ES 2 561 482 T3 © 1 egep _ clienasspatiora oe aig Premesvwaaces ihe EsPaia Qimero de publicacion: 2 561 482 Orn cr: CO7C 219108 x0 CO7D 31724 uso AGIK 31/164 cxo10 CO7D327N0—aws0 AGIK 31/232 coon COPFONTS — non AGIK 31/957 coouon COPF 916574 ceo, AGIK 31/99 cs) AGIK 31/661 coo AGIK 31/665 cx) AGIP 35/00 cx) C07 239720 ea CO7C 691587 ea @ TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 13 @ Fecha de presentacion y nimero dela solctud europea: 14.02.2008 € 08714624 (7) @ Fecha y numero de publcacisn dela concesion europea: 11.11.2015 EP 2121876 @ rio: Monohicridos a ido graso poliinsaturado, derivados, y sus usos © Prova Others 15.02.2007 US aa9984 P CENTRE DE RECHERCHE SUR LES BIOTECHNOLOGIES MARINE (100.0%) 208, 26 RUE EST © Fecna ge pubicaciony mencion en BOPI dea 5 Feenaepubicaion yr RIMOUSKI, QUEBEC GL 9H9, CA 25022016 ® invertors: FORTIN, SAMUEL © Agentesnepresentante: DE ELZABURU MARGUEZ, Alberto Observaciones ‘Véase nota informativa (Remarks) en el folleto original publicado por la Oficina Europea de Patontes ‘AvisO: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacion en el Boletin europeo de patentes, de la mencién de concesién de la patente europea, cualquier persona podra oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicion deberd formularse por escrito y estar mollvada; sélo se considerard como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicion (art. 89.1 del Convenio sobre concesisn de Patentes Europeas),10 18 20 25 30 35 40 45 50 55 ES 2 561 482 T3 DESCRIPCION Monoglicéridos de acide graso polinsaturado, derivados, y sus usos Campo de la invencién El presente documento se reflere al campo de quimica medicinal. Mas particularmente se refiere al campo de agentes actives usados como agente quimiopreventiva del cancer y radiopotenclador para radioterapia del cancer. Antecedentes dela invencién Se estima que ocurtan 153.100 nuevos casos de canoer y 70.400 muertes por cancer en Canada en 2006. Los hombres superan a las mujeres tanto en numero de casos como de muertas, en 5% en incidencia y 11% en mortaldad. Tres tipos de cancer dan cuenta de por lo menos el 55% de los nuevos casos en cada sexo; cdnceres de préstata, pulmén y colorectal en hombres; y canceres de mama, pulmén y colorectal en mujeres. El veintinueve por Ciento de muertes por cancer en hombres y el 26% en mujeres son debidos s6lo al cancer de pulmén. En base a los. actuales porcentajes de incidencia, el 38% de las mujeres canadienses y el 44% de los hombres desarrollaran cancer durante sus vidas. En base a los actuales porcentajes de mortalidad, el 24% de mujeres y el 29% de los. hombres, o aproximadamente 1 de cada 4 canadienses moriré del céncer (Canadian cancer society, 2006). En las Ultimas dos décadas la Division of Cancer Prevention de! US National Cancer Institute ha organizado un programa de investigacion y desarrollo para la evaluacion clinica de potenciales agentes preventivos del cancer. El NCI define la quimioprevencién como un érea innovadora de investigacién del céncer que se centra en la prevencién del cancer por medio de intervenciones farmacolégicas, biologicas y nutricionales. Como se describié originalmente, esto implica la prevencion primaria de iniciacion y la prevencion secundaria, retraso, o inversién de la promocién y pragresion (Crowell JA., et al., European Journal of Cancer 41, 2005). Los estudios epidemiolégicos han mostrado una correlacién entre el alto consumo de grasa y un riesgo Incrementado de cancer de mama (WWynder EL, Cancer, 58, 1986). Ademas, tanto el tipo como la cantidad de grasa de la diela parece afectar al desarcollo del cancer de mama (Bartsch H, etal. Carcinogenesis 20, 1999). Una ingesta felativamente alta de Acidos grasos poliinsaturados (PUFAs) r-8 se considera que es un factor de riesgo y esta asociado a una etapa mas avanzada de la enfermedad en el momento del diagnéstico (Nomura AM, et al, Breast Cancer Res Treat 18, 1991) y supervivencia reducida (Rohan TE, et al., Nutr Cancer, 20, 1993). En contraste, existe tna relacién inversa entre la incidencia de céncer de mama y el nivel de consumo de pescado, lo que sugiere un papel protector para los PUFAS n-3 en el cdncer de mama humano, Una dieta que contiene LA (PUFA n-6) estimulé el crecimiento y metastasis de células de cancer de mama humano trasplantadas a ratones desnudos atimicos, mientras que EPA 0 DHA ejercieron efectos supresores comparado con cido palmitica (PA). De este modo, de acuerdo con observaciones epidemiolégicas, el La (PUFA n6) acelera, mientras que el EPA y el DHA (PUFA n-3) suprimen el cancer de mama comparado con la dieta de PA en sistemas, experimentales (Rose DP, et al, JNCI 87, 1995) (Senzaki H, et al, Anticancer Res 18, 1998). Kaframy et al. (Docosahexeenoic acid in phosphatidylcholine mediates cytotoxicity more effectively than other omega-3 and omega-6 fatty acids" Cancer Letter, 1998, vol 132, paginas 23-29) describe moléculas que se han ensayado en un modelo in vitro de la linea celular de leucemia murina T27A. Estas moléculas son: di-C22:6 fosfatdicolina, C18:0,C22:6 fosfatiicolina, C18:1,C22:6 fosfatdicolina, C18:3,C22:6 fosfalidicolina, C20:4,C22:6 {osfatidicolina y C20:5,C22'6 fosfatdicolina, Pacetti et al. (‘High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry of phospholipid molecular species in egg from hens fed diets enriches in seal blabber oi, Journal of Chromatography, 2008, vol. 1097, no. 1-2, Paginas 66-73) describe varios fosfolipidos encontrados en huevos. Estas molécules se analizaron por HPLCIMSIMS y se describen basadas en la fragmentacion en el espectrémetro de masas. No se descriten en este aticulo ni usos ni composiciones de estas moléculas. El documento JP 7 149786 (SAGAMI CHEM RES, 13 June 1995) descrive gliceroglicalipido que tiene fuerte accién de inhibicién del promotor carcindgeno y baja citotoxicidad y es uit como inhibidor del promoter carcindgeno efectivo ‘como un componente activo de un agente de prevencién o tratamiento del céncer. El objetivo principal del documento EP 1 402 894 At es proporcionar agentes para la supresién de la metastasis del cancer. Las moléculas descritas en este documento son principalmente heterociclos de fosfato de cinco miembros de una cadena principal de glicerol esterficada con un Acido graso (palmitico, EPA y DHA) o un derivado de ciclopropano de un dcido graso monoinsaturado. Se describen también andlogos de éteres o carbamatos del éster undo I documento WO 2004/000333 describe combinaciones de derivados de écido graso y carboxiderivados de piridina, ue incluyen ésteres de cido graso on glicerol y 3-catboxiderivados de piridina tales como niacinamida. Estas ‘cominaciones tienen actividad antiviral y antimicrobiana y se usan para el tratamiento de estados inflamatorios e infecciones.10 5 ES 2 561 482 T3 Vandevoorde et al. ("influence of the degree of insaturation ofthe acyl side chain upon the interaction of analogues of 4-arachidonoyiglycerol with monoacyiglycerol lipase and fatty acid amine hydrolase”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, vol 337, no. 1, paginas 104-109), describe una investigacién acerca de la capacidad de trece compuestos para inhibir el metabolismo de 2-oleligicerol por MAGL. y anandamida por FAAH. Se ha mostrado que estas enzimas estén implicadas en varios procedimientos fisioldgicos Importantes como el control de los estados emocionales, apetito, -y percepcién del dolor. Las trece moléculas ensayadas son sn-1- monoacilgicerido de C14:0, C16,0, C20,0, C20:1n9, C20:1n15, C20:2, ©20:3, C20:3 (a-metl), C20:4, C20:4 (a- rmeti), C22:4, C224 (a-meti, ‘Sumario de la invencién Se describen compuestos de formulas (I), (I), IM), y IV en las que Xj 6s 0, NH, oS; X2e3 0, NH, oS; X es 0, NH, oS; Ri y Re cada uno independientemente representa -H, -C(O)NH:, -S(O):NH:, -(oxijalquilo de C1-C22, -alquilo de C1- €22, -(hidroxi)alquilo de C1-C22, -(aminojalquilo de C1-C22, -{halo)alquilo de C1-C22, -alqueniio de C3-C22, - aiquinilo de C3-C22, -cicioalquilo de C3-C7 sin substituir o substtuido con por lo menos un substituyente escogido de alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y -alquinilo de C2-C22, -arilo de C6-C12, -(arialquilo de C7-C22, 310 8 20 25 ES 2 561 482 T3 (atllalquenilo de C8-C22, -(arialquinilo de C8-C22, heterociclo no aromatico de tres a siete miembros sin substituir © substituido con por lo menos un substituyente escogido de ~alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y —alquinllo de C2-C22, heterociclo aromatico de cinco a siete miembros sin substiuir o substituido con por lo menos un substituyente escogido de ~alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y ~alquinilo de C2-C22, -(CH,),aminodcido en ‘01 que el aminodcido esté conectado por medio de su dtomo de carbono alfa. -(CHz),péptido en el que el péptido ‘esté conectado por medio del Stomo de carbono alfa de uno de sus aminodcidos, -CH.ORs, -C(O)Rs, -C(O)ORs, - C(OJNRs, -PO{ORs)2, ~S(O)eNHRs, -SORs, -S(O)-Re, arilP(OORs)a, un azcar, 0 un fosfato de azicar © Ry Re se unen conjuntamente para formar un heteraciclo no aromiatico de cinco a siete miembros sin substituir 0 substituido con por lo menos un substituyente escogido de alquilo de C1-C22, alquenilo de C2-C22, y alquinlo de €2-C22, un fosfato, grupo sulfatocarbonilo, o una tiocarbonilimina; Re €8 -H, -alquilo de C1-C22, -cicloalquilo de C3-C7, -haloalauilo de C1-C22, -atilo de C8-C12, -alquenilo de C2- 22, -alquinilo de C2.C22, -{ari)alquilo de C7-C22, -(arljalquenio de C8-C22, ~(arijalquinlo de C8-C22. - (hidroxijalquilo de C1-C22, -alcoxi de C1-C22, -(amino}alquilo de C1-C22, un ~cicloalquilo de C3-C7 sin substtuir 0 Substituido con por lo menos un substituyente escogido de ~alqullo de C1:C22, -alquenilo de C2-C22 y ~alquinilo de €2-C22, un heterociclo no aromatico de tres a siete miembros sin substitu 0 substituido con por lo menos un substituyente escogido de ~alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y alquinilo de C2-C22, un heterociclo ‘aromitico de tres a siete miembros sin substituir 0 substituldo con por io menos un substituyente escogido de - aiquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22 y ~alquinilo de C2-C22, un -(CH),aminodcido en el que el aminogcido esta conectado al compuesto por medio de su étomo de carbono atfa, un ~(CHe},péptido en el que el péptido esta ‘onectado al compuesto por medio del étomo de carbone alfa de uno de sus aminoacidos, un aziicaro un fosfato de azicar, y nes un numero entero que tiene un valor de 0, 1, 2,3,0.4, y sus sales farmacéuticamente aceptables, Los compuestos de la invencién son segdn las relvindicaciones 1 a5. Se describen también compuestos de formulas (V), (VI), (Vil), (VIN, (IX), (X) (XN, (XM), (XI), (XIV) 0 (XV): : f.ES 2 561 482 T3 vu xt xi xu10 18 20 25 20 ES 2 561 482 T3 xiv xv Xj es 0, NH, oS; X25 0, NH, oS; X50, NH, oS; Rey Ré cada uno independientemente representa -H, -C(O)NH:, -S(0):NH», -(oxijalquilo de C1-C22, -alquil de C1- 22, -{hidrox)aiquilo de. C1-C22, -{amino)alqullo de C1-C22, -{halojalquilo de C1-C22, -alquenilo de C3-C22, - alquinilo de C3-C22, -cicloalquilo de C3-C7 sin substitu © substituido con por lo menos un substituyente escogido de -alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y -alquinilo de C2-C22, -arlo de C8-C12, -farialquilo de C7-C22, - (arialquenio de C8-C22, -arijalquinlo de C8-C22, heterociclo no aromatico de tres a siete miembros sin substituir © substtuido con por lo menos un substituyente escogido de ~alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22, y -alquinlo de C2.C22, heterocicio aromatico de cinco a siete miembros sin substiuir 0 substituido con por lo menos un substtuyenie escogido de ~alquilo de C1-C22, -lquenilo de C2-C22, y ~alquinilo de C2-C22, -(CH_)raminodcido en el que el aminoécido esta conectado por medio de su atomo de carbono atfa, -(CHz),péptido en el que el péptido esté conectado por medio del &tomo de carbono alfa de uno de sus aminodcidos, -CH-OR, -C(O)R., -C(O}OR, - C(OINRs, -PO(ORs}z, -S(O}eNHRs, -SORs, -S(O)zRe, -arlP(O\ ORs), un azicar, oun fostaio de azicar © Rs y Re se unen conjuntamente para formar un heterociclo no aromiético de cinco a siete miembros sin substtuir 0 substituido con por lo menos un substituyente escogido de alqullo de C1-C22, alquenilo de C2-C22, y alquinlo de €2-C22, un fosfato, grupo sulfatocarbonilo, o una tiocarbonilimina;, Ry es -H, -alquilo de C1-C22, -cicloalquilo de C3-C7, -haloalquilo de C1-C22, -atilo de C8.C12, -alquenilo de C2- €22, -alquinilo de C2.C22, “{ari)alquilo de C7-C22, -(arijalqueniio de C8-C22, -(arijalquinio de C8-C22. - (hidroxijalquilo de C1-C22, -alcoxi de C1-C22, -(amino)alquilo de C1-C22, un -cicloalquilo de C3-C7 sin substtuir o Substituido con par lo menos un substituyente escogido de alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22 y -alquinilo de €2-€22, un heterociclo no aromatico de tres a siete miembros sin substituir © substituido con por lo menos un substituyente escogido de —alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2.C22, y alquinilo de C2-C22, un heterociclo aromatico de tres a siete miembros sin substitu 0 substtuido con por io menos un substituyente escogido de - alquilo de C1-C22, -alquenilo de C2-C22 y ~alquinilo de C2-C22, un -(CH),aminoacida en el que el aminoacido esta Conectado al compuesto por medio de su atomo de carbono atfa, un -(CHz),péptido en el que el péptido esta ‘onectado al compuesto por medio del étomo de carbono atfa de uno de sus aminoacidos, un azucar o un fosfato de aziicar, y nes un ndmero entero que tiene un valor de 0, 1, 23.0.4, y Sus sales farmacéuticamente aceptables, Se encontré que tales compuestos se pueden usar para reducit 0 inhibir el crecimiento tumoral, © inhibit la proliferacion de células tumorales in vitro asi como in vivo, Se encontré también que los compuestos previamente encionados pueden ser utiles como agentes quimiopreventivos del cancer (por ejemplo cancer de mama, cancer 610 18 20 25 30 ES 2 561 482 T3 de prdstata, cancer de colon y canoer de pulmén). Los compuestos de la presente invencién se pueden usar separadamente 0 en una mezcla de por lo menos dos de ellos (por ejemplo, 2, 3, 0 4 de ellos). Los compuestos pueden estar también en forma alslada, Los compuestos de la presente invencién se pueden usar en forma de una ‘Composicion que incluye también un vehiculo farmaceuticamente aceptable, También se descrie que los compuestos previamente mencionados pueden proporcionar composiciones farmacéutica para quimioprevencién del céncer. Tales composiciones pueden comprender por lo menos dos Compuestos escogidos de compuestos de formulas (I), (Il), (Il) y (IV) Estos compuestos también pueden ser efectivos como radiopotenciadores para radioterapia del cdncer, 0 en combinacién con un ingrediente fermacéuticamente activo en quimioterapla del cancer. Los compuestos o las composiciones segiin la invencién pueden ser efectivos para quimioprevencién de varios tipos de cancer (tales como canoer de mama, cancer de pulmén, cancer de préstata, cancer de colon). El crecimiento de tumores de tales tipos de caincer se puede inhibr o reducir con estos compuestos. Se describe un método pera quimioprevenir el céncer que comprende la etapa de administrar a un sujeto por fo menos un compuesto escogido de compuestos de formulas (1), (I), (I), (IV), (V), (Vl), (Vl), (VI), (IX), OX), OX, OXI, (XI), (XIV) y (XV), Los compuestos 0 las composiciones segun la Invencién se pueden usar en un método para quimioprevenir el cancer. Se describe un método para inhibir el crecimiento tumoral, inhibir la prolferacion de células tumorales, © reducir el crecimiento tumoral, in vitro o in vivo, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de por lo. ‘menos un compuesto escogido de los compuestos de formulas (I), (i), (I). (IV), (V). (VI), (VI) (VI), (IX), (X). XD (AN, (XI), (XIV) y (XV). Los compuestos © las composiciones segin la inveneién se pueden usar en un método para inhibir el crecimiento tumoral, inibir la prolferacién de céiulas tumoral, o reducir el crecimiento tumoral, In vito 0 in vivo. Se describe un método para reducir el crecimiento tumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto por lo menos un compuesto escogido de compuestos de las férmulas (1) (I), (ll), (I), (V). (WU, CVI) (VI), (EX), (X). OX, (XA), (IN), (XIV) y (XY). Los compuestos 0 las composiciones segii la invencién se pueden usar en un método para reducir el crecimiento tumoral La presente descripcién describe también un método para preparar un compuesto de formula (V), (V1), (Vil, (Vil), (Dd), 00), OC), (XIN, (XIN), OXY) 0 (XV), comprendiendo et método hacer reaccionar un compuesto de férmula (XVI), (VIN), 0 Pout) d "SNA, NOY { \ fh Mi fen a. que X;, Xe, Xa, Re y Ru son como se define previamente,10 ES 2 561 482 T3 ‘con por lo menos un éster de por lo menos un dcido graso escogido de siendo entendido que cuando se usa un compuesto de formula (XVI), se obtiene un compuesto de formula (V). (VI) (il), 0 (Vil), cuando se usa un compuesto de formula (XVII), se obtiene un compuesto de formula (1X), (X), 0 (XD, ¥ ‘cuando se usa un compuesto de formula (XVIll) se obtiene un compuesto de formula (XII), (Xil), (XIV) 0 (XV), Por ejemplo, un compuesto de formula (XVI) y el éster de dcido graso se pueden hacer reaccionar conjuntamente en presencia de una base (tal como KOH 0 NaOH). Altemativamente, se pueden hacer reaccionar conjuntamente en presencia de una enzima, por ejemplo, una lipasa tal como Candida antartica EI métode puede comprender adicionalmente tratar e! compuesto obtenido de formula (V), (VI), (Vil) o (Vill) en. ‘condiciones acidas para abrir su anillo heterociclico y protonar Xe y Xs, Por ejemplo, el compuesto de formula (XVI) puede ser10 18 20 ES 2 561 482 T3 El método puede comprender adicionalmente tratar el compuesto obtenido de formula (V), (VI), (Vil) (Vill) en. Condiciones acidas para obtener Las condiciones écidas se pueden producir por medio de un Acido escogido de acido acstico, acide férmico, acido clothidrico, &cido p-toluenosuifénico, Acido trifluoroacético, Acido perciérico y tosilato de piridinio o por medio de una resina acida, El éster puede ser un éster de alquilo de C1-C6 del Acido graso. Allemnativamente el éster puede ser un monaglicerido o un diglicérido en e! que por lo menos uno de los atomos de oxigeno de la cadena principal de glicerol forma un éster con el dcido graso. El éster puede ser también un trglieérido en el que os tres atomos de ‘xigeno de la cadena principal de glicerol farman un éster oon una molécula del acido graso. El éster puede ser también un diglicérdo © triglicérido en el que por lo menos un tomo de oxigeno de la cadena principal de glicerol forma un éster con otro acido graso omega-3 0 uno acido graso omega 6, Por ejemplo, la preparacién de compuestos de formulas (V), (VI), (Vl) (VI), (IX), (X), (XI), (XI), (XI), (XIV) y OXY) se puede llevar a cabo haciendo reaccionar conjuntamente un acelte de pescado que contiene el triglicérido con el Compuesto de férmula (V), (VI), (VI), (VIN, (1X), 0X), OX), (XH, (XII), (XIV) © OV), De hecho, se pueden usar varios aceites ricos en dcidos grasos omega-3 ylo omega-6. Por ejemplo, se pueden usar aceites vegetales (tales como aceite de linaza, aceite de semilla de calabaza, aceite de colza, aceite de soja, aceite de nuez, etc.) y aceltes marinos (tales como aceite de algas, aceite de foca, aceite de krill, aceite de pescado (por ejemplo, aceite de higado de bacalao, aceite de salmén, aceite de atin, aceite de tiburén, aceite de peces pelagicos, aceite de sardinas, etc.) EI método puede comprender hacer reaccionar el compuesto de Formula (XVI), (XVII), © (XVI) con por lo menos dos cidos grasos diferentes escogides de los acidos grasos previamente definidos. El método puede también ‘comprender hacer reaccionar mas de un compuesto escogido de los compuestos de formulas (XVI), (XVID, y (XVII) El término “aro” tal como se usa aqut se refiere a un anllo aromatico cictico 0 policilco. Por ejemplo, el grupo aio.10 15 20 25 ES 2 561 482 T3 puede ser fenilo 0 naftio. La expresion *heterocicio aromatico” tal como se usa aqui se reflere a un sistema anular aromatico ciclico 0 policicico condensado que tiene por lo menos un hetercatomo seleccionado del grupo que consiste en N, O, Sy P. Los ejemplos no limitantes que incluyen grupos heteroarilo son futlo, tienilo, piidlo, quinolnil, isoquinolinio, indolilo, Soindolil, trazollo, piri, tetrazollo, imidazolio, pirazolilo, oxazolio, tiazollo, ' benzofuranio, benzotiofeniio, carbazollo, benzoxazolio, pirmiiaio, benzimidazolilo, quinoxalinilo, benzotiazolio, naftrdinilo, isoxazollo, isotiazolilo, purnilo, quinazolirilo, etc. La expresion “heterociclo no aromético” incluye anillos o sistemas de anillo no arométicos que contienen por lo ‘menos un anillo que tiene por lo menos un heterotomo (tal como nitrégeno, oxigeno, azufre o fosforo). Este término incluye, de una manera no limitante, todos los derivados totalmente saturados y parcialmente Insaturados de los. anteriormente mencionados grupos heterociclicos aromticos. Los ejemplos de grupos heterocielicos no aromalicos incluyen, de una manera no limitante, pirrolidinio, tetrahidrofuranilo, morfolnilo,tiomorfolinilo,piperidinilo,piperazilo, tiazolidnilo, sotiazolidinilo,e imidazolidinio El azicar se puede escoger de azicares de 5 carbonos y aziicares de 6 carbonos. Los ejemplos no limitantes de azicares de 5 carbonos incluyen ribosa, arabinosa, xilosa, y litosa. Los ejemplos no limitantes de azicares de 6 ccarbonos incluyen glucosa, galactosa, manosa, alosa, gulosa, dasa, talosa y altrosa, El fosfato de azucar se puede escoger de monosacétidos (tales como manosa-6-fosfato, glucosa-6-fosfalo, galactosa-6-fosfato, manosa-1-fosfato, glucosa-\osfato y galactosa- 1-fosfato), disacdridos (tales como 6-O-fosfori- 2-D-manopiranosil(1-2}-D-manopiranosa, _6-O-fosfori-a-D-manopiranosil-(1-3)manopiranosa, _6-O-fosfori-a-D- ‘manopiranosi-1-6)-D-manopitanosa),trisacdridos (tales como 6-O-fosfota-D-manopiranosit-(1-2)-D-manopiranosil- (1-2)-D-manopirenosa), y oligosacéridos lineales 0 ramificados superiores (tales como pentamanosa-6-fosfato), El aminodcido se puede escoger de alanina, arginina, asparagina, Acido aspartico, cisteina, glutamina, Acido glutamico, glcina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptdfano, tiosina, y valina El péptido se puede escoger de cualquier posible combinacion de los aminodicidos previamente descritos. Se describen compuestos que son de formulas: oN 4 ‘OH j NNN NN 10ES 2 561 482 T3 Ccom*yr* a — es on xr Fk / NNN eS x ry mee. CoCr ry Cote , CooES 2 561 482 T3ES 2 561 482 T3 RAD a — ° Las composiciones de la invencién son segun las relvindicaciones 6 a 8, 1410 18 20 25 30 35 40 ES 2 561 482 T3 La presente invencion se refiere también a compuestos 0 composiciones como se define anteriormente para su uso ‘como un medicamento, Breve descripcion de las figuras Las caractetisticas y ventajas adicionales de la invencién se harén mas evidentes de la siguiente descripcion de realizaciones especificas como se lustra a mado de ejemplo en las figuras adjuntas en las que: La Fig. 1 e3 un diagrama que muestra los resultados de un ensayo in vitro de una composicién segin una realizacién de la presente invencién, en la que el ensayo se llevé a cabo en una linea celular de cancer humano A549; La Fig, 2 es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo in vitro de una composicién segin una realizacién de la presente invencién, en la que el ensayo se llevé @ cabo en una linea celular de cancer humano PCs; La Fig, 3 es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo in vitro de una composicién segin una realizacién de la presente invencién, en la que el ensayo se llevé a cabo en una linea celular de cancer humano HOT-15; La Fig, 4 es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo in vitro de una composicién segin una realizacién de la presente invencién, en la que el ensayo se llev6 @ cabo en una linea celular de céncer humano BT> 549; La Fig, 5 es una curva que representa os resultados de un estudio comparativo de eficacia in vivo de una ‘omposicién segin una realizacién de la presente invenciin, en la que el estudio se lev a cabo en un modelo de xenoinjerto en ratones (NUINU-Foxtnuy, y La Fig. 6 es una curva que representa el peso corporal del modelo de ratones (NUIUN-Fox‘nu) como funcién de los. dlas post inoculacién en el estudio de eficacia in vivo de la Fig. 5. Descripcién detallada de la invencién Las caracteristicas y ventajas adicionales de los compuestos previamente mencionados se hardn mas evidentes de la siguiente descripcién de ejemplos no limitantes. Ejemplo 1 Preparacion de monaglicérido 4 Ester etlico del acide docosapentaenoico (compuesto 2) (10 g) y compuesto 3 (6 g) se mezclaron conjuntamente y calentaron a una temperatura de 60°C. Se afiadié la enzima (100 mg) y la mezcla de reaccién se agitd a 60°C a vacio (18 mbar) 0 con burbujeo de nitrogeno durante 5 h. La mezcia de reaccién se fitro y la enzima se lav6 con etanol de 95% (20 mi). La resina dcida (500 mg) 0 dcido organico se aftadié a la disolucién de etanol y se calent a reflujo durante 18 h. La resina se retiro por fitracién y el etanal se evaporé a vacio. El producto en bruto resultante se disolvis en una mezcla de hexanos/acetato de etilo 90:10 (10 ml) y se afiadié gel de slice (40 g). La suspension se puso en un embudo esmerilado y se eluyé con hexanos/acetato de eto 90:10 (150 mi) para retirar el material de partida sin reaccionar. Una segunda elucién con acetato de etilo (300 ml) dio, despues de la evaporacion a vacio, e! compuesto 1 puro (6,7 g). Se ensayé in vitro en el ensayo de viabilidad celular y en un modelo tumoral de xenoinjerto in vivo. Los compuestos puros 5 y 6 (véase a continuacién) se han preparado también con éxito siguiendo el mismo procedimiento. 8ES 2 561 482 T3 Ejemplo 2 Preparacién de una composicién (composicién 1) que comprende varios monoglicéridos (compuestos 1, 5 y 6) ee peta La composicién 1 que comprende los compuestos 1, § y 6 se preparé segin el mismo pracedimiento que se 5 descrite previamente en el Ejemplo 1, El material de partida era una mezcia de compuestos 2, 7 y 8 a respectivamente (10%, 80% y 10%). Esta composicién de material de partida fue vendida por la compafiia CRODA™ Chemical Europe Ltd. con el nombre INCROMEGA™ DHA 700 E SR, De este modo, la composicién 1 obtenida contiene 10% del compuesto 1, 80% del compuesto 5, y 10% del compuesto 6. Ejemplo 3 10. Preparacién de monoglcérido 1 1) Rese deidatOH 2) desiacen| 1610 18 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 561 482 T3 Un aceite de pescado (que comprende aceite de peces peligicos) (30 g) y el compuesto 3 (6 g) se mezclaron Conjuntamente y se calentaron a una temperatura de 60°C. Como se llustra en el esquema de reaccién anterior acelte de pescado puede comprender una pluralidad de trigicéridos, Los dos grupos R, que pueden ser iguales 0 diferentes, pueden representar la cadena de varios acidos grasos u otros acidos organicos presentes en tal acette. En tales triglicéridos, por lo menos un tomo de oxigeno de la cadena principal de glicerol forma un éster con un Acido graso omega-3. Se ahadié la enzima (lipasa) (100 mg) © KOH (1.000 mg) y la mezcia de reaccién se agité a 60°C durante 3 h. La mezcia de reaccién se fitré sobre una almohadila de gel de silice y la enzima se lave con etano} de 95% (20 mi), Se afladié la resina acida (500 mg) o un dcido a la disolucion de etanol y se calento a reflujo durante 16 h, La resina se retir6 por fitracién y el etanol se evaporé a vacio. El producto bruto resultante se dest a presién reducida para dar el compuesto puro 4 Se pueden usar varios otros aceltes ricos en acidos grasos omega-3 ylo omega-6. Por ejemplo, se pueden usar aceites vegetales (como aceite de linaza, aceite de semila de calabaza, aceite de colza, aceite de soja, aceite de rnuez) y aceites marinos (tal como aceite de algas, aceite de microalgas, aceite de fitopiancton, aceite de foca, aceite de kil, aceite de pescado (por ejemplo, aceite de higado de bacalao, aceite de salmén, aceite de atun, aceite de tiburén, aceite de sardinas, etc.) Ejemplo 4 El ensayo de viablidad celular se realiza para medir el estado relativo de la viabilidad celular de las células de cancer tras la exposicion a los compuestos de ensayo en comparacién con un control positiv (etopésido) y un ‘control negativo (vehiculo). Las oélulas adherentes que crecen en placas de 96 pocillos se exponen a compuestos de ensayo durante 3 dias (72 horas). Se usan cuatro lineas celulares de cdncer, que incluyen los tipos de pulmén, ‘colon, préstata y mama dado que estos tipos de cancer poseen alta incidencia en seres humanos. Los compuestos de ensayo (composicién 1 que comprende los compuestos 1, 5 y 6), as! como los controles positives y negatives se ensayaron en paralelo en la misma placa de cultivo. Todas las condiciones se ensayan por triplicado. Se usan agentes apoptiticos tales como etopésido 0 epigallo-catequina-galato como controles positvos para matar céiulas ‘mientras que el disolvente (sulféxido de dimetilo y agua) se usa como control negativo para la determinacin basal La inhibicién de 50% del crecimiento celular en comparacién con el estado basal es el limite inferior que indica una respuesta biolégica posiva (considerada como un éxito). Después del tiempo de incubacién, el contenido total de proteina se cuantfica después de la tincién con el colorante anisnico sulforrodamina B (SRB), La detecciin de luminiscencia, emitida por SRB, se completa por medio de un lector de microplacas. Este método de deteccién asta basado en trabajos publicados por Monks et a, en el Journal ofthe National Cancer Institute vol. 82 no. 13 (1991) p. 757, Skehan et al, en el Journal of the National Cancer Institute vol, 82 no. 13 (1990) p. 1107 y Rubinstein etal. en el ‘Journal of tne National Cancer Institute vol. 82 no. 13 (1990) p. 1113, La cantidad de luminiscencia es directamente proporcional al numero de células vivas en el cultvo Las células cancerigenas se cultvaron en mattaz T-75 (Falcon) que contiene 20 mi de medio de cultivo apropiado, se subcultivaron dos veces @ la semana a 37°C, 5% de COs, 95% de aire y humedad relativa del 100% y se ‘mantuvieron a bajo nimero de pases (de 5 2 20), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las lineas celuiares Usadas fueron A-849 (carcinoma de pulmén humano), HCT-15 (adenocarcinoma de colon humano), BT-549 (carcinoma ductal de mama humano) y PC3 (adenocarcinoma de préstata humano). Las células se trpsinizaron Usando tripsina al 0,25% (pesolv) / disolucién 0,53 mM de EDTA (Hycione), se contaron y se depositaron a densidades de entre 1.000 y 3.000 células por pocillo en placas transparentes de 96 pocilos de fondo plano (Becton Dickinson) en 100 il de apropiado medio de cultivo suplementado con suero Bovino fetal (Hyclone). Las placas de cultiVvo se incubaron @ 37°C, 5% de CO2, 95% de aire y humedad relativa del 100% durante 72 horas. Al 20-30% de confluencia celular, se afadieron 80 ul de medio de cultivo apropiado cada pocilo, Se afadieron 20 ul de ‘cualquiera de una disolucién de compuestos de ensayo en 6 diferentes concentraciones, Farmaco para controles postivos (a una concentracién de 29 mg/ml) o disolvente (vehiculo 0 agua) para los controles negativos sobre los. 4180 ul de medio de cultvo para obtener un volumen final de 200 pi. Se incluyeron en cada experimento placas de referencia que contienen el mismo volumen de medio sin células. Las microplacas que contienen las células y los Compuesios de ensayo se incubaron a 37°C, 5% de CO2, 95% de aire y humedad relativa del 100% durante 72 horas. Se establecié una microplaca para cada linea celular como se describe a continuacién. Estas cuatro mmicroplacas representaban el crecimiento basal en el tiempo cero. Después de un tiempo de incubacion de 72 horas, las oélulas se fjaron con 50 ul de acido tricloroacético (TCA) al 50% (peso!) fio (4°C) aadido sobre 200 wil de medio de cultiv. Estas microplaces contenian condiciones del control de crecimiento y ensayo de crecimiento Las mictoplacas se dejaron 60 minutos a 4°C y subsecuentemente se lavaron cinco veces con 200 pl de agua desionizada, Las microplacas se dejaron secar a temperatura ambiente durante por lo menos 24 horas. A todas las mmicroplacas se les agregaron 100 jl de SRB al 0,4% (pesolv fra disuelta en disolucion de dcido acético al 1% en ‘agua afiadidos a cada pocilo que contiene células y se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La SRB sin unir se retié con lavados sucesivos (cinco veces) con 200 jil de disolucién de dcido acético fio al 1% en agua. Todas las microplacas se dejaron secar a temperatura ambiente durante por lo menos 24 horas. La SRB unida a proteinas se solubliz6 con la adicién de 100 pi de disolucién Tris-base 10 mM fria no tamponada (pH 10,5). Las, rmicroplacas se dejaron en un agitador de placas durante 5 minutos, Se leyé la absorbancia @ 516 nm usando un lector de luminiscencia Multiskan Spectrum de placa de 96 pocillos (Thermo Electron Corporation). Se realizé el andlisis de datos con Excel 2003 y SigmaPlot 8.0 0 software GraphPadPrism 3.02. El porcentaje de Inhibicion del crecimiento se calculé usando las medidas de absorbancia [Crecimiento en el tiempo cero (Ts), control de 710 18 20 25 30 35 40 45 50 55 ES 2 561 482 T3 crecimiento (C) més el crecimiento del ensayo a las concentraciones de férmaco ensayadas (T}) como sigue: (T- To)(C-To) x 100]. Los resultados obtenidos se muestran en las Figs. 1 a4, La Figura 1 representa el ensayo in vitro de la viablidad celular de seis diferentes concentraciones de composicién 4 en la linea celular de cancer de pulmén humano A-549. El etopésido de control positive a 294 g/m muestra et 100% de inhibicion del crecimiento, EI 50% de inhibicion del crecimiento esta alrededor de 12.5 ygiml de la composicién ensayada, La Figura 2 representa el ensayo in vito de la viablidad celular de sels diferentes concentraciones de composicién 4 en [a linea celular de cancer de préstata humano PC-3. El etopdsido de control positive a 294 g/ml muestra el 100% de inhibicion del crecimiento, El 50% de inhlbicion del crecimiento esta alrededor de 6,25 igiml de la composicién ensayada, La Figura 3 representa el ensayo in vitro de la viablidad celular de sels diferentes concentraciones de composicién 4 en la Ifnea celular de cancer de colon humano HCT-16. El etopésido de control postvo a 294 gimi muestra el 100% de inhibicién del crecimiento, El 50% de inhibicién dei crecimiento esta alrededor de 50 ygiml de la composicién ensayada, La Figura 4 representa el ensayo in vitro de la viablidad celular de seis diferentes concentraciones de composicién 4 en [a linea celular de cancer de mama humano BT-549. El elopésido de control positive a 294 g/ml muestra el 100% de inhibicién del crecimiento. El 50% de inhibicién del crecimiento esta alrededor de 18,75 ug/ml de la composicién ensayada, Los mismos ensayos se han llevado a cabo en el compuesto 1 sustancialmente purificado y se obtuvieron resultados similares, Ejomplo § El protecolo del modelo de tumor de xenoinjerto In vivo usa dieclocho ratones (NUINU-Foxinu), Después de 3 dias de aclimatacién se identiicaron, se pesaron y se seleccionaron al azar en tres cohortes por peso. Los animales recibieton 3 dosis de tratamiento antes de la inoculacion de las células MCF-7. La dosificacion consistié en 0,5 ml 3 dias a la semana durante un total de 7 semanas pata cada cohorte, Los fatones reciberon un suplemento de estrégenos via un implante que se insert subcuténeamente en la region subescapular 48 horas antes de la Inoculacién de las células MCF-7, Los animales se pesaron una vez a la semana y los tumores se midieron 2 veces por semana. Se recogieron muestras de sangre (150 mi) una vez antes de inicar el tratamiento, y subsecuentemente cada 2 semanas después de la inoculacién de cdlulas y ala terminacién, Se recogié plasma, asi como el pelet de RBC, se congelé y almacend a -80°C. Los animales se observaron para ver el aspecto del desarrollo del tumor. Una vez que se detectaron tumores, los volimenes tumorales se evaluaron usando la ecuacién: V = L (mm) x W2 (mm)/2, en la que W es la anchura y L es la longltud del tumor. Al final del estudio los. animales supervivientes se sometieron a eutanasia usando isoflurano y se realizé una punclén cardiaca para una extraccién de sangre final, Una vez que se detectaron tumores, los voldmenes tumorales se evaluaron usando la ecuacion: V = L (mm) x W2 (mm)/ 2, en la que W es la anchura y L es la longitud del tumor. Al final del estudio los animales supervivientes se sometieron a eutanasia usando isoflurano y se realiz una puncién cardiaca para una extraccién de sangre final, Una vez que se detectaron tumores, los voldmenes tumorales se evaluaron usando la ecuacion: V = L (mm) x W2 (mm) 2, en la que W es la anchura y Les la longitud del tumor. Al final del estudio los. animales supervivientes se sometieron a eutanasia usando isoflurano y se realize una puncién cardiaca para una extraccién de sangre final. Cada animal se marcd en la oreja para identficar su numero individual y sus colas se rmarearon con el numero de jaula. Los animales recbieron comida y agua ad libitum durante el estudio y se als 3 animales juntos por jaula. Los resultados obtenidos se muestran en las Figs. 5 6, La Figura 5 representa un estudio comparativo de la eficacia in vivo de la composicién 4, un aceite de pescado (peces pelégicos) y un control (aceite de maiz), levado a cabo en un modelo de xenoinjerto en ratones (NU/NU- Foxinu). Tanto en el grupo de control positivo (aceite de pescado) como en el grupo de la composiciin 1, se observ6 una cinética tumoral alterada. En ambos casos, la progresién del tumor se redujo y esto se observé en una considerablemente mayor medida para el grupo de composicion 1 La Figura 6 representa el peso corporal del modelo de ratones (NUINU-Foxinu) en el estudio de eficacia in vivo de. la composicion 1, un acelte de pescado y un control (aceite de maiz). El peso corporal del animal no fue afectado por ringuno de fs tratamientos, lo que suglare que no se observé toxicidad aparente a estas dosis, ‘Aunque la invencién se ha descrito con respecto a sus realizaciones especificas, se entenderé que es capaz de modificaciones adicionales y esta solictud se pretende que cubra cualquier variacién, uso 0 adaptacién de la invencion, siguiendo, en general, los principios de la invencion e incluyendo tales desviaciones de la presente descripcién como sucede en la practica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invencién y ‘como se puede aplicar a las caracieristicas esenciales expuestas aqui anteriormente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. 1810 18 20 ES 2 561 482 T3 REIVINDICACIONES 1 Un compuesto de formula (I) enia que X1 6s Oo NH X08 OO NH Xs es Oo NH Ri y Re cada uno independientemente representa -H, -aiqullo de C1-C22, -(hidroxijaqulo de C1-C22, - (amino)alquilo de C1-C22 0 ~elquenilo de C3-C22, © una de sus sales farmacéuticamente aceptable, 2. El compuesto de la relvindicaci6n 1, en el que Ri y Re cada uno independientemente representa -H, -alquilo de C1-C22, 0 ~alquenilo de C3-C22, 3. El compuesto de la reivindicacién 1, en el que Ry es -H y Re es -H 4. El compuesto de lareivindicaciin 1 0 2, en el que X: es 0, X: €5 O, y Xs es O. 5. El compuesto de a reivindicacién 1, en el que dicho compuesto es: 6. _Una composicién que comprende por fo menos dos compuestos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11a 5. 7. Una composicion que comprende el compuesto de la relvindicacién 5 y los compuestos de las siguientes férmulas: 1910 ES 2 561 482 T3 8. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 5 0 una composicion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso como medicamento. 10. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a § 0 una composicién como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso para tratar cancer. 11, Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.0 una composicién como se define on una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso para tratar cancer, siendo dicho cancer el cancer de mama, céncer de pulmén, cancer de préstata, o céncer de colon, 12, _Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.0 una composicién como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso para reducir el crecimiento tumoral 20Porcentaje de viabilidad celular (%) Porcentaje de viabilidad celular (%) 228 S$ 8 ES 2 561 482 T3 Ensayo in vitro en la linea celular de cancer de pulmén humane (A549) > S$ y 8 y Ss 0 moh - toes ugh SDujol ul (O6ugad 626ighl 3 ful vericue Sl Ensayo in vitro en la linea celular de cancer de préstata humano (PC3) 3 wi. 7 : etopésiso LJ Sughti ugh 125 ugh! 425 ugh’ 4 Gugh venicuo ts Oe wv va aS"_2 atPorcentaje de viabilidad celular (%) Porcentaje de viabilidad celular (%) ES 2 561 482 T3 Ensayo in vitro en la linea celular de cancer de colon humano (HCT-15) S Ss @ ie | | | | | | | | 2 s S & | iS 8 1 | | | | : rE ee Eur A i S S35 oe Shug Buhl (25ul Bgl Ee vores Ensayo in vitro en la linea celular de cancer de mama humano (BT-549) 60} = 40 a 20 a Fevnsews EE] ED aia Se QR venom 20° Mug 5g) Bg 4 2Volumen medio del tumor (mm) Peso corporal (g) 304 2s 18 | 10 — ES 2 561 482 T3 + Aceite de maiz we Aceite de pescado ‘4 Composicién 1 5 10 15 20 28 30 35 40 Dias después de la inoculacién de células MCF-7 eS" 4 —e— Aceite de maiz | | “B— Acsite de pescado | 10 20 30 40 50 Dias después de la inoculacion SS" 5 23