NORME ISO

INTERNATIONALE 8968-1
FIL
20-1
Deuxième édition
2014-02-01

Lait et produits laitiers —

Détermination de la teneur en azote —
Partie 1:
Méthode Kjeldahl et calcul de la
teneur en protéines brutes
Milk and milk products — Determination of nitrogen content —
Part 1: Kjeldahl principle and crude protein calculation

Numéros de référence
ISO 8968-1:2014(F)
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Sommaire Page

Avant-propos.................................................................................................................................................................................................................................v
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 1
4 Principe........................................................................................................................................................................................................................... 2
5 Réactifs............................................................................................................................................................................................................................ 2
6 Appareillage............................................................................................................................................................................................................... 3
7 Échantillonnage...................................................................................................................................................................................................... 5
8 Préparation de l’échantillon pour essai........................................................................................................................................ 5
8.1 Lait liquide entier, demi-écrémé ou écrémé................................................................................................................... 5
8.2 Fromage à pâte dure, demi-dure ou molle....................................................................................................................... 5
8.3 Lait en poudre et produits laitiers en poudre............................................................................................................... 6
9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6
9.1 Méthode classique................................................................................................................................................................................ 6
9.2 Méthode de minéralisation en bloc........................................................................................................................................ 8
9.3 Essai à blanc............................................................................................................................................................................................ 10
9.4 Essais de récupération................................................................................................................................................................... 11
10 Calcul et expression des résultats....................................................................................................................................................12
10.1 Calcul............................................................................................................................................................................................................. 12
10.2 Expression des résultats............................................................................................................................................................... 13
11 Fidélité.......................................................................................................................................................................................................................... 13
11.1 Essais interlaboratoires................................................................................................................................................................. 13
11.2 Lait liquide, lait entier et lait écrémé................................................................................................................................. 14
11.3 Fromage à pâte dure, demi-dure ou molle.................................................................................................................... 14
11.4 Lait en poudre et produits laitiers en poudre............................................................................................................ 15
12 Rapport d’essai.....................................................................................................................................................................................................15
Annexe A
(informative)

Prise d’essai.............................................................................................................................................................................................................16
Annexe B
(informative)

Essai interlaboratoires.................................................................................................................................................................................17
Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 19

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Aliments et produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers ainsi que la Fédération internationale du lait (FIL) et le présent
document est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Cette deuxième édition de l’ISO 8968-1|FIL 20-1 annule et remplace la première édition de
l’ISO  8968-1|FIL  20‑1:2001, de l’ISO  8968-2:FIL  20‑2:2001, de l’ISO  5549:1978|FIL  92:1979, et de
l’ISO/TS 17837|FIL/RM 25:2008 qui ont fait l’objet d’une révision technique.

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La Fédération internationale du lait (FIL) est une fédération mondiale du secteur laitier ayant un
comité national dans chaque état membre. Chaque comité national a le droit de faire partie des comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO pour
l’élaboration de méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les équipes d’action et les comités permanents
sont soumis aux comités nationaux pour vote. La publication comme Norme internationale requiert
l’approbation de 50 % au moins des comités nationaux de la FIL votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales utilisées dans le présent document sont des informations données par
souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne saurait constituer un engagement.
L’ISO 8968-1|FIL 20‑1 a été élaborée par la Fédération internationale du lait et par le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec l’AOAC.
Elle est publiée conjointement par l’ISO et la FIL.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de travail mixte ISO/FIL, Composés azotés, du comité
permanent chargé des Méthodes d’analyse de la composition (SCAMC), sous la conduite de ses chefs de
projet : M. R. Johnson (NZ), M. J. Romero (US), Dr. Barbano (US), Dr. Orlandini (IT), et M. Psathas (CY).
Cette deuxième édition de l’ISO 8968-1|FIL 20-1 annule et remplace la première édition de
l’ISO  8968-1|FIL  20‑1:2001, de l’ISO  8968-2:FIL  20‑2:2001, de l’ISO  5549:1978|FIL  92:1979, et de
l’ISO/TS 17837|FIL/RM 25:2008, qui ont fait l’objet d’une révision technique.

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Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en

azote —
Partie 1:
Méthode Kjeldahl et calcul de la teneur en protéines brutes
ATTENTION — La présente Norme internationale peut impliquer l’utilisation de produits
et la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillages à caractère dangereux. La
présente Norme internationale ne prétend pas aborder tous les risques liés à son utilisation.
Il incombe à l’utilisateur de la présente Norme internationale d’établir, avant de l’utiliser, des
pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer l’applicabilité des restrictions
réglementaires locales.

1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en azote et de
calcul de la teneur en protéines brutes du lait et des produits laitiers selon la méthode Kjeldahl, à l’aide
des méthodes de minéralisation classiques et en bloc.
Les méthodes sont applicables:
— au lait de vache liquide (entier, demi-écrémé ou écrémé), au lait entier de chèvre et de brebis liquides;
— aux fromages à pâte dure, demi-dure ou molle;
— au lait en poudre et aux produits laitiers en poudre, notamment les laits infantiles , aux concentrés
de protéines de lait, aux concentrés de protéines de lactosérum, aux caséines et aux caséinates.
Elles ne sont pas applicables aux échantillons contenant du caséinate d’ammonium.
NOTE Des résultats erronés seront obtenus pour les protéines brutes si des sources d’azote autres que le lait
sont présentes dans les produits spécifiés dans la présente Norme internationale.

2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 385, Verrerie de laboratoire — Burettes
ISO 8655-3, Appareils volumétriques à piston — Partie 3: Burettes à piston

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
teneur en azote
concentration en azote (M/M) déterminée par le mode opératoire spécifié
Note 1 à l’article: Elle est exprimée en pourcentage M/M.

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3.2
teneur en protéines brutes
concentration en protéines brutes (M/M) calculée conformément aux spécifications
Note 1 à l’article: Elle est exprimée en pourcentage M/M.

4 Principe
Minéralisation d’une prise d’essai avec un mélange d’acide sulfurique concentré et de sulfate de
potassium, en utilisant du sulfate de cuivre (II) comme catalyseur pour convertir ainsi l’azote organique
présent en sulfate d’ammonium. La fonction du sulfate de potassium est d’élever le point d’ébullition de
l’acide sulfurique et de permettre d’obtenir un mélange oxydant plus fort pour la minéralisation. Addition
d’hydroxyde de sodium excédentaire au minéralisat refroidi pour libérer de l’ammoniac. Distillation à
la vapeur de l’ammoniac libéré dans un excédent de solution d’acide borique, puis titration en utilisant
une solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique. Calcul de la teneur en azote à partir de la
quantité d’ammoniac produite.

5 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de
l’eau distillée ou déminéralisée, ou de l’eau de pureté équivalente.
NOTE Les solutions spécifiées dans le présent mode opératoire peuvent être différentes de celles requises
pour le fonctionnement des dispositifs de titration automatiques. L’objectif est de les présenter, mais il incombe à
l’opérateur de respecter les instructions du fabricant de l’équipement.

5.1 Sulfate de potassium (K2SO4), exempt d’azote.

5.2 Solution de sulfate de cuivre (II) pentahydraté, c(CuSO4.5H2O) = 5,0 g/100 ml.

Dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté dans de l’eau.
Compléter au volume avec de l’eau, puis mélanger.

5.3 Acide sulfurique (H2SO4), ayant une concentration (M/M) comprise entre 95 % et 98 %, sans
azote (ρ20 = environ 1,84 g/ml).

5.4 Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH), exempte d’azote, contenant 50  g d’hydroxyde de
sodium pour 100 g.

Avec les systèmes de distillation automatiques, d’autres concentrations (M/M) d’hydroxyde de sodium
peuvent être utilisées à condition qu’un excédent d’hydroxyde de sodium soit ajouté au mélange de
distillation, par exemple une concentration (M/M) de 40 % de solution d’hydroxyde de sodium peut être
utilisée à la place d’une concentration (M/M) de 50 %, dans le cas où l’on rencontre des problèmes de
colmatage. Il convient de tenir compte du volume total de cette solution d’hydroxyde de sodium pour
maintenir les volumes de distillation à un niveau approprié.

5.5 Solution d’indicateur

Dans une fiole jaugée de 50 ml à un repère (6.16), dissoudre 0,1 g de rouge de méthyle dans de l’éthanol
à 95 % (rapport de volume). Diluer à 50 ml avec de l’éthanol et mélanger. Dans une fiole jaugée de 250 ml
à un repère (6.16), dissoudre 0,5 g de vert de bromocrésol dans de l’éthanol à 95 % (rapport de volume).
Diluer à 250 ml avec de l’éthanol et mélanger. Mélanger un volume de la solution de rouge de méthyle
avec cinq volumes de la solution de vert de bromocrésol ou combiner et mélanger l’ensemble des deux
solutions.

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5.6 Solution d’acide borique, c(H3BO3) = 40,0 g/l.

Dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.16), dissoudre 40,0 g d’acide borique (H3BO3) dans 1 l d’eau chaude.
Laisser refroidir la fiole et son contenu à 20  °C. Compléter au volume avec de l’eau, ajouter 3  ml de
la solution d’indicateur (5.5) et mélanger. Conserver la solution, qui doit être orange clair, dans une
bouteille en verre de borosilicate. Durant le stockage, protéger la solution de la lumière et des sources
de vapeur d’ammoniac.
Avec les systèmes de distillation automatiques, d’autres concentrations en acide borique peuvent être
utilisées si elles ont été validées.
En cas de titration avec point final en pH, l’ajout de la solution d’indicateur à la solution d’acide borique
n’est pas obligatoire. D’autre part, le changement de couleur peut aussi servir à contrôler le mode
opératoire de titration.

5.7 Solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique, c(HCl) = (0,1 ± 0,0005) mol/l.

Il est recommandé d’acheter ce matériau déjà ajusté à cette concentration et répondant à ces spécifications.
Bien souvent, les erreurs systématiques (qui peuvent être évitées) introduites par un analyste qui dilue
un acide concentré, puis détermine la molarité de l’acide, peuvent diminuer la reproductibilité de la
méthode. Il convient que l’analyste n’utilise pas de solution de titration de concentration supérieure
à 0,1 mol/l car cela réduirait le volume total de titration par échantillon, et l’incertitude de lecture de
la burette représenterait un pourcentage plus élevé de la valeur. Cela aura un impact négatif sur les
performances de répétabilité et de reproductibilité de la méthode.
Si de l’acide sulfurique est utilisé à la place de l’acide chlorhydrique, il convient que la solution présente
une concentration de 0,05 ± 0,0003 mol/l.

5.8 Sulfate d’ammonium [(NH4)2SO4], ayant une pureté minimale de 99,9 % (concentration (M/M))
sur la matière sèche.

Immédiatement avant l’emploi, sécher le sulfate d’ammonium à 102  °C  ±  2  °C pendant au moins 2  h.
Laisser refroidir à température ambiante dans un dessiccateur.

5.9 Tryptophane (C11H12N2O2) ou chlorhydrate de lysine (C6H15ClN2O2), ayant une pureté

minimale de 99 % (concentration (M/M)).

Ne pas sécher ces réactifs dans une étuve avant l’emploi.

5.10 Saccharose, dont la concentration (M/M) en azote est inférieure à 0,002 %.

Ne pas sécher le saccharose avant l’emploi.

6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Bain d’eau, pouvant être maintenu à une température comprise entre 38 °C et 40 °C.

6.2 Balance analytique, précise à 0,1 mg près.

6.3 Burette ou pipette automatique, permettant d’obtenir des doses de 1,0 ml de solution de sulfate
de cuivre (5.2).

6.4 Éprouvettes graduées, d’une capacité de 25 ml, 50 ml, 100 ml et 500 ml.

6.5 Fioles coniques d'une capacité de 500 ml.


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6.6 Burette automatique, de capacité appropriée (par exemple 20 ml), d’une résolution d’au moins
0,004 ml, conforme aux exigences de l’ISO 8655-3. Il est également possible d’utiliser une burette d’une
capacité de 50 ml, graduée au moins tous les 0,1 ml, conforme aux exigences de l’ISO 385, classe A, pour
l’analyse du lait.
NOTE Les burettes manuelles n’ont pas une résolution suffisante pour atteindre le nombre requis de chiffres
significatifs pour tous les autres produits.

6.7 Broyeur

6.8 Ballons de minéralisation (Kjeldahl), d’une capacité de 500 ml ou 800 ml. Adaptés au système de
minéralisation à utiliser et conformes aux spécifications du fabricant de l’appareil de minéralisation (6.10
ou 6.11).

6.9 Corps facilitant l’ébullition, par exemple pièces de porcelaine dures ou granules d’alundon
amphotères (carbarundon) lisses, d’une pureté élevée et d’une taille de mailles de 10. Ne pas réutiliser
les corps facilitant l’ébullition.
NOTE Des billes de verre d’environ 5 mm de diamètre peuvent également être utilisées, mais celles-ci peuvent
être moins efficaces pour l’ébullition que les granules d’alundon, et des problèmes de formation de mousse pendant
la minéralisation peuvent davantage se poser avec les billes de verre.

6.10 Appareil de minéralisation, pour maintenir les ballons de minéralisation (6.8) en position inclinée
(environ 45°), pourvu de résistances électriques ou de becs à gaz ne chauffant pas les ballons au-delà du
niveau de leur contenu, ainsi que d’un système d’évacuation des fumées.

Il convient que la source chauffante soit réglable pour permettre de contrôler le réglage maximal de
l’élément chauffant à appliquer durant la minéralisation. Préchauffer la source chauffante au réglage
de l’élément chauffant à évaluer. La durée de préchauffage doit être de 10 min dans le cas d’un bec à
gaz et de 30 min dans le cas d’un élément chauffant électrique. Déterminer, pour chacun des éléments
chauffants, le réglage qui permet de porter à ébullition 250 ml d’eau et 5 à 10 corps facilitant l’ébullition
(en partant d’une température initiale de 25 °C) en 5 min à 6 min. Ce réglage correspond au réglage
maximal de l’élément chauffant à appliquer durant la minéralisation.

6.11 Appareil de distillation (méthode classique), en verre de borosilicate ou autre matière appropriée,
pouvant être équipé d’un ballon de minéralisation (6.8), se composant d’une tête antiprojections
efficace, relié à un condenseur efficace avec tube intérieur droit et un tube d’écoulement fixé à son
extrémité inférieure. Le tube de connexion et le(s) bouchon(s) doivent être étanches et de préférence en
polychloroprène.
NOTE L’appareil de distillation mentionné ci-dessus peut être remplacé par le montage de distillation de
Parnas-Wagner1)) complet ou par un autre équipement approprié.

6.12 Bloc de minéralisation (méthode de minéralisation en bloc), bloc en alliage d’aluminium ou

bloc équivalent, équipé d’un régulateur de température et d’un dispositif de mesure de la température du
bloc.

6.13 Tubes de minéralisation (méthode de minéralisation en bloc), d’une capacité de 250 ml,

compatibles avec le bloc de minéralisation (6.12).

6.14 Tubulure d’échappement (méthode de minéralisation en bloc), compatible avec les tubes de
minéralisation (6.13).

1) Parnas-Wagner est un exemple de montage de verrerie disponible dans le commerce, utilisé pour la distillation
Kjeldahl. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne saurait constituer
un engagement de l’ISO ou de la FIL à l' égard de ce produit.

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6.15 Séparateur centrifuge ou pompe ou aspirateur à filtre (méthode de minéralisation en bloc),

constitué d’un matériau résistant à l’acide, utilisable avec l’alimentation en eau principale.

6.16 Fioles jaugées, à un repère, d’une capacité de 50 ml, 250 ml et 1 000 ml.

6.17 Unité de distillation (méthode de minéralisation en bloc), permettant une distillation à la

vapeur, manuelle ou semi-automatique, compatible avec les tubes de minéralisation de 250 ml (6.13) et
les fioles coniques de 500 ml (6.5).

6.18 Dispositif de titration automatique pourvu d’un pH-mètre

Il convient que le pH-mètre soit correctement étalonné dans la gamme de pH 4 à pH 7 selon les méthodes
normales d’étalonnage du pH en laboratoire. La burette du dispositif de titration automatique doit être
conforme aux exigences énoncées en 6.6.

6.19 Spatule ou dispositif de transfert approprié

6.20 Papier filtre, exempt d’azote, de dimensions et de porosité appropriées pour contenir la prise
d’essai de fromage.

6.21 Agitateur magnétique éclairé.

7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707|FIL 50.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif et n’ayant pas été endommagé ou
modifié durant le transport ou le stockage.

8 Préparation de l’échantillon pour essai

8.1 Lait liquide entier, demi-écrémé ou écrémé

Placer l’échantillon pour essai dans le bain d’eau (6.1) réglé entre 38  °C et 40  °C. Bien mélanger en
retournant sans formation de mousse ni barattage. Une fois que l’échantillon est bien mélangé, le laisser
refroidir à température ambiante.
Procéder comme indiqué en 9.1 ou 9.2.

8.2 Fromage à pâte dure, demi-dure ou molle

Enlever la croûte, la graisse ou la couche de surface moisie du fromage, de façon à fournir un échantillon
pour essai représentatif du fromage couramment consommé.
Broyer l’échantillon pour essai à l’aide d’un dispositif approprié (6.7). Mélanger rapidement toute la
masse et broyer à nouveau la masse rapidement, de préférence. Après avoir broyé l’échantillon pour
essai, l’analyser dès que possible.
Avec la spatule (6.19), peser la quantité requise (Tableau A.1) de fromage broyé préparé sur un papier
filtre taré et préalablement plié (6.20). Enrober le fromage dans le papier filtre et déposer le papier filtre

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contenant le fromage au fond d’un ballon de minéralisation (6.8) ou d’un tube de digestion (6.13) comme
indiqué en 9.1.1 ou 9.2.1.
NOTE L’utilisation d’un papier filtre peut favoriser la formation de mousse dans les systèmes de minéralisation
en bloc. Pour éviter ce phénomène, le papier filtre peut, lors de l’utilisation de la méthode de minéralisation en
bloc (9.2), ne pas être utilisé en pesant l’échantillon dans un récipient approprié, en pesant ensuite le fromage et le
récipient en transférant le fromage dans le récipient de minéralisation, et en pesant à nouveau le récipient à vide.
On déterminera ainsi la masse de l’échantillon en soustrayant la masse du récipient à vide de la masse du fromage
et du récipient.

8.3 Lait en poudre et produits laitiers en poudre

Laisser l’échantillon pour essai atteindre une température comprise entre 20  °C et 25  °C avant de le
transvaser dans un récipient d’un volume interne environ égal au double du volume de l’échantillon
pour essai. Fermer immédiatement le récipient pour éviter de modifier la teneur en eau de l’échantillon.
Mélanger vigoureusement l’échantillon en faisant tourner et en retournant plusieurs fois le récipient.
Procéder comme indiqué en 9.1 ou 9.2.

9 Mode opératoire

9.1 Méthode classique

9.1.1 Prise d’essai et prétraitement

Dans un ballon de minéralisation (6.8) propre et sec, introduire 5 à 10 corps facilitant l’ébullition (6.9),
15,0  g de sulfate de potassium (5.1), 1,0 ml de solution de sulfate de cuivre (II) (5.2), la quantité de
l’échantillon pour essai préparé (8.1, 8.2 or 8.3) comme indiqué dans le Tableau A.1, pesé à 0,1 mg près,
et 25 ml d’acide sulfurique (5.3). À cet effet, utiliser l’acide sulfurique pour entraîner tout résidu de la
solution de sulfate de cuivre (II), du sulfate de potassium ou de la prise d’essai restant sur le col du
ballon. Mélanger doucement le contenu du ballon de minéralisation.
Des comprimés disponibles dans le commerce contenant, par exemple, 15 g de sulfate de potassium et
0,05 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté, peuvent être utilisés comme alternative aux dispositions
des paragraphes 5.1 et 5.2, à condition que :
a) les comprimés contiennent une quantité de sulfate de potassium telle que la quantité requise peut
être distribuée en utilisant un nombre entier de comprimés entiers permettant de maintenir un
rapport sel/acide (5.3) à un niveau similaire. Par exemple, trois comprimés contenant chacun 5 g de
sulfate de potassium peuvent être utilisés avec 20 ml d’acide sulfurique (5.3) et
b) les comprimés ne contiennent pas de sels de métaux toxiques tels que le sélénium ou le mercure.

9.1.2 Détermination

9.1.2.1 Minéralisation

Brancher le système d’évacuation des fumées de l’appareil de minéralisation (6.10) avant de commencer la
minéralisation. Chauffer le ballon de minéralisation et son contenu (9.1.1) sur l’appareil de minéralisation
en réglant l’élément chauffant sur une température suffisamment basse pour que le minéralisat ne
déborde pas en moussant par le col du ballon de minéralisation. Effectuer la minéralisation à ce réglage
de l’élément chauffant jusqu’à ce que de la fumée blanche apparaisse dans le ballon au bout d’environ
20 min. Augmenter le réglage de l’élément chauffant jusqu’à une position correspondant à la moitié du
réglage maximal déterminé en 6.10 et continuer le chauffage pendant 15 min. Au terme de la période de
15 min, augmenter le chauffage jusqu’au réglage maximal déterminé en 6.10. Une fois que le minéralisat
s’est éclairci (il devient transparent avec une coloration bleu clair à vert), continuer à faire bouillir le
contenu pendant 1 h à 2,5 h au réglage maximal. Si le liquide transparent ne forme pas de bulles visibles

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à la surface du liquide chaud, alors il se peut que la température du dispositif de chauffage soit trop
faible. La durée totale de la minéralisation sera comprise entre 1,8 h et 3,25 h.
Pour déterminer le temps d’ébullition spécifique nécessaire pour les conditions d’analyse du lait dans
un laboratoire utilisant un appareillage défini, sélectionner un échantillon de lait à haute teneur en
protéines et en matières grasses et déterminer sa teneur en protéines en appliquant différents temps
d’ébullition (de 1 h à 2,5 h) après l’éclaircissement. D’autres produits laitiers nécessitent des échantillons
de composition similaire à celle soumise à essai. Le résultat moyen de la teneur en protéines augmente
avec le temps d’ébullition, se stabilise, puis diminue quand le temps d’ébullition est trop long. Sélectionner
un temps d’ébullition permettant d’obtenir le meilleur rendement en protéines pour le produit soumis
à essai.
Au terme de la minéralisation, le minéralisat doit être transparent et exempt de matière non digérée.
Laisser refroidir le minéralisat à température ambiante dans des flacons ouverts pendant environ
25 min. Si les ballons refroidissent sur le dispositif de chauffage encore chaud, le temps pour atteindre la
température ambiante sera plus long. À la fin de cette période de refroidissement de 25 min, il convient
que le minéralisat refroidi soit complètement liquide ou avec quelques petits cristaux au fond du ballon.
Ne pas laisser le minéralisat non dilué dans les ballons pendant toute une nuit. En effet, le minéralisat non
dilué peut se cristalliser lors de cette période et il sera ensuite très difficile de le remettre en solution.
NOTE La cristallisation excessive au bout de 25 min est le résultat d’une perte d’acide trop importante au
cours de la minéralisation et risque de donner des valeurs d’essai faibles. Cette perte d’acide est causée par une
aspiration excessive des fumées ou par une minéralisation trop longue due à un réglage maximal incorrect du bec.

Ajouter 300  ml d’eau dans les ballons de minéralisation de 500  ml ou 400  ml d’eau dans les ballons
de minéralisation de 800  ml. Pendant l’ajout d’eau, rincer abondamment le col du ballon. Mélanger
complètement le contenu en s’assurant que tous les cristaux qui se sont formés sont dissous. Laisser le
mélange refroidir à température ambiante avant de procéder à la distillation. Les minéralisats dilués
peuvent être conservés dans des fioles bouchées et utilisés ultérieurement pour la distillation.

9.1.2.2 Distillation

Faire circuler l’eau du condenseur pour l’appareil de distillation (6.11). Ajouter 75  ml de solution
d’hydroxyde de sodium (5.4) au minéralisat dilué (9.1.2.1) en versant délicatement la solution dans le
col incliné du ballon de minéralisation, de façon à former une couche au fond du bulbe du ballon. Il
convient que l’interface entre les deux solutions soit nette. Pour réduire le risque de perte d’ammoniac,
relier le ballon de minéralisation à l’appareil de distillation (6.11) immédiatement après avoir ajouté
la solution d’hydroxyde de sodium dans le ballon. La pointe du tube d’écoulement du condenseur est
plongée dans 50 ml de la solution d’acide borique (5.6) contenue dans une fiole conique (6.5). Agiter
vigoureusement par un mouvement de rotation le ballon de minéralisation jusqu’à ce qu’il n’y ait plus
de phases différentes visibles dans le ballon. Mettre en marche le bec du générateur de vapeur à un
réglage suffisamment élevé pour porter le contenu du ballon de minéralisation à ébullition. Continuer la
distillation jusqu’à ce qu’une ébullition irrégulière (ébullition pulsatoire) commence, puis déconnecter
immédiatement le ballon de minéralisation et arrêter le bec. Arrêter l’eau du condenseur. Rincer à l’eau
l’intérieur et l’extérieur de l’extrémité du tube d’écoulement, recueillir l’eau de rinçage dans la fiole
conique et mélanger.
Le débit de distillation doit permettre de recueillir environ 150 ml de distillat avant que ne commence
l’ébullition irrégulière (ébullition pulsatoire). Le volume total contenu dans la fiole conique sera d’environ
200 ml. Si le volume de distillat recueilli est inférieur à 150 ml, il est probable qu’une quantité d’eau
inférieure à 300  ml a été ajoutée pour diluer le minéralisat. L’efficacité du condenseur doit être telle
que la température du contenu de la fiole conique ne dépasse pas 35 °C pendant la distillation en cas
d’utilisation d’un point final de titration colorimétrique.

9.1.2.3 Titration

Titrer le contenu de la fiole conique (9.1.2.2) avec la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique
(5.7) à l’aide d’une burette (6.6). Le point final de titration est atteint à la première trace de rose dans

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le contenu. Estimer la lecture de la burette à 0,05 ml près. Un agitateur magnétique éclairé (6.21) peut
faciliter la visualisation du point final de titration.
Il est également possible de titrer le contenu de la fiole conique (9.1.2.2) avec la solution volumétrique
standard d’acide chlorhydrique (5.7) au moyen d’un dispositif de titration automatique équipé d’un
pH-mètre étalonné (6.18). Le point final de titration est atteint au pH 4,6, qui correspond au point le
plus haut de la courbe de titration (point d’inflexion). Noter la quantité de solution titrée utilisée sur le
dispositif de titration automatique.
NOTE 1 La première trace de rose est observée entre pH 4,6 et pH 4,3 pour l’indicateur et la solution d’acide
borique à 4 % spécifiée dans la présente méthode. En pratique, la variation du pH en fonction de l’ajout d’acide
chlorhydrique à 0,1 N est très rapide dans cette gamme de pH. Il faut environ 0,05 ml d’acide chlorhydrique à 0,1 N
pour changer le pH de 0,3 unité dans la gamme de pH comprise entre 4,6 et 4,3 dans ce système.

NOTE 2 Les statistiques intralaboratoires et interlaboratoires concernant les performances de cette méthode
ont été déterminées à l’aide d’une titration à point final colorimétrique. La comparaison entre les résultats d’essai,
y compris ceux des essais à blanc, obtenus avec un point final de pH 4,6 et les résultats d’une titration à point final
colorimétrique n’a montré aucune différence statistiquement significative.

9.2 Méthode de minéralisation en bloc

9.2.1 Prise d’essai et prétraitement

Dans un tube de minéralisation (6.13) propre et sec, ajouter 12,0 g de sulfate de potassium (5.1), 1,0 ml
de solution de sulfate de cuivre (II) (5.2), la quantité de l’échantillon pour essai préparé (8.1, 8.2 ou
8.3) comme indiqué dans le Tableau A.1, pesé à 0,1 mg près, et 20 ml d’acide sulfurique (5.3). À cet effet,
utiliser l’acide sulfurique pour entraîner tout résidu de la solution de sulfate de cuivre (II), du sulfate de
potassium ou de la prise d’essai restant sur les parois supérieures du tube de minéralisation. Mélanger
doucement le contenu du tube.
NOTE Des volumes d’acide supérieurs à 20  ml dans les systèmes de digestion en bloc créent de graves
problèmes de formation de mousse pendant la minéralisation et donnent des résultats variables. Les utilisateurs
des appareils de minéralisation en bloc doivent noter que le fait de conserver suffisamment d’acide sulfurique
résiduel à la fin de la minéralisation nécessite plus d’attention de la part de l’analyste qu’avec les systèmes
classiques. Une perte d’acide excessive due à une aspiration trop importante des fumées est plus problématique
dans les appareils de minéralisation en bloc que dans les systèmes classiques.

En variante, des comprimés disponibles dans le commerce contenant, par exemple, 3,5 g de sulfate de
potassium et 0,105 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté et 0,105 g de dioxyde de titane, peuvent être
utilisés comme alternative aux dispositions des paragraphes 5.1 et 5.2, à condition que :
a) les comprimés contiennent une quantité de sulfate de potassium telle que la quantité requise peut
être distribuée en utilisant un nombre entier de comprimés entiers permettant de maintenir un
rapport sel/acide (5.3) à un niveau similaire. Par exemple, deux comprimés contenant chacun 3,5 g
de sulfate de potassium peuvent être utilisés avec 12 ml d’acide sulfurique (5.3) et
b) les comprimés ne contiennent pas de sels de métaux toxiques tels que le sélénium ou le mercure.

9.2.2 Détermination

9.2.2.1 Minéralisation

Régler le bloc de minéralisation (6.12) à une température initiale basse pour contrôler la formation
de mousse (entre 180 °C et 230 °C environ). Transférer le tube dans le bloc de minéralisation et placer
la tubulure d’échappement (6.14), elle-même raccordée à un séparateur centrifuge ou à un dispositif
similaire (6.15), au sommet du tube. La vitesse d’aspiration du séparateur centrifuge ou du dispositif
similaire doit être juste suffisante pour éliminer la fumée. Il peut être nécessaire de placer tout l’appareil
de minéralisation sous une hotte aspirante.

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Lorsque la formation de mousse n’est pas problématique, les tubes de minéralisation (6.13) contenant la
prise d’essai (9.2.1) peuvent être transférés dans le bloc de minéralisation (6.12) initialement réglé à une
température comprise entre 410 °C et 430 °C sans autre réglage de la température.
Minéraliser la prise d’essai pendant 30  min ou jusqu’à l’apparition de fumées blanches. Augmenter
ensuite la température du bloc de minéralisation entre 410 °C et 430 °C et poursuivre la minéralisation
de la prise d’essai jusqu’à ce que le minéralisat soit transparent.
Il peut être nécessaire d’augmenter la température progressivement sur une période d’environ 20 min
pour contrôler la formation de mousse. Dans tous les cas, ne pas laisser la mousse monter à plus de
4 cm à 5 cm en-dessous de la surface de la tubulure d’échappement insérée au sommet du tube de
minéralisation.
Une fois que le minéralisat s’est éclairci (il devient transparent avec une coloration bleu clair à vert),
continuer à minéraliser entre 410 °C et 430 °C pendant au moins 1 h. Pendant cette période de temps,
l’acide sulfurique doit être en ébullition. Si le liquide transparent ne forme pas de bulles visibles à la
surface du liquide chaud autour du périmètre du tube, il se peut que la température du bloc soit trop
faible.
La durée totale de minéralisation peut se situer entre 1,75 h et 3 h. Des durées de minéralisation plus
longues seront requises pour les produits dans lesquels la formation de mousse était contrôlée par une
baisse de la température de minéralisation initiale en-dessous de 410 °C.
Pour déterminer le temps d’ébullition spécifique nécessaire pour les conditions d’analyse du lait dans
un laboratoire particulier utilisant un ensemble bien défini d’appareils, sélectionner un échantillon de
lait liquide à haute teneur en protéines et en matières grasses et déterminer sa teneur en protéines en
appliquant différents temps d’ébullition (de 1 h à 2,5 h) après l’éclaircissement. D’autres produits laitiers
nécessiteront des échantillons de composition similaire à celle soumise à essai. Le résultat moyen de
la teneur en protéines augmente avec le temps d’ébullition, se stabilise, puis diminue quand le temps
d’ébullition est trop long. Sélectionner un temps d’ébullition permettant d’obtenir le meilleur rendement
en protéines pour le produit soumis à essai.
Au terme de la minéralisation, le minéralisat doit être transparent et exempt de matière non digérée.
Retirer le tube du bloc en laissant la tubulure d’échappement en place.
Laisser le minéralisat refroidir à température ambiante sur une période de 25 minutes environ. Il
convient que le minéralisat refroidi soit liquide ou avec quelques petits cristaux au fond du tube. Ne pas
laisser le minéralisat non dilué dans les tubes pendant toute une nuit. En effet, le minéralisat non dilué
peut se cristalliser lors de cette période et il sera ensuite très difficile de le remettre en solution.
NOTE La cristallisation excessive au bout de 25 min est le résultat d’une perte d’acide trop importante au
cours de la minéralisation et risque de donner des valeurs d’essai faibles. Cette perte d’acide trop importante est
causée par une aspiration excessive des fumées ou par une durée de minéralisation trop longue à une température
inférieure à la température d’analyse maximale. Pour réduire la perte d’acide, diminuer la vitesse d’aspiration des
fumées.

Une fois que le minéralisat a refroidi à température ambiante pendant 25 min environ, retirer la tubulure
d’échappement et ajouter soigneusement 85 ml d’eau dans chaque tube. Mélanger en tournant tout en
s’assurant que les cristaux sont séparés ou dissous. Laisser le contenu du tube refroidir à température
ambiante.

9.2.2.2 Distillation

Faire circuler l’eau du condenseur de l’appareil de distillation. Fixer le tube de minéralisation contenant
le minéralisat dilué à l’unité de distillation (6.18). Placer une fiole conique (6.5) contenant 50 ml de
solution d’acide borique (5.6) sous la sortie du condenseur, de manière à ce que la sortie se trouve sous
la surface de la solution d’acide borique. Régler l’unité de distillation (6.17) de façon à ce qu’elle distribue
55 ml de solution d’hydroxyde de sodium (5.4).
En cas d’utilisation d’une solution d’hydroxyde de sodium à 40 % (M/M), il convient que le volume
distribué soit réglé sur 65  ml. Si la distribution automatique de solution d’hydroxyde de sodium est

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extrêmement variable en raison du colmatage partiel du tuyau de distribution d’hydroxyde de sodium,

on risque d’obtenir des résultats en double très variables.
Conformément aux instructions du fabricant, utiliser l’unité de distillation de façon à distiller à la
vapeur l’ammoniac libéré par l’ajout de la solution d’hydroxyde de sodium et recueillir le distillat dans
la solution d’acide borique. Continuer la distillation jusqu’à ce qu’au moins 150 ml de distillat soient
recueillis. Retirer la fiole conique de l’unité de distillation et laver entièrement l’extrémité de distillation.
Rincer à l’eau l’intérieur et l’extérieur de l’extrémité et recueillir l’eau de rinçage dans la fiole conique.
Toujours rincer à l’eau l’extrémité entre chaque échantillon. L’efficacité du condenseur doit être telle
que la température du contenu de la fiole conique ne dépasse pas 35 °C pendant la distillation en cas
d’utilisation d’un point final de titration colorimétrique.

9.2.2.3 Titration

Titrer le contenu de la fiole conique (9.2.2.2) avec la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique
(5.7) à l’aide d’une burette (6.6). Le point final de titration est atteint à la première trace de rose dans
le contenu. Estimer la lecture de la burette à 0,05 ml près. Un agitateur magnétique éclairé (6.21) peut
faciliter la visualisation du point final de titration.
Il est également possible de titrer le contenu de la fiole conique (9.2.2.2) avec la solution volumétrique
standard d’acide chlorhydrique (5.7) au moyen d’un dispositif de titration automatique équipé d’un
pH-mètre étalonné (6.18). Le point final de titration est atteint au pH 4,6, qui correspond au point le
plus haut de la courbe de titration (point d’inflexion). Noter la quantité de solution titrée utilisée sur le
dispositif de titration automatique.
NOTE 1 La première trace de rose est observée entre pH 4,6 et pH 4,3 pour l’indicateur et la solution d’acide
borique à 4 % spécifiée dans la présente méthode. En pratique, la variation du pH en fonction de l’ajout d’acide
chlorhydrique à 0,1 N est très rapide dans cette gamme de pH. Il faut environ 0,05 ml d’acide chlorhydrique à 0,1 N
pour changer le pH de 0,3 unité dans la gamme de pH comprise entre 4,6 et 4,3 dans ce système.

NOTE 2 Les statistiques intralaboratoires et interlaboratoires concernant les performances de cette méthode
ont été déterminées à l’aide d’une titration à point final colorimétrique. La comparaison entre les résultats d’essai,
y compris ceux des essais à blanc, obtenus avec un point final de pH 4,6 et les résultats d’une titration à point final
colorimétrique n’a montré aucune différence statistiquement significative.

9.3 Essai à blanc

Toujours titrer les prises d’essai à blanc en utilisant la même solution volumétrique standard d’acide
chlorhydrique (5.7) et la même burette (6.6) ou le même dispositif de titration automatique équipé d’un
pH-mètre (6.18) que pour les prises d’essai. Réaliser un essai à blanc en suivant le mode opératoire
décrit en 9.1 ou 9.2. Remplacer la prise d’essai par 5 ml d’eau et environ 0,85 g de saccharose (5.10).
Consigner les valeurs à blanc. Si ces valeurs varient, identifier la cause de ce changement.
Une quantité de 0,85 g de saccharose (5.10) peut être utilisée sans ajouter d’eau.
NOTE Dans un blanc ou un étalon de recouvrement, l’utilisation de saccharose permet d’apporter de la
matière organique pour consommer, lors de la minéralisation, une quantité d’acide sulfurique équivalente à celle
d’une prise d’essai. Si la quantité d’acide sulfurique libre restant à la fin de la minéralisation est insuffisante, la
récupération de l’azote déterminée suivant les essais de récupération en 9.4.2 et 9.4.3 sera faible. Cependant, s’il
reste, à la fin de la minéralisation, une quantité suffisante d’acide sulfurique libre pour retenir tout l’azote, mais
que les conditions de température et de durée de la minéralisation ont été insuffisantes pour libérer totalement
l’azote de l’échantillon, sa récupération en 9.4.2 sera acceptable tandis qu’elle sera faible en 9.4.3.

Il convient que la quantité de solution titrée utilisée pour le blanc soit toujours supérieure à 0,00 ml. Il
convient que les blancs réalisés dans le même laboratoire soient stables dans le temps. Si le blanc est déjà
rose avant le début de la titration, cela n’est pas normal. En général, dans ce cas, les fioles coniques ne
sont pas propres ou l’eau contenue dans l’air humide pouvant se condenser à l’extérieur du condenseur
est entrée dans la fiole de récupération. Les valeurs types de blanc sont inférieures ou égales à 0,2 ml.

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9.4 Essais de récupération

9.4.1 Il convient de vérifier régulièrement la précision du mode opératoire par les essais de récupération
suivants, réalisés conformément au mode opératoire décrit en 9.1 ou 9.2.

9.4.2 Vérifier qu’il ne se produit aucune perte d’azote en utilisant une prise d’essai de 0,12 g de sulfate
d’ammonium (5.8) avec 0,85 g de saccharose (5.10).
NOTE La vérification de la récupération du sulfate d’ammonium ne donne aucune indication sur la capacité
des conditions de minéralisation à libérer l’azote lié aux structures protéiques.

Le pourcentage d’azote récupéré doit être supérieur à 99 % pour toutes les positions de l’appareil. Pour
les récupérations inférieures à 99 %, la normalité de la solution titrée peut être supérieure à la valeur
fixée, ou une perte d’azote peut avoir eu lieu lors de l’étape de minéralisation ou de distillation.
Il est possible d’utiliser un mélange de sulfate d’ammonium et une petite quantité d’acide sulfurique
(la quantité résiduelle à la fin de la minéralisation) dans un ballon de Kjeldahl. Diluer avec un volume
normal d’eau, ajouter la quantité normale d’hydroxyde de sodium, puis distiller. Si la récupération
d’azote est toujours faible dans les mêmes proportions, la perte d’azote survient dans l’appareil de
distillation et non pas dans celui de minéralisation. La cause en est probablement la fuite d’un tube dans
un système traditionnel ou le fait que les pointes du condenseur ne sont pas immergées totalement dans
l’acide borique dès le début de la distillation. Il convient que l’appareil réussisse cet essai avant que la
récupération ne soit vérifiée suivant le mode opératoire donné en 9.4.3.
Si les récupérations d’azote sont supérieures à 100 % et si aucune perte d’azote ne peut être constatée,
les causes éventuelles sont :
a) le sulfate d’ammonium est contaminé,
b) la normalité réelle de la solution titrée est inférieure à sa valeur fixée,
c) l’étalonnage de la burette pour la solution titrée est erronée,
d) la température de la solution titrée est trop élevée par rapport à la température d’étalonnage de la
burette,
e) la vitesse d’écoulement de solution titrée à l’extérieur de la burette est supérieure à la vitesse
maximale à laquelle l’étalonnage de la burette est valide.
Même s’il convient que la récupération théorique maximale ne dépasse pas 100 %, des récupérations
supérieures à cette limite peuvent être obtenues dans la pratique, en raison de l’incertitude de mesure,
par exemple des valeurs de 99 % à 101 % peuvent être obtenues si la récupération moyenne d’un certain
nombre d’essais est supérieure à 100 % ; il convient d’en examiner la cause.

9.4.3 Vérifier l’efficacité du mode opératoire de minéralisation en utilisant 0,16 g de chlorhydrate de

lysine ou 0,18 g de tryptophane (5.9) avec 0,67 g de saccharose (5.10).
NOTE Bien que le tryptophane (5.9) soit un indicateur adéquat de l’efficacité de minéralisation pour les laits
liquides, il n’est pas un indicateur approprié pour le lait en poudre et les produits laitiers en poudre ; l’utilisation
de chlorhydrate de lysine (5.9) donne une indication plus pertinente de l’efficacité de minéralisation pour ces
produits laitiers en poudre.

Un pourcentage de récupération d’au moins 98  % de l’azote doit être obtenu. Si la récupération est
inférieure à 98 % après avoir obtenu une récupération de 99 % à 100 % du sulfate d’ammonium, la
température ou la durée de minéralisation est insuffisante, ou alors une partie de l’échantillon n’est pas
minéralisée (à savoir brûlée) à l’intérieur du ballon de Kjeldahl.
Les laboratoires réalisant cet essai sont encouragés à participer à un programme international d’essais
d’aptitude.

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9.4.4 Des résultats inférieurs obtenus dans l’un ou l’autre des essais de récupération (ou supérieurs
à 100,0 % en 9.4.2) indiquent qu’il y a des erreurs dans le mode opératoire et/ou une concentration
érronée de la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique (5.7).

10 Calcul et expression des résultats

10.1 Calcul

10.1.1 Teneur en azote

Calculer la teneur en azote de l’échantillon pour essai, wn, à l’aide de la Formule (1) :

1, 4007 × (Vs − V b )× M t
wn = (1)
m
où
wn est la teneur en azote de l’échantillon pour essai, exprimée sous forme de pourcentage
(M/M) ;

Vs est le volume, en millilitres, de la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique

(5.7) utilisé dans la détermination (9.1.2.3 ou 9.2.2.3), exprimée au moins à 0,05 ml près ;

Vb est le volume, en millilitres, de la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique

(5.7) utilisé dans l’essai à blanc (9.3), exprimée au moins à 0,05 ml près ;

Mt est la molarité exacte de la solution volumétrique standard d’acide chlorhydrique (5.7),

exprimée à quatre décimales près. Si l’acide chlorhydrique est remplacé par l’acide
sulfurique, Mt est la molarité exacte de l’acide sulfurique multipliée par un facteur de 2,
exprimée avec quatre décimales;

m est la valeur numérique de la masse de la prise d’essai (9.1.1 ou 9.2.1), en grammes, expri-
mée à 0,1 mg près.

10.1.2 Teneur en protéines brutes

Calculer la teneur en protéines brutes, wp, à l’aide de la Formule (2) :

w p = w n ×6,38 (2)

où
wp est la teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage (M/M) ;

wn est la teneur en azote de l’échantillon pour essai, exprimée sous forme de pourcentage
(M/M), à quatre décimales près (10.1.1) ;

6,38 est le coefficient multiplicateur généralement admis pour exprimer la teneur en azote en
tant que teneur en protéines brutes laitières.

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10.1.3 Taux de récupération

Calculer le taux de récupération de l’azote, Rn, à l’aide de la Formule (3) :

w n ×100
Rn = (3)
Tn
où
Rn est le taux de récupération de l’azote, exprimé sous forme de pourcentage (M/M) ;

wn est la teneur en azote de l’échantillon pour essai, exprimée sous forme de pourcentage
(M/M) ;

Tn est la teneur en azote théorique de la substance, exprimée sous forme de pourcentage (M/M).

La teneur en azote théorique du sulfate d’ammonium est de 21,20 %, celle du tryptophane est de 13,72 %
et celle du chlorhydrate de lysine est de 15,34 %.
Les limites inférieures de récupération, en 9.4, sont basées sur le dosage minimal spécifié en 5.7 et 5.8. Il
convient de n’appliquer aucune tolérance supplémentaire concernant la pureté des réactifs lors du calcul
du taux de récupération.

10.2 Expression des résultats

10.2.1 Généralités

Il convient de ne pas arrondir les résultats avant l’utilisation finale de la valeur d’essai.
Cela est particulièrement vrai lorsque les valeurs sont appelées à être utilisées pour des calculs
ultérieurs. C’est le cas, par exemple, lorsque les valeurs d’essai individuelles obtenues à partir de l’analyse
de plusieurs échantillons sont utilisées pour calculer les statistiques de performance de la méthode
concernant les variations intralaboratoires et interlaboratoires. C’est également le cas lorsque les valeurs
servent de référence pour l’étalonnage d’un instrument (par exemple un analyseur de lait à infrarouge),
où les valeurs concernant plusieurs échantillons seront utilisées pour un calcul de régression simple ou
multiple. Dans ces cas-là, il convient de ne pas arrondir les résultats obtenus avant de les utiliser pour
les calculs ultérieurs.

10.2.2 Teneur en azote

Exprimer les résultats obtenus à quatre décimales près, si nécessaire pour des calculs ultérieurs. S’il
s’agit de résultats finaux, les exprimer à trois décimales près.

10.2.3 Teneur en protéines brutes

Exprimer les résultats obtenus à trois décimales près, si nécessaire pour des calculs ultérieurs. S’il s’agit
de résultats finaux, les exprimer à deux décimales près.

11 Fidélité

11.1 Essais interlaboratoires

Des essais interlaboratoires ont été réalisés conformément à l’ISO 5725-1 et à l’ISO 5725-2. Les valeurs
de répétabilité et de reproductibilité pour le lait et les produits laitiers décrits dans la présente Norme
internationale ont été publiées dans les références.[5][6][7][8][9][10] Les valeurs dérivées de ces essais
peuvent ne pas être applicables aux plages de concentration et matrices autres que celles indiquées.

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11.2 Lait liquide, lait entier et lait écrémé

11.2.1 Répétabilité

11.2.1.1 Lait de vache

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à l’aide de la même
méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur
utilisant le même appareillage dans un court intervalle de temps, n’excédera 0,006 % pour la teneur en
azote (0,038 % pour la teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

11.2.1.2 Lait de chèvre

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à l’aide de la même
méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur
utilisant le même appareillage dans un court intervalle de temps, n’excédera 0,008 4 % pour la teneur en
azote (0,052 % pour la teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

11.2.1.3 Lait de brebis

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à l’aide de la même
méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur
utilisant le même appareillage dans un court intervalle de temps, n’excédera 0,007 8 % pour la teneur en
azote (0,050 % pour la teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

11.2.2 Reproductibilité

11.2.2.1 Lait de vache

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels, obtenus à l’aide de la même méthode sur
un matériau identique soumis à l’essai dans des laboratoires différents par des opérateurs différents
utilisant des appareillages différents, n’excédera 0,007 7 % pour la teneur en azote (0,049 % pour la
teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

11.2.2.2 Lait de chèvre

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels, obtenus à l’aide de la même méthode sur
un matériau identique soumis à l’essai dans des laboratoires différents par des opérateurs différents
utilisant des appareillages différents, n’excédera 0,013 1 % pour la teneur en azote (0,084 % pour la
teneur en matière azotée totale) que dans 5 % des cas au plus.

11.2.2.3 Lait de brebis

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels, obtenus à l’aide de la même méthode sur
un matériau identique soumis à l’essai dans des laboratoires différents par des opérateurs différents
utilisant des appareillages différents, n’excédera 0,011  4 % pour la teneur en azote (0,073 % pour la
teneur en matière azotée totale) que dans 5 % des cas au plus.

11.3 Fromage à pâte dure, demi-dure ou molle

11.3.1 Répétabilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à l’aide de la même
méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur
utilisant le même appareillage dans un court intervalle de temps, n’excédera 0,048 9 % pour la teneur en
azote (0,312 % pour la teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

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11.3.2 Reproductibilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels, obtenus à l’aide de la même méthode sur
un matériau identique soumis à l’essai dans des laboratoires différents par des opérateurs différents
utilisant des appareillages différents, n’excédera 0,067  0 % pour la teneur en azote (0,428 % pour la
teneur en protéines brutes) que dans 5 % des cas au plus.

11.4 Lait en poudre et produits laitiers en poudre

11.4.1 Répétabilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à l’aide de la même
méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur
utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, n’excédera 0,007  M, où M est la
moyenne arithmétique de deux résultats, que dans 5 % au plus des cas.

11.4.2 Reproductibilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels, obtenus à l’aide de la même méthode sur
un matériau identique soumis à l’essai dans des laboratoires différents par des opérateurs différents
utilisant des appareillages différents, n’excédera 0,013 M, où M est la moyenne arithmétique de deux
résultats, que dans 5 % des cas au plus.

12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit indiquer :
a) toutes les informations nécessaires à l’identification complète de l’échantillon ;
b) la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue ;
c) la méthode utilisée, et la référence à la présente Norme internationale, à savoir ISO 8968-1|FIL 20‑1 ;
d) tous les détails de mode opératoire non spécifiés dans la présente Norme internationale, ou
considérés comme étant facultatifs, ainsi que les détails des incidents susceptibles d’avoir influencé
le(s) résultat(s) d’essai ;
e) le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s) et, si la répétabilité ou la récupération a été vérifiée, le résultat
final établi obtenu.

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Annexe A
(informative)

Prise d’essai

Tableau A.1 — Dimensions de la prise d’essai pour la détermination de la teneur en azote

et pour le calcul de la teneur en protéines brutes dans le lait et les produits laitiers selon la
méthode Kjeldahl
Substance Dimension de la prise d’essai
Lait de vache liquide, entier et écrémé 5 g ± 0,10 g
Lait de chèvre liquide, entier 5 g ± 0,10 g
Lait de brebis liquide, entier 2,5 g ± 0,10 g
Fromage à pâte dure, demi-dure ou molle 1 g ± 0,05 g
Lait en poudre et laits infantiles 0,5 g ± 0,05 g
Concentré de protéines de lait, concentré de protéines de lactosérum, 0,25 g ± 0,05 g
caséine et caséinate

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Annexe B
(informative)

Essai interlaboratoires

Tableau B.1 — Résumé des paramètres statistiques de l’essai interlaboratoires applicables au

pourcentage de protéines brutes (N × 6,38) dans le lait et les produits laitiers selon la méthode
Kjeldahl, à l’exception des valeurs aberrantes[5][6][7][8][9]
Statistiques
Moyenne r R
sr sR CV,r (%) CV,R (%)
Substance (%) (2,8 sr) (2,8 sR)
Lait de vache liquide, entier et écrémé 3,395 0,014 0,017 0,39 0,50 0,038 0,049
Lait de chèvre liquide, entier 4,807 0,018 0,030 0,37 0,62 0,052 0,084
Lait de brebis liquide, entier 5,398 0,018 0,026 0,35 0,49 0,050 0,073
Fromage 26,461 0,111 0,153 0,42 0,58 0,312 0,428

Tableau B.2 — Résumé des paramètres statistiques de l’essai interlaboratoires applicables au

pourcentage de protéines brutes (N × 6,38) dans le lait et les produits laitiers selon la méthode
Kjeldahl, à l’exception des valeurs aberrantes[10]
Statistiques
Moyenne r R
sr sR CV,r (%) CV,R (%)
Substance (%) (2,8 sr) (2,8 sR)
Lait entier en poudre (2000) 23,47 0,067 0,077 0,28 0,33 0,19 0,22
Lait entier en poudre (1995) 25,37 0,042 0,100 0,16 0,39 0,12 0,28
Lait écrémé en poudre (2004) 33,85 0,066 0,111 0,20 0,33 0,18 0,31
Lait écrémé en poudre (2009) 32,32 0,083 0,142 0,26 0,44 0,23 0,40
Lait infantile (2011) 11,71 0,039 0,064 0,34 0,54 0,11 0,18
Lait infantile (2010) 11,90 0,022 0,049 0,19 0,41 0,06 0,14
Concentré de protéines de lait (1971) 42,98 0,181 0,275 0,42 0,64 0,51 0,77
Concentré de protéines de lait (1992) 84,67 0,273 0,422 0,32 0,50 0,76 1,18
Concentré de protéines de lactosérum
78,86 0,122 0,262 0,15 0,33 0,34 0,73
(2005)
Concentré de protéines de lactosérum
92,36 0,292 0,355 0,32 0,38 0,82 0,99
(2002)
Caséine (2006) 86,45 0,251 0,464 0,29 0,54 0,70 1,30
Caséine (2001) 87,20 0,150 0,583 0,17 0,67 0,42 1,63
Caséinate (1988) 92,08 0,157 0,477 0,17 0,52 0,44 1,34
Caséinate (1984) 92,27 0,170 0,363 0,18 0,39 0,48 1,02

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1,8

1,6
Precision values [crude protein ( %)]

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Mean crude protein concentra on (%)
Key
Reproducibility Repeatability
Linear (reproducibility) Linear (repeatability)
Légende
Precision values (crude protein %) Valeurs de fidélité (% de protéines brutes)
Mean crude protein concentration (%) Concentration moyenne en protéines brutes (%)
Reproducibility Reproductibilité
Repeatability Répétabilité
Linear (reproducibility) Linéaire (reproductibilité)
Linear (repeatability) Linéaire (répétabilité)

Figure B.1 — Relation de r et R avec le pourcentage de concentration en protéines brutes (%)[10]

Les valeurs de fidélité étant fortement corrélées à la concentration en protéines, l’utilisation de valeurs
de répétabilité et de reproductibilité relatives est appropriée.
La répétabilité relative moyenne, r, est de 0,69 % et la reproductibilité relative moyenne, R, est de 1,28 %.

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Bibliographie

[1] ISO 707|FIL 50, Lait et produits laitiers — Lignes directrices pour l’échantillonnage

[2] ISO 5725-1, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure — Partie 1: Principes
généraux et définitions
[3] ISO 5725-2, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure — Partie 2: Méthode
de base pour la détermination de la répétabilité et de la reproductibilité d’une méthode de mesure
normalisée
[4] Parnas J.K., & Wagner R. Uber die Ausfuhrung von Bestimmungen kleiner Stickstoffmengen
nach Kjeldahl, Biochem. Z., 125, 1921, pp. 253–256
[5] Barbano D.M., Clark J.L., Dunham C.E., Fleming J.R. Kjeldahl method for determination of total
nitrogen content of milk: Collaborative study. Journal of AOAC, 73, 1990 pp. 849–859
[6] Lynch J.M., Barbano D.M., Fleming J.R. Performance evaluation of direct forced-air total solids
and Kjeldahl total nitrogen methods: 1990 through 1995. Journal of AOAC, 80, 1997, pp. 1038–
1043
[7] Lynch J.M., & Barbano D.M. Determination of the Total Nitrogen Content of Hard, Semihard and
Processed Cheese by the Kjeldahl Method: Collaborative Study. Journal of AOAC, ( 85) 2, 2002,
p. 445
[8] Orlandini S., Lattanzi L., Paggi U., Psathas G., Leray O. Interlaboratory Collaborative
Study on the Kjeldahl Reference Method for Nitrogen Determination in Goat Milk according to
ISO 8968‑1/2|IDF 20-1/2. Bull. Int. Dairy Fed., 440, 2009, pp. 15–24
[9] Orlandini S., Psathas G., Leray O. Interlaboratory Collaborative Study on the Kjeldahl Reference
Method for Nitrogen Determination in Sheep Milk according to ISO 8968‑1/2|IDF 20-1/2. Bull.
Int. Dairy Fed., 440, 2009, pp. 2–14
[10] Johnson R., & Crawford R. Interlaboratory Collaborative Study on the Kjeldahl Reference
Method for Nitrogen Determination of Dried Milk Products according to ISO  8968‑1/2|IDF
20-1/2. Bull. Int. Dairy Fed., 459, 2012, pp. 2–14

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