KROMATOGRAFI

Apa itu kromatografi ???

Kromatografi merupakan salah satu metode yang secara luas digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis campuran senyawa.

Ada beberapa tipe kromatografi:

◦ Gas chromatography
◦ Paper chromatography
◦ Colum Chromatography
◦ Thin-layer chromatography (TLC)
◦ High pressure liquid chromatography (HPLC)
◦ Affinity chromatography
◦ Ion-exchange chromatography
Teori Kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu atau berdasarkan
perbedaan afinitas suatu zat dalam dua fase yang berbeda yaitu fase diam dan
fase gerak.
Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase yaitu fase diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan polaritas senyawa
atau kecenderungan senyawa tersebut untuk berikatan pada fase gerak dan fase
diam.
Teori Kromatografi
Ada banyak tipe kromatografi, namun secara umum memiliki prinsip
yang sama, yaitu kromatografi terdiri dari 2 komponen utama:
◦ Fase diam
◦ Berupa padatan atau cairan yang diikatkan pada fase padat
◦ Fase gerak
◦ Berupa cairan atau gas
Teori kromatografi
Fase gerak akan merambat melewati fase diam dan kemudian akan memisahkan
komponen campuran menjadi bagian-bagiannya.
◦ Akan terjadi kompetisi pengikatan komponen sampel oleh fase diam dan fase
gerak
◦ Setiap komponen memiliki karakteristis ikatan tersendiri dengan tiap fase 
terjadi perbedaan kecepatan perambatan
Teori Kromatografi
Terdapat beberapa interaksi/jenis ikatan yang terjadi antara
komponen sampel dengan tiap fase  dipengaruhi oleh sifat fisiko
kimia dari analit
◦ Ionization state
◦ Polarity and polarizability
◦ Hydrogen bonding/van der Waals’ forces
◦ Hydrophobicity
◦ Hydrophilicity
Teori kromatografi
Komponen yang :
◦ Memiliki afinitas yang kuat dengan fase diam
◦ Afinitas lemah dengan fase gerak Tertahan lebih lama pada fase
diam (pergerakan lambat)

◦ Memiliki afinitas lemah dengan fase diam

◦ Afinitas kuat dengan fase gerak
Bergerak lebih cepat
Ada 4 (empat) tipe afinitas atau interaksi yang menyebabkan terjadinya pemisahan
yaitu :

Kecendrungan zat untuk melarut dalam pelarut (koefisien partisi),

Kecendrungan zat membentuk ikatan adesi dengan padatan polar pada
permukaan fase diam (koefisien adsorpsi )
Kecendrungan zat untuk menguap (sifat volatilitas)
Kecendrungan zat masuk dalam pori-pori permukaan fase diam (tergantung
ukuran/besar molekul /exclution).
Berdasarkan dari jenis fase geraknya,

1. Kromatogafi gas
2. Kromatografi cair
Berdasarkan jenis atau sifat fase diamnya

1. Kromatografi partisi (fase diam, zat padat inert yang permukaannya dilapisi
cairan)
2. Kromatografi adsorpsi (fase diam bersifat sangat polar)
3. Kromatografi eksklusi (fase diam bersifat porous)
4. Kromatografi penukar ion (fase diam memiliki gugus ionik dipermukaannya)
Dilihat dari bentuk fisik fase diamnya

1. Kromatografi Kertas (KKt) : Hampir

sama dengan KLT, fase diam
menggunakan kertas.
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
3. Kromatografi Kolom
Kromatografi Lapis Tipis
(THIN LAYER CHROMATOGRAPHY)
TLC
TLC
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa
murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.
Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik
penyerap maupun cuplikannya.
Fase diam : menggunakan sebuah lapis tipis silika gel (SiO2) atau alumina (Al2O3) atau selulosa
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras

Kadang ditambahkan senyawa yang dapat berfluoresensi ke dalam fase diam seperti zinc sulfide

Fase gerak : menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai

PELARUT/SOLVENT/FASE GERAK:
Non Polar : Parafin cair
Petroleum eter
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluena
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
Polar methanol
air
TLC Procedure
Step 1: Preparing the chamber

A) Choose a container
that is large enough
and can be sealed.

B) Add the a few cm

of the mobile phase
solvent to the chamber.
TLC Procedure
Step 1: Preparing the chamber
C) Seal the chamber
◦ The atmosphere of the chamber should
be saturated with the solvent vapors before
running samples.

◦ You may line part of the inside of your

chamber with filter paper to aid in this
saturation process.
TLC Procedure
Step 2: Preparing the stationary phase
A) Prepare the TLC plate:
Mix:
◦ Adsorbent
◦ Small amount of an inert binder
◦ Water

Spread a thin layer (no more than a few mm) of the mixture on an non-reactive
support.
After the plate is dried, it is activated by heating in an oven for approximately 30
minutes at 110˚C.
 TLC Procedure
Step 2: Preparing the stationary phase
-TLC plates are also commercially
prepared and can be purchased
ready for use.
B) Draw a line of origin
approximately 0.5cm
from the bottom of the
filter paper.
C) Indicate where each sample will be added.
TLC Procedure
Step 3: Spotting the samples
A) If the sample isn’t in solution, dissolve it in an appropriate solvent.
◦ As a rule of thumb,

◦ If the sample is too concentrated = smear

◦ If the sample is too

dilute = no results

The image above shows a sample ran at

three different concentrations. The left
plate was ran too concentration and the
spots are running together. The other two
plates yielded good separation.
 TLC Procedure
Step 3: Spotting the samples

B) Spot a small amount of sample

onto the plate.
◦ Make sure the sample spot is dry
before continuing.
Spotting samples
Manual application of samples
Semiautomatic Application
Automatic Application (Alat penotol
sampel otomatis)
Step 4: Developing the chromatograms
◦ When the sample spot has dried, the TLC plate is placed into the
chamber containing the solvent.
◦ It is important that the sample spot is above the level of the
solvent.
Gambar berikut ini menunjukkan posisi dari totolan sampel, posisi
lempeng dalam bejana serta ketinggian eluen dalam bejana
Lempeng dengan menunjukan kenaikan bercak dan batas atas pengelusian.
Deteksi bercak
Deteksi bercak pada KLt dapat dilakukan secara kimia dan fisika.
Cara kimia
adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga
bercak menjadi jelas.
Cara fisika
Adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet.
Gambar lempeng dengan menggunakan penampak bercak dengan pendarfluor dan
cara kimia (penyemprotan)
Penampakan bercak dengan penyemprotan
Penampakan bercak dengan paparan sinar UV 254 nm
Fase Diam Silika Gel 60 GF254
Perhitungan Nilai Rf

Perbandingan jarak bercak dan jarak tempuh eluen

Nilai Rf
didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari
titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari
titik asal
Sample Rf Calculation
TERIMA KASIH