Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh

Módulo 3: Controle de Qualidade - Meio de Ogawa-Kudoh

Curso

Diagnóstico de Tuberculose -
Método de Ogawa-Kudoh

Módulo 3

Controle de Qualidade –
Meio de Ogawa-Kudoh

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Expediente

Produzido por
Núcleo de Doenças Infecciosas da
Universidade Federal do Espírito Santo
(NDI/UFES) - Vitória / ES

Equipe responsável
Moisés Palaci
Solange Alves Vinhas
Eunice Atsuko Totumi Cunha
Luiz Guilherme Schmidt Castellani
Rosalia Maia

Adaptação pedagógica
Lucy Maria Bez Birolo Parucker
Helena Cristina Franz
Darcita Buerger Rovaris
Breno Biagotti
Artemir Coelho de Brito
Nicole Menezes de Souza

Diagramação
Bruna Goddini de O. Ferreira

Apoio
OPAS/OMS - Organização Pan-Americana
da Saúde
Sumário
1. Introdução 4
2. Controle de qualidade 4
3. Observação dos aspectos macroscópicos e
microbiológicos do meio de cultura. 5
3.1. Aspectos macroscópicos 5
3.2. Aspectos microbiológicos 6
4. Controle de esterilidade 6
5. Controle microbiológico 7
6. Materiais utilizados para o controle microbiológico 7
7. Referências 11
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1. Introdução
A avaliação da confiabilidade e da eficiência de procedimentos relacionados
ao cuidado das pessoas com tuberculose depende fundamentalmente do
processo de monitoração e da melhoria da qualidade no laboratório de
microbiologia.
Acurácia, confiabilidade e reprodutibilidade são propriedades procuradas
para os testes realizados no laboratório de microbiologia nos programas
de controle de qualidade. Para isso, o microbiologista responsável deve
continuamente:
• Avaliar a qualidade das amostras recebidas;
• Monitorar os procedimentos técnicos;
• Monitorar a qualidade dos reagentes;
• Garantir a integridade dos meios de cultivo;
• Avaliar o funcionamento de equipamentos;
• Garantir a qualidade da equipe de profissionais;
• Rever os resultados e avaliar a aplicabilidade clinica das informações
produzidas.

Um programa de qualidade eficaz deve identificar, monitorar e controlar

sistematicamente todos os fatores de risco do processo para promover a
constante melhoria dos resultados.

2. Controle de qualidade
Todos os lotes de meio fabricado, com ou sem droga, devem passar pelo
controle de qualidade, que se dá pela observação dos aspectos macroscópicos,
pelo controle de esterilidade e o controle microbiológico.
Todas as etapas de execução e os parâmetros físico-químicos dos meios de
cultura devem ser monitorados, documentados e criteriosamente avaliados
antes do uso na rotina laboratorial.
Os indicadores da qualidade (esterilidade, pH, características físicas e a
viabilidade ou inibição do crescimento) são estratégias que irão colaborar
com a reprodutibilidade e confiabilidade dos ensaios microbiológicos.

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3. Observação dos aspectos macroscópicos e

microbiológicos do meio de cultura.

3.1. Aspectos macroscópicos

Do ponto de vista macroscópico, deve ser observado a cor, consistência,
volume e a inclinação do meio de cultura.
1. Cor: considera-se normal quando a coloração do meio de cultura se
encontra homogênea. Neste caso, a mistura não pode apresentar
manchas brancas ou azuis. Os tubos de um mesmo lote de meios
de cultura não podem mostrar diferenças de coloração. Se isso
ocorrer, há evidências de que a homogeneização não foi completa
durante a preparação. Portanto, deve-se ter bastante atenção
antes da distribuição do meio nos frascos. A concentração de verde
malaquita, também interfere na cor do meio. Por um lado, uma
coloração mais clara pode indicar alcalinidade do meio, devida à
menor concentração de verde malaquita e/ou pelo uso de solução
não fresca do verde malaquita, ou ainda, pela presença de resíduo
de detergente no tubo. Por outro lado, uma coloração mais intensa
pode indicar acidez do meio, que se deve à maior concentração de
verde malaquita.
2. Consistência: o meio de cultura deverá estar firme e aderido às
paredes do tubo, de tal forma que não se rompa no momento da
semeadura, especialmente, com o uso do swab. Os meios com
consistência mole são decorrentes de mistura inadequada dos
componentes e/ou do tempo ou temperatura da coagulação
insuficiente.
3. Volume e inclinação: o volume ideal é aquele que permite um
espaço suficiente para a realização de uma boa leitura visual. Para
um tubo de 20 mm por 150 mm, o volume ideal permite que, após a
coagulação, tenha 1 cm na parte inferior do tubo preenchido com o
meio e o restante distribuído em bisel, terminando a 2 cm antes da
rosca (Figura 1). Para que isso aconteça, acerte o volume envasado
no tubo com a inclinação da bandeja do coagulador.

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Figura 1. Representação esquemática da distribuição do meio de cultura

em tubo de 20mm por 150 mm inclinado para obter uma boa área de leitura.

4. Textura: se na superfície do meio de cultura houver orifícios e ou

irregularidades, a qualidade do produto final estará comprometida.
Neste sentido, recomenda-se durante a distribuição do meio nos
tubos de ensaio uma agitação constante, a fim de manter o meio
homogeneizado e a agitação deve ser suave para evitar a formação de
bolhas de ar. Mesmo com esse cuidado, se após a coagulação, houver
orifícios e irregularidades na superfície do meio, estes indicam que
a temperatura de coagulação foi superior a 85°C e a qualidade do
meio está comprometida.

3.2. Aspectos microbiológicos

Os meios de cultura apresentam duas propriedades fundamentais que
são a esterilidade e a eficiência. Essas propriedades são submetidas ao
controle microbiológico. Neste sentido, poderão ser avaliadas a estabilidade
dos reagentes e demais insumos utilizados na produção do meio de cultura
de Ogawa-Kudoh e a presença de microrganismos capazes de afetar o
crescimento das micobactérias.

4. Controle de esterilidade
O Controle de esterilidade é o procedimento utilizado no laboratório para
garantir que o meio de cultura é estéril, isto é, não está contaminado com
qualquer microrganismo. A esterilidade é uma propriedade fundamental dos
meios de cultura.
Os materiais utilizados para controle de esterilidade são o lote do meio
fabricado e a estufa a 37°C. Afrouxe as tampas de rosca para que penetre o
oxigênio e também proporcione a secagem da água de condensação formada
durante a coagulação.

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• Incube todo o lote de meios produzidos por 48 horas a 37°C para

verificar a ausência de bactérias. Retire da estufa 99% do lote,
deixando apenas 1% do mesmo até completar 2 semanas para
verificar a presença de fungos.
• Havendo ausência de contaminação, o lote será considerado
“aprovado pelo controle de esterilidade”.
• Havendo contaminação total dos meios, o lote deverá ser
considerado “reprovado pelo controle de esterilidade” e
imediatamente descartado.
• Caso ocorra contaminação parcial do lote, descarte os tubos
contaminados e reincube os outros por mais 24 horas. Após
esse período, não havendo contaminação, o lote é considerado
“aprovado pelo controle de esterilidade”; se houve contaminação,
o lote é considerado “reprovado pelo controle de esterilidade” e
imediatamente descartado.

O lote de meios que foram “aprovados pelo controle de esterilidade”

deverá ser encaminhado para o controle microbiológico.

5. Controle microbiológico
O controle microbiológico do meio de cultura utiliza cepas padrões ATCC
de M. tuberculosis H37Rv -ATCC 27294 e M. tuberculosis H37Ra -ATCC 25177
que são cepas de referência e avalia o desempenho e a capacidade do meio de
cultura de proporcionar crescimento de micobactérias, avaliado pelo número
de unidades formadoras de colônias (UFC) estabelecidas como critérios de
desempenho do meio de cultura.

6. Materiais utilizados para o controle microbiológico

Cepas de Referência: são culturas de microrganismos padrão fornecidos
por instituição de reconhecimento internacional (ATCC – American Type
Culture Colection (EUA) e NCTC – National Collection of Type Cultures (Reino
Unido). Também chamadas cepas-controle, amostras-tipo ou cepas-padrão.
• Cabine de segurança biológica Classe II A2 ou II B2
• 6 tubos do lote do meio em estudo
• Tubo Nº 1 da Escala McFarland
• Cepa de referência com crescimento em meio sólido

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• Alça bacteriológica descartável estéril

• 8 Tubos de ensaio com tampa de rosca, 20 x 150 mm (de paredes
reforçadas), contendo 10 pérolas de vidro, estéreis
• Água destilada estéril
• Agitador mecânico tipo Vórtex
• Cronômetro
• 2 Pipetas pasteur descartáveis estéreis
• Pipeta automática 1000 μL
• Ponteiras 1000 μL estéreis com filtro
• Estufa bacteriológica 37°C

Todo o procedimento deve ser realizado dentro da Cabine de Segurança

Biológica. Classe II A2 ou II B2
• Após a aprovação no item controle de esterilidade, separe 6
tubos do lote de meios em estudo e 6 tubos do lote anteriormente
produzido e testado, escolhidos ao acaso, para serem testados pelo
controle microbiológico;
• O controle microbiológico se inicia com o preparo de uma
suspensão com turvação equivalente ao padrão número 1 da escala
de McFarland;
• Este procedimento utiliza culturas de micobactérias em meio
sólido, em fase logarítmica, entre 21 e 28 dias;
• Retire com alça bacteriológica o maior número possível de colônias;
• Transfira para um tubo de ensaio com tampa de rosca, contendo as
pérolas de vidro e 0,2 mL de água destilada estéril;
• Homogeneíze por 30 segundos;
• Mantenha em repouso por 20 minutos para sedimentar os grumos
maiores;
• Transfira, com pipeta estéril, o sobrenadante para outro tubo de
ensaio estéril, tendo cuidado para não levar os grumos.
• Ajuste a turvação da suspensão da cepa de referência com a turvação
do tubo Nº 1 da Escala McFarland, utilizando água destilada estéril,
gota a gota;

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Figura 2. Procedimento de controle microbiológico.

• A partir dessa suspensão de McFarland 1, efetuar seis novas

diluições em escala decimal:
• Identificar seis tubos de ensaio estéreis, como 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5 e 10-6.
• Adicione 0,9 mL de água destilada estéril em cada um deles;
• Transfira 0,1 mL da suspensão nº 1 de McFarland e homogeneíze;
• Troque a ponteira e prossiga com as diluições sucessivamente até
o tubo 10-6;
• Identifique 2 tubos do lote de meios em estudo como 10-3, dois
tubos como 10-5 e 2 como 10-6 e inocular 0,1 mL das respectivas
diluições nesses tubos. Repita este mesmo passo para inocular os
tubos do lote anterior;
OBS: Este ajuste também pode ser feito utilizando-se um
espectrofotômetro num comprimento de onda de 625 nm, obtendo-
se uma absorbância de 0,35 - 0,40.
• Acondicione os tubos de meios inoculados em bandeja de
polipropileno, inclinados de maneira que o lado da tampa fique
ligeiramente mais alto e com a superfície do meio voltada para cima;
• Incube em estufa bacteriológica a 37°C por 48 horas;
• Após 20 dias, realizar a leitura em cada um dos tubos de cada
diluição e registrar as contagens correspondentes das colônias.
Obtenha a média das UFC*, de forma separada para cada diluição.
*UFC = Unidade Formadora de Colônias:

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• Após obter a média do número de colônias em cada diluição, para

o crescimento nos meios de cultura em estudo, interprete-os
comparando com o número de colônias esperado para cada diluição,
como segue:

Tabelas dos 3 tubos e a descrição:

Tubo 10-3: crescimento confluente de colônias
(incontáveis);
Tubo 10-5: crescimento de 50 a 150 colônias
(colônias contáveis);
Tubo 10-6: crescimento de 1 ou 2 colônias nos
tubos do lote anterior.

• O lote de meios de cultura será considerado “aprovado pelo

controle microbiológico” quando a média do número de colônias
for compatível com as médias dos números de colônias esperadas.
• O controle deste procedimento é o crescimento de micobactérias
nos tubos do lote anteriormente produzido.

O lote deve ser etiquetado: “aprovado pelo Controle de Qualidade Interno”,

assim como as demais identificações, nome do produto, número do lote, data
de fabricação e de validade e as condições de armazenamento e conservação.
Se nesse período não houver crescimento de nenhuma colônia, ou raras
colônias no tubo 10-3, o lote em estudo não estará satisfatório e as amostras
semeadas estão comprometidas e devem ser descartadas. Nesse caso,
identificam-se quais as amostras foram semeadas com esse lote, e, para aquelas
cujos resultados foram negativos, eles devem ser semeados novamente em
outro lote aprovado.

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7. Referências
1. Costa, R.R. et al. Comparação entre os métodos de Ogawa-Kudoh
e Petroff modificado para o cultivo de micobactérias no diagnóstico da
tuberculose pulmonar. v. 16, n. 2, p. 1-5. São Paulo: Einstein, 2018.
2. Pedro, H.S.P. et al. Avaliação do desempenho dos meios de cultura
Ogawa-Kudoh e MGITTM para isolamento de micobactérias. BEPA, Bol.
epidemiol. paul. (Online). São Paulo, v. 8, n. 91, jul. 2011. Disponível em
http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-
42722011000700002&lng=pt&nrm=iso. Acesso em 10 ago. 2020.
3. Costa, R.R.; Silva, M.R.; Gonçalves, I.C. Diagnóstico laboratorial da
tuberculose: Revisão de literatura. Rev Med Minas Gerais 2018; 28 (Supl 5):
e-S280525.

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