INFORME DE PRÁCTICAS DE TOXICOLOGÍA:

DEGRADACIÓN ENZIMÁTICA DE XENOBIÓTICOS

Nombre y apellido : Chaymae Bouyabla

Compañera de trabajo: Aicha Bougrine

Grupo 1

Programa de tiempo 1:
Absorbancia de los patrones a 400nm:

Absorbancia de los Patrones

Medida 0 µM
10 µM 20 µM 30 µM 40 µM 50 µM 60 µM 70 µM
Nº (Blanco)

1 0 0,219 0,411 0,62 0,834 1,038 1,242 1,44

En el experimento de reactivación por Ca 2+, ¿Cuál es la razón concentración de

calcio / concentración de EDTA en el volumen de reacción enzimática?
Representar en una figura de barras la actividad enzimática en función del tiempo
de incubación en presencia de EDTA. ¿Qué se observa? ¿Cómo podría justificar
estos resultados?
¿Cuál es la razón concentración de calcio / concentración de EDTA en el volumen de
reacción enzimática?

En la razón de la concentración del calcio y del EDTA se puede observar que la cantidad de
calcio es mucho mayor que la del EDTA por lo tanto la enzima puede ser reactivada debido a la
cantidad suficiente de calcio presente.

Cálculos Programa de Tiempos 1

Tubo Absorbancia [p-nitrofenol] Act. Enz. Rel. Act. Enz. Rel.

1 2 C1 C2 C (µmol·min- (% vs 0 min)
1
(µM) (µM) (µM) ·mL-1)

Reactivación por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA

0 min 1,760 1,814 85,02 87,63 2,61 4,176 100%

5 min 1,794 1,831 86,67 88,40 1,73 2,768 66,3%

15 min 1,881 1,894 90,87 91,5 0,63 1,008 24,14%

30 min 1,926 1,938 93,04 93,62 0,58 0,928 22,22%

Representar en una figura de barras la actividad enzimática en función del tiempo de
incubación en presencia de EDTA.

Actividad enzimáti ca relati va (%)

frente al ti empo
120%
100.00%
100%
Actividad relativa en (%)

80%
66.30%
60%

40%
24.14% 22.22%
20%

0%
0 min 5 min 15 min 30 min
Tiempo(min)

. ¿Qué se observa? ¿Cómo podría justificar estos resultados?

Podemos observar que mientras pasa el tiempo, la actividad enzimática disminuye y esto es
debido a que la unión del EDTA que es un agente quelante con una alta afinidad al calcio y la
unión de estos dos produce una inhibición de la actividad enzimática`porque se recupera
menos.
Cálculos Programa de Tiempos 2

Tubo Abs 2 Abs 1 Abs C (µM) Act. Enz. Rel. Act. Enz. Rel.

(µmol·min-1·mL-1) (µmol·min-1·mL-1)

Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Cu2+-Ctrl 1,036 0,532 0,504 24,35 38,96 29,68

Cu2+ 0,810 0,528 0,282 13,62 21,79 12,51
Cu2+-EDTA 0,640 0,520 0,12 5,8 9,28
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de
conejo

pOHMB-Ctrl 1,128 0,750 0,378 18,26 29,22 19,64

pOHMB 0,930 0,780 0,15 7,25 11,6 2,02
pOHMB- 0,964 0,840 0,124 5,99 9,58
EDTA

Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Ctrl 1 0,893 0,559 0,334 16,14 25,82 15,39

Ctrl 2 0,922 0,496 0,426 20,58 32,93 20,87
Media Ctrl 29,38 18,14
EDTA 1 0,664 0,529 0,135 6,52 10,43
EDTA 2 0,774 0,618 0,156 7,54 12,06
Media EDTA 11,24
 Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de Cu2+

Actividad enzimáti ca del Cu2+-Ctrl y

del Cu2+
Actividad enzimática Relativa (MICROMOL·min-

35
29.68
30

25
1·mL-1 )

20

15 12.51
10

0
1 2

1- Cu2+ - Ctrl
2- Cu2+

¿Cuál es el efecto del Cu2+? ¿Cómo podría justificar estos resultados?

Podemos observar que la actividad enzimática relativa se ha reducido en la presencia del Cu2+
y esto es debido a que el Cobre compite con el calcio por el centro activo.

El desplazamiento del calcio del centro activo por parte del cobre dará lugar a una disminución
de la actividad ya que la actividad de la enzima depende del calcio.

Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato
 Acti vidad enzimática del pOHMB-Ctrl
y del pOHMB
25
Actividad enzimática relativa

20
19.64
(µmol·min-1·mL-1 )

15

10

0 2.02
1 2

1-pOHMB-Ctrl

2-pOHMB

¿Cuál es el efecto del p-hidroximercuriobenzoato? ¿Cómo podría justificar estos resultados?

Debido a la presencia del pOHMB, la actividad enzimática relativa disminuye y esto es porque
el mercurio bloquea los grupos tioles de los residuos de cisteína presentes en el centro activo
lo que produce una inhibición de la actividad enzimática

- Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de EDTA.

Actividad enzimática muestra control y presencia

de EDTA

2 11.24

1 29.38

0 5 10 15 20 25 30 35
1-Media Ctrl

2-Media EDTA

¿Cuál es el efecto del EDTA sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo? ¿Cómo se
justifican estos resultados?

Como el EDTA capta el calcio presente en el centro activo de la enzima esto disminuirá la
actividad enzimática y debido a la ausencia del calcio en el medio no podemos recuperar la
enzima.

- Represente en una gráfica la concentración de p-nitrofenol en el tubo HQ frente al tiempo.

Describa y discuta el cambio de la concentración en función del tiempo. ¿Considera que
dichos resultados suponen un sesgo o artefacto en el cálculo de las actividades de las
cuestiones 2-4? Justifique su respuesta

Tiempo 43 44 45 46 47

Absorbancia 0,947 1,003 1,059 1,118 1,180

Concentración 45,75 48,45 51,16 54 57

Tiempo 48 49 50 51 52

Absorbancia 1,244 1,310 1,380 1,449 1,522

Concentración 60,1 63,3 66,67 70 73,53

- Represente en una gráfica la concentración de p-nitrofenol en el tubo HQ frente al tiempo.

 Concentración de p-nitrofenol en el tubo HQ vs el
tiempo
80
70 f(x) = 3.08739393939394 x − 87.6552121212121
60 R² = 0.997982018309279
Concentración (µM)

50
40
30
20
10
0
42 44 46 48 50 52 54
Tiempo (min)

Describa y discuta el cambio de la concentración en función del tiempo.¿Considera que

dichos resultados suponen un sesgo o artefacto en el cálculo de las actividades de las
cuestiones 2-4? Justifique su respuesta

Podemos observar que la concentración del p-nitrofenol es directamente proporcional al

tiempo, al pasar el tiempo aumenta la concentración.

En nuestro caso hemos tenido en cuenta la hidrólisis química, la actividad de la enzima de la

carboxilesterasa y la actividad de la paraoxonasa. Al aislar la actividad paraoxonasa sin tener en
cuenta los 3 factores (la hidrólisis química, la actividad de la enzima de la carboxilesterasa y la
actividad de la paraoxonasa) no existe ningún tipo de sesgo o artefacto en el cálculo de las
actividades.

Efecto de la especie sobre la actividad paraoxonasa

Cálculos Programa de Tiempos 3

Tubo Abs 2 Abs 1 Abs C (µM) Act. Enz. Rel. Act. Enz. Rel.

(µmol·min-1·mL-1) (µmol·min-1·mL-1)

TRIS 0,132 0,078 0,05 2,61

4

TRIS-EDTA 0,189 0,138 0,05 2,46

1

Conejo 0,520 0,232 0,28 13,91 22,256 17,312

8

Conejo-EDTA 0,252 0,188 0,06 3,09 4,944

 4

Oveja 0,723 0,232 0,49 23,72 37,952 32,928

1

Oveja-EDTA 0,288 0,223 0,06 3,14 5,024

5

Caballo 0,322 0,232 0,09 4,35 6,96 1,168

Caballo- 0,330 0,255 0,07 3,62 5,792

EDTA 5

Pollo 0,320 0,258 0,06 2,99 4,784 0,464

2

Pollo-EDTA 0,376 0,320 0,05 2,70 4,32

6

Discuta el resultado del incremento de concentración de p-nitrofenol y su actividad

enzimática resultante en los tubos TRIS y TRIS-EDTA.

Podemos observar que las concentraciones en los tubos de TRIS son mayores a las de los tubos
con TRIS-EDTA. Como la actividad de la paraoxonasa no está presente debido a que no hemos
añadido un suero de algún animal por lo tanto el aumento de la concentración del p-nitrofenol
puede ser debido a la hidrólisis química del sustrato.

Represente en una misma gráfica de barras la actividad paraoxonasa cuando se utiliza suero
de conejo, oveja, caballo y pollo.
 A cti vidad e nz imáti ca de la paraoxonas a
35 32.928

30

25

20 17.312
15

10

5
1.168 0.464
0
1 2 3 4
Actividad enzimática

1- Conejo
2- Oveja
3- Caballo
4- Pollo

A partir de la gráfica, podemos observar que la actividad de la paraoxonada de la

oveja>Conejo>Caballo>Pollo esto es debido a que los mamíferos tienen niveles altos de
actividades hidrolizantes de organofosforados.

El pollo será la especie más susceptible a la exposición al paraoxon debido a que las aves tienen
una baja o nula actividad de la fosotriesterasa y son sensibles a los efectos tóxicos de los
organofosforados.