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Utilisation de bactéries marines cellulolytiques pour le prétraitement enzymatique dans

la production de biogaz microalgal

Camilo Munoz,bCatalina Hidalgo,bManuel Zapata,un BDavid Jeson,cCarlos Riquelme,bMarielle Rivasun B

Centro de Investigación Científico Tecnológico para la Minería (CICITEM), Antofagasta, Chiliun; Laboratorio de Ecología Microbiana, Centro de Bioinnovación, Universidad de
Antofagasta, Antofagasta, Chilib; Département de génie chimique et noyau scientifique et technologique des bioressources, Université de La Frontera, Temuco, Chilic

Dans cette étude, nous avons conçu et évalué une méthode de prétraitement des microalgues utilisant des bactéries cellulolytiques qui dégradent
naturellement les microalgues dans leur habitat naturel. Des souches bactériennes ont été isolées de chacune des deux espèces de mollusques dans un
milieu contenant 1 % de gélose à la carboxyméthylcellulose. Nous avons sélectionné neuf souches bactériennes ayant une activité endoglucanase : cinq
souchesMytilus chilensis, une moule chilienne, et quatre souches deMésodesma donacium, une palourde trouvée dans le Pacifique Sud. Ces souches ont
été identifiées phylogénétiquement comme appartenant aux genresAéromonas,Pseudomonas,Chryséobactérie, etRaoultell. Les capacités productrices de
cellulase de ces souches ont été caractérisées, et la dégradation des parois cellulaires chezBotryococcus brauniietNannochloropsis gaditanea été testé
avec des expériences cellulolytiques "cellules entières".Aeromonas bivalveMA2,Raoultella ornithinolyticaMA5, etAeromonas salmonicidaMC25 dégradéB.
braunii, etR. ornithinolyticaMC3 et MA5 dégradésN. gaditane. En outre,N. gaditanea été prétraité avecR. ornithinolyticasouches MC3 et MA5 et a ensuite
été soumis à un processus de digestion anaérobie, qui a augmenté le rendement en méthane de 140,32 % et 158,68 %, respectivement, par rapport à celui
des microalgues non prétraitées. Par conséquent, un prétraitement cellulolytique « à cellules entières » peut augmenter les performances et l'efficacité de
la production de biogaz.

M Les microalgues ont été utilisées à travers l'histoire dans des applications
industrielles en raison de la variété de produits d'intérêt qui peuvent être
générés à partir de cette ressource (1). Pour la production de biocarburants, les
microalgues présentent des avantages distincts, notamment la croissance à une
densité élevée, la génération d'une biomasse plus dense par hectare que même les
meilleures cultures oléagineuses (2), et le fait qu'elles ne concurrencent pas les cultures
vivrières pour le sol (1,2). Ces dernières années, la biomasse microalgale est devenue
une option pour la production de biocarburants alternatifs (3). Cependant, pour
produire des biocarburants qui concurrencent directement les sources d'énergie
traditionnelles, comme le biodiesel ou le biogaz, le coût de production de la biomasse
microalgale doit être réduit (4).
Le biogaz produit à partir de la biomasse microalgale est généré
par un processus de digestion anaérobie. La composition biochimique
Cependant, la plupart de ces méthodes nécessitent beaucoup d'énergie et sont
donc coûteuses (12), augmentant le coût de production des biocarburants. Le
prétraitement avec des cellulases commerciales pour dégrader la cellulose
pendant la production de biogaz est rarement utilisé et n'a pas été testé à
l'échelle industrielle car les enzymes sont d'un coût prohibitif et ne peuvent pas
être réutilisées (12–14).
Le but de cette étude était d'identifier des bactéries capables de dégrader
spécifiquement la paroi cellulaire des microalgues, composée principalement de
cellulose. Dans des études antérieures, des chercheurs ont isolé des bactéries et des
champignons cellulolytiques d'environnements terrestres, tels que du compost, des
excréments de ruminants et des déchets végétaux (15). De plus, ils ont également
trouvé des bactéries cellulolytiques dans les environnements marins, telles que

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des microalgues, qui comprend les oligo-éléments fer, cobalt et zinc (5
), répond aux besoins nutritionnels généraux du microbiote
anaérobie ; ainsi, l'incubation de la biomasse microalgale avec des
microbes anaérobies peut stimuler la méthanogenèse (6). La quantité
de biogaz produite dépend de l'espèce de microalgues utilisée, car les
proportions relatives de protéines, de glucides et de lipides contenus
dans les cellules de microalgues influencent l'action des bactéries
Teredinibacter turnerae, isolé de mollusques appelés « vers de terre », qui est capable
de dégrader la cellulose du bois (16). Cependant, ces bactéries particulières n'ont pas
encore été utilisées pour prétraiter la biomasse de microalgues, car la paroi cellulaire
des microalgues n'est pas composée exclusivement de cellulose. Nous nous sommes
concentrés sur l'isolement, l'identification et la caractérisation de bactéries marines à
capacité cellulolytique isolées des intestins de mollusques bivalves filtrants pour une
utilisation dans le prétraitement enzymatique «cellule entière» de la paroi cellulaire
dans la biomasse microalgale pour la production de biogaz. Les espèces bactériennes

méthanogènes (7). Un autre facteur pouvant affecter le potentiel d'invertébrés et de mollusques bivalves n'ont pas été étudiées pour leurs capacités à

méthanogène des microalgues est la résistance aux protéases de dégrader les parois cellulaires des microalgues. La plupart des bivalves et des

leurs parois cellulaires, qui limite l'efficacité des microorganismes invertébrés marins dépendent des microalgues au cours de leur cycle de vie (17).

présents dans les digesteurs anaérobies à métaboliser les Comme les larves de poissons et de crustacés, les bivalves se nourrissent directement

composants intracellulaires des microalgues (6,8). de microalgues.

Les parois cellulaires de nombreuses espèces de microalgues sont multicouches et

contiennent une proportion relativement importante de cellulose. La cellulose est un
polymère linéaire de --1,4-ré-unités anhydroglucopyranose, ce qui le rend très stable et A reçu11 mars 2014Accepté27 avril 2014
résistant à la dégradation (9). Pour permettre aux bactéries méthanogènes d'accéder Publié avant l'impression2 mai 2014 Éditeur:
au contenu intracellulaire des microalgues, la biomasse est d'abord soumise à un RM Kelly
prétraitement de la paroi cellulaire ; ce prétraitement augmente à la fois la Adressez la correspondance à Mariella Rivas, mariella.rivas@cicitem.cl.

biodégradabilité globale et la production de méthane (6). Les prétraitements les plus CM et CH ont contribué à parts égales à cet article.

couramment utilisés comprennent l'homogénéisation à haute pression, l'acide Copyright © 2014, Société américaine de microbiologie. Tous les droits sont réservés.

sulfurique, le battage de billes induit par micro-ondes et l'autoclavage (dix,11). doi:10.1128/AEM.00827-14

Comment-

Juillet 2014 Volume 80 Numéro 14 Microbiologie appliquée et environnementale p. 4199 – 4206 aem.asm.org4199
Muñoz et al.
gai (18). Nous avons donc émis l'hypothèse que les systèmes digestifs des
mollusques bivalves filtrants contiennent des micro-organismes symbiotiques
qui ont une activité cellulolytique et d'autres activités de dégradation
enzymatique ; ces activités pourraient ainsi favoriser l'hydrolyse de la paroi
cellulaire des microalgues et donc augmenter la biodisponibilité des nutriments
de la biomasse des microalgues.
MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Collecte et préparation d'échantillons de coquillages.Des échantillons ont été
prélevés sur les intestins des mollusques bivalves filtreurs suivants :Mytilus chilensis,
Protothaca thaca, etMésodesma donacium. Tous ont été collectés au marché aux
poissons d'Antofagasta, au Chili. A cet effet, 1 g d'intestin de chaque espèce a été pesé,
dilué dans 9 ml de solution saline marine et homogénéisé à l'aide d'un mélangeur de
laboratoire Stomacher 80 pendant 2 min. L'homogénat résultant a été utilisé comme
échantillon initial pour l'ensemencement des plaques dans un milieu gélosé sélectif à la
carboxyméthylcellulose (CMC).
Milieu et conditions de croissance bactérienne.Des solutions homogénéisées
d'intestins de mollusques ont été striées sur des plaques avec un milieu sélectif d'agar
CMC modifié à partir des travaux de Samira et al. (19), constitué de milieu minimal
additionné de 10 g litre-1CMC, 1 g litre-1KH2Bon de commande4, 0,5 g litre-1MgSO4·7H2O,
20 g litre-1NaCl, 0,01 g litre-1FeSO4·7H2O, 0,01 g litre-1MnSO4·H2O, 0,3 g litre-1NH4NON3,
et 15 g litre-1gélose. Les plaques ont été incubées à 30°C pendant 7 jours. Les colonies
qui se sont développées dans ce milieu sélectif ont été transférées dans un milieu de
gélose Luria-Bertani additionné de 2 % de NaCl et ont été incubées à 30 °C pendant 3
jours. Les colonies qui se sont développées après le troisième isolement ont été
inoculées dans 20 ml de milieu Luria-Bertani additionné de 2 % de NaCl et ont été
incubées à 30 °C pendant 3 jours sous agitation constante à 125 tr/min. Ces cultures
bactériennes ont été utilisées comme inoculum dans des expériences ultérieures.
Criblage de bactéries productrices de cellulase.Chaque culture bactérienne a été
inoculée sur de l'agar CMC et a été incubée à 30°C pendant 7 jours. Une coloration de
Gram a été réalisée pour visualiser l'activité cellulolytique (20). Les plaques de gélose
CMC ont été inondées d'iode de Gram à température ambiante pendant 3 min; l'excès a
été éliminé et le diamètre de la dégradation du halo autour de chaque colonie a été
mesuré. Les souches qui ont formé des zones d'hydrolyse ont été sélectionnées pour
être utilisées dans des essais ultérieurs. Le contrôle positif pour l'activité cellulase était
de 0,5 U ml-1cellulase deAspergillus niger(Sigma).
Croissance et profil biochimique.Chaque souche bactérienne a été cultivée dans
100 ml de milieu Luria-Bertani additionné de 2 % de NaCl à 30 °C, et l'absorbance à 600
nm a été mesurée à des intervalles de 24 h pendant 5 jours. En outre, un comptage
microscopique direct des cellules a été effectué à l'aide d'une chambre Neubauer. La
caractérisation biochimique a été réalisée à l'aide du test API 20E (Biomerieux Inc.).
Extraction d'ADN et identification moléculaire à l'aide de gènes d'ARNr
16S. L'ADN génomique a été extrait et purifié à l'aide du kit de purification d'ADN
Power Soil (Mo Bio). Le gène de l'ARNr 16S a été amplifié à partir de l'ADN
génomique à l'aide des amorces F27 (5=-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3=) et
R1492 (5=-GGTTACCTTGTTACGACTT-3=). Les conditions de PCR étaient les
suivantes : dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de
dénaturation à 95°C pendant 30 s, annelage à 55°C pendant 30 s, et extension à
72°C pendant 1 min, avec une extension finale à 72°C pendant 5 min. Les
produits de PCR ont été purifiés avec le kit d'extraction de gel QIAquick (Qiagen).
Ensuite, les produits ont été séquencés par Macrogen Inc. (Corée du Sud). Les
séquences ont été analysées avec l'éditeur d'alignement de séquences Bioedit,
assemblées à l'aide du logiciel ChromasPro 1.5, puis analysées à l'aide du logiciel
BLASTN par rapport à la base de données non redondante disponible dans
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.htm) avec un seuil de 1
10-5.
Test de dégradation du papier filtre.Le test sur papier filtre a été effectué
comme décrit par Lu et al. (21). Chaque souche sélectionnée a été incubée avec
Whatman no. 1 papier filtre (bandes de 1 sur 6 cm ; masse, 0,5 g) dans 40 ml
d'une version modifiée du milieu minimal décrit par Samira et al. (19) [5 g litre-1
KH2Bon de commande4, 0,2 g litre-1MgSO4·7H2O, 20 g litre-1NaCl, 2,5 g litre-1
extrait de levure, et 0,6 g litre-1(NH4)2DONC4] à 30°C pendant 7 jours sous
agitation constante à 125 rpm. Le milieu de culture a ensuite été retiré et
4200aem.asm.org
le papier filtre a été soniqué pendant 3 min à 60 Hz et a été lavé avec de l'eau
distillée pour éliminer les bactéries qui adhèrent au papier. Cette procédure a
été répétée cinq fois. Ensuite, chaque papier a été séché à 45°C pendant 30
minutes, jusqu'à ce qu'un poids constant soit atteint. Le pourcentage de
dégradation du papier filtre a été calculé en comparant le poids initial au poids
final.
Perturbation des cellules microalgales avec un prétraitement bactérien
« cellule entière ».Nous avons testé la biomasse microalgale deBotryococcus
braunii UTEX572 cultivé dans des conditions de lot extérieur en milieu UMA2 en
0,4 m3photobioréacteurs tels que décrits par Bazaes et al. (22).Nannochloropsis
gaditaneCCMP527 a été soumis à une culture continue à une concentration
d'environ 2 g litre-1en milieu F/2 (23) dans un photobioréacteur de 2 litres à 20°C
avec une lumière continue. (N.gaditaneculture a été effectuée à l'Université de La
Frontera, Temuco, Chili.)
Chaque souche bactérienne a été cultivée individuellement en milieu
minimal additionné d'extrait de levure [2,5 g litre-1extrait de levure, 5 g litre-1
K2HPO4, 20 g litre-1NaCl, 0,2 g litre-1MgSO4·7H2O, et 0,6 g litre-1
(NH4)2DONC4] pendant 48h à 30°C et 125 rpm. Après incubation, la biomasse de
chaque bactérie dans 1 g litre-1a été dilué dans 5 ml de milieu et a été mélangé
avec 5 ml deB. brauniiou alorsN. gaditaneculture en phase stationnaire. Le
témoin négatif correspondait à un milieu minimal avec biomasse microalgale
mais sans bactéries.
Les mélanges microalgue-bactérie ont été incubés à 30°C pendant 72 h (pourB.
braunii) ou 96 h (pourN. gaditane). Toutes les 24 h, un échantillon de 1 ml de chaque
mélange a été prélevé. Le succès du traitement deB. brauniia été évaluée par l'ajout
d'un colorant blanc au calcofluor (Sigma), qui colore spécifiquement la cellulose de la
paroi cellulaire (24) qui a été dégradé. Ces échantillons ont été incubés pendant 16 h
dans l'obscurité et ont été analysés par microscopie à épifluorescence et à fond clair
(avec un microscope Olympus BX52). L'étendue de la dégradation a été calculée comme
le rapport des cellules intactes aux cellules totales.
La moyenneN. gaditanela taille des cellules est plus petite que la moyenneB. braunii la
taille des cellules, et donc, la coloration au blanc calcofluor de la paroi cellulaire ne permet pas
de détecter la rupture deN. gaditanecellules. Au lieu de cela, les cellules intactes qui ont
maintenu leur autofluorescence de chlorophylle ont été comptées dans une chambre de
Neubauer. Le comptage cellulaire initial correspondait au jour 1 et le comptage final
correspondait au jour 3 (72 h). Les souches qui perturbaient le plus efficacement la paroi
cellulaire ont été sélectionnées pour être utilisées dans le prétraitement enzymatique avant la
digestion anaérobie de la biomasse de microalgues.
Prétraitement enzymatique « cellules entières » deN. gaditane.Pour le
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prétraitement enzymatique, des cultures de chaque souche bactérienne cellulolytique
sélectionnée et une culture de biomasse microalgale de stade stationnaireN. gaditane
ont été obtenus. Les deux cultures ont été mélangées dans une proportion de 1:1 (vol/
vol), et le mélange a été incubé pendant 48h à 30°C sous agitation constante à 125 rpm.
Ensuite, la biomasse de microalgues a été soumise à une digestion anaérobie pour la
production de biogaz.
Essai de digestion anaérobie.Le test de digestion anaérobie a utilisé la biomasse
de microalgues (20 g litre-1) et une culture de chaque souche bactérienne cellulolytique
(1 g litre-1). LesN. gaditanela biomasse a été rincée pour éliminer les sels présents dans
la culture, car les sels peuvent inhiber la croissance des bactéries méthanogènes (25,26
). Pour concentrer les deux cultures, nous avons utilisé un système d'ultrafiltration avec
un filtre tubulaire de type X-flow de 0,03 m (Norit, Pays-Bas). Le test de potentiel
biochimique de méthane a été réalisé à l'aide d'un inoculum microbien de boue
anaérobie obtenue à partir d'un digesteur anaérobie pour le traitement des eaux usées
à l'usine de brasserie CCU, Temuco, Chili.
Des flacons de digestion anaérobie (50 ml) ont été utilisés. Dans chaque flacon, le
substrat a été ajouté à une concentration de 2 g litre-1dans de la boue anaérobie en
proportion 1:1 (wt/wt) avec la biomasse de microalgues prétraitée, avec 0,5 ml d'extrait
de levure, 0,5 ml de NaHCO3(50 g litre-1), 50 l de nutriments (65 mg litre-1NH4Cl, 18,5 mg
litre-1KH2Bon de commande4, 4 mg litre-1CaCl·2H2O, 5,7 mg litre-1MgSO4·7H2O, 20 g litre
-1extrait de levure, et 50 g litre-1NaHCO3), et de l'eau distillée pour un volume final de 50
ml. Un flux de N2-CO2(80:20 [vol/vol]) a été appliqué à chaque flacon pour expulser O2.
Chaque bouteille a été scellée et incubée pendant 30 jours à 35°C. Les témoins suivants
ont également été inclus : (i) chaque souche bactérienne sélectionnée ajoutée
séparément, (ii) les microalgues
Microbiologie appliquée et environnementale
 Espèces bactériennes marines pour le prétraitement des microalgues

FIG. 1Effet de la coloration à l'iode de Gram sur la zone cellulolytique dans des plaques avec de l'agar CMC. (A à E) Halos de dégradation des souches isolées de
Mytilus chilensis. (A) MC3 ; (B) MC18 ; (C) MC21 ; (D) MC23 ; (E)MC25. (F à I) Halos de dégradation des souches isolées deMésodesma donacium. (F) MA2 ; (G) MA3 ;
(H)MA5; (I) MA11. (J)Aspergillus nigerla cellulase (Sigma) a servi de témoin positif pour l'activité cellulase.

sans prétraitement, et (iii) un témoin négatif avec de l'eau ajoutée plutôt
qu'un substrat.
Au cours de la digestion anaérobie, les changements de pression de gaz dans l'espace de
tête dans chaque flacon ont été mesurés avec un capteur de pression (Cole Parmer) et la
composition des gaz de l'espace de tête a été déterminée à l'aide d'un chromatographe en
phase gazeuse avec un détecteur de conductivité thermique (Clarus 580 ; PerkinElmer). La
composition a été évaluée pendant 25 jours d'incubation. Ces valeurs ont été utilisées pour
déterminer la quantité de méthane produite à partir de chaque substrat.
Traitement de l'information.Pour mesurer la production de méthane à
partir du substrat pour chaque prétraitement enzymatique « cellule entière », il a
fallu considérer la présence de deux biomasses différentes, à savoir les
biomasses bactérienne et microalgale, dans un rapport 1:2 (wt/wt [exprimé en
grammes de solides volatils en suspension {VSS}]). De plus, pour chaque flacon
contenant de la biomasse de microalgues non prétraitées, le substrat avait deux
fois le poids de VSS (en grammes) que les flacons avec des microalgues
prétraitées par des bactéries. Les VSS ont été mesurés selon la méthode 2540 de
SMéthodes standard pour l'examen de l'eau et des eaux usées(27) à l'aide d'un
four à moufle (four Thermolyne type 1300). Pour déterminer la quantité de
méthane (exprimée en millilitres par gramme de VSS) produite à partir de
microalgues prétraitées, l'équation suivante a été utilisée :
CH4produit à partir de microalgues prétraitées
mlCH4g VSS-1bactéries
(souche MC18),KF436948(souche MC21),KF436949(souche MC23), et
KF436950(souche MC25).
RÉSULTATS
Sélection et isolement de bactéries cellulolytiques.Les bactéries
cellulolytiques ont été isolées à l'aide d'un milieu sélectif d'agar CMC dans
lequel la cellulose était la seule source de carbone. A partir des solutions
homogénéisées extraites des tripes deM. chilensis,M.donacium, et
P. thacamollusques, 54 souches bactériennes ont été obtenues :
29 souchesM. chilensis, 12 deM.donacium, et 13 deP. thaca. Neuf
souches ont montré une activité endoglucanase après coloration
à l'iode de Gram (Fig. 1): à partir deM. chilensis, les souches MC3,
MC18, MC21, MC23 et MC25, et deM.donacium, souches MA2,
MA3, MA5 et MA11 (Fig. 1). Aucune des souches isolées de
P. thacaformé des halos de dégradation sur des plaques de gélose CMC
après le test de coloration. Parmi les souches isolées deM. chilensis, ceux
qui produisaient les diamètres de zone claire les plus longs étaient MC3
(1,8 cm) et MC25 (1,5 cm); les souches deM.donaciumqui ont produit les
diamètres de zone claire les plus longs étaient MA2 (1,1 cm) et MA11 (0,9
cm) (Tableau 1).
Identification phylogénétique des bactéries cellulolytiques.Analyse

-mlCH gg VSS
4 prétraitement
-1
Prétraitement VSS --
g bactéries VSS
2
phylogénétique (Tableau 1) basée sur les séquences du gène de l'ARNr 16S a
révélé que les souches MC3 et MA5 appartiennent à l'espèceRaoultella
-
g Microalgues VSS ornithinolytica, avec 99% d'identité dans chaque cas.R. ornithinolyticaest une
Analyses statistiques.Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les niveaux bactérie à Gram négatif généralement présente dans les milieux aquatiques et
moyens de production de méthane dans différents échantillons ont été comparés par une associée à des maladies telles que la fièvre entérique chez l'homme (28).
analyse de variance unidirectionnelle suivie de tests de Tukey pour la signification statistique à

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l'aide du logiciel Statgraphics Plus, version 5.1 (Centurion). Dans tous les cas, les différences
avec unPvaleur de 0,05 ont été considérées comme significatives.
Numéros d'accès aux séquences nucléotidiques.Les séquences du
gène ARNr 16S que nous avons obtenues pour les souches isolées deM.
chilensisetM.donaciumont été téléchargés sur GenBank avec les numéros
d'accès suivants :KF436942(souche MA2),KF436943(souche MA3),KF436944
(souche MA5),KF436945(souche MA11),KF436946(souche MC3),KF436947
Les souches MC23, MC25 et MA2 ont montré un degré élevé de similitude de
séquence du gène de l'ARNr 16S avecAéromonasespèces, avec 98 à 99%
d'identité. Ces espèces sont associées à des maladies humaines telles que la
gastro-entérite et les infections respiratoires, sont couramment présentes dans
les milieux aquatiques (principalement dans les intestins des mollusques et des
poissons) et ont la capacité de produire des facteurs de virulence (29).

TABLEAU 1Diamètres des halos de dégradation de la CMC et identification phylogénétique des souches cellulolytiques isolées deMytilus chilensisetMésodesma
donacium

Bactérien Espèces avec séquence Similarité Identité Homologue Diamètre de

souche Espèce hôte homologieun Valeur E (%) (%) Numéro d'accès GenBank. auréole (cm)

MC3 Mytilus chilensis Raoultella ornithinolytica 0.0 100 99 NR_102983.1 1.8

MC18 Mytilus chilensis Chryséobactériesp. 0.0 100 99 JQ660045.1 1.1
MC21 Mytilus chilensis Chryséobactériesp. 0.0 98 96 JQ660045.1 1.0
MC23 Mytilus chilensis Aeromonas bivalve 0.0 100 99 DQ504430.1 1.1
MC25 Mytilus chilensis Aeromonas salmonicida 0.0 99 98 AB472980.1 1.5
MA2 Mésodesma donacium Aeromonas bivalve 0.0 100 99 DQ504430.1 1.1
MA3 Mésodesma donacium Pseudomonas pseudoalcaligenes 0.0 99 99 HE575911.1 0,6
MA5 Mésodesma donacium Raoultella ornithinolytica Klebsiella 0.0 100 99 CP004142.1 0,8
MA11 Mésodesma donacium sp. 0.0 100 99 GU290323.1 0,9
unL'homologie de séquence a été déterminée avec BLASTN.

Juillet 2014 Volume 80 Numéro 14 aem.asm.org4201

Muñoz et al.

TABLEAU 2Profils biochimiques des souches isolées à l'aide de l'API 20E

Aéromonas Aéromonas Aéromonas Raoultell

bivalve salmonicida bivalve ornithinolytique Klebsiellasp.
Test Réaction et/ou enzyme (MC23) (MC25) (MA2) (MA5) (MA11)
ONPG - - Galactosidase (ortho-nitrophényl---ré- -
galactopyranosidase)
ADH Arginine dihydrolase - -
PMA Lysine décarboxylase - - -
ODC Ornithine décarboxylase - - - - -
ICT Utilisation du citrate - - -
H2S H2Production de S - - - - -
URE Uréase - - -
ADT Tryptophane désaminase
INDIANA Production d'indole
vice-président Production d'acétoïne (test de Voges-Proskauer) -
GEL Gélatinase - -
GLU Fermentation/oxydation (glucose)
HOMME Fermentation/oxydation (mannitol)
INO Fermentation/oxydation (inositol) - - -
DORS Fermentation/oxydation (sorbitol) - - -
RHA Fermentation/oxydation (rhamnose) - - -
SAC Fermentation/oxydation (saccharose)
MEL Fermentation/oxydation (mélibiose) - - -
AMIE Fermentation/oxydation (amygdaline) - -
ARA Fermentation/ oxydation (arabinose)
Réduction des nitrates NON2production - -
Tube GLU

A ce jour, il y a peu d'informations surAeromonas bivalve, car la microscopie à épifluorescence à 24 et 48 h de prétraitement a

il n'a été décrit que récemment (30).
Les souches MC18 et MC21 ont montré une identité de séquence du
gène de l'ARNr 16S de 99 % et 96 %, respectivement, avecChryséobactérie
spp., qui, comme les espèces citées ci-dessus, ont été décrites dans des
milieux aquatiques. Cependant, seuls certainsChryséobactérie les espèces
sont pathogènes pour l'homme, causant des maladies principalement chez
les nouveau-nés et les personnes immunodéprimées (31). La souche MA3 a
montré une identité de 99 % avecPseudomonas pseudoalcaligenes, une
révélé queA. salmonicidaMC25,A. bivalveMA2, etR. ornithinolyticaMA5
a modifié la morphologie de la paroi cellulaire des microalgues. De
plus, seuls des fragments de paroi cellulaire colorés ont été observés.
Ceci indique que ces trois souches ont efficacement favorisé la
dégradation de la paroi cellulaire deB. braunii.
Le rapport des cellules intactes aux cellules totales a diminué dans tous les cas

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espèce associée au processus de biorestauration du cyanure (32) (Tableau
1). Les espèces correspondant à MC18, MC21 et MA3 n'ont pas été décrites
comme ayant une activité cellulolytique.
Profil biochimique.Souche MC3 (R. ornithinolytica) et les souches
MC18 et MC21 (Chryséobactériesp.) pousse plus lentement à 20°C qu'à
30°C. De plus, la phase stationnaire a été atteinte par toutes les souches
sélectionnées à 48 h avec une incubation à 30 °C et une agitation constante
à 125 tr/min (données non présentées). Un profil biochimique a été
déterminé pour chaque espèce sélectionnée (Tableau 2). Cependant, seuls
lesA. bivalveles souches MA2 et MC23,Aeromonas salmonicidaMC25,R.
ornithinolyticaMA5, etKlebsiellasp. la souche MA11 étaient capables de
fermenter ou d'oxyder le glucose, le mannitol, le saccharose et l'arabinose.
R. ornithinolyticaMA5 etKlebsiella sp. MA11 était positif pour tous les tests
de fermentation/oxydation et a montré la capacité de produire de la lysine
décarboxylase, de l'uréase et du NO2et pour métaboliser le citrate.

Test de dégradation du papier filtre.Toutes les souches ont dégradé

le papier filtre dans une certaine mesure, mais les souches les plus
efficaces ont étéR. ornithinolyticaMA5 (5,26 % de dégradation) et MC3 (4,23
%) etA. bivalveMC23 (3,51%) (Figure 2).
Dégradation deB. braunii.L'effet du prétraitement "cellule entière" a
été déterminé en utilisant du blanc de calcofluor pour teindre la paroi
cellulaire des microalgues (Figure 3). Observation en fond clair et
FIG 2Dégradation du papier filtre par les souches cellulolytiques. Un B,Aeromonas
bivalve; Pp,Pseudomonas pseudoalcaligenes; Ro,Raoultella ornithinolytica; K.sp,
Klebsiellasp.; C.sp,Chryséobactériesp.; Comme,Aeromonas salmonicida. Chaque barre
représente la moyenne des résultats pour trois répétitions par échantillon. Barres
d'erreur, écarts types. Tous les résultats pour les souches de ce test étaient
significativement différents (P, 0,05) de celle avec le contrôle négatif (-, pas de
bactéries).

4202aem.asm.org Microbiologie appliquée et environnementale

 Espèces bactériennes marines pour le prétraitement des microalgues

FIG 3Dégradation deB. brauniiparois cellulaires après prétraitement avec des souches dégradant la cellulose. Une visualisation microscopique en fond clair et en épifluorescence a
été réalisée à 24 et 48 h de prétraitement. Les échantillons ont été colorés avec du blanc calcofluor. Ro,Raoultella ornithinolytica; Un B,Aeromonas bivalve; C.sp, Chryséobactériesp.;
K.sp,Klebsiellasp.; Comme,Aeromonas salmonicida.

entre 24 et 48 h de prétraitement, contrairement au ratio pour le
témoin (Figure 4).A. salmonicidaMC25,A. bivalveMA2, etR.
ornithinolyticaMA5 a montré la plus grande dégradation des
microalgues. La survie a diminué chez le témoin négatif pendant le
test en raison de l'absence d'aération et du faible niveau de lumière.
De plus, des différences importantes de dégradation ont été observées
à différentes températures pour certaines souches (Figure 5).A.
salmonicida MC25 etR. ornithinolyticaMA5 étaient plus efficaces à dégrader
ingB. brauniià 20°C qu'à 30°C. Cependant,A. bivalveMA2, qui a montré la
plus grande différence entre les températures de toutes les souches
testées, était plus efficace à 30°C. Surtout,R. ornithinolyticasouche MC3 et
Chryséobactériesp. les souches MC18 et MC21 ne se sont pas développées
de manière optimale à 20°C, et par conséquent, elles n'ont pas été prises
en compte dans cette comparaison.
Dégradation deN. gaditane.Le rapport des cellules finales aux cellules
initiales indiquait que les microalgues avaient une survie cellulaire inférieure

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FIG 4Survie deB. brauniiaprès dégradation par les bactéries cellulolytiques, déterminé par comptage des cellules intactes (IC) et des cellules totales (TC) sur 96 h. (A) Dosage à
30°C; (B) dosage à 20°CAb,Aeromonas bivalve; Pp,Pseudomonas pseudoalcaligenes; Ro,Raoultella ornithinolytica; K.sp,Klebsiellasp.; C.sp,Chryséobactérie sp.; Comme,Aeromonas
salmonicida. Les barres d'erreur montrent les écarts-types pour trois répétitions par échantillon.

Juillet 2014 Volume 80 Numéro 14 aem.asm.org4203

Muñoz et al.
FIG 5Survie deB. brauniiaprès dégradation par les bactéries cellulolytiques, exprimée
par le rapport des cellules intactes (IC) aux cellules totales (TC), tout au long d'une
incubation de 48 h à 20°C (barres grises) ou 30°C (barres noires). Un B,Aeromonas
bivalve; Pp,Pseudomonas pseudoalcaligenes; Ro,Raoultella ornithinolytica; K.sp,
Klebsiellasp.; C.sp,Chryséobactériesp.; Comme,Aeromonas salmonicida. Chaque barre
représente la moyenne des résultats pour trois répétitions par échantillon. Barres
d'erreur, écarts types. Différences significatives (P, 0,05) entre le contrôle négatif (-) et le
traitement à 20°C (*) ou 30°C (O) sont indiqués. ND, non déterminé.
taux en présence de la plupart des souches bactériennes testées
qu'en présence du témoin, à l'exception deA. bivalveMC23 etP.
pseudoalcaligènesMA3 (Figure 6). Les souches qui ont produit le plus
deN. gaditanedégradation étaientR. ornithinolyticaMC3 et MA5, avec
des taux de survie cellulaire finaux de 62,8 % et 54,7 %,
respectivement.
Effet du prétraitement des microalgues sur la production de biogaz.Les
R. ornithinolyticales souches MC3 et MA5 ont été utilisées dans le test de
prétraitement car elles dégradaient bien les deux espèces de microalgues mais
dégradaientN. gaditanele plus efficacement.Figure 7montre les niveaux de
production de méthane à partir de la biomasse de microalgues sans
prétraitement et à partir deN. gaditanebiomasse exposée à un prétraitement «
cellule entière » avecR. ornithinolyticasouche MC3 ou MA5. Après 25 jours
d'incubation, le taux de production de méthane à partir des microalgues non
prétraitées était de 109,37 ml g VSS-1, alors que la production à partir de
biomasse prétraitée avecR. ornithinolyticasouche MC3 ou MA5 était de 262,84 ml
g VSS-1ou 282,92 ml g VSS-1, respectivement.
DISCUSSION
Dans cette étude, malgré des résultats prometteurs pour les tests de
dégradation sur gélose CMC, la dégradation du papier filtre et la dégradation
des deux espèces de microalgues testées, il semble y avoir des différences
spécifiques à l'espèce sous-jacentes aux résultats du test sur papier filtre et du
test.N. gaditaneessais de dégradation. Dans le test CMC,A. salmonicidala souche
MC25 présentait un large halo de dégradation de 1,5 cm (Fig. 1) qui a coïncidé
avec la dégradation deB. braunii(survie, 48,85 % à 20 °C) (Figure 4et5). Dans les
essais sur papier filtre (Figure 2) et leN. gaditanetest de dégradation (Figure 6),
cependant, la souche MC25 n'avait pas la même efficacité de dégradation. De la
même manière,A. bivalvela souche MA2 ne dégrade pas la gélose CMC aussi
efficacement que certaines autres souches (Fig. 1), mais il s'est dégradéB. braunii
avec une grande efficacité (survie, 42,13% à 30°C) (Figure 4et5). La différence-
4204aem.asm.org
FIG 6Dégradation deN. gaditanepar un prétraitement enzymatique « cellule entière ».
IC, cellules initiales à 0 h ; FC, cellules finales après 72 h de prétraitement. Un B,
Aeromonas bivalve; Pp,Pseudomonas pseudoalcaligenes; Ro,Raoultella ornithinolytica;
K.sp,Klebsiellasp.; C.sp,Chryséobactériesp.; Comme,Aeromonas salmonicida. Chaque
barre représente la moyenne des résultats pour trois répétitions par échantillon. Barres
d'erreur, écarts types. Les astérisques indiquent des différences significatives (P, 0,05)
entre le contrôle négatif (-) et le traitement à 30°C.
ences observées peuvent être attribuées à des différences interspécifiques et sont
probablement dues à d'autres activités enzymatiques non évaluées dans cette étude.
De plus, si l'on compare les effets des différentes souches bactériennes
sur la dégradation des microalgues,A. salmonicidasouche MC25 etA.
bivalvesouche MA2 dégradéeB. brauniile plus efficacement (Figure 4et5);
cependant, ils ne se sont pas dégradésN. gaditaneefficacement (Figure 6).
LesR. ornithinolyticales souches MC3 et MA5 étaient les plus efficaces pour
dégraderN. gaditane(Figure 6), mais MC3 était l'une des souches qui
dégradaientB. brauniile moins efficacement (Figure 4 et5). Les différences
observées dans la dégradation des microalgues pourraient être dues à des
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différences de salinité environnementale, qui, à leur tour, pourraient
affecter le métabolisme des bactéries cellulolytiques et influencer le niveau
de dégradation des microalgues.
LesR. ornithinolyticales souches MC3 et MA5 ont produit une dégradation
substantielle de la paroi cellulaire dans la plupart des essais. De plus, MA5 était
positif pour la plupart des activités enzymatiques spécifiques dans notre
caractérisation biochimique, telles que l'expression de la --galactosidase et de
l'uréase, la fermentation/oxydation du glucose et le métabolisme du mannitol,
de l'inositol, du saccharose et de l'arabinose (Tableau 2). De plus, la souche MA5
était également positive pour la lysine décarboxylase et la tryptophane
désaminase, suggérant la présence d'une activité peptidase. Selon l'analyse
phylogénétique, les souches MC3 et MA5 ont été identifiées commeR.
ornithinolyticasur la base du fait qu'ils produisaient une arginine dihydrolase (33
), étaient négatifs pour l'ornithine décarboxylase (34), étaient positifs pour la
lysine décarboxylase et l'uréase (33), et produit du citrate. Ceci est cohérent avec
nos résultats de caractérisation biochimique. D'autres espèces ont été identifiées
comme appartenant au genreAéromonas(Tableau 1), commeA. bivalve. Cette
espèce a été isolée précédemment à partir de mollusques bivalves et s'est
avérée faire partie du microbiote cellulolytique prédominant chez les poissons
herbivores (35). Les autres espèces identifiées ont été trouvées dans des
environnements marins et également comme pathogènes opportunistes chez
l'homme (29,31). Cependant, il n'y a pas
Microbiologie appliquée et environnementale

FIG 7Comparaison de la production de méthane à partir de biomasse microalgale non prétraitée avec la production de méthane à partir de biomasse microalgale prétraitée enzymatiquement avec des bactéries
cellulolytiques « à cellules entières ». Les barres d'erreur montrent les écarts-types pour trois répétitions par échantillon.
documentation montrant que n'importe laquelle de ces espèces est
capable de dégrader la cellulose. De plus, à l'exception deP.
pseudoalcaligènes, les applications biotechnologiques n'existent pas pour
ces espèces bactériennes.
Contrairement à notre étude, la plupart des recherches sur l'isolement
de l'activité cellulolytique chez les bactéries ont été réalisées dans des
environnements terrestres. Cependant, certaines études d'organismes
marins ont décrit la bactérieTeredinibacter turnerae, isolés de mollusques
appelés « tarets » qui dégradent la cellulose des bateaux en bois auxquels
ils adhèrent (16). Cependant, ces bactéries n'ont pas été testées pour leur
capacité à dégrader la paroi cellulaire des microalgues ou appliquées en
tant que prétraitement.
D'autres méthodes de perturbation cellulaire ont été utilisées comme
prétraitements pour la production de biogaz. Généralement, les prétraitements
sont utilisés pour augmenter la production de méthane (14). Schimpf et
Valbuena, ainsi que Ziemiński et al. (36,37), a testé le prétraitement enzymatique
de la biomasse lignocellulosique, qui a généré une
Augmentation de 20 % de la production de méthane par rapport à celle
obtenue avec de la biomasse non prétraitée. Grala et al. ont réalisé des études
sur la biomasse de macroalgues (Pilayella,Ectocarpe, etEntéromorphe) en
utilisant un complexe multienzymatique commercial comme prétraitement ; la
quantité de méthane générée à partir de la biomasse prétraitée était supérieure
de 63,63 % à celle de la biomasse non prétraitée (38). Notre prétraitement
enzymatique "cellule entière" proposé pour la digestion anaérobie est une
alternative aux méthodes précédentes. De plus, ce type de prétraitement
enzymatique est plus économique et plus simple car il utilise des bactéries
entières, éliminant ainsi le besoin de purifier les cellulases.
L'utilisation de microalgues comme substrat dans la production de méthane
peut altérer et inhiber le processus de digestion anaérobie en raison (i) de la
toxicité de l'ammonium causée par la teneur élevée en protéines des
microalgues, qui affecte les bactéries méthanogènes acétoclastes (6,39), et (ii) la
concentration élevée de sodium (140 mM) présent dans le milieu de culture, qui
peut inhiber l'activité bactérienne anaérobie (25). Par conséquent, la production
de méthane pourrait être affectée si la biomasse provient de microalgues
marines telles queN. gaditane, qui re-
Juillet 2014 Volume 80 Numéro 14
Espèces bactériennes marines pour le prétraitement des microalgues
nécessite un milieu de culture à forte concentration en NaCl (de 0,5 à 1 M) (
26). Un moyen d'éliminer les sels et d'éviter la toxicité est d'utiliser des
membranes d'ultrafiltration, que nous avons d'ailleurs utilisées dans notre
étude.
Prétraitement de la biomasse microalgale avec leR. ornithinolytica
la souche cellulolytique MA5 ou MC3 a augmenté la production de
méthane de 140,32 % et 158,68 %, respectivement, par rapport à la
biomasse non prétraitée. La production de méthane par
prétraitements s'est développée en deux phases : la première phase
du jour 1 au jour 7, correspondant à la conversion de substrats
facilement biodégradables, et la seconde du jour 18 au jour 25,
correspondant à la bioconversion plus lente de la part de les substrats
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les plus résistants à la biodégradation (40).
Sur la base de nos résultats, nous concluons que l'utilisation de
bactéries à activité cellulolytique comme prétraitement enzymatique
"cellule entière" de la biomasse microalgale deN. gaditaneaugmente la
production de méthane à 262,84 ml CH4g VSS-1et 282,92 ml CH4g VSS-1,
teneurs supérieures à celle de la biomasse non prétraitée (109,37 ml CH4g
VSS-1). Ces résultats diffèrent des résultats de production de méthane
décrits par Sanchez et Travieso (41), qui a obtenu 315 à 350 ml de méthane
g VSS-1à partir deChlorelle vulgairebiomasse microalgale sans
prétraitement dans un réacteur discontinu. Cependant, la production de
méthane est directement liée à la composition cellulaire des microalgues
(protéines, glucides et lipides), qui dépend à la fois de l'espèce et de
l'environnement (6). Enfin, on peut en déduire qu'en raison de
l'environnement dans lequel les bactéries ont été obtenues et de la
température de dosage (30°C), les coûts énergétiques étaient inférieurs
avec notre prétraitement enzymatique "cellules entières" qu'avec les
enzymes commerciales disponibles ( les enzymes commerciales ont une
activité maximale sur une plage de température de 50 à 55°C) (42,43).
REMERCIEMENTS
Cette étude a été financée par Fondecyt 1120488, CICITEM R10C1004,
l'Université d'Antofagasta et l'Université de La Frontera.
aem.asm.org4205
Muñoz et al.
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Microbiologie appliquée et environnementale