mycoides, P. aeruginosa hamują rozwój bakterii fermentacji propio-
nowej.

Antybiotyki wytwarzane przez paciorkowce

mleczne
Hirsch i Wheater (43) w poszukiwaniu paciorkowców © większej wy-
dajności lub produkujących inne antybiotyki niż nizyny przebadali 10 000
szczepów paciorkowców należących do różnych grup serologicznych.
79 E. Lipińska [4]

Stwierdzili oni, że wytwarzanie antybiotyków w stosunkowo dużych

ilościach jest właściwością paciorkowców z grupy serologicznej N. Nie-
które enterokoki mogą wytwarzać antybiotyki podobne do nizyny, ale
w ilosciach znacznie mniejszych.
Nizyna została oczyszczona i scharakteryzowana przez Berridge’a (6, 7).
Nizyna krystaliczna zawiera 40000000 jednostek antybiotyku w 1 g.
Jako szczepu wzorcowego do pomiarów aktywności preparatów nizyno-
wych używa się Str. cremoris IP3.
W czasie prac związanych z oczyszczaniem nizyny, przy oznaczaniu
stałej rozpuszczalności, uzyskana krzywa wskazywała na niejednorodność
preparatu. Również Hirsch (40) zaobserwował, że zmiana temperatury
w czasie fermentacji prowadzi do uzyskania antybiotyku o nieco odmien-
nych właściwościach antybakteryjnych. W celu wyjaśnienia natury ni-
zyny poddano czyste preparaty antybiotyku rozdziałowi przeciwprądo-
wemu w aparacie Craiga złożonym z 102 elementów (8). W wyniku
uzyskano 4 frakcje polipeptydowe, które nazwano nizynami A,B,C i D.
Frakcje te zbadane przez Govansa (34) okazały się niejednolite pod
względem aktywności antybiotycznej; frakcje A i B posiadały podobną,
dosyć wysoką aktywność, frakcje C i D tyłko 1/3 aktywności frakcji Ai B.
W rzeczywistości więc, gdy mówimy o nizynie mamy do czynienia
z kilkoma antybiotykami.
Próby podwyższenia wydajności szczepów nizynotwórczych przepro-
wadzone przez Hirscha (41) wykazały, że większa zawartość peptonu
w podłożu nie wpływa na wydajność antybiotyku. Dodatek 2,5% glikozy
1 0,6 wg/ml pantotenianu wapnia znacznie zwiększa wydajność pod wa-
runkiem, że usuwa się kwas mlekowy wytworzony w czasie fermentacji.
Autor określił też optymalną temperaturę fermentacji (29,5°C) i mie-
szanki soli najbardziej sprzyjające wytwarzaniu nizyny. Ciszar (22)
10—15-krotnie powiększył wydajność nizyny przez naświetlanie promie-
niami ultrafioletowymi szczepu nizynotwórczego o normalne j wydajności.
Berridge (8) oznaczył skład aminokwasów nizyny. Nizyny A,BiC
zawierają leucynę, izoleucynę, walinę, alaninę, glicynę, prolinę, kwas aspa-
raginowy, histydynę, lizynę, metioninę, lactioninę, wreszcie cystatio-
ninę — tę ostatnią w stosunkowo dużej ilości. Nizyna D zawiera kwas
glutaminowy, nie zawiera natomiast Wwaliny i metioniny.
Nizyna hamuje rozwój drobnoustrojów gramododatnich paciorkow-
ców, gronkowców, neisserii, pałeczek, clostridii, corynebakterii, myko-
bakterii, aktynomyces i innych. Początkowe nadzieje oparte na doświad-
czeniach laboratoryjnych, że antybiotyk ten może okazać się skuteczny
przy zwalczaniu gruźlicy, nie ziściły się. Nizyna nie znalazła zastosowania
w lecznictwie, |
[5] Antybiotyki w mleczarstwie 73

Nizyna jest słabo rozpuszczalna w roztworach neutralnych, co także

utrudnia jej zastosowanie w celach leczniczych (34). Jest natomiast roz-
puszczalna w roztworach kwaśnych i w tych warunkach jest ciepłostała.
Przez ogrzewanie w roztworach neutralnych nizyna traci część aktywności,
a ogrzewanie w roztworach zasadowych całkowicie ją unieczynnia (58,
40). Nizyna nie hemolizuje czerwonych ciałek krwi, nie działa na leuko-
cyty, nie jest toksyczna. Penicylinaza nie działa na nizynę (20). Niektóre
drobnoustroje niszczą ją, wytwarzają one zapewne nizynazę (31).

Zastosowanie nizyny przy wyrobie serów twardych

dojrzewających

Jak już zaznaczono, nizyna w zależności od stężenia działa bakterio-

bójczo ewentualnie bakteriostatycznie m. in. na bakterie fermentacji
masłowej, które są groźnymi szkodnikami w przemyśle serowarskim.
Właściwość ta stała się podstawą zastosowania nizyny do przeciwdzia-
łania fermentacji masłowej w serach dojrzewających twardych i topio-
nych. Wykorzystanie nizyny do tego celu znajduje uzasadnienie w nie-
szkodliwości tego antybiotyku dla organizmów wyższych oraz w tym,
że nie jest stosowany w celach terapeutycznych. Pierwsze próby wyrobu
sera ementalskiego z mleka pasteryzowanego zakażonego bakteriami
kwasu masłowego przy użyciu jako zakwasu hodowli paciorkowca nizy-
notwórczego, przeprowadzone przez Hirscha i ianych (42) w 1951 r., dały
pozytywne wyniki. Sery doświadczalne nie wykazywały objawów fer-
mentacji masłowej, sery kontrolne były wzdęte. Zaznaczyć należy, że
wyrób sera nie był prowadzony w sposób normalny. Ażeby uniknąć
wysokiego dogrzewania, które mogło być zabójcze dla paciorkowców wy-
twarzających nizynę, autorzy powstrzymywali przyrost kwasowości
w ziarnie sera przez mycie ziarna wodą ogrzaną do 42 *C. W tym samym
roku Pette i Koody (75) opublikowali wyniki doświadczeń wyrobu
sera edamskiego z mleka pasteryzowanego i surowego, zawierającego
bakterie fermentacji masłowej, stosując jako zakwas wyłącznie nizymo-
twórcze szczepy paciorkowców mlecznych. Wyniki były pozytywne wów-
czas, gdy w w mleku nie było szczepów Lbc. plantarum, który niszczy
nizynę. Autorzy zdołali uzyskać zahamowanie rozwoju bakterii fermen-
tacji masłowej w serach doświadczalnych nawet w obecności Lbc. plan-
tarum, jeżeli mleko użyte do wyrobu sera zaszczepili równocześnie
Lbc. casei, który działa antagonistycznie w stosunku do Lbc. plantarum,
a tym samym wywiera ochronne działanie w stosunku do nizyny.
Próby zastosowania zakwasów nizynotwórczych przy wyrobie sera
Herrgard, przeprowadzone w Szwecji przez Bylunda (16), wykazały ich
skuteczność w przeciwdziałaniu fermentacji masłowej, jednak sery do-
74 E. Lipińska [6]:

świadczalne rzadko kiedy miały ładną normalną oczkowatość. Autorzy

określili kwasy tłuszczowe w serach doświadczalnych i kontrolnych.
We wszystkich serach nastąpiła hydroliza tłuszczu. Kwas masłowy, jak
również kwas walerianowy i izowalerianowy, występowały tylko w se-
rach kontrolnych.
Dalsze prace w tej dziedzinie — to wykonane w Instytucie Przemysłu
Mleczarskiego (55) próby wyrobu sera edamskiego z mleka pasteryzowa-
nego, zakażonego bakteriami kwasu masłowego, przy zastosowaniu
zakwasu złożonego w ?/3 z normalnego zakwasu maślarskiego, w 1/3 z ho-
dowli nizynotwórczego szczepu Str. lactis, izolowanego w kraju. Pierwsza
produkcja doświadczalna z powyższą kombinacją zakwasów dała pozy-
tywne wyniki, tzn. że sery doświadczalne nie okazywały objawów wzdę-
cia, zaś sery kontrolne były wzdęte.
Opublikowane w sprawozdaniach z XIV Międzynarodowego Kongresu
Mleczarskiego dwie prace dotyczące omawianego zagadnienia dochodzą
do częściowo sprzecznych wniosków. Rosell i Matallana (84) opisali do-
świadczenia przeprowadzone w Hiszpanii, obejmujące 390 wyrobów sera
edamskiego z mleka pasteryzowanego, silnie zakażonego bakteriami kwasu
masłowego. Doświadczenia przeprowadzono w mleczarni przerabiającej
mleko od krów, które wypasły podmokłe bagniste łąki. Normalnie wzdęcia
serów spowodowane przez bakterie fermentacji masłowej występowały
po 15 dniach. Warto podkreślić ciekawe obserwacje autorów dotyczące
fermentacji masłowej, mianowicie że w czasie masowego zakażenia, szcze-
gólnie latem, bakterie fermentacji masłowej mogą w ogóle nie prze-
trwalnikować i pozostając stale w formie wegetatywnej zdolne są wy-
wołać wzdęcia sera nawet pod prasą. Autorzy stwierdzili, że przez zasto-
sowanie zakwasu złożonego w */3 z normalnych szczepów Str. lactis i Str.
cremoris i w */3 z nizynotwórczych szczepów Str. lactis uzyskali sery
pierwszego gatunku. Przerwa 15- dniowa w stosowaniu zakwasu nizyno-
twórczego spowodowała nawrót fermentacji masłowej w serach.
Doświadczenia przeprowadzone przez Pulaya (73) na Węgrzech na
4 rodzajach sera (ovarer — rodzaj sera tylżyckiego, trapistów, pannonia,
ementalski) doprowadziły autora do odmiennych wniosków. Dobre wy-
niki doświadczeń uzyskał on w serach ovarer i trapistów, tzn. w serach
o stosunkowo krótkim czasie dojrzewania, w których oczkowatość jest
międzyziarnista. Natomiast w serach pannomia i ementalskich zakwasy
nizynotwórcze nie zawsze przeciwdziałały fermentacji masłowej, a nawet
gdy udało się jej uniknąć — oczkowatość serów była nieprawidłowa.
Wg Pulaya antybiotyk w pierwszym okresie dojrzewania hamuje rozwój
fermentacji masłowej, a w okresie późniejszym, ponieważ opóźnia prze-
miany cukrów, działa nawet pobudzająco na rozwój bakterii fermentacji
masłowej; w serach doświadczalnych obok odmian bakterii kwasu ma-
[7] Antybiotyki w mleczarstwie 75

słowego fermentujących mleczany, mogą się rozwijać clostridia fermen-

tujące cukry.
Przyczyn tak rozbieżnych wyników można się doszukiwać m. in. w róż:
nych układach mikroflory nie tylko dla różnych typów sera, produko-
wanych w omawianych doświadczeniach, ale także dla sera jednego
typu, produkowanego w różnych krajach. Niezależnie od faktu, że różne
nizyny mogą mieć odmienne właściwości antybakteryjne, ich działanie
na różne szczepy tej samej odmiany, a nawet na szczep w różnych
stadiach rozwoju jest niejednolite; wyniki badań Hirscha (44) nad dzia-
ianiem nizyny na formy przetrwalnikujące różnych szczepów bakterii
kwasu masłowego wskazują na większą wrażliwość przetrwalników niż
form wegetatywnych na działanie tego antybiotyku. W cytowanych na-
szych już doświadczeniach formy przetrwalnikujące badanych bakterii
fermentacji masłowej były bardziej oporne na działanie antybiotyku
wytwarzanego przez Str. lactis 91, niż formy wegetatywne tych drobno-
ustrojów.
Galesloot opublikował ostatnio dwie prace poświęcone temu zagad-
nieniu. W pierwszej z nich (31) podaje, że nizynę mogą unieczynniać
także paciorkowce, między innymi niektóre szczepy Str. lactis, Str. cre-
moris, Str. diacetilactis. W crugiej pracy (33) dokonuje przeglądu opor-
ności na działanie nizyny kilku grup drobnoustrojów ważnych dla sero-
warstwa. Z wyników tych badań można wysnuć wniosek, że istnieje
pewien zakres oporności na działanie nizyny, typowy dla danej grupy
drobnoustrojów, ale że w jej obrębie mogą występować duże wahania.
Dotychczasowe wyniki badań nad zastosowaniem nizynotwórczych
szczepów przy wyrobie serów dejrzewających, w celu przeciwdziałania
fermentacji masłowej, zdają się wskazywać dalsze drogi rozwiązania
zagadnienia. Jedna z nich — to wprowadzenie do zakwasów, które
mają być użyte wespół z paciorkowcami nizynotwórczymi, tylko szczepów
nie niszczących nizyny (nie zawierających nizynazy). Drugą drogą są
próby przyzwyczajenia zakwasów do takich stężeń antybiotyku, jakie
mogą wystąpić w serze. Powinno to zapewnić normalny przebieg dojrze-
wania sera wyprodukowanego z dodatkiem paciorkowców nizynotwór-
czych. W tych kierunkach prowadzone są obecnie badania w Instytucie
Przemysłu Mleczarskiego.

Zastosowanie nizyny przy wyrobie

serów topionych

Pierwsza publikacja dotycząca tego zagadnienia — to opis wyników

doświadczeń przeprowadzonych przez Mc Clintock (60) w 1952 r. Do
masy serowej zakażonej bakteriami kwasu masłowego dodawano prepa-
76 E. Lipińska = [8].
rat nizyny tuż przed zakończeniem topienia. Z tej samej partii surowca
przygotowano równolegie próbki kontrolne, bez dodatku nizyny. Obser-
wacje przeprowadzone po kilkunastu dniach przechowywania serów topio-
nych w temp. 37°C wykazały, że nizyna znacznie zmniejsza często-
tliwość występowania fermentacji masłowej — nie eliminując jej jednak
całkowicie. Od tego czasu dodawanie preparatów zawierających nizynę
do masy serowej, przeznaczonej do wyrobu serów topionych, szeroko
rozpowszechniło się w niektórych krajach, np. w Anglii, Francji, Holandi
i,
Danii i innych. Z czasem coraz bardziej ulepszano preparaty nizyny.
Najpierw dodawano do mieszanki sera kwaśne mleko, uzyskane
przez
fermentowanie mleka odtłuszczonego nizynotwórczym szczepem Str. lactis.
Ten sposób dodawania antybiotyku nie był wygodny. Podjęte w
Anglii
próby produkcji na skalę przemysłową doskonalszych preparatów nizy-
nowych uwieńczone zostały pozytywnym wynikiem. Jednym z pierws
zych
preparatów było mleko w proszku zawierające 10 000 j/g nizyny. Dalszy
preparat — to ser zawierający taką samą ilość nizyny w 1 g. Prepar
aty
te dodawane do masy przeznaczonej do topienia w ilości 1,5—2% dawały
dobre wyniki, nie zawsze jednak wstrzymywały fermentację masłow
ą.
Wg Hawley'a (39) wyprodukowano w Anglii do 1955 r. 100 000 funtów
sera topionego z dodatkiem tych preparatów. Ocena równoległych próbek
kontrolnych wykazała, że dodatek nizyny uchronił od wtórnego wzdęci
a
10% masy towarowej.
Od niedawna dla celów serowarskich produkuje się nizynę pod postacią
proszku zawierającego 1 000 000 j/g.
W Instytucie Przemysłu Mleczarskiego (56) przeprowadzone zostały
w ub. r. próby zastosowania proszku mlecznego zawierającego antybiotyk
wytwarzany przez Str. lactis 91 oraz proszku mlecznego zawierającego
nizynę, w celu przeciwdziałania fermentacji masłowej w serach topio-
nych. Z surowca silnie zakażonego bakteriami kwasu masłowego topiono
serki, dodając do partii serków doświadczalnych po 1,5% i 2% preparatów
antybiotycznych. Po 3 miesiącach przechowywania w pokojowej tempe-
raturze 100% serków kontrolnych uległo wzdęciu. Sery z dodatkiem 1,5%
preparatu angielskiego uległy wzdęciu w 67%, z dodatkiem 1,5% prepa-
ratu polskiego — w 50%. Sery z dodatkiem 2% wyżej wymienionych pre-
paratów uległy wzdęciu odpowiednio w 40% i 20%.

Antybiotyki stosowane w celach terapeutycznych,

przechodzące do mleka i dodawane w celu jego
konserwowania
W krajach, które produkują duże ilości antybiotyków, znalazły one
szerokie zastosowanie przy leczeniu zapalenia wymion. N ajczęściej sto-
n 5

[9] Antybiotyki w mleczarstwie 77

suje się do tego celu penicylinę, ponieważ większość zapaleń wywołana

jest przez drobnoustroje (paciorkowce i gronkowce) wrażliwe na dzia-
łanie tego antybiotyku. W przypadkach zapalenia wymion, spowodowa-
nego przez pałeczki okrężnicy, stosuje się inne antybiotyki, z których
hajskuteczniejszą okazała się aureomycyna, mniej skutecznymi — chloro-
mycetyna i terramycyna.
Tam, gdzie od wielu lat stosuje się penicylinę do leczęnia zapaleń
wymion, daje się zauważyć zmniejszenie ilości zachorowań spowodowa-
nych przez drobnoustroje wrażliwe na działanie penicyliny, kosztem
wzrostu ilości zachorowań wywoływanych przez drobnoustroje oporne na
działanie tego antybiotyku. Pozostawiając na uboczu weterynaryjną stronę
zagednienia zajmiemy się wpływem antybiotyków, stosowanych przy le--
czeniu krów, na mleko, jego mikroflorę i dalszy przerób.
Część antybiotyków wprowadzonych do chorego wymienia przechodzi
do mleka, w którym można je wykryć jeszcze przez pewien okres po
zakończeniu leczenia. W zależności od rodzaju i sposobu podawania
penicyliny, jej zawartość w mleku może się wahać od dziesiętnych
części jednostki do kilkudziesięciu jednostek w 1 ml, przy czym większy
wpływ na jego zawartość w mleku ma ilość wprowadzonego każdora-
zowo antybiotyku, niż częstotliwość dawkowania. Na okres występowania
antybiotyku w mleku po zakończeniu leczenia ma także wpływ rodzaj
preparatu. Penicylina prokainowa w 2-procentowym stearynianie glinu
występuje w mleku po 5—6 udojach (18), ten sam zaś preparat w oleju
występuje w mleku ieszcze po 9 dniach (14).
Inne antybiotyki, np. streptomycyna, występują w mleku od krów
leczonych w ilościach wahających się od dziesiętnych części jednostki
do kilku jednostek w 1 ml. Streptomycynę można wykryć w mleku
jeszcze po 72 godzinach (61) po zakończeniu leczenia. Aureomycynę (51)
można wykryć jeszcze po 12 udojach. Overby (67) zbadał mleko od krów
leczonych 5 różnymi antybiotykami i stwierdził, że dodatek do mleka
normalnego 2% mleka pochodzącego z pierwszego udoju po zadaniu
аигеотусупу całkowicie hamuje przyrost kwasowości. Taki stan został
osiągnięty przez dodanie do mleka normalnego 5% mleka ze streptemy-
cyną, 10% mleka z penicyliną i terramycyną oraz 40% mleka z chloro-
mycetyną, uzyskanych w opisanych wyżej warunkach.
Borenstein już w 1940 r. (13) zwrócił uwagę na hamujące działanie peni-
cyliny w stosunku do Str. lactis. Od tego czasu wiele prac naukowych
pozwoliło określić w podanych poniżej granicach działanie penicyliny
i innych antybiotyków na zakwasy i na drobnoustroje ważne w przemyśle
mleczarskim. Antybiotyki nie działają w jednakowym stopniu na różne
drobnoustroje, przy czym różni autorzy podają dla tych samych odmian
78 Е. Lipińsica | [10]

Zahamowanie rozwoju niektórych drobnoustrojów i zakwasów przez penicylinę

Drobnoustroje ind aan | Drobnoustroje sen ee

Str. lactis 0,1 —1,0 i Propionobact. shermani 0,1

Str. cremoris 0,01—0,25 Zakwasy maślarskie
Str. diacetżlactis 0,01—0,25 lekkie zahamowanie
Str. thermophilus 0,01—0,1 | rozwoju 0,01—0,5
Lbc. helveticus 0,1 —1,0 całkowite zahamowanie
Lbc. lactis 0,1 —1,0 | rozwoju 10—50
Lbc. bulgaricus 0,3

różne wartości. Dla przykładu podaję niektóre wartości dla penicy

liny,
zestąwione na podstawie danych zawartych w artykule A. J. Overb
y (70).
Ien sam autor (69, 67) uzyskał lekkie zahamowanie przyrostu kwaso-
wości, gdy mleko zaszczepione 1% zakwasu mieszanego zawierało: 0,02
ug
aureomycyny, 0,20 “g chloromycetyny, 0,04 ug streptomycyny
i 0,01 ug
terramycyny w 1 ml mleka.
O wynikach badań nad zastosowaniem różnych antybiotyków do
kon-
serwowania mleka donoszą liczne publikacje.
Curran i Evans (23, 24, 25) badali oporność na działanie penic
yliny
różnych niepożądanych drobnoustrojów, występujących w mleku.
Stwier-
dzili oni, że B. cereus, B. mycoides, B. metiens i niektóre
przetrwalni-
kujące beztlenowce są bardzo oporne na działanie tego antybi
otyku.
Nawet 1000 j/ml mleka nie powstrzymywało ich rozwoju. Podobne rezul-
taty uzyskali z wysokimi stężeniami streptomycyny. Autorzy uznali,
że
penicylina i streptomycyna nie nadają się do konserwowania mleka.
Linneweh (54) przez dodatek 2 mg streptomycyny do 100 ml mleka
całkowicie zahamował rozwój pałeczki okrężnicy i przyrost kwasowości
w mleku przechowywanym w temperaturze pokojowej.
Lizgunowa (57) opóźniała o 4 dni psucie się mleka surowego, przecho-
wywanego w temp. 25—28 °C, przez dodatek 400 milionowych części gra-
mycydyny S.
Angelotti (1) zbadał wpływ różnych antybiotyków na 20 szcze
pów
typowych przedstawicieli drobnoustrojów szkodliwych i pożyt
ecznych
w maleczarstwie. Stwierdził on, ze chloromycetyna, terramycyna i aureo-
mycyna mają szersze działanie niż penicylina i batracyna. Szereg prac
badaczy japońskich (37, 38, 45) donosi o działaniu chloromycetyny, aureo-
mycyny, terramycyny na 17 szczepów gnilnych wyizolowanych z mleka.
Dodatek do mleka przechowywanego w 30°C 0,01—0,02% różnych
antybiotyków chroni je od zepsucia przez okres 15 dni. Szczeg
ólnie dobre
wyniki uzyskano z mieszanką aureomycyny i patuliny. Carena (17)
określił przyrost kwasowości w mleku zawierającym
5 j/ml penicyliny
[11] 1... /. Antybiotyki w mleczarstwie 79

i 2,5 mg/ml streptomycyny lub chloromycetyny. Stwierdził on, że naj-

silniej hamuje przyrost kwasowości penicylina, słabiej chloromycetyna,
najsłabiej z badanych antybiotyków działa aureomycyna. Evans (28)
zastosował subtylinę i uprzednie łagodne podgrzanie do konserwowania
mleka zagęszczonego, zakażonego przetrwalnikami CI. botulinum. W tych
warunkach subtylina nie przeciwdziała rozwojowi CI. botulinum w mleku
zagęszczonym.
Działanie temperatury częściowo unieczynnia antybiotyki zawarte
w mleku. Spadek aktywności jest zależny od temperatury, do której pod-
grzano mleko.
Penicylina ogrzana do 65°C przez 20 minut traci 5—30% aktywności (29).
Ogrzewanie do 100”C niszczy ten antybiotyk w 50%. Stassanizacja mleka
nie niszczy penicyliny (16). Pasteryzacja momentalna w 80°C nie ma
wpływu na aktywność penicyliny, aureomycyny, chloromycetyny, strep-
tomycyny i terramycyny (69). Kondensacja mleka i suszenie metodą
rozpyłową także nie niszczą penicyliny (35). Ogrzewanie pod ciśnieniem
unieczynnia penicylinę w 73%, całkowicie zaś unieczynnia streptomycynę
i aureomycynę.
Masowe leczenie krów antybiotykami wywołało perturbacje podczas
przerobu mleka — szczególnie w serowarstwie. W mleku zawierającym
antybiotyki ukwaszanie przebiega nienormalnie.
Kastli już w 1948 r. (49) sygnalizował występowanie wczesnych wzdęć
spowodowanych przez rozwój pałeczki okrężnicy w serach z mleka zawie-
rającego 0,4 j/ml penicyliny. W serach cammembert, wyprodukowanych
z mleka zawierającego 0,05—0,15 j/ml penicyliny, Kundrat i Folta (52)
stwierdzili następujące wady: nadmierny rozwój drożdży, słaby wzrost
pleśni, smak gorzkawo-gnilny. Jacquet (46) stwierdził zahamowanie roz-
woju kwasowości, złe ociekanie, gąbczastą strukturę i niepożądaną oczko-
watość w serach cammembert wyprodukowanych z mleka zawierającego
0,15 j/ml penicyliny. Wessner (90) stwierdził ujemne działanie penicyliny
w ilościach 0,02—0,2 j/ml mleka na jakość sera Herrgard.
Whitehead (92) produkował sery cheddar z mleka zawierającego różne
ilości penicyliny, przy czym wyrób prowadzony był tak, ażeby kwasowość
w czasie prasowania i solenia sera była jednakowa w serach kontrolnych
i doświadczalnych. Obecność w mleku 0,05 j/m! penicyliny przedłuża
wyrób o 25 minut, nie wywierając wpływu na jakość sera. Penicylina
w stężeniach 0,1 ifml mleka juz wptywala na jakość sera. Berridge (9,
10) w badaniach nad wpływem penicyliny na wyrób sera Cheshire,
poprzedzonych badaniami nad wpływem penicyliny na bakterie fermen-
tacji mlekowej stosowane w zakwasach przy wyrobie sera tego typu
stwierdził, że penicylina w stężeniach do 0,096 j/ml mleka nie hamuje
ich rozwoju, ani nie wpływa na jakość sera. W oparciu o te doświad-
80 E, Lipińska | [12]

czenia autor wysuwa wniosek, że w stężeniach, które nie działają na

wytwarzanie kwasu mlekowego przez zakwasy, penicylina nie wpływa
ujemnie na przebieg dojrzewania sera.
W niektórych krajach przeprowadzone zostały masowe badania mleka,
mające na celu określenie aktualnego stanu zanieczyszczenia mleka anty-
biotykami, wynikłe na skutek leczenia krów. W USA, gdzie na cele
weterynaryjne zużywa się 75 ton antybiotyków rocznie, obok niebezpie-
czeństwa szkód w produkcji występują zagadnienia wpływu tej masy
leków na zdrowie publiczne. Welch (89) opisuje wyniki badań 1706 próbek
mleka, pobranych w różnych stanach w USA. 5,9% próbek zawierało
penicylinę w ilości 0,003—0,55 j/ml mleka, i% próbek zawierało inne
antybiotyki. Sahani (85) w 151 próbkach pobranych w stanie Columbia
stwierdził obecność penicyliny w 7,3%. Podobne badania, przeprowadzone
w Anglii przez Berridge'a (12) na 5000 próbkach pobranych w różnych
okolicach tego kraju, wykazały w mleku zbiorowym ilości penicyliny
wahajace sie od 0,01—0,04 j/ml mleka.
Najprostszym i najczęściej stosowanym sposobem przeciwdziałania
ujemnym wpływom antybiotyków zawartych w mleku na dalszy jego
przerób, jest oparte na dyscyplinie dostawców zobowiązanie ich do
zawiadamiania zakładu mleczarskiego o leczeniu krów antybiotykami.
W czasie leczenia i przez pewien czas po jego zakończeniu (różny dla róż-
nych antybiotyków, wynoszący np. dla penicyliny, streptomycyny i terra-
mycyny 3 dni, dla chloromycetyny — 2 dni, dla aureomycyny —
4 dni (569) mleko nie jest używane do wyrobu serów. Wg Jacquet (46)
można je wykorzystać do wyrobu masła bez większej szkody dla jego
jakości.
Poszukiwania sposobów zużytkowania mleka zawierającego antybio-
tyki doprowadziły do ciekawych rozwiązań, które nie są jednak szeroko
wykorzystywane w przemyśle. Wg Pedersena (74) mleko od krów leczo-
nych penicyliną rozcieńczone 200-krotnie może być użyte do wyrobu sera.
Katznelson (48) zaleca zwiększenie ilości dodawanego zakwasu do 3%—5%.
Jednak badania Pedersena wykazały (72), że dodatek większej ilości
zakwasu nie przeciwdziała wadom sera, jeżeli mleko zawierało 0,2 j/ml
penicyliny. Próbowano także stosować zakwasy ze szczepów opornych
na działanie antybiotyków. Do tego celu użyto szczepy Str. faecalis (63).
Liczni badacze przyzwyczajali do określonych stężeń penicyliny Lbe. bul-
garicus, Str. thermophilus, Lbc. lactis, Lbc, heiveticus, jak też i całe
zakwasy uzyskując różne wyniki (69, 4, 36).
Do niszczenia penicyliny w mleku zastosowano też penicylinazę. Sto-
sując ten enzym udało się wyprodukować z mleka zawierającego penicy-
linę sery Herrgard, Cammembert i Cheshire (46, 90, 20) normalnej
 [131 Antybiotyki w mleczarstwie 81

jakości. Przeszkodą w zastosowaniu penicylinazy na szerszą skalę jest

brak szybkiej metody oznaczania antybiotyków w mleku, co uniemożliwia
określenie ilości penicylinazy, którą należy dodać do mleka.

Metody oznaczania antybiotyków w mleku

Dotychczas nie została jeszcze opracowana metoda oznaczania zawar-

tości antybiotyków w mleku, która byłaby dostatecznie szybka i dostoso-
wana do potrzeb ruchowych przerobu mleka. Wszystkie znane metody
są biologiczne, oparte bądź na bezpośrednim oznaczaniu rozwoju szczepu
wrażliwego, bądź też na określaniu spowodowanych przez rozwój drobno-
ustrojów zmian zabarwienia swoistych wskaźników. Metod takich opisano
bardzo dużo. W pracach naukowych z zakresu stosowania antybiotyków
w mleczanstwie oznacza się ich zawartość metodami już obecnie klasycz-
nymi, jak nefelometryczna, rozcieńczeniowa, naczynkowa, nasycania
krążków standardowych bibuły badanym materiałem. Są też metody spe-
cyficzne dla mleczarstwa, spośród których wymienię kilka.
Zmodyfikowana metoda Meews'a (62) polega na wypełnieniu otworu
wyciętego w warstwie agaru o standardowej grubości, zakażonego stan-
dardową ilością szczepu wrażliwego, określoną ilością badanego płynu
i odczytaniu po 20—24 godz. inkubacji Q strefy zahamowania rozwoju
szczepu wrażliwego. Na podobnych założeniach oparta jest metoda
Beach'a (5). Kossikowski (50) opisuje metodę, która polega na nałożeniu na
agar, zakażony szczepem wrażliwym, tabletek uzyskanych przez liofili-
zacje w standardowym naczynku 2 ml badanego mleka. Chevallier (21)
opisuje metodę, która powinna szczególnie nadawać się do wyszukiwania
szczepów wytwarzających antybiotyki: podłoże agarowe zakaża się jedno-
cześnie badanym materiałem i odpowiednio dobranym, nie rozwijającym
się w temperaturze poniżej 30”C szczepem Lbc. lactis. Płytkę z tym podło-
żem przechowuje się najpierw w temperaturze 22° przez 24 godziny,
a następnie w temperaturze 30”C przez 48 godzin. W temperaturze 22”C
rozwijają się szczepy produkujące antybiotyk; wokół ich kolonii tworzą
się strefy dyfuzji antybiotyku, na której później wyrastający Lbc. lactis
" już się nie rozwija. Whitehead (93) opisuje metodę oznaczania penicyliny,
polegającą na obserwacji zmian morfologicznych szczepu Str. cremoris po
5 godzinach inkubacji w temperaturze 30*C, w mleku z penicyliną.
Raibaud (78) opisuje szybką metodę oznaczania nizyny, opartą na
zastosowaniu Lbc. tarbellicus w logarytmicznej tazie rozwoju. Stężenie
nizyny oblicza się ze zmiany pH już po 30 minutach inkubacji w 68"C.
Do oznaczania antybiotyków w mleku szeroko są też wykorzystywane
próby reduktazowe z zastosowaniem błękitu metylenowego (82), reza-
zuryny (30), chlorku 2-, 3-, 5-trójfenylotetrazolu (65). Można też przepro-

6 — Zeszyty problemowe nr 18
89 | E. Lipińska | [14]

wadzać obserwację na zwykłym mleku z lakmusem. Ta ostatnia metoda

jest stosowana przez Pette i Galesloota w ich pracach nad zastosowaniem
antybiotyków w serowarstwie (32).
Ostatnio Mocquot (64) opublikował metodę oznaczania aktywności
antybiotycznej w serze, polegającą na wykrojeniu z sera słupka o określo-
nych rozmiarach, umieszczeniu tego słupka na płytce Petriego i zalaniu
słupka standardową ilością agaru zawierającego szczep wrażliwy. Wokół
słupka sera tworzy się strefa zahamowania wzrostu szczepu wrażliwego.
W podobny sposób oznacza się zawartość antybiotyku w serach w Insty-
tucie Przemysłu Mleczarskiego. Do oznaczania zawartości antybiotyku
w mleku można się wreszcie posiużyć określeniem zmian w przyroście
kwasowości próbki mleka badanego i równoległej próbki kontrolnej.

Zreferowane prace, wybrane spośród tysięcy poświęconych tym

zagadnieniom, obok zarysowujących się już obecnie perspektyw praktycz-
nego wykorzystania ich wyników posiadają też tę ogromną wartość, że
odkrywają mechanizm antagonizmów i symbiozy poszczególnych układów
bakteryjnych w mleku : jego przetworach. Dopiero poznanie tych mecha-
nizmów umożliwi oddziaływanie na produkty mieczarskie w pożądanym
kierunku.

LITERATURA

1. Angelotti R. i inni — Appl. Microbiol. 1955, nr 3, s. 243.

2. Auclair J. — Le lait, 1951, t. 31, s. 121.
3. Auclair J. — XIII Miedz. Kongr. Mlecz. 1953, t. 3, s, 1130.
4. Auclair J., Berridge N. J. — J. Dairy Res. 1953, t. 20, s. 370.
5. Beach A. S. — J. Gen. Microbiol. 1952, t, 6, s. 60.
6. Berridge N. J. — The Lancet 1949, t. 257, nr 6462, s. 7.
7. Berridge N. J. — Biochem. J. 1949, t. 45, s. 486.
8 Berridge N. J. i inni — Biochem, J. 1952, t. 52, nr 4, s. 529.
9. Berridge М. J. — J. Dairy Res. 1956, t. 23, nr 3, s. 336.
10. Berridge N. J. — J. Dairy Res. 1956, t. 23, nr 8, s. 342.
ll. Berridge N. J. — J. Dairy Res. 1956, t. 23, nr 3, s. 348.
12. Binder W. — Milchwiss. Ber. Wolfpassing 1954, t. 4, nr 2, s. 88.
1s. Borenstein S. — J. Bact, 1940, t. 39, s. 383.
14. Bryan C. S. — Quart. Bull. Mich. Agric. Exp, Sta. 1951, t. 33, s. 23.
15. Broggler H. i inni — Maanedesskr. Dyrlaeg. 1951, t. 62, s. 217,
16. Bylund G.i inni — Svenska Mejeriditn, 1954, t. 31, s. 438.
17, Carena A. — Ann. Sper Agr. 1956, t. 10, nr 3, s. 865.
18. Carmichael J. — Vet. Res. 1949, t. 61, s. 866.
19. Chapman H. — Dairy Ind. 1956, t. 21, nr 12, s. 970.
20. Cheeseman G.C., Berridge N, J. — Act. Chem. Scand. 1954, t. 8, nr 1,
s. 127.
 [51] Antybiotyki w mieczarstwie 83

21. Chevallier R. i inni — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 3, sekcja 3, cz. IV,
s. 44.
22. Ciszar H., Pulay G. — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 2, sekcja 2, s. 423.
23. Curran N.R, Evans F.R. — Proc. Soc. Exper, Biol. Med. 1945, t. 58, s. 262.
24. Curran N.R., Evans F. R. — Bact. J, 1946, t. 52, s. 89.
25. Curran N.R., Evans F. R. — Bact. J, 1946, t. 52, s. 142.
26. Emanuliof J.J. Nachef L. — Izw. Mikrob. Inst. Sofia 1953, nr 4, s. 53.
27. EmanuliofJ., Nachef L. — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 1, sekcja 1,
cz. II, s. 548.
25. Evans F, R., Curran N, R. — J. Dairy Sci. 1952, t. 35, s. 1161.
29. Forster J. W, Woodurff H. B. — J. Bact. 1943, t. 46, s. 187.
30. Friedman R, Epstein C. — J. Gen. Microbiol. 1951, t. 5. s. 830.
31. Galesloot 1. E. — Neth, Melk. — Z.-Schrift 1956, t. 10, nr 2, s. 142.
22. Galesloot T. E, Pette J. W. —- Neth. Melk. Dairy J. 1956, t. 10, nr 2,
s. 137,
38. Galesloot T. E, Neth. Melk.-Z.-Schrift 1957, t. 11, nr 1, s. 58.
34. Govans J. L. i inni — Brit. J. Pharm. 1952, t. 7, s. 58.
35. Hansen H O.i inni — Proc. W. Div. Amer. Dairy Sci. Ass. 1950, s. 72.
36. Hargrove R. E. i inni — J. Dairy Sci. 1950, t. 33, s. 401.
37. Hashida W. — J. Ferm. Techn. Jap. 1952, t. 30, s. 287.
38. Hashida W., Asai T. — Ferm. Techn. Jap .1953, t. 31, s. 112.
39. Hawley H. B. — J. Appl. Bact. 1955, t. 18, s. 338.
40. Hirsch A, — Nature Lond. 1951, t. 167, s. 1031,
41. Hirsch A. — J. Gen. Microbiol. 1951, t. 5, s. 208.
42 Hirsch A. i inni — J, Dairy Res. 1951, t. 18, s. 205.
43. Rirsch A, Wheater D. M. — J. Dairy Res. 1951, t. 18, s. 193.
44. Hirsch A, Grinsted E. — J. Dairy, Res. 1954, t. 21, s. 101.
45. Inomoto Y., Hashida W, — J. Ferm. Techn. Jap. 1952, t. 30, s. 287.
46. Jacquet J. — XIII Międz. Kongr. Mlecz. 1953, t. 3, sekcja 4, s. 1143.
41. Jones F.S.,, Simms H. S. — J. Exp. Med. 1930, t. 51, $. 21.
48. KatznelsonH., Hood E. G. — J. Dairy Sci. 1949, t. 32, s. 961.
49. Kastli P. — Schweitz Arch. Tierheilk 1948, t. 90, s. 685.
50. Kossikowski F, Mocquot G. — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 3 >

sekcja 3, s, 203.
ol. Krienke W. — Bult. Cheese Milk. Prod. 1950, t. 51, nr 1, 5: 32.
52. Kundrat W. Folda W. — Ber. Forsch. Anst. Milchw. Weihenstephan
1950, t. 1, s. 387.
53. Lato M., Colucci S. — Riv, Biol. Perugia, 1949, t. 41, s. 447.
54. Linneweh F. — Med. Klink. 1949, t. 44, s. 166.
55. Lipinska E. — Prace Inst. Przem. Mlecz. 1955, t. 2, nr 6, s. 1.
56. Lipińska E. — Strzałkowska M.: Frace Inst. Przem. Mlecz. — w druku.
57. Lizgunowa A. V. — Higiena i Sanit. 1952, t. 17, nr 8, s. 27.
58. Mattick A. T. R, Hirsch A. — Nature Lond. 1944, t. 154, s. 551.
59. Mattick A. T.R, Hirsch A. — The Lancet 1947, t. 11, s. 5.
60. Mc Clintock M. — J.
Dairy Res. 1952, t. 19, s. 187.
61. Me Culloch E, C, i inni — Vet. Med. 1949, t. 44, s. 253.
62. Meewes K. H., Milosevié S. — Kiel. Milchwissen. Eericht. 1954, t. 6,
nr 1, s. 59.
63. Mocquot G.i inni — C. R. Acad. Agric, Fr. 1949, t. 35, s. 30.
64. Mocquot G, Lefebre E. — J. Appl. Bact. 1956, t. 19, ur 2, $. 322.
g4 E. Lipińska [16]

65. Neal C. E., Colbert H. E. — J, Dairy Sci. 1955, t. 38, nr 6, s. 525.

66. Crla-Jensen S. — Milchw. Zbl. 1944, t. 73, s. 1.
67. Overby A. J. — Nord. Vet. Med. 1952, t. 4, s. 993.
68. Overby A. J. — Maelkeritidende 1952, t. 65, s. 1073.
69. Overby A. J. — Maelkeritidende 1953, t. 66, s. 363.
TW. Overby A. J. — Dairy Ści. Abstr. 1954, t. 16, nr 1, s. 2.
71. Oxford A. E. — Biochem. J. 1944, t. 38, s. 178.
72. Pedersen i inni — Bereten. Forsogsm. 1951, Kbh, s. 64.
78. Pulay G. — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 2, sekcja 2, s. 432.
74. Petersen N. — Molkereiztg. Hildesheim 1953, t. 4, s. 1431.
75. Pette J. W., KoodyS. J. — XIII Międz. Kongr. Mlecz. 1953, t. 3, sekcja 4,
s. 1172.
76. Pijanowski E. — Chemia i Higiena mleka, W-wa, 1948.
77. Polonskaja M.S.i inni — Dokłady Wsiesojuz. A. N. ZSRR 19538, nr 8, s. 21.
8. Raibaud P. — Ann. Inst. Nat. Rech. Agronom. 1956, t. 5, nr 3, s. 441.
79. Ritter P. — Schweiz. Z. Allg. Path. 1954, t. 17, nr 4, s. 551.
. Ritter P. — Schweiz. Milchztg. 1956, t. 82, s. 273.
Rogers L. A. — J. Bact. 1928, t. 16, s. 321.
Romanowicz T. R. — Mołocz. Prom. 1954, nr 4, s. 45.
Rosenan M.J., McCoy G. W. — J, Med. Res. 1908, t. 18, s. 165.
Rosell J. M, Matallana S. — XIV Międz. Kongr. Mlecz. 1956, t. 2,
sekcja 2, s. 479.
. Sahani K. M. i inni — Antib. Chemother. 1956, t. 6, s. 544.
. Sartory R.i inni — Bull. Ass. Dipl. Microb. Nancy 1956, t. 62, s. 17.
- Seneca H.i inni — Amer. Practic 1950, t. 1, s. 1252.
„.Skorodumowa A. M. — Woprosy Pitanja 1956, t. 15, nr 2, s. 33.
. Welch H. i inni — Antib. Chemother. 1956, t. 6, s. 369.
. Wessner A. W. — XIII Miedz. Kongr, Mlecz. 1953, t. 3, sekcja 4, s. 1121.
. Whitehead H.R. Riddet W. — N. Z. J. Agric. 1953, t. 46, s. 225.
. Whitehead H.R, Lane D. J. — J. Dairy Res. 1956, t. 23, nr 3, s. 355.
Whitehead H. R., Cox G. A — J. Appl. Bact. 1956, t. 19, nr 2, s. 449.
. Wilkowska H. H.i inni — J. Dairy Sci. 1954, t. 36, nr 10, s. 1184.
. Winkler $. — Milchw. Ber. Wolfpass. 1952, t. 4, s. 145. >
Winkler S. — XIII Międz. Kongr. Mlecz. 1953, t. 3, sekcja 4, s. 1164.
97. Wolin A. G, Kossikowski F. V. — J. Dairy Sci. 1956, t. 38, nr 6, s. 55.
98. Zajkowski J. S. — Chimja i fizika motoka i motocznych produktow,
Moskwa 1950.