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550 COLLIER: HEMOGLOBINA ECan. MA J.

[Junho de 1944, vol. 50

acoplada a 0,5 ml. amostras do sangue diluído ,

A PADRONIZAÇÃO DO SANGUE
DETERMINAÇÕES DE HZPMOGLOBINA *
Por H. Bruce Collier, MA., Ph.D.
Halifax
A inadequação dos comumente empregados _
métodos para a determinação da
hemoglobina sangüínea levou recentemente
vários pesquisadores a propor métodos
aprimorados e a buscar um padrão absoluto
conveniente para essas determinações . _ _ _
_ Mington1 recomendou o método
sobre puro hwmochromogen pyridine de Roets ,
usando o método de cinza úmida de Myers e Eddy.4
Os padrões de ferro puro (30 jug . Fe) para
comparação colorimétrica foram sempre preparados
na mesma quantidade de ácido sulfúrico que foi
usado na digestão . Como Beruhart e Skeggs7
descobriram que a hemoglobina pura contém
0,340% de ferro , esse valor foi usado para calcular
as concentrações de hemoglobina .
TABELA I.
COMPARAÇÃO DAS TERMINAÇÕES DE HmMOGLoBIN DTi
Hb. gm. por 100 ml.
Método
Humano Cachorro

2 baseado em hmemin como padrão . Clegg e

King" propuseram um método de hematina Fe. mercaptoacetato 16,9
0,164 P*iina himocromogênio. 166 16,7
alcalina , também baseado em heme puro . Hamatina acalina (não corrigida) .. 19,9 20,5

Vários pesquisadores , incluindoMyers e Eddy,'

e Karr e Clark , 5 confiaram nas determinações O ferro sanguíneo costuma ser estimado pelo
de ferro total , que concordam com as estimativas com basedo
método natiocianato
capacidade de oxigênio
, mas .
isso é muito
Um relatório recente ao Medical Research insatisfatório para um trabalho preciso (Hofifma8).
Council8 recomenda, como padrão , a Bons resultados foram obtidos com o método
dosagem de ferro em eritrócitos lavados . do acetato de mercapto , seguindo o
A determinação da hemoglobina sanguínea procedimento de K6oenig e Johnson.9 Este
envolve : (1) um método conveniente e preciso reagente tem a vantagem de baixo custo ,
para medições de rotina ; (2) um padrão absoluto relativa ausência de interferência e atua como seu próprio a
para calibrar as medições. Nossa experiência O método foi aplicado a uma amostra de heme puro
com vários procedimentos, decorrente de um gentilmente fornecida pelo Dr. E. J. King, e deu o
estudo da anemia fenotiazínica , é delineada mesmo valor, dentro de 0,5%, conforme relatado
nos experimentos a seguir . por ele para a titulação de sulfato titânico de
Delory10 . O mercaptoacetato é um pouco menos
EXPERIMENTAL sensível do que a o-fenantrolina ou o dipiridil,
As determinações foram realizadas em fornecendo cerca de dois terços da intensidade da
sangue humano e canino . Em cada caso , o cor em nossas condições. Verificou - se que o uso
sangue venoso foi oxalado e então diluído de fenantrolina na determinação do ferro no sangue
1:10 com água, a fim de facilitar a amostragem deu resultados cerca de 2% a menos , enquanto o
precisa ; todas as análises foram realizadas dipiridil deu, em um caso, um valor 10% a mais .
nesta solução resultante de hemoglobina , Preparação de hmmin. - Htemin pura foi
usando a mesma pipeta . As medidas preparada a partir de eritrócitos de cães lavados
colorimétricas um
foram feitas em
colorímetro fotoelétrico pelo método de Delory.10 O teor de ferro dos
Lumetron modelo 401 , utilizando tubos de ensaio cristais foi encontrado, pelo método colorimétrico
de 1/2 polegada e filtro verde B530; os valores descrito acima, em 8,27 % . A recristalização
de transmissão foram convertidos em extinções pelo método de Delory resultou em um produto
pela fórmula E = - log T. Os resultados relatados contendo a quantidade teórica de ferro, 8,57%b .
são médias- de medições repetidas com um desvio Este heme puro foi usado como padrão absoluto
médio inferior a 1 % . Os resultados obtidos pelos nos métodos de hemocromógeno de piridina e
vários métodos são ilustrados na Tabela I , dando linha alcalina de hematina descritos abaixo . Os
valores para uma amostra de sangue humano e cristais de hemina fornecidos pelo Dr. King
uma de sangue canino . (contendo 8,45 % de ferro ) também foram usados
Ferro. determinações.- Ferro total foi estimado- nesses dois métodos e deram valores idênticos , dentro de 100%
Método do huemocromogênio da piridina . - O
* Do Departamento de Bioquímica da Universidade de método de Roets2 foi modificado da seguinte forma.
Dalhousie , com assistência financeira do Conselho
Nacional de Pesquisa do Canadá. Para cerca de 7 ml. de N/10 NaOH em 10 ml . cilindro
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Pode... M. A. J. 1 de
junho de 1944, vol. 50J
COLUER: ---HMOGLOBINA
foi adicionado 0,20 ml. de sangue diluído e a este
foram adicionados 2 ml. de 'iridina. Verificou - se
que esperar 30 min por utes após a mistura é
necessário para o desenvolvimento total da cor ;
em seguida, 5 a 10 mg.- de hidrossulfito de sódio
foi adicionado, a solução foi diluída para 10 ml.
com NaOH e a intensidade da cor vermelha foi medida . _Azul, B420.... 0,758 0,513 Verde,
Como padrão absoluto , o heme puro foi
dissolvido em N/10 NaOH na concentração de
65 mg.
100porml., equivalente a 0,001 M. Desta solução Visual, (0,10 mM)
estoque , 0,20 ml . foi tratado como acima.
Conforme apontado por Drabkin e Austin ,
1 " os espectros de absorção dos
hemocromógenos de piridina reduzida da
hemoglobina e da hwmin não são
idênticos . _ _ _ _ _ _ _ _ _
erro.
Método da hematina alcalina . O procedimento e no vermelho aumentou acentuadamente .
de Clegg e King3 foi seguido. Do diluído até
N/10 , 0,5 ml. foi feito 10,0 ml . _ em sangue
NaOH e este foi aquecido 5 minutos em banho
- maria fervente ; a solução foi então resfriada
e lida no colorímetro . Como padrão ,. 0,5 ml.
da solução estoque de htemina foi diluída para
10 ml. com o NaOH. Conforme apontado por
Clegg e King , a intensidade da cor da hmatina
alcalina da hemoglobina é apreciavelmente
maior do que a derivada da heemina pura .
Eles conseqüentemente adicionaram uma
correção de 30 % à intensidade de cor
observada da hematina alcalina do hamin .
Para comparar os espectros de absorção,
soluções de hammatina alcalina foram
preparadas a partir de sangue humano e de
hemina, em concentração equivalente ( baseada pigmento ideal para a determinação da concentração total ".
em ferro) de 0,050 mM por litro . As extinções
das duas soluções foram medidas com quatro
ifiters no colorímetro fotoelétrico , e também
com os oito filtros espectrais Ilford em um
colorímetro visual contra um disco cinza de densidade
Os resultados são registrados na Tabela II e
confirmam a observação de Clegg e King de que
os dois espectros divergem consideravelmente .
obtiveram Praticamente a proporção que
colorímetrofoi observado o mesmo filtro no
visual . com o verde Com o colorímetro
fotoelétrico , porém, a proporção no verde era de
apenas 1,22 ; este valor foi obtido repetidamente
com sangue humano
( Hmmin e canino .
do Dr. proporções de 1,21 plotada contra a concentração desviou -se ligeiramente de uma re
deu
King e 1,34 nos colorímetros fotoelétricos e
visuais , respectivamente.) Deve - se observar
ainda que o espectro de absorção do heama
estanho alcalino muda rapidamente , mesmo quando Um
551
TABELA II.
ABSORÇÃO DE LUZ DE SOLUÇÕES ALCALINAS DE HAIMATIN
Extinção
Filtro
Razão, Hb. Hemin Hb./hzmin :
Fotoelétrico, (0,05 mM)
1,48
B530........... 0,362 0,296 Amarelo, 1,22
B590........ 0,294 0,250 Vermelho, 1,17
B660 0,128 0,090
............. 1,42
Violeta, 450 mU........ 1,16 0,62 1,87
0,52 1,62
Azul, 470 mg..... .... 0,84 Azul
esverdeado, 490 m,U.. . . 0,70 0,51 1,37
Verde, 520 mA,U.. .. . . 0,60 0,44
0,34
1,36
1,50
Verde-amarelo, 550 mU...
0,51 Amarelo, 575 m,........ 0,48 0,32 1,50
mantido no escuro . A extinção no verde
permaneceu constante, mas a absorção no azul
É claro que este método não é adequado para
a padronização absoluta das determinações de
hemoglobina , uma vez que a proporção e,
portanto , o fator de correção dependerá das
características espectrais da fonte de luz , do
filtro e da fotocélula ou outro dispositivo de detecção .
Determinações de rotina. -Tanto o método do
ferro como o da piridina são muito complicados
para as determinações de rotina da hemoglobina .
Verificou - se que o método de hematina alcalina
de Clegg e King fornece resultados consistentes ,
se padronizados por um método absoluto , mas a
cor marrom não é ideal para comparação
colorimétrica . Preferimos adotar o método da
cianometamoglobina , conforme recomendado por
Drabkin e Austin,12 que afirmam : " MHbCN é um
O procedimento é essencialmente o mesmo
descrito recentemente por Sunderman.l . _ Em
cerca de 9 ml. de água em 10 ml . cilindro ou
balão volumétrico é pipetado 0,02 ml. de sangue;
óptica
a isto 0,74 -se
adiciona . 1 gota de ferricianeto de
potássio a 5% e cerca de 1 mg. de KCN sólido
(estimado na ponta de uma espátula ). A solução
é preparada para 10 ml , misturada e lida
imediatamente no colorímetro com filtro verde . _
O método é simples, rápido e relativamente
seguro. Com uma amostra de sangue de
concentração conhecida de Hb é construída uma
curva de calibração . Descobrimos que a extinção
Antes que o colorímetro fotoelétrico se tornasse
disponível, um colorímetro visual era usado como
fotômetro , conforme descrito por Sunderman.18
disco cinza
a solução é neutro Ilford de densidade óptica 0,74
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552 OoT4u: g$EQ0WIB4 N Pode. M. A. J.

[~~~~~~~~~~~~~~~~Junho de 1944. vol.560
1

foi colocado no copo esquerdo , com um filtro A padronização absoluta desses procedimentos
espectral verde -amarelo Uford (550 mu) na ocular . pode ser realizada pelo método do ferro ou
Nessas condições, o sangue contém 15 g . Hb por da piridina , conforme descrito acima .
100 ml., diluído 1:200, deu uma leitura de cerca de O método de Clegg e King para padronizar a
1,8 cm., ou seja, a extinção (1 cm de profundidade) hematina alcalina em comparação com o hememin
foi de 0,74/1,8 = 0,41. puro mostrou - se pouco confiável , uma vez que os
Este método cyanmetheemoglobin , embora espectros de absorção das hematinas alcalinas da Hb
eminentemente . adequado, para determinações de e da hememina divergem tão acentuadamente.
hemoglobina de rotina , não fornece , é claro, valores Nenhum fator de correção constante , aplicável em
absolutos , a menos que um espectrofotômetro esteja todos os laboratórios, pode ser usado para os valores
disponível para medir coeficientes de extinção absolutos htemin
. , porque a taxa de correção depende da
(Em uma ocasião anterior , uma oportunidade distribuição espectral da luz usada na medição
de usar um Espectrofotômetro Cckman Universal colorimétrica .
para medir o coeficiente de extinção de MHbON em
540 mg deu resultados para a concentração de Hb RESUMO
que foram cerca de 10% muito baixos, em 1. O método da cianometaemoglobina foi
comparação com os valores de ferro . empregado para a determinação rotineira da
Presumivelmente , isso se deve ao fato de que a
concentração de hemoglobina no sangue ( pigmento total ).
banda de 35 miu do instrumento é mais larga que o
2. O método foi calibrado, usando sangue
pico da banda de absorção do MHbCN.)
humano e canino , por determinação de ferro
Para calibração do método MHbCN , o teor total e pelo método de hemocromógeno de
de hemoglobina de várias amostras de sangue piridina contra heemina pura . Os dois métodos
humano e canino foi determinado pelo ferro deram resultados concordantes dentro de lo.
total e pelo método da piridina- hamocromogênio , 3. O método da hematina alcalina foi considerado
conforme descrito acima e ilustrado na Tabela I. inadequado para a determinação da concentração
Os valores médios desses dois métodos foram absoluta de hemoglobina , uma vez que a hmmin pura
usados para obter o fator de calibração para
forneceu um espectro de absorção marcadamente
MHbCN. Por exemplo, a amostra de sangue diferente daquele obtido com o sangue.
humano na Tabela I foi tomada para ter uma
concentração de hemoglobina de 16,5 gm. por 100 ml. REFERÊNCIAS

O fator MHbCN (Hb conc. * . extinção) foi 1. RIMINGTON, C.: Brit. M1. J., 1942, 7 de fevereiro de 177.
de 62,7 . Para o sangue de cachorro , 16,8 2. ROETS, G. C. S.: Onderst. J. Vet. Sc. A'nimae In4,
1940, 14: -451.
gm. Rb por 100 ml., o fator foi de 62,0. 3. CLEGW, J. W. E KING, E. J.: Brit. M.J. , 1942, 19 de
setembro de 329.
4. MYERS, V. C. E EDDY, H. M.: J. Lab. 1939, inJMed.,
DISCUSSÃO 24: 502.
5. KARR, W. G. E CLARK, J. H.: Am. J. CZin. Caminho.,
Os experimentos descritos envolveram quatro Tecnologia Supp., 1941, 5: 127.
6. Anônimo: Brit. M.J. , 1943, 20 de fevereiro de 209.
métodos de determinação da concentração de 7. BERNHART, F. W. E SKEGGS, L.: J. Biol. Chem.,
hemoglobina no sangue : ferro total , hemocromogênio 1943, 147: 19.
8. HOFFMAN, W.S .: Am. J. Clin. Path., 1942, 12: 449.
piridínico, hamatina alcalina e cianometahemoglobina . 9. KOENIG, R. A. E JOHNSON, C. R.: J. Biol. Chem.,
1942, 142: 233.
O método do ferro dá valores absolutos para Hb 10. DELORY, G. E.: Analyst, 1943, 68: 5.
(como somando uma quantidade insignificante de ferro não-Hb ).
11. DRA~KIN, D. L E AUSTIN, J. H.: J. Biol. Chem., 1935,
112: 89.
O método de piridina hwemochromogen também 12. Idem: J. Biol. Chem., 1935, 112: 51.
fornece valores absolutos , quando calibrado contra 13. SUNDERMAN, F. W.: Am. J. Clin. Caminho., Tecnologia. Supp.,
1943, 7: 1. -
hwmin puro como padrão . Esses dois métodos deram
resultados concordantes dentro de lo, valores que
podem , portanto , ser assumidos como essencialmente corretos.
Infelizmente, os procedimentos são muito complicados
Afirma - se oficialmente que um remédio para enjôo
para determinações rotineiras de Rb ; mas eles parecem foi elaborado no Canadá como resultado do trabalho
ser muito adequados para uma padronização precisa . realizado pelo falecido Sir Frederick Banting , Capitão
Tanto o método da hmatina alcalina quanto Cirurgião C. H. Best , Marinha Real Canadense e Dr. _ _ _
o da cianometiemoglobina são úteis para a Wilder Penfield, Instituto Neurológico de Montreal . O
remédio, que impediu experimentalmente o enjôo em
determinação de rotina do pigmento total . 'O cerca de 75% das pessoas normalmente suscetíveis a
último método é preferido para 'simplesidade ele, é administrado em forma de cápsula. -J . Roy. Inst.
e rapidez, maior intensidade e estabilidade da corBar.
. Health 4 Hyg., 1943, 6: 303.