UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE MEDICINA
CÁTEDRA DE GENÉTICA CLÍNICA

TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR Y

APLICACIONES

DOCENTE
DR. RAMÓN VARGAS

SUBGRUPO 3

INTEGRANTES
ARÉVALO SANTANA SILVIA NICOLE
MALDONADO ANGULO ARIANA MYLENA
NAVARRETE SANGUÑA NATALIA MICHELLE
VALAREZO HIDALGO MARÍA EDUARDA

MED-S-CO-8-3
2023 – 2024 CI
Contenido
Contenido........................................................................................................................................1
Objetivos......................................................................................................................................3
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................4
Secuenciación del ADN...............................................................................................................4
¿Qué es la secuenciación del ADN?................................................................................................4
Aplicaciones de la secuenciación del ADN.....................................................................................4
Métodos clásicos de secuenciación: Sanger y Maxam-Gilbert..................................................5
Método de secuenciación enzimática de Sanger.............................................................................5
Método químico de Maxam y Gilbert..........................................................................................7
Síntesis del proceso de secuenciación del Maxam y Gilbert.......................................................9
Otros................................................................................................................................................9
Métodos de secuenciación del ADN: Secuenciación de alto rendimiento: la secuenciación de
la próxima generación...................................................................................................................9
MÉTODOS AUTOMATIZADOS.............................................................................................10
Secuenciación por Illumina.................................................................................................10
Pirosecuenciación.................................................................................................................10
Reacción en cadena de polimerasa (PCR).....................................................................................11
Utilidad de la PCR.....................................................................................................................12
Componentes requeridos para la PCR.......................................................................................12
Fases de la reacción...................................................................................................................13
1. Desnaturalización:.......................................................................................................13
2. Hibridación o anillamiento de cebadores:...................................................................13
3. Elongación o extensión del primer por la ADN polimerasa........................................13
Análisis del producto amplificado.............................................................................................14
PCR en tiempo real........................................................................................................................15
¿Cuáles son los métodos para detectar los productos amplificados?........................................15
 Métodos inespecíficos.....................................................................................................15
 Métodos específicos........................................................................................................15
¿Cómo se captura la señal de fluorescencia?.............................................................................16
 Curva de amplificación:..................................................................................................16
 Curva de disociación o Melting:.....................................................................................17
 Métodos de cuantificación de la expresión génica....................................................................17
 Cuantificación absoluta mediante la curva estándar:......................................................17
 Cuantificación relativa mediante el método Livak.........................................................17
MLPA “Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples”...................................17
Etapas.........................................................................................................................................18
Aplicación..................................................................................................................................18
Variantes....................................................................................................................................19
Ventajas......................................................................................................................................20
Limitaciones..............................................................................................................................20
BIBLIOGRAFÍA:........................................................................................................................22
 Objetivos

1. Definir el concepto de secuenciación del ADN, las técnicas utilizadas y las aplicaciones,
mediante seminario y diapositivas para socializar el conocimiento.

2. Sintetizar los procesos de secuenciación enzimática de Sanger, mediante seminario y

diapositivas para socializar el conocimiento

3. Describir los procesos del método químico de maxam y gilbert

4. Identificar otros métodos de secuenciación de la nueva generación: método automatizado,

pirosecuenciación e ilumina

5. Identificar la técnica utilizada en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) mediante el

estudio detallado de sus fases para reconocer la utilidad de su aplicación.

6. Detallar los componentes requeridos para realizar una PCR.

7. Establecer la diferencia entre una PCR y qPCR

8. Conocer la importancia de la técnica de amplificación de sondas dependiente de ligandos

múltiples (MLPA) mediante la explicación de su metodología, aplicaciones, variantes,
ventajas y limitaciones.
 INTRODUCCIÓN
Las técnicas de genética molecular son herramientas que permiten el análisis y manipulación de
la información genética presente en el ADN. Desde su descubrimiento, estas técnicas han
revolucionado la biología y han abierto nuevas posibilidades para entender la genética de los
organismos, su evolución y su relación con el ambiente. Las aplicaciones de estas técnicas en la
investigación y la industria son amplias y diversas, y han permitido avances significativos en
campos como la medicina, la agricultura y la biotecnología. En este sentido, la genética
molecular se ha convertido en una disciplina clave para el estudio de la vida y sus procesos
fundamentales. En este contexto, resulta fundamental conocer en detalle las técnicas y
aplicaciones de la genética molecular para entender su impacto y sus potenciales beneficios. Las
técnicas que se incluyen en el seminario serán: la secuenciación del ADN, reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) y amplificación múltiple de sondas dependiente de ligamiento (MLPA).

Secuenciación del ADN

¿Qué es la secuenciación del ADN?

En términos concretos es el proceso en el cual se determina la secuencia de nucleótidos de un
fragmento de ADN, esta es una técnica que permite leer la información contenida en el material
genético de un organismo.

Aplicaciones de la secuenciación del ADN

Las aplicaciones de la secuenciación del ADN son muy diversas y abarcan múltiples áreas de la
biología, la medicina, la agricultura, la biotecnología y la investigación científica en general.
Algunas de las principales aplicaciones son:

 Estudios de evolución y biodiversidad.

 Agricultura y mejora genética de cultivos.
 Análisis forense y de paternidad.
 Estudios de microbiología.

En medicina, la secuenciación del ADN, desde la década de los setenta viene influyendo en los
diagnósticos y tratamientos de diferentes enfermedades y actualmente el uso de esto en medicina
puede estar orientado en:
  Identificación de enfermedades genéticas: La secuenciación del ADN se utiliza para
identificar mutaciones genéticas causantes de enfermedades hereditarias. Esto permite el
diagnóstico de enfermedades genéticas en pacientes y en familias, y la identificación de
portadores asintomáticos.
 Diagnóstico y tratamiento personalizado del cáncer: La secuenciación del ADN de los
tumores permite identificar mutaciones específicas que pueden ser tratadas con terapias
personalizadas. Además, la secuenciación del ADN se utiliza para detectar la presencia de
células tumorales circulantes y para evaluar la eficacia de los tratamientos.
 Medicina de precisión: La secuenciación del ADN se utiliza para identificar variaciones
genéticas que afectan la respuesta de los pacientes a los fármacos. Esto permite la
selección de tratamientos más efectivos y la reducción de efectos secundarios.
 Diagnóstico de enfermedades infecciosas: La secuenciación del ADN se utiliza para
identificar patógenos en muestras clínicas y para determinar la resistencia a los
antibióticos. Esto permite el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades infecciosas con
mayor precisión.
 Diagnóstico prenatal: La secuenciación del ADN se utiliza para detectar anomalías
cromosómicas y mutaciones genéticas en el feto durante el embarazo. Esto permite el
diagnóstico temprano de enfermedades genéticas y la toma de decisiones informadas
sobre la gestión del embarazo.

En esencia, la secuenciación del ADN es una herramienta esencial en múltiples áreas de la

ciencia y la tecnología, y su uso seguirá siendo cada vez más relevante en el futuro.

Métodos clásicos de secuenciación: Sanger y Maxam-Gilbert

Método de secuenciación enzimática de Sanger

La secuenciación del ADN por el método de Sanger es una técnica que permite obtener la
secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN. Según Thompson (2016), la técnica más
utilizada para el análisis de secuencias de DNA es la secuenciación Sanger. A continuación, se
describen los pasos principales del proceso:
1. Preparación de la muestra: Se aísla el fragmento de ADN que se va a secuenciar y se
amplifica mediante la técnica de la PCR para obtener una cantidad suficiente de
moléculas de ADN para la secuenciación.
2. Preparación de la mezcla de reacción: Se prepara una mezcla de reacción que contiene
la muestra de ADN, un iniciador (primer), ADN polimerasa, nucleótidos marcados con
fluoróforos y dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcados con una etiqueta fluorescente
diferente para cada nucleótido.
3. Extensión de la cadena de ADN: La ADN polimerasa
incorpora los nucleótidos marcados a la cadena de ADN en
crecimiento hasta que encuentra un ddNTP, que detiene la
elongación de la cadena porque carece del grupo 3’-OH
necesario para la formación del enlace fosfodiéster.
4. Separación de las cadenas: Se separan las cadenas de
ADN recién sintetizadas según su longitud mediante una
electroforesis en gel de poliacrilamida, que separa los fragmentos de ADN según su
tamaño.
5. Detección y análisis de la secuencia: La secuencia de nucleótidos se lee mediante la
detección de los fluoróforos correspondientes a cada ddNTP, que emiten una señal
luminosa al ser excitados por un láser. El patrón de emisión de luz permite determinar el
orden de los nucleótidos.
6. Ensamblaje de la secuencia: Finalmente, se ensamblan los fragmentos de secuencia
obtenidos en un orden coherente para obtener la secuencia completa del fragmento de
ADN.
7. Interpretación de la secuencia: La secuencia de nucleótidos se deduce a partir de la
longitud de los fragmentos y de la posición de los ddNTPs que terminaron la síntesis de
cada fragmento.
 Este proceso se repite varias veces
para obtener una secuencia más
precisa y fiable, ya que los ddNTPs
se incorporan al azar, lo que
permite confirmar la secuencia en
diferentes lugares del fragmento.
La secuenciación de Sanger ha sido
una técnica fundamental en la
historia de la genómica y ha
permitido la secuenciación de
muchos genomas importantes,
incluyendo el genoma humano.

Método químico de Maxam y Gilbert

El método de secuenciación de Maxam y Gilbert consiste en un proceso de degradación química,
posterior a la separación y fragmentación de la doble hebra de ADN que participa en el proceso,
siendo la fragmentación la característica que le atribuye a este proceso un cierto grado de labor
exhaustiva. Este proceso se rige a través de los siguientes pasos:

 La modificación de una base

 La eliminación de la base modificada
 Rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada
 El análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida. 
La modificación de la base le confiere la especificidad para el posterior corte y secuenciación
como resultado final. Este proceso está asociado a la inducción con gamma 32p que son isotopos
radioactivos de fosforo (fosfatasa alcalina: elimina el fosfato terminal del extremo 5’ - fosfato:
produce hebra marcada de forma terminal)
respectivamente, de manera continua se
produce la fragmentación selectiva a nivel de las bases marcadas a través del tratamiento con
piperidina seguido por una inducción química a través de 4 reacciones químicas específicas para
G – A y G – C -C y T que generan los fragmentos marcados de diferentes tamaños, representando
las posiciones de la base indicada en la secuencia.
El proceso es discontinuo debido a que la escisión e hidrolisis de la cadena en secuencia se
genera por fragmentos, en especificidad de la base marcada; además este proceso está limitado a
unos 100 – 500 nucleótidos.

Como última parte del proceso de secuenciación de Maxam y Gilbert se consta de la colocación
de la secuencia en una base de gel de poliacrilamida para determinar la lectura en base al patrón
de bandas radioactivas generadas por base (fragmentos de Adn que tiene una sola base expuesta.)
El resultado final es una lectura de la secuencia de nucleótidos en el fragmento de ADN, con
cada base identificada en su posición correspondiente en la cadena.
Síntesis del proceso de secuenciación del Maxam y Gilbert

Otros

Métodos de secuenciación del ADN: Secuenciación de alto rendimiento: la

secuenciación de la próxima generación
Las técnicas de secuenciación de alto rendimiento se desarrollaron y se desarrollará para abordar
las limitaciones y desafíos de la secuenciación de Sanger, que era la técnica dominante para la
secuenciación del ADN en ese momento.
 MÉTODOS AUTOMATIZADOS
Secuenciación por Illumina

Principalmente se genera el estudio a través de la adhesión de los 4 nucleótidos marcados

previamente con fluoro foro independientemente. Estos subsecuentemente deben ser
fragmentados y por ende desnaturalizados para ser asociados a los adaptadores (son secuencias
de ADN sintéticas que se unen a los extremos de los fragmentos de ADN para permitir su
amplificación y secuenciación)

Posteriormente, cada fragmento monocatenario es amplificado por el compuesto de cebadores de

la PCR generando entre 100 – 200 millones de grupos clonales de amplificación

Pirosecuenciación
Es un método de secuenciación que se encuentra ligado a la captación y medición de la
liberación de pirofosfato cada que una medición se la realiza a través de bioluminiscencia.

Un agente cebador se une a la cadena de ADN sencilla en presencia de dNTPS (adenina, timina,
citosina y guanina), ADN polimerasa, ATP sulfirasa, luciferasa y la aspirasa.

El proceso comienza con la asociación del primero de

los cuatro dNTPS, si bien este resulta ser
complementaria a la base de la secuencia molde del
ADN, se liberará PPi (pirofosfato)

 La ATP sulfirasa es una enzima que

cataliza la conversión del ATP (adenosín
trifosfato) en pirofosfato y adenosina 5'-
fosfosulfato
  La luciferasa es una enzima que cataliza la oxidación de la luciferina, un compuesto
orgánico, para producir luz
 Aspirasa se encarga de degradar el ATP y los
dNTPS no asociados a la cadena para
paulatinamente ir apagando la reacción y
emisión de luz.
Las entidades enzimáticas ATP sulfirasa y la luciferasa, son las encargadas de generar le
producción de luz y su intensidad, siendo esta última proporcional a la cantidad de ATP presente.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Es un proceso bioquímico in vitro, extraordinariamente versátil debido a su sensibilidad,

especificidad y sencillez; esta técnica nos permite mediante varios ciclos repetidos amplificar un
fragmento de ADN de interés a partir de una muestra de ADN, obteniendo como resultado
millones de copias de dicho fragmento.
Mullis y Faloona en 1987 realizaron los primeros experimentos de amplificación con PCR,
además desarrollaron el primer termociclador; por ello en 1993, se le otorgó el premio nobel de
química al bioquímico Kary Mullis.
Si utilizamos como sustrato al ADN genómico, entonces estamos hablando típicamente de una
PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico
mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés); y
para ello se requerirá su conversión mediante la transcripción reversa, a partir de la cual el
ARNm es transformado a ADNc. por la acción de la transcriptasa reversa.

Utilidad de la PCR
La PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos. Usando PCR, una secuencia de
ADN puede amplificarse millones o miles de millones de veces y producir suficientes copias de
ADN para ser analizadas por otros métodos.
 Detección de microorganismos: esta técnica nos permite gracias a su velocidad,
sensibilidad y precisión identificar la presencia de microorganismos detectando el ADN
de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente. Por ello, este método también
suele utilizarse para detectar casos de VIH o hepatitis B.
 Identificación y detección de mutaciones heredades o adquiridas: con el fin de
determinar si son portadores de la enfermedad, esta prueba puede realizarse a los padres o
a su vez analizar el ADN del embrión en muestras de líquido amniótico.
 Pruebas de paternidad: tiene la capacidad de determinar el grado de parentesco entre
dos personas. Esto requiere un pretratamiento de la muestra, donde el ADN se corta en
pequeños fragmentos con enzimas y estos fragmentos se unen a cebadores de PCR
vinculados a secuencias polimórficas diferentes y heredadas para cada individuo.
 Arqueología y paleontología: su alta sensibilidad lo hace útil para estudiar residuos de
ADN conservados en tejidos momificados, restos óseos o incluso, este método permite
identificar el organismo patógeno responsable de las epidemias de siglos pasados
mediante el análisis de restos de material genético conservados.
 Botánica: mediante esta técnica podemos realizar el estudio de la evolución de especies
vegetales o las variedades de una especie.
 Genética forense y medicina legal: la PCR permite establecer polimorfismos de ADN;
es útil además porque a partir de muestras de sangre, saliva u otros restos biológicos nos
permite identificar un cadáver o el autor de un crimen

Componentes requeridos para la PCR

 ADN molde o temblado de ADN: cadenas de ADN separadas que sirven como molde en
la reacción.
 ADN polimerasa: enzima encargada de la catálisis, sintetizando nuevas cadenas de
ADN, la más utilizada es la enzima termoestable TaqADN polimerasa.
 Primers o cebadores: secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la
secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a la misma.
Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases. Se usan dos secuencias
diferentes de primers; una denominada “forward” y otra “reward”, ambas están diseñadas
para que hibriden con el templado de ADN y dejan un segmento 3´ libre para la acción de
la Taq polimerasa.
  Desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina):
representan las bases nitrogenadas con los que la ADN polimerasa construye una nueva
hebra de ADN.
 Buffer: sustancia amortiguadora que garantiza el medio óptimo para la reacción.
 Magnesio: cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción.
 Agua: disolvente de la reacción, se usa en forma destilada libre de nucleasas.
 Tubo de PCR: sitio donde se mezclarán todos los componentes antes mencionados, y
posteriormente será colocado en el termociclador.
 Termociclador: dispositivo automático donde se llevan a cabo los 3 pasos o fases de la
PCR, el equipo está diseñado para establecer un sistema homogéneo en donde las
condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los
ciclos.

Fases de la reacción.

Las 3 fases se llevan a cabo en el termociclador, para ello se requiere que previamente los
componentes hayan sido colocados en el dispositivo.
1. Desnaturalización: las cadenas de ADN son separadas tras su exposición a elevadas
temperaturas (94-96°C) durante 20-30 segundos. Como resultado se obtiene la ruptura de
los enlaces de puentes de hidrógenos lo cuales eran responsables de mantener unidas
ambas hebras de ADN, por ende, obtenemos dos cadenas por separado las cuales servirán
de molde para continuar con el proceso de amplificación.
2. Hibridación o anillamiento de cebadores: la temperatura desciende a 50-60°C con el
objetivo de permitir que los primers o cebadores se alineen en el extremo 3´ del templado
y unan a las cadenas por complementariedad de las bases. Se requiere que el diseño de
los primers sea el correcto y que la temperatura sea la adecuada para garantizar la
especificidad de la reacción.
3. Elongación o extensión del primer por la ADN polimerasa: tras la unión de los primers a
las cadenas complementarias empieza la acción de la ADN polimerasa, la enzima actúa
sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy
rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. Para
esta fase se requiere una temperatura de 72 °C y la nueva cadena se sintetiza en dirección
5’ a 3’.
Al final del primer ciclo obtenemos la síntesis de una nueva cadena complementaria a la cadena
original, sin embargo, la PCR se completa con 30 a 40 ciclos y a medida que suceden estos ciclos
se generan más copias.

Análisis del producto amplificado

Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son
visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa. La electroforesis implica la
separación de moléculas grandes como los ácidos nucleicos a través
de una matriz sólida que actúa como filtro y separa las moléculas en
un campo eléctrico según su tamaño y carga. Para ello, se requiere de
un buffer o tampón y un gel el cual se obtiene diluyendo agarosa en el
buffer y se calienta hasta que la agarosa hierva lo suficiente,
posteriormente se vacía en un recipiente de base para que se
solidifique; generalmente se prepara 1.2% de gel; otro ingrediente
requerido es una molécula intercalante denominada como bromuro de
etidio, la cual se caracteriza por tener afinidad a la doble cadena de
ADN, y tras exponerse con luz UV, es excitado y emite una señal que
permite la visualización de los amplicones en forma de banda.
Al momento de colocar la muestra en el gel se logra observar en el
primer carril un standard o marcador de peso molecular, cada una de
las bandas representa un fragmento de tamaño conocido, suelen aparecer unas bandas con mayor
intensidad que otras, las mismas nos servirán como referencia para facilitar la visualización de
nuestro fragmento de ADN amplificado, puesto que los fragmentos de ADN de la misma
longitud forman una "banda" en el gel y de dicha manera es posible identificar si la banda
observada si corresponde a nuestro fragmento.
PCR en tiempo real.
En 1992, Higuchi y colaboradores pusieron las primeras bases para el desarrollo de la PCR en
tiempo en real, al videograbar la incorporación de bromuro de etidio al ADN en tiempo real
durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV; desde allí se estableció el principal objetivo
de esta técnica, que se resume en detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos
nucleicos presentes en la reacción mediante el uso de reporteros fluorescentes. La diferencia con
la PCR convencional es la forma en como se detectan y analizan los productos de amplificación,
puesto que, en esta técnica, no se requerirá la manipulación con gel de agarosa para confirmar el
éxito de la reacción, ya que podremos detectar los productos amplificados en tiempo real durante
cada ciclo. Los componentes utilizados son los mismos utilizados en una PCR convencional,
agregando el uso de reporteros fluorescentes, y estos ingredientes se encuentran mezclados en un
“Máster mix”
Esta técnica se caracteriza por ser mas sensible y más específica, permite discriminar distintos
productos y analizar múltiples muestras, por ello es útil en el estudio de la expresión génico,
micro ARNs y el genotipaje.

¿Cuáles son los métodos para detectar los productos amplificados?

Podemos identificar dos métodos para detectar los productos amplificados:

 Métodos inespecíficos: utilizan moléculas intercalantes caracterizadas por tener afinidad
por la doble cadena de ADN y emitir una señal fluorescente tras su oxidación.
o SYBR Green: es activado al intercalar en el ADN de doble cadena y como
respuesta emite fluorescencia, y se
desactiva en las cadenas simples; su uso
debe ser cuidadoso para evitar formar
dímeros de cebadores o amplificar
regiones no deseadas para el estudio.
 Métodos específicos: transmiten energía desde un donador fluorescente a un aceptor,
utilizan la transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET) para generar
la señal.
o Sondas Taqman: cuenta con un fluróforo en su extremo 5´ y un quencher en su
extremo 3´, se une por complementariedad de las bases durante el anillamiento y
es degradada por la ADN polimerasa durante la elongación; como resultado de la
separación se sus extremos, emite una señal que es captada por el fotoreceptor.
Este método es muy utilizado en la detección de polimorfismos y mutaciones del
ADN, en el análisis genotípico y la expresión génica.
 o Sondas Beaton: tiene forma de horquilla, el fluróforo se ubica en su extremo 5´ y
el quencher en su extremo 3´, emite una señal fluorescente cuando el quencher
está alejado a la secuencia de interés por efecto de la hibridación. Este método es
útil en el genotipaje y expresión génica de muestras de AND o ANDc.

¿Cómo se captura la señal de fluorescencia?

Para la detección de los productos amplificados también se requiere de la tecnología incluida en

los termocicladores de PCR en tiempo real, para permitir la excitación del reportero, la emisión
de la señal y su captura en el fotodetector para posteriormente realizar el análisis cuantitativo de
la muestra. Generalmente los termocicladores están proveídos de una PC con un software que
genera distintas gráficas que muestran los datos requeridos para comprobar el éxito de la
reacción:
 Curva de amplificación: muestra el progreso de la reacción, la detección se da mediante
la medición del incremento de la temperatura, siendo esta última proporcional al aumento
de ADN.
  Curva de disociación o Melting: muestra información sobre la especificidad de la
reacción mediante la observación de un único pico de amplificación que nos garantiza
que los amplicones formados son del tamaño esperado.

Métodos de cuantificación de la expresión génica.

 Cuantificación absoluta mediante la curva estándar: permite conocer el número exacto de

copias amplificadas o saber cual es la concentración de ácidos nucleicos presentes en la
muestra. Este tipo de cuantificación es útil para medir la carga viral o bacteriana de los
tejidos; para ello se utiliza una recta estándar.
 Cuantificación relativa mediante el método Livak: permite evaluar cambios en la
expresión de genes en distintos estadios fisiológicos, los cambios se basan en los niveles
de ARNm del gen blanco comparado a un gen housekeeping (de referencia) que no
cambia su expresión en los distintos estados fisiológicos.

MLPA “Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples”

MLPA "Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples". Es una técnica variante de
la reacción en cadena de PCR de la ADN polimerasa múltiple, utilizada en genética molecular
para detectar y cuantificar copias de secuencias de ADN específicas en una muestra.

El MLPA como tal, combina la amplificación de múltiples secuencias de ADN mediante la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la hibridación de sondas de ADN específicas.
Estas sondas se diseñan para unirse a secuencias objetivo específicas en la muestra de ADN. El
proceso implica la ligadura de sondas de ADN a las secuencias objetivo en la muestra, seguida
de la amplificación de las sondas ligadas mediante PCR. Luego, se analiza la cantidad de ADN
amplificado para determinar la presencia y la cantidad de las secuencias objetivo en la muestra.

Etapas
Se divide típicamente en los siguientes pasos:

 Desnaturalización del ADN e hibridación de las sondas: Se diseñan sondas de ADN

específicas que se unirán a las secuencias objetivo en la muestra de ADN.
 Ligación: Si las sondas hibridan perfectamente, la enzima ligasa actuará correctamente.
Esta etapa permite la unión específica de las sondas a las secuencias de interés.
 Amplificación: La amplificación se lleva a cabo utilizando cebadores específicos que se
unen a las sondas ligadas y generan múltiples copias de las mismas.
 Separación de los productos de amplificación
por electroforesis: Los productos de PCR se
separan por electroforesis y se analizan para
determinar la cantidad de ADN amplificado. Esto
permite identificar y cuantificar la presencia de
las secuencias objetivo en la muestra.
 Análisis de datos: El análisis de los datos se
realiza por medio del software Coffalyser.net
desarrollado por MRC-Holland. El análisis de los
datos requiere de normalización de los datos
donde se compara cada dato de la muestra con
datos de muestra de referencia.

Aplicación
Tiene diversos usos en genética molecular y diagnóstico genético. Algunos de los usos más
comunes de la MLPA son los siguientes:

 Detección de anomalías genéticas: La MLPA se utiliza para detectar y cuantificar

deleciones y duplicaciones de secuencias de ADN específicas. Esto es útil para identificar
alteraciones genéticas asociadas con enfermedades genéticas hereditarias, como el
síndrome de Down, la distrofia muscular y el síndrome de Angelman, entre otros.
  Detección de mutaciones puntuales recurrentes: La MLPA se utiliza como una
herramienta de diagnóstico para identificar mutaciones puntuales o cambios en el número
de copias de genes específicos que pueden estar relacionados con enfermedades
genéticas. Esto permite una detección precisa y rápida de enfermedades genéticas en
pacientes.
 Estudios de investigación genética: La MLPA es una técnica versátil que se utiliza
ampliamente en investigaciones genéticas para explorar las bases moleculares de
enfermedades, identificar biomarcadores genéticos y estudiar la variación genética en
poblaciones.
 Cuantificación relativa de ARNm: La variante RT-MLPA del MLPA se utiliza para
analizar la expresión génica y cuantificar los niveles de ARNm en muestras biológicas.
Esto permite estudiar la regulación génica y la expresión diferencial de genes en
diferentes condiciones o tejidos.
 Análisis de perfiles de metilación: La MLPA puede utilizarse en su variante MS-MLPA
para analizar la metilación del ADN. Esto es útil en la investigación del cáncer y otras
enfermedades en las que los patrones de metilación anormales pueden estar implicados en
la alteración de la expresión génica.

Variantes
1. MS-MLPA: Es una variante del MLPA que se utiliza para analizar la metilación del
ADN, que es un proceso epigenético importante en la regulación de la expresión génica.
Esta variante es útil en la investigación del cáncer y otras enfermedades relacionadas con
la metilación anormal del ADN.
2. RT-MLPA: Combina el MLPA con la reacción en cadena de la polimerasa reversa (RT-
PCR). Permite la detección y cuantificación de ARN mensajero (ARNm) en lugar de
ADN, lo que es especialmente útil para investigar la expresión génica y los niveles de
ARNm en muestras biológicas. El RT-MLPA se utiliza en estudios de investigación y en
el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la expresión génica anormal.
Ventajas
 Requiere de cantidades de 50ng-100ng de ADN humano
 Facilita la amplificación y detección de múltiples objetivos con un solo par de primers o
cebadores
 No amplifica el ADN diana, sino solo las sondas
 Es rápida y más económica que otras pruebas moleculares, máximo dura 16 horas y los
resultados en 2-3 días.
 Puede diferenciar secuencias que difieren en un solo nucleótido

Limitaciones
La MLPA es caracterizada por su simplicidad relativa, costos bajos y la capacidad de realizar la
técnica en cualquier laboratorio con un termociclador y un secuenciador capilar. No obstante, es
importante considerar las restricciones que tiene:

 Calidad de la muestra: Los resultados del MLPA pueden verse afectados por la calidad
de la muestra de ADN analizada. Factores como el tipo de muestra utilizada (por ejemplo,
sangre, saliva, entre otros), la técnica de extracción del ADN, el almacenamiento y la
presencia de contaminantes pueden influir en la calidad de la muestra y afectar la
precisión de los resultados.
 Diseño de sondas: El diseño de las sondas utilizadas en el MLPA es crucial para obtener
resultados precisos. Las sondas deben ser específicas para la secuencia de interés y no
 deben tener interacciones no deseadas con otras secuencias del genoma. La presencia de
polimorfismos o mutaciones en el sitio de unión de las sondas puede interferir con la
hibridación y conducir a resultados falsos positivos o falsos negativos.
 Detección de variantes fuera de las regiones objetivo: El MLPA se enfoca en la
detección de deleciones o duplicaciones en regiones específicas del genoma donde se han
diseñado las sondas. Esto significa que no puede detectar variantes genéticas que ocurran
fuera de estas regiones, como reordenamientos estructurales complejos, translocaciones o
inversiones.
 Sensibilidad y límites de detección: La sensibilidad del MLPA puede variar
dependiendo de la técnica y las sondas utilizadas. Algunas variantes genéticas pueden ser
más difíciles de detectar debido a su tamaño o ubicación en el genoma. Además, la
capacidad del MLPA para detectar cambios en el número de copias puede verse limitada
en casos de mosaicismo, donde solo una proporción de las células en la muestra muestra
la alteración genética.
 Interpretación de resultados: La interpretación de los resultados del MLPA puede ser
compleja y requiere experiencia y conocimientos especializados. Es importante tener en
cuenta el contexto clínico y considerar otros métodos de confirmación para validar los
resultados obtenidos por MLPA, especialmente en casos de relevancia clínica alta.
 Limitaciones técnicas: Aunque el MLPA es una técnica poderosa, tiene algunas
limitaciones técnicas. Requiere equipos específicos, como un termociclador y un
secuenciador capilar, y es necesario realizar varias etapas de procesamiento y análisis de
los datos.
BIBLIOGRAFÍA:
Thompson y Thompson. Genética en medicina, 8ª edición, de Robert L. Nussbaum,. Roderick R.
McInnes y Huntington F. Willard. 2016 Elsevier.

Khan Academy. Secuenciación del ADN.

Paz-y-Miño C & López-Cortés A (2014) Genética Molecular y Citogenética Humana:

Fundamentos, aplicaciones e investigaciones en el Ecuador.(Universidad de las Américas.
Universidad Yachay). Quito,Ecuador. 400pp.

Tamay DL, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad. 2013;2 (2):70-78.

Carrasco, P., Mérida I. (2018). Aplicaciones clínicas de las técnicas actuales de biología
molecular. MLPA en el diagnóstico de enfermedades hereditarias.

Belinda Claudia Gómez Meda; Guillermo Moisés Zúñiga González; José María Vera Cruz;
Bertha Adriana Álvarez Rodríguez. (2022). Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en
las ciencias de la salud. Secuenciación del ADN y microarreglos.

https://www.seqc.es/download/tema/25/5625/1185439114/1169799/cms/tema-4-mlpa-en-el-
diagnostico-de-enfermedades-hereditarias.pdf/