Separación de proteínas por electroforesis

en
gel de poliacrilamida- SDS

Integrantes:
Salomón Constancio
Renato Reyes
Joshua Silva
Emeka Udeh

Fecha laboratorio : Jueves 12 de enero del 2023

Nombre profesor : Jorge Cortés Mella
 Introducción

Electroforesis es un proceso de éxodo de moléculas cargadas a través de

soluciones en un campo eléctrico. Este método es empleado frecuentemente en la
detección de proteínas, ya que las cadenas laterales de varios aminoácidos existen
en forma disociada a un determinado pH, atribuyendo cargas positivas y negativas a
las macromoléculas. Estos procedimientos no son generalmente utilizados para
purificar proteínas en grandes cantidades ya que hay otros métodos más exactos
para este fin como cromatografía en columna. Sin embargo, la electroforesis es muy
útil como método analítico, ya que permite observar y hacer una estimación rápida
del número de proteínas en una mezcla y de su peso molecular aproximado.
Además, la electroforesis permite determinar el grado de pureza de una
preparación.

Para una mayor resolución en la técnica se realiza un sistema discontinuo, que

consiste en crear un gel con dos regiones, una región concentradora que contiene
un menor porcentaje de poliacrilamida, bajo pH y baja fuerza iónica que la región del
gel separador. Este sistema discontinuo el efecto que tiene resulta en que las
macromoléculas se moverán rápido al entrar al gel concentrador, acumulándose en
bandas antes de entrar al gel separador. Al momento de entrar al gel separador las
distintas proteínas se separan en bandas de acuerdo a su movilidad.

Al moverse a través del gel separador, éste ofrece resistencia frente a las moléculas
más grandes, por lo que ira separando las proteínas basándose en el tamaño de las
moléculas.
Este procedimiento se realiza para determinar el peso molecular de proteínas, al
realizar la electroforesis de proteínas estándar. Al graficar la distancia de migración
versus el logaritmo del peso molecular se obtiene una recta para poder interpolar la
distancia relativa de las muestras en el grafico y así obtener el peso molecular.

Métodos y materiales

Materiales

Cámara de electroforesis Mini-PROTEAN 3

Preparación de albúminas obtenidas del laboratorio pasado

Tubos eppendorf

Micropipeta
Soluciones y Reactivos

Solución 30 (acrilamida 30% – bis-acrilamida 0,8 %)

Solución B (Buffer gel separador): 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Solución C (Buffer gel concentrador): 1 M Tris-HCl, pH 6.

Buffer de corrida Tris-glicina pH 8

Buffer L (de carga)

TEMED

SDS al 10 %

Persulfato de amonio (APS) al 10%

Preparación de las muestras

Para denaturar las muestras de proteínas,se adicionaron en tubos eppendorf 10 μL

de muestra (porotos, habas y espinaca) junto con 10 μL del buffer de carga
(compuesto por: SDS, b-mercaptoetanol, glicerol y azul de coomassie).

Se introdujo la muestra en un thermo-shaker por 3 minutos a 95°C para denaturar

las proteínas. Se cargó con 10 μL de muestra y 10 μL de estándar de peso
molecular en un pocillo.

Se cargó con 10 μL de muestra y 10 μL de estándar de peso molecular en un

pocillo.
Posteriormente se conecto la camara a la fuente de poder y se le aplicó un voltaje
de
120 volts por 40 minutos, y luego de 90 volts por 30 minutos.

Tinción del gel

Luego de terminar el práctico, los geles fueron teñidos por las asistentes técnicas. El
objetivo de esto era, obtener unas bandas de color azul intenso en los sitios del gel
donde se encuentra la proteína.
Resultados

Tabla 1

Soluciones recta estándar Método de Bradford

Tubo Concentración Volumen Volumen Volumen Volumen Abs a 595 nm

(mg/ml) de BSA de Agua de sol Reactivo de
1mg/ml destilada estándar Bradford

Blanco 0 0 500 μl 100 μl 5 ml 0

1 0,1 50 μl 450 μl 100 μl 5 ml 0,090

2 0,2 100 μl 400 μl 100 μl 5 ml 0,112

3 0,3 150 μl 350 μl 100 μl 5 ml 0,167

4 0,4 200 μl 300 μl 100 μl 5 ml 0,214

5 0,5 250 μl 250 μl 100 μl 5 ml 0,243

6 0,6 300 μl 200 μl 100 μl 5 ml 0,304

7 0,7 350 μl 150 μl 100 μl 5 ml 0,338

8 0,8 400 μl 100 μl 100 μl 5 ml 0,440

Mesón 1

Imagen 1 (Solo se observa una muestra (muestra 1a 30mm))

Mesón 3

Imagen 2 (se observan dos muestras (Muestra 1 b 36 mm) (Muestra 2b 29mm)

 Mesón 2

Imagen 3 (Solo se observa una muestra (muestra 1c 25mm))

El gel tiene un largo de corrida de 60 mm.

Para poder calcular su peso molecular fue necesario crear la curva estándar del estándar de
peso molecular con los siguientes datos.
 Tabla 2

PM (kDa) Log PM Distancia Distancia total Distancia

(mm) (mm) Relativa
190 2,28 30 60 0,55
135 2,13 34 60 0,57
100 2 39 60 0,65
75 1,88 41 60 0,68
58 1,76 50 60 0,83
46 1,66 55 60 0,92

Gráfico 2 (Log PM v/s Distancia relativa)

Para calcular los pesos moleculares fue necesario calcular la distancia relativa de las
muestras encerradas en un círculo rojo como muestran en las imágenes

Distancia recorrida
Rf =
Distancia Total

Y =−1,5005∗X + 3,0021
 LogPM =−1,5005∗Rf +3,0021.

Distancia recorrida por la muestra 1a del mesón 1: 30mm

30
Rf = =0,5
60

- Peso molecular

LogPM =−1,5005∗0,5+3,0021

2,252
PM =10

PM =178,65 kDa

Distancia recorrida por la muestra 1b del mesón 2: 36mm

36
Rf = =0,6
60

- Peso molecular

LogPM =−1,5005∗0,6+3,0021
2,1
PM =10

PM =126,42 kDa

Distancia recorrida por la muestra 2b del mesón 2: 29mm

29
Rf = =0,48
60
 - Peso molecular

LogPM =−1,5005∗0,48+3,0021

2,28
PM =10

PM =191,36 kDa

Distancia recorrida por la muestra 1c del mesón 3: 25mm

25
Rf = =0,42
60

- Peso molecular

LogPM =−1,5005∗0,42+ 3,0021

2,37
PM =10

PM =235,45 kDa

Discusión de los resultados

 En esta experiencia cada mesón utilizó una muestra de
proteínas vegetales distintas a las cuales se le calcularon
los pesos moleculares de cada muestra en un punto referido (Círculo rojo). Todas
las muestras marcaron una franja de color azul indicando presencia de distintas
proteinas y solo se seleccciono el punto de mayor concentracion de estas
Con esta experiencia se pudo analizar y relacionar que a medida que más abajo se
encuentren bandas en el gel de las muestras, más pequeña es la proteína y más
bajo es su peso molecular, por lo que es directamente proporcional.
Cabe señalar que en las imágenes hay muchos espacios vacíos, a estos espacios
se les había agregado las muestras de proteínas, pero al parecer por el largo tiempo
de espera a la hora de ver resultados estos quedaron dañados y hubo pérdida de
información.

Conclusión

Se logró comprender y llevar a cabo el procedimiento práctico de la

Electroforesis de manera exitosa, obteniendo así bandas de proteínas que
pueden ser comparadas y por consecuencia de esto es posible estimar
características de estás.
Las bandas de proteínas variaron según su fuente de origen en este caso las
proteínas se extrajeron de legumbres

Bibliografía

Rojas, A. C. (11 de diciembre de 2020). Conogasi. Obtenido de

https://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-poliacrilamida-para-proteinas/