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Revista de Biociencia y Bioingeniería

VOLUMEN 107 núm. 2, 119–123, 2009

www.elsevier.com/locate/jbiosc

Streptococcus thermophilusproduce exopolisacáridos incluyendo

ácido hialurónico

Naoki Izawa,⁎Tomoko Hanamizu, Ryoko Iizuka, Toshiro Sone, Harumi Mizukoshi,

Kazumasa Kimura y Katsuyoshi Chiba

Instituto Central de Investigación Microbiológica de Yakult, 1796 Yaho, Kunitachi-shi, Tokio, 186-8650, Japón

Recibido el 31 de julio de 2008; aceptado el 7 de octubre de 2008

El ácido hialurónico (HA) es un material importante para aplicaciones médicas, cosméticas y alimentarias. El HA se obtiene
comercialmente a partir de crestas de gallo y de la fermentación de estreptococos. Sin embargo, los problemas de seguridad como la
hialuronidasa o la contaminación por exotoxinas siguen siendo controvertidos. Para reducir el riesgo de contaminación por hialuronidasa o
exotoxina, intentamos aislar cepas deStreptococcus thermophiluscon alta productividad de exopolisacáridos útiles (EPS), incluido HA de
productos lácteos tradicionales. Cuarenta y seisS. termófiloSe aislaron cepas de productos alimenticios lácteos y se examinó su producción
de HA utilizando un método de proteína de unión a HA. Según los resultados, seisS. termófilocepas produjeron EPS incluyendo HA.S.
termófiloYIT 2084 tuvo una productividad HA marcadamente alta (aproximadamente 8 mg/l). Nos enfocamos en la fracción de masa
molecular alta de EPS (2000 kDa) deS. termófiloYIT 2084. Mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución, se encontró que una
fracción de masa molecular alta de EPS incluíaNORTE-acetilglucosamina (54,4%) y ácido glucurónico (45,6%), que son componentes de la HA.
Además,13La espectroscopia de resonancia magnética nuclear C mostró que los espectros de la fracción de alta masa molecular se
correspondían bien con los del HA comercial. Aquí describimos por primera vez queS. thermophilus,que es una bacteria segura
generalmente reconocida, produce HA. La nueva bacteria productora de HAS termófiloYIT 2084 tiene un gran potencial para aplicaciones en
el campo médico, cosmético y alimentario, aunque sus condiciones de cultivo aún están por mejorar.

© 2008, Sociedad de Biotecnología, Japón. Reservados todos los derechos.

[Palabras clave:Streptococcus thermophilus;Leche; exopolisacárido; Ácido hialurónico; proteína de unión al ácido hialurónico; 1-fenil-3-metil-5-
método de pirazolona; hialuronidasa]

El ácido hialurónico (HA) es un polisacárido lineal de alta masa molecular
compuesto por alternancia deNORTE-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido
glucurónico (GlcA)(1). HA es un componente importante de la matriz
extracelular de la piel y las articulaciones(2), y se utiliza ampliamente en los
campos médico, cosmético y alimentario.
El HA se obtiene comercialmente por extracción de crestas de gallo y por
fermentación por bacterias del ácido láctico (BAL). La extracción de las
crestas de gallo requiere mucho tiempo y es costosa, y está plagada de
problemas graves, a saber, la reducción de la calidad por contaminación con
enzimas degradantes de HA (HAase)(3, 4)y reacciones inflamatorias tras la
inyección(5). Varios estreptococos, comoStreptococcus equisimilis,
Streptococcus pyogenesyStreptococcus equi,tienen HA sintasa y producen
HA(6–8). La producción industrial de HA se ha logrado utilizando
S.equisubesp.zooepidemicus(9, 10). Sin embargo, estas cepas, clasificadas
como grupos A y C de Lancefield, son patógenas.(11, 12). Recientemente,
una cepa recombinante deBacillus subtilisse ha informado que produce HA a
S. termófilose utiliza tradicionalmente en productos lácteos, como
yogur y queso.S. termófilose ha informado que produce varios tipos de
EPS con diferentes composiciones de monómeros(14–16). La relación
estructura-función de estos EPS se ha dilucidado parcialmente.(17). Sin
embargo, hasta donde sabemos, no hay producción de HA porS.
termófiloha sido reportado todavía.
Se han estudiado varios enfoques para realizar la producción de HA por
bacterias seguras. Aquí, intentamos aislar LAB no patógenas,S. termófiloque
produce un EPS útil con un alto contenido de HA, utilizando un método de
proteína de unión a HA (HABP)(18,19)para aplicaciones médicas, cosméticas
y alimentarias. Además, la determinación estructural de una fracción de EPS
de alta masa molecular se realizó mediante cromatografía de permeación en
gel (GPC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectroscopia
de resonancia magnética nuclear (NMR).
MATERIALES Y MÉTODOS

escala de laboratorio(13). En Japón, las cepas recombinantes útiles son

difíciles de usar para la producción comercial de HA para alimentos y
cosméticos, debido a las regulaciones y la falta de consenso en la sociedad.
⁎Autor correspondiente. Tel.: +81 0 42 577 8960; fax: +81 0 42 577 3020.
Dirección de correo electrónico:naoki-izawa@yakult.co.jp (N.Izawa).
Organismos y condiciones de cultivo. Cuarenta y seisS. termófilocepas aisladas
de productos lácteos se utilizaron en este estudio. Todas las cepas fueron recolectadas por el
Instituto Central de Yakult, Tokio (YIT), y se les asignaron números YIT. En este estudio, todos los
aisladosS. termófilolas cepas se representaron por números YIT. Todos los cultivos se realizaron a
42 °C sin agitación. Una asada de solución de dimetilsulfóxido deS. termófilose inoculó en 2 ml de
medio MRS (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). Las células se cultivaron durante la noche,
después de lo cual se inocularon 0,1 ml de caldo de cultivo en 10 ml de leche desnatada al 10%
(Becton Dickinson). Las células se cultivaron adicionalmente durante la noche.

1389-1723/$ - ver portada © 2008, The Society for Biotechnology, Japan. Reservados todos los derechos. hacer:
10.1016/j.jbiosc.2008.11.007
120 IZAWA ET AL. JBIOSCI. BIOENG.,

Se contó con dos escalas de cultivo: una para detectar HA y otra para aislar EPS. Para el cribado a 37 °C durante 40 min. Después de la incubación, se añadieron 100 μl de NaOH 0,4 M para
de cepas productoras de HA, se inocularon 0,5 ml de leche desnatada fermentada en 50 ml de detener la reacción enzimática. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 120 μl
leche desnatada al 10%. El caldo se muestreó a las 0, 4, 7, 10 y 24 h y se usó para la cuantificación de borato de potasio 0,8 M (pH 9,1) y se calentaron 300 μl de la mezcla a 100 °C durante 3 min.
de HA. Para aislar EPS, se inocularon 10 ml de leche desnatada fermentada en 1 l de leche Después de enfriar a temperatura ambiente, 180 l de 1%pag-Se añadió
desnatada al 10 %, seguido de un cultivo de 4 a 6 h. dimetilaminobenzaldehído con HCl al 1,25 % en ácido acético a 30 μl de la mezcla de reacción y la
Método de proteína de unión a HA para la cuantificación de HA La concentración de HA fue mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 20 min. Después de enfriar a temperatura ambiente,
determinado por los métodos de Bertheim y Hellström(18)y Miyazaki et al.(19) utilizando se midió la absorbancia a 595 nm. El ensayo se realizó por duplicado. Se calculó la concentración
HABP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) con modificaciones menores. Se utilizó una media de GlcNAc.
inmunoplaca de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para el ensayo. Cada pocillo se El segundo método utiliza el ensayo de placa HA realizado por Grenier y Michaud
recubrió primero con 200 μl de 100 mg/ml de sal sódica HA deS. zooepidemicus (Wako (24)y Markis et al.(25). Brevemente,S. termófiloYIT 2084 se inoculó en placas de agar MRS
Pure Chemical Industries, Osaka), que también se utilizó como HA estándar en este suplementadas con HA (0,1 %) y se incubó a 37 °C. Después del crecimiento, la placa se
estudio, se disolvió en carbonato de Na 2 mM (pH 9,6) a 37 °C durante 4 h. Todas las inundó con cloruro de cetilpiridinio (CPC) al 10 % y se dejó reposar a temperatura
incubaciones en este método se llevaron a cabo a 37 °C. A continuación, cada pocillo se ambiente durante 30 min. El CPC se lavó con agua destilada. Se observó una zona clara
lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBST). Después del lavado, cada alrededor de las bacterias productoras de HAase.
pocillo se bloqueó con albúmina de suero bovino al 1% (Boehringer Mannheim,
Alemania) en PBST durante 1,5 h y luego se lavó nuevamente. A continuación, se RESULTADOS
incubaron 100 μl de HA estándar (0, 5, 10, 25 y 50 ng/ml) y leche desnatada fermentada
diluida en los pocillos con un volumen igual de HABP (0,5 mg/ml) en PBST durante 1 h.
Después del lavado, se añadieron 200 μl de conjugado extra de avidina con fosfatasa Detección de cepas productoras de HA Para seleccionar la producción de HA
alcalina (Sigma) diluido a 1/70 000 en PBST y las placas se incubaron a 37 °C durante 0,5 tensión, 46S. termófiloLas cepas se cultivaron en leche desnatada. Según los
h, seguido de lavado. Después,2y ZnCl 2 mM2fue añadido. La densidad óptica a 405 nm se
resultados de la cuantificación de la concentración de HA usando HABP, seis
midió cuando se añadió la solución (h0) y después de 1,5 h de incubación (h1). Para cada
pozo, (h1)
cepas acumularon HA detectable.Figura 1muestra el curso temporal de la
− (h0) se calculó y se determinó la concentración de HA. La reproducibilidad del método producción de HA por cepas productoras de HA. Cada cepa creció bien en
se evaluó realizando dos experimentos diferentes en cada cepa. La concentración media leche desnatada. Después de la fermentación, el pH de cada leche
de HA se calculó en dos experimentos diferentes. desnatada fermentada fue de aproximadamente 4,0 y el recuento de células
Aislamiento y purificación de EPS Para eliminar las proteínas, una décima parte del volumen de
viables alcanzó 108ufc/ml. Seis cepas (S. termófiloYIT 2001, 2025, 2059, 2084,
Se añadió ácido tricloroacético al 100 % (p/v) al caldo, seguido de incubación durante 2 h
a 4 °C y centrifugación durante 30 min a 18 700 ×gramoa 4 °C. Luego se agregó un
2091 y 2098) produjeron EPS que incluía HA en el caldo de cultivo. YIT 2084
volumen de etanol al 99 % al sobrenadante y la solución resultante se dejó reposar a 4 °C produjo una concentración de HA notablemente mayor (8 mg/l) que las otras
durante la noche. La solución se centrifugó durante 30 min a 18.700 ×gramoa 4 °C, y el cepas. Desde el inicio del cultivo, la concentración de HA aumentó
precipitado se dializó tres veces frente a agua ultrapura para la desionización. Para la rápidamente, alcanzando un máximo a las 10 h. A excepción de YIT 2091, las
diálisis se utilizó la membrana Spectra/Por con un corte de masa molecular de 3500 Da
otras cepas no mostraron degradación de HA.
(Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA, EE. UU.). Después de la diálisis, el pH de
la solución de EPS se ajustó a 7,0 con NaOH y se liofilizó. En este estudio, los EPS No se detectó HA en el caldo de YIT 2021, a pesar de que el caldo era el
purificados deS. termófiloLos cultivos YIT 2021, 2059 y 2084 se denominaron 2021EPS, más viscoso, lo que indica que YIT 2021 produjo diferentes tipos de EPS. Por
2059EPS y 2084EPS, respectivamente. lo tanto, seleccionamos tres cepas diferentes: YIT 2021, que no tiene
Estimación de masa molecular Para el análisis de masa molecular se utilizó un sistema HPLC productividad de HA; YIT 2059, que tiene una productividad HA media; y YIT
usado. Se disolvieron diez miligramos de cada EPS en 1 ml de NaCl 50 mM. Se utilizó NaCl (50
2084, que tiene una alta productividad de HA para producir EPS en los
mM) como tampón de ejecución. El análisis se llevó a cabo en una columna Shodex SUGAR KS-804
(Showa Denko, Tokio). La temperatura de la columna fue de 80 °C y el caudal fue de 1 ml/min. siguientes experimentos.
Para la detección se utilizó el detector de índice de refracción RI980 (Labosystem, Tokio). Estimación de masa molecular Para estimar la masa molecular de
EPS, se realizó GPC. Los perfiles GPC de todos los EPS examinados se
Para obtener una fracción de masa molecular alta para el análisis por espectroscopía de
muestran enFigura 2(C.A). Todos los EPS aislados mostraron un pico
RMN, se fraccionó el 0,5 % de cada una de las soluciones acuosas de 2084EPS y HA estándar
aproximadamente a los 7 min, correspondiente a 2000 kDa de masa
mediante GPC de columna abierta. Se utilizó hidrobicarbonato de amonio (50 mM) como tampón
de funcionamiento y el caudal fue de 0,25 ml/min. Se utilizó una columna de 1,6 x 90 cm que molecular calculada a partir de los marcadores de masa molecular. El pico
contenía Sephacryl-400 HR (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Para la detección se de 2059EPS fue pequeño en comparación con los picos correspondientes de
utilizó el detector de índice de refracción YRD-880 (Shimamuratec, Tokio). Para la calibración se los otros EPS. Por otro lado, 2084EPS y 2021EPS dieron altas cantidades de
utilizaron glucosa, lactosa y dextranos con masas moleculares de 11,7, 580 y 2000 kDa.
polisacáridos de alto peso molecular. En particular, 2084EPS dio un pico
Análisis de composición de monómeros El análisis de la composición de monómeros se llevó a cabo
amplio de 2000 a 100 kDa y un pico único de aproximadamente 50 000 Da
por el método derivado de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP) como se describió anteriormente
(20)con modificaciones menores. Se añadieron diez miligramos de EPS liofilizado a 1 ml de
metanol que contenía HCl al 5 % y la mezcla resultante se calentó a 100 °C durante 2 h. Después
de la evaporación, se añadió 1 ml de ácido trifluoroacético 4 M, seguido de calentamiento a 100
°C durante 1 hora. El hidrolizado se evaporó y se añadieron 2 ml de agua desionizada. De esta
solución de hidrolizado, 200 μl se mezclaron con 200 μl de metanol que contenía 0,5 M PMP y 100
μl de 0,6 M NaOH, seguido de incubación a 70 °C durante 30 min. Después de la incubación, se
añadieron 600 μl de HCl 0,1 M. Luego se eliminó el exceso de PMP usando cloroformo. Los
monómeros de PMP se separaron por HPLC con Symmetry 300 C185 mm en una columna de 4,6 ×
250 mm (Waters, Milford, MA, EE. UU.) y se detectó utilizando un detector UV Waters 486 (Waters)
a 245 nm. Se usó tampón de fosfato de potasio cien mM (pH 7,0) como tampón de
funcionamiento. La temperatura de la columna fue de 35 °C y el caudal fue de 1 ml/min.

espectroscopia de RMN La fracción de masa molecular alta de 2084EPS y estándar

Los HA se obtuvieron usando Sephacryl-400 HR y se liofilizaron. Las muestras se
disolvieron en D2O, y sus1Mano13Los espectros de C-NMR se registraron a 30 °C con un
espectrómetro ECA-500 FT-NMR (500 MHz) (JEOL, Tokio). Acetona (2,22 ppm para1H- o
35,0 ppm para13C-NMR) se utilizó como referencia interna. Ensayo de actividad HAase
El ensayo de actividad HAasa se llevó a cabo usando dos
métodos.
El primer método se basó en la reacción de color de Morgan-Elson.(21–23). En este método,
se midió el resto GlcNAc escindido por HAasa. Para activar la HAasa en el caldo de cultivo, se
incubaron 100 μl del compuesto 48/80 (MP biomedicals, CA, EE. UU.) y 50 μl del sobrenadante del
cultivo a 37 °C durante 20 min. Como control, se usaron de 0 a 25 µl de 5 mg/ml de HAasa de HIGO. 1. Evolución temporal de la concentración de ácido hialurónico en leche desnatada con seis
testículo bovino (Sigma) en tampón de acetato de sodio 0,2 M (pH 4,0) en lugar del sobrenadante altamente productivasStreptococcus thermophiluspresiones. Símbolos: círculos abiertos,S.
del cultivo. El volumen total se ajustó a 150 μl mediante la adición de tampón de acetato de sodio termófilo YIT 2084; triángulos abiertos,S. termófiloYIT 2059; triángulos cerrados,S. termófiloYIT
0,2 M (pH 4,0). Luego, se agregaron 250 μl de solución de HA de potasio de 1,0 mg/ml en tampón 2091; plazas abiertas,S. termófiloYIT 2001; cuadrados cerrados,S. termófiloYIT 2025; y diamantes
de acetato de sodio 0,2 M (pH 4,0), seguido de incubación. abiertos,S. termófiloYIT 2098.
VOL. 107, 2009
HIGO. 2. Perfiles GPC de cada EPS y leche descremada no fermentada. (A) 2021EPS; (B) 2059 EPS;
(C) 2084 EPS; y (D) leche descremada no fermentada. Las líneas verticales representan
marcadores de masa molecular: (a) 2000 kDa; (b) 580.000 Da; (c) 11.700 Da, (d) 342 Da; y (e) 180
Da. La flecha indica la fracción de masa molecular alta.
(Figura 2(C)). Los tres picos de baja masa molecular de 10 a 12 min se
consideran oligosacáridos de leche desnatada, porque la leche desnatada no
fermentada también presentó tres picos de baja masa molecular (Figura 2
(D)).
Análisis de composición de monómeros Para examinar el monómero
composición de todo el EPS, se usaron fracciones moleculares enteras de los
EPS para el análisis de la composición de monómeros.tabla 1muestra el
porcentaje molecular de constituyentes de monosacáridos de EPS. 2084EPS
y 2059EPS mostraron altas cantidades de GlcNAc y GlcA, que son los
principales componentes sacáridos de HA. En particular, 2084EPS mostró
mayores cantidades de estos sacáridos que 2059EPS. Se mantuvieron
pequeñas diferencias en los contenidos de ribosa, glucosa (Glc) y galactosa
(Gal) entre 2059EPS y 2084EPS. Esta diferencia parecía estar causada por la
fracción de masa molecular más pequeña de los EPS. Por otro lado, 2021EPS
comprendía Glc y Gal, lo que implica que es un tipo diferente de
polisacárido. Estos resultados correspondieron a los del ensayo HABP. Sin
ramnosa, ácido galacturónico,NORTE-Se detectó acetil galactosamina,
arabinosa o fucosa en todos los EPS. La fracción de masa molecular alta de
2084EPS (2084EPS-h) (Figura 2(C) flecha) se purificó mediante GPC en
columna abierta. 2084EPS-h contenía cantidades casi iguales de los dos
monómeros GlcNAc (54,4 %) y GlcA (45,6 %), que se estimó que eran
polisacáridos similares a HA. No se detectó ningún otro sacárido en
2084EPS-h. La leche descremada no fermentada estaba compuesta por Glc y
Gal, que probablemente provenían de mono y oligosacáridos (tabla 1).
espectroscopia de RMN Para determinar las estructuras de 2084EPS-h
y se llevó a cabo espectroscopía estándar de HA, RMN. La estructura y13Los
espectros C-NMR de HA estándar se muestran enFig. 3A. Standard HA y 2084EPS-h
mostraron señales en la misma posición (Fig. 3ANTES DE CRISTO). Por ejemplo, los
desplazamientos químicos del carbono en β-D-Las unidades de
glucopiranosiduronato (ppm) de HA estándar y 2084EPS-h fueron C1 (102,9,
102,7), C2 (72,1, 72,1), C3 (73,2, 73,2), C4 (80,0, 80,0), C5 (75,9, 75,3) y C6 (175.6,
175.6). Estas señales correspondían a la de HA en un informe anterior(26). Los
resultados de1La espectroscopia H-NMR también muestra señales similares entre
HA estándar y 2084EPS-h (datos no mostrados). Sobre la base de los resultados del
análisis de la composición de monómeros y la espectroscopia de RMN, se
determinó que 2084EPS-h era HA.
Ensayo de actividad HAase Para investigar el riesgo potencial de HA
degradación por enzimas intrínsecas de YIT 2084, se examinó la actividad
HAase. El sobrenadante de cultivo de YIT 2084 se usó para el ensayo de
actividad de HAasa. En el control, el aumento del volumen de la enzima dio
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO HIALURÓNICO PORS. TERMOFILO 121
cantidades crecientes del resto GlcNAc. Sin embargo, no hubo diferencias en
la concentración de GlcNAc entre los sobrenadantes de cultivo con y sin HA
(datos no mostrados). Estos datos sugieren la ausencia de actividad HAasa
en el sobrenadante del cultivo. Aunque se detectó una pequeña cantidad de
GlcNAc en las muestras de sobrenadante de YIT 2084, se consideró que era
GlcNAc libre producida por YIT 2084. En el ensayo de placa de HA, no se
observó una zona clara alrededor de las colonias (datos no mostrados). Por
lo tanto, YIT 2084 no mostró actividad HAasa.
DISCUSIÓN
Para seleccionarS. termófiloproduciendo EPS con un alto contenido de
HA, se utilizó el método HABP para la primera selección. Los caldos de
cultivo diluidos de seis cepas mostraron una reacción positiva a la HABP (
Figura 1). Existía la posibilidad de que la HABP se uniera de forma no
específica a los metabolitos en los caldos de cultivo porque las muestras se
aplicaron antes de la purificación. El caldo de cultivo de YIT 2021 no mostró
reacción con HABP aunque los 2021EPS incluyen una fracción de masa
molecular alta (Figura 2A). Sin embargo, el caldo de YIT 2084 reaccionó
positivamente con HABP. Por lo tanto, el cribado con el método HABP
pareció ser suficiente para la selección inicial de LAB productoras de HA.
Usando GPC, se encontró que tres cepas seleccionadas produjeron EPS
con una alta masa molecular de aproximadamente 2000 kDa. La
productividad de esa fracción dependía de la cepa (Figura 2). YIT 2021 y 2084
producen eficientemente fracciones de alta masa molecular. A partir de los
resultados del análisis de composición de monómeros, 2084EPS tenía un
alto contenido de GlcNAc y GlcA, que son los componentes principales de
HA. Se estimó que la fracción de masa molecular alta de 2084EPS (2084EPS-
h) era HA, porque los contenidos de GlcNAc y GlcA aumentaron
significativamente con la purificación (tabla 1). Según los resultados de los
análisis estructurales (1Mano13espectroscopias C-NMR), el 2084EPS-h
constaba de unidades HA. Aunque otra fracción fue detectada en 2084EPS
por GPC (Figura 2C), esta fracción probablemente era EPS con una pequeña
cantidad de HA sobre la base de los resultados de las composiciones de
monómeros entre las fracciones moleculares completas de 2084EPS y
2084EPS-h. Curiosamente, YIT 2021 también produjo una fracción de alta
masa molecular (Figura 2A), aunque el caldo de cultivo de esta cepa
reaccionó negativamente con la HABP.
Sobre los datos completos del genoma deS. thermohilusCNRZ1066, LMD-9 y
LMG 18311 en la base de datos GenBank, los genes HA sintasa (HAS) (tiene A, tiene
Bytiene c)no han sido reportados. Por lo tanto, YIT 2084 poseería diferentes tipos
de genes relacionados con HAS de los de las bacterias productoras de HA
convencionales.
En general, la masa molecular del HA producido por bacterias es de
varios millones de Da.(11). 2084EPS-h tiene un rango de masa relativamente
bajo y amplio (2000 a 100 kDa). Se ha informado que la fracción de masa
molecular media de HA (hasta 200 kDa) estimula los macrófagos
inflamatorios para producir importantes mediadores de lesión y reparación
de tejidos, como citocinas, quimiocinas, especies reactivas de nitrógeno y
factores de crecimiento.(27, 28). Por lo tanto, el prometedor 2084EPS-h
tendría impacto como nuevo HA funcional en las aplicaciones.
TABLA 1.Porcentajes de composición de monómeros de todos los exopolisacáridos
2021EPS 2059EPS 2084EPS 2084EPS-hbLeche desnatada no fermentada
Hombre 0a 1.1 0.9 0 0
GlcNAc 0 12.4 16.1 54.4 0
Costilla 0 3.6 11.3 0 0
GlcA 0 6.6 22.1 45.6 0
glc 70.3 23.3 26.6 0 42.0
Galón 23.7 53.0 23.0 0 58.0
Hombre, manosa; GlcNAc,NORTE-acetil glucosamina; Costilla, ribosa; GlcA, ácido glucurónico; Glc,
glucosa; Gal, galactosa.
aLa composición se expresa en mol%.
bFracción de alta masa molecular de 2084EPS.
122 IZAWA ET AL.
HIGO. 3. (A) Estructura de HA.13Espectro C-NMR (500 MHz) de (B) HA estándar y (C) 2084EPS-h. Los números corresponden a ubicaciones de carbono.
YIT 2084 no mostró actividad HAasa en dos ensayos diferentes. Este
resultado indica que el HA en el caldo de cultivo se acumuló sin
digestión a través de la fermentación. YIT 2084 también mostró un
crecimiento y una formación de ácido equivalentes en leche desnatada
en condiciones experimentales preliminares en comparación con otras
cepas (datos no mostrados). Además, la leche desnatada fermentada
por YIT 2084 no tenía olor extremadamente viscoso ni peculiar. Por lo
tanto, YIT 2084 tiene potencial para la producción eficiente de HA,
aunque las condiciones de cultivo aún deben mejorarse. Para uso
industrial, se requiere al menos un aumento de 10 veces en el
rendimiento de HA. La separación del 2084EPS-h sería difícil porque
contiene una masa molecular media de HA, sin embargo, la bacteria
segura YIT 2084 hace posible simplificar los pasos de purificación.
S. termófiloes filogenéticamente cercano a los estreptococos patógenos.
Sin embargo, según el resultado del análisis genómico comparativo, la mayoría de
los genes relacionados con la virulencia de los estreptococos están inactivados o
ausentes en los productos lácteos.S. termófilo(29). El riesgo de la posible
coproducción de esta toxina con el uso de estreptococos patógenos es motivo de
preocupación(4, 11, 13). Sin embargo, el uso de YIT 2084 elimina esta
preocupación.
JBIOSCI. BIOENG.,
En este estudio, encontramos queS. thermophilus,que pertenece al grupo de
GRAS (generalmente reconocido como seguro), puede producir EPS que incluyen
HA con una amplia gama de masas moleculares. Por lo tanto, sugerimos que esta
bacteria es adecuada para la producción de HA debido a su seguridad. HA con su
amplia gama de masas moleculares podría ser un material útil en aplicaciones
médicas, cosméticas y alimentarias.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Los autores agradecen a Masae Sasamoto por preparar las cepas
bacterianas y a Yasuyuki Takahashi y Saho Sugimoto por su útil
discusión.
Referencias
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