Manual OMS Semen 2021-66-89.en - Es

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ii. Producción de espermatozoides severamente limitada o transporte de espermatozoides obstaculizado
b. La ausencia de espermatozoides sugiere:
i. Posible ausencia completa de espermatozoides (azoospermia), probablemente causada por
1. Producción nula o extremadamente baja de espermatozoides
2. No hay paso de los testículos a la uretra
2.4.9 Morfología espermática
El valor de la evaluación de la morfología del esperma humano no es solo el valor pronóstico limitado con respecto a los embarazos
espontáneos o el resultado de las tecnologías de reproducción asistida, sino aún más la información diagnóstica sobre el estado
funcional de los órganos reproductores masculinos, principalmente los testículos y los epidídimos. Para la evaluación de los órganos
reproductores masculinos, no es suficiente determinar únicamente la proporción de espermatozoides “normales”. Es importante
evaluar la morfología específica de la cabeza, el cuello/pieza intermedia, la cola y la posible presencia de residuos citoplasmáticos
anormales.
Todos los eyaculados humanos contienen espermatozoides con una amplia gama de apariencias morfológicas diferentes. Las definiciones
anteriores de la morfología de los espermatozoides se basaban principalmente en las experiencias de la medicina veterinaria y las
investigaciones microscópicas. A partir de investigaciones de la morfología de los espermatozoides capaces de penetrar el moco cervical y
unirse a la zona pelúcida, se desarrollaron los criterios presentados aquí.
El término espermatozoide “normal” es en cierto modo ambiguo, lo que provoca malentendidos e incluso conflictos académicos.
Un significado general de "normal" es una cualidad que es común, por ejemplo, en una población. Esto no es cierto para la
"morfología espermática normal" en humanos. Otro significado es que indica que la célula o individuo no está afectado por
enfermedad, pero una morfología normal no significa que el espermatozoide no pueda portar otra causa de patología, por
ejemplo cola inmóvil o ADN dañado.
La morfología variable de los espermatozoides humanos dificulta la evaluación, pero las observaciones de los espermatozoides
recuperados del aparato reproductor femenino, especialmente en el moco endocervical poscoital (Fredricsson y Bjork, 1977,
Menkveld, et al., 1990) y también de la superficie de la zona pelúcida (Liu y Baker, 1992, Menkveld, et al., 1991) (Figura 2.8 ), han
ayudado a definir la apariencia de los espermatozoides potencialmente fecundantes (morfológicamente normales o, mejor,
“ideales” o “típicos”). Mediante la aplicación estricta de ciertos criterios de morfología de los espermatozoides, se han
establecido relaciones entre el porcentaje de formas "normales" y varios criterios de valoración de la fertilidad (tiempo hasta el
embarazo (TTP), tasas de embarazo in vivo e in vitro) (Coetzee, et al. ., 1998, Eggert-Kruse, et al., 1996, Garrett, et al., 2003,
Jouannet, et al., 1988, Liu, et al., 2003, Menkveld, et al., 1991, Toner, et al. ., 1995, Van Waart, et al., 2001), que pueden ser útiles
para el pronóstico de la fertilidad.
La filosofía subyacente del sistema de clasificación descrito aquí es limitar lo que se identifica como típico para
la subpoblación potencialmente fertilizante de espermatozoides que prevalece en el moco endocervical. El rango de porcentaje
66
las formas normales para hombres fértiles e infértiles es probable que estén muy por debajo del 30% (Menkveld, et al., 2001).
Esto producirá inevitablemente umbrales bajos que discriminen entre poblaciones fértiles e infértiles; de hecho, se han
encontrado límites y umbrales de referencia de 3–5% de formas normales en estudios de fertilización in vitro (FIV) (Coetzee, et
al., 1998), inseminación intrauterina (IIU) (Van Waart, et al., 2001) y fertilidad in vivo (van der Merwe, et al., 2005). Además, se
debe enfatizar que las diferencias observadas en los promedios grupales entre hombres infértiles y subfértiles no significan
automáticamente que los "límites" calculados puedan usarse para la interpretación de los resultados de hombres individuales.
Para obtener tales límites útiles, se deben determinar los valores predictivos positivo y negativo. Esto es difícil, por ejemplo,
cuando se trata de la proporción de espermatozoides "normales" (o "ideales" o "típicos"). Para distinguir estadísticamente entre,
por ejemplo, 3% y 5% de formas "normales" para hombres individuales, varios miles de espermatozoides deben ser evaluados
por personal altamente capacitado.
Los espermatozoides unidos a la zona pelúcida humana también exhiben una subpoblación de espermatozoides morfológicamente similares
(Liu, et al., 2003),
Para una mejor comprensión de la morfología de los espermatozoides humanos a nivel microscópico de luz, puede ser útil una revisión
exhaustiva de la ultraestructura y la función de los espermatozoides (Mortimer, 2018).
Los pasos prácticos para evaluar la morfología del esperma humano comprenden los siguientes pasos:
• Preparación de un frotis de eyaculado en un portaobjetos (Sección 2.4.9.1 )
• Secar al aire, fijar y teñir el portaobjetos (Sección 2.4.9.2 )
• Montar el portaobjetos con un cubreobjetos si el portaobjetos se va a guardar durante mucho tiempo (Sección 2.4.9.5 ).
• Examinar el portaobjetos con óptica de campo brillante con un aumento de ×1000 con inmersión en aceite (Sección 2.4.9.6 ).
• Evaluando aproximadamente 200 espermatozoides (Sección 2.4.9.6 ).
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Figura 2.8 Espermatozoides morfológicamente “típicos”
Espermatozoides teñidos con Papanicolaou
2.4.9.1 Preparación de frotis de eyaculado
La adición rápida de fijador al eyaculado no permite una visualización adecuada de los espermatozoides, ya que están
oscurecidos por las proteínas seminales desnaturalizadas. Para el análisis morfológico, se acostumbra preparar frotis de
eyaculado que se secan al aire antes de fijarlos y teñirlos. Sin embargo, tal proceso conduce a artefactos morfológicos, ya que el
secado al aire de frotis de semen está asociado con:
• cambios en las dimensiones de los espermatozoides: los espermatozoides secos, fijados y teñidos son más pequeños que los espermatozoides
vivos visualizados en el semen (Katz, et al., 1986);
• expansión de cabezas de espermatozoides inmaduros (Soler et al., 2000); y
• pérdida de gotitas citoplasmáticas osmóticamente sensibles (Abraham-Peskir, et al., 2002, Cooper, et al., 2004), aunque
se retienen grandes cantidades de exceso de citoplasma residual.
Se deben hacer dos o más frotis de la muestra de semen fresco en caso de que haya problemas con la tinción o se rompa
un portaobjetos.
• Mezcle bien la muestra de semen.
• Retire una alícuota inmediatamente, sin dejar tiempo para que los espermatozoides se asienten fuera de la suspensión.
• Vuelva a mezclar la muestra de semen antes de retirar las alícuotas duplicadas.
• Se pueden usar diferentes métodos de frotis en diferentes condiciones (Figura 2.9 ).
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Figura 2.9 Métodos de frotis de semen para determinar la morfología de los espermatozoides
(a) Método de “emplumado” para semen sin diluir. La gota de semen (S) se extiende a lo largo del borde posterior del portaobjetos en
ángulo y se tira hacia adelante sobre el portaobjetos para formar el frotis. (b) Método de pipeta para muestras lavadas. Se esparce una
gota de la suspensión de esperma (SS) sobre la superficie del portaobjetos empujando la pipeta horizontal (P).
(a) (b)
(S) (SS)
2.4.9.1.1 Eyaculados con características normales
En este procedimiento se unta una alícuota de semen sobre toda la superficie del portaobjetos mediante la técnica del emplumado (
higos. 2.9a ,2.10 ).
1. Limpie ambas superficies de los portaobjetos esmerilados frotando enérgicamente con papel de seda sin pelusa o
limpiando con etanol.
2. Etiquete la parte congelada con información de identificación (p. ej., número de identificación, fecha); asegurarse de que
la marca no puede hacerse ilegible por la fijación, tinción o montaje
3. Aplique una alícuota de 5–10 µl de semen, según la concentración de espermatozoides, al final del portaobjetos. Utilice un segundo portaobjetos
para jalar la gota de semen a lo largo de la superficie del portaobjetos (higos. 2.9a ,2.10 ). Si el portaobjetos de arrastre no está esmerilado, los
bordes de ambos extremos del portaobjetos se pueden utilizar para hacer 4 frotis diferentes.
a. el volumen de semen y la concentración de espermatozoides: cuantos menos espermatozoides, menos probable es que
se superpongan entre sí;
b. el ángulo de la diapositiva de arrastre: cuanto menor sea el ángulo, más delgado será el frotis;
C. la velocidad de frotar cuanto más rápido es el movimiento, más delgado es el frotis.
Comience con un volumen de 10 µl, un ángulo de 45° y un frotis de aproximadamente 1 segundo. Estos parámetros se pueden variar, si es necesario,
para reducir la superposición de los espermatozoides en el portaobjetos (Menkveld, et al., 1990). El emplumado funciona bien cuando la viscosidad del
semen es baja, pero a menudo no es adecuado para semen extremadamente viscoso (Figura 2.10 ).
4. Permita que los portaobjetos se sequen al aire y se tiñen como se describe enSección 2.4.9.2 .
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Figura 2.10 Preparación de un frotis de semen normal
Para tener una idea del movimiento, coloque la corredera de arrastre en un ángulo de 45° y muévala hasta que entre en contacto con la
alícuota de semen (panel izquierdo), que corre a lo largo del borde del tobogán (panel central). Lleve el portaobjetos de arrastre lentamente
hacia atrás (durante aproximadamente 1 segundo) a lo largo del portaobjetos para producir el frotis (panel derecho).
Fotografías cortesía de C Brasil.
2.4.9.1.2 Eyaculados con características anormales
Con bajas concentraciones de espermatozoides (menos de 2×106/ml), muestras viscosas o cargadas de desechos, es posible que se necesiten diferentes
enfoques.
2.4.9.1.2.1Eyacula con baja concentración de esperma
Si la concentración de espermatozoides es baja (por ejemplo, menos de 2×106/ml), concentrar la muestra:
1. Centrifugar la muestra a 600gramodurante 10 minutos.
2. Retire la mayor parte del sobrenadante.
3. Vuelva a suspender el sedimento en el resto del sobrenadante pipeteando suavemente.
4. Obtener la mayor concentración de espermatozoides posible, no superando aproximadamente 50 × 106/ml.
5. Tratar como una muestra normal (Sección 2.4.9.2 ).
Nota: Esta manipulación puede afectar la morfología de los espermatozoides y su uso debe registrarse.
2.4.9.1.2.2eyaculaciones viscosas
A veces es difícil preparar buenos frotis porque el plasma seminal es muy viscoso, lo que da como resultado frotis de grosor irregular.
Las muestras viscosas se pueden tratar de la misma forma que las muestras mal licuadas o mediante lavado. Nota: Estas
manipulaciones pueden afectar la morfología de los espermatozoides y su uso debe registrarse.
2.4.9.1.2.3Eyaculaciones cargadas de desechos o viscosas
Los desechos y una gran cantidad de material particulado (como en muestras viscosas) pueden hacer que los espermatozoides se acuesten con
la cabeza de lado, lo que dificulta su categorización. Estas muestras se pueden lavar de la siguiente manera.
1. Diluya una alícuota de eyaculado bien mezclado (0,2–0,5 ml, según la concentración de espermatozoides) con una solución salina 170
mM para reducir los cambios osmóticos en los espermatozoides. Dependiendo de cuánto tiempo después de la preparación de la
eyaculación, la osmolalidad de la eyaculación puede aumentar a 350-400 mOsm/kg. Un medio que es isotónico al general.
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la osmolalidad corporal (290 mOsm/kg) inducirá un shock hipotónico a los espermatozoides adaptado a la mayor
osmolalidad del eyaculado licuado (Holmes, et al., 2019, Holmes, et al., 2019).
2. Centrifugar a 800×gramodurante 10 minutos.
3. Decantar la mayor parte del sobrenadante.
4. Vuelva a suspender el precipitado en el sobrenadante restante (típicamente 20–40 µl) pipeteando suavemente.
5. Haga un frotis de la suspensión extendiendo 5–10 µl de suspensión de esperma en un portaobjetos de microscopio con una
pipeta Pasteur (Figura 2.9b ).
6. Escanee el portaobjetos con óptica de contraste de fase con un aumento de x400 para asegurarse de que el frotis se distribuya uniformemente.
7. Verifique que haya al menos 40 espermatozoides por campo de ×400 sin aglomeraciones ni superposiciones.
8. Permita que los portaobjetos se sequen al aire y se tiñen como se describe enSección 2.4.9.2 .
• Si hay demasiados espermatozoides superpuestos en el portaobjetos, haga otro frotis con una alícuota más pequeña de
eyaculado.
• Si los espermatozoides son demasiado escasos en el portaobjetos, haga otro frotis con una alícuota más grande de eyaculado.
• Estas manipulaciones pueden afectar la morfología de los espermatozoides y su uso debe registrarse.
2.4.9.2 Fijación y tinción

Una vez que los frotis de eyaculado se han secado al aire, deben fijarse y teñirse para resaltar los detalles de los
espermatozoides. Se recomienda el uso de Papanicolaou ya que se han realizado validaciones y evaluaciones exhaustivas
para los Criterios estrictos de Tygerberg utilizando este tipo de tinción que brinda la mejor visibilidad general de todas
las regiones del espermatozoide humano (Franken, et al., 2000, Kruger, et al. al., 1988, Menkveld, et al., 2003, Menkveld,
et al., 1990, Zollner, et al., 1996). El uso de otras tinciones debe validarse en comparación con la tinción de Papanicolaou
descrita adaptada para espermatozoides humanos.
Con el método de tinción recomendado en óptica de campo claro (iluminación de Köhler), la cabeza se tiñe de azul pálido en la
región acrosómica y de azul oscuro en la región post-acrosómica. Tiñe las regiones acrosomales y post-acrosómicas de la
cabeza, el exceso de citoplasma residual, la pieza intermedia y la pieza principal. La pieza intermedia puede mostrar algunas
manchas rojas y la cola se tiñe de azul o rojiza. El exceso de citoplasma residual, generalmente ubicado detrás de la cabeza y
alrededor de la pieza intermedia, generalmente se tiñe de verde; si se tiñe de rojo, puede indicar otras anomalías. La tinción de
Papanicolaou también da una buena tinción de otras células. La técnica de tinción descrita aquí a veces es útil para distinguir
entre células germinales inmaduras y células no espermáticas (Figura 2.16 y2.17 ). Los procedimientos de rutina se han
modificado para trabajar sin éter (como fijador) o xileno (para el montaje) (Kvist y Björndahl, 2002)) (Sección 2.4.9.3 ). Los
portaobjetos teñidos con el procedimiento de Papanicolaou se pueden montar y almacenar de forma permanente para su uso
futuro en programas de formación y control de calidad interno. Si se almacenan en la oscuridad, deberían ser estables durante
meses o años.
71
Hay algunas otras técnicas comunes descritas en la última parte de este capítulo: Tinción corta y rápida. La razón de
recomendar la tinción de Papanicolaou es que sigue siendo la técnica mejor evaluada. Para un uso global es fundamental que
las técnicas y los criterios de evaluación estén estandarizados. Se pueden usar otras técnicas, pero con una evaluación y
validación adecuadas con técnicas estándar, especialmente si se usan para estudios científicos.
2.4.9.3 Fijación y Papanicolaou1pasos de tinción Esto

implica los siguientes pasos:
Tabla 2.5 Pasos de fijación y tinción de Papanicolaou
FIJACIÓN
al menos 15
etanol 95% (v/v) arreglar las celdas; también los deshidrata;
minutos
TINCIÓN
1 80% (v/v)2 30 segundos rehidratar gradualmente los frotis fijados para
etanol clasificado permitir la tinción con hematoxilina soluble en
2 50% (v/v) 30 segundos
agua;
para rehidratar frotis secos para permitir
3 agua purificada 30 segundos
la tinción soluble en agua;
4 Hematoxilina de Harris 4 minutos teñir el núcleo de azul;
para eliminar la hematoxilina
5 agua purificada 30 segundos
nuclear no unida;
para eliminar el colorante no unido
6 etanol ácido3 4-8 inmersiones45
específicamente del citoplasma (destinción);
7 agua purificada 30 segundos para reducir la acidez y devolver el color azul al
núcleo; La solución de Scott se puede utilizar si el
8 correr agua fría del grifo 5 minutos
agua del grifo es insuficiente
9 etanol 50% (v/v) 30 segundos
10 etanol 80% (v/v) 30 segundos para deshidratar frotis para permitir la tinción
al menos 15 con Orange G/EA-50 soluble en etanol;
11 etanol 95% (v/v)
minutos
12 Tinción naranja G-6 1 minuto teñir el citoplasma de rosa;
dieciséis EA-50 mancha verde 1 minuto teñir el citoplasma y los nucléolos de rosa;
19 etanol 100% 15 segundos
1Tinciones constituyentes de Papanicolaou: comercialmente disponibles o verSección 8.4.13 ).

2 La fijación de etanol provoca la deshidratación de las células. Por lo tanto, los frotis tomados directamente desde el paso de fijación en etanol al 95 % hasta la tinción pueden
necesitar solo 10 segundos en etanol al 80 %, mientras que los frotis que se han secado al aire después de la fijación deben permanecer más tiempo (2 a 3 minutos) en etanol al
50 %.
3Etanol ácido: añadir 1,0 ml de ácido clorhídrico concentrado a 200 ml de etanol al 70% (v/v).
4Un chapuzón corresponde a una inmersión de aproximadamente 1 segundo
5 comience con 4 inmersiones; continuar hasta que los resultados sean satisfactorios. Este es un paso crítico, ya que la duración de la decoloración altera drásticamente la
intensidad final de la tinción. Si se omite este paso, los espermatozoides y el fondo estarán oscuros. Aumentar el número de inmersiones hará que los espermatozoides y el
fondo sean más débiles.
72
deshidratar gradualmente los frotis teñidos para
20 etanol 100% 15 segundos permitir el uso de preparaciones solubles en
etanol;
para permitir el uso de medios de montaje
xileno
insolubles en etanol
Los portaobjetos se pueden ver sin montar o montados (sin o con un cubreobjetos adjunto). El montaje de los portaobjetos permite el
almacenamiento a largo plazo, de modo que puedan volver a evaluarse si es necesario y utilizarse en un programa de control de
calidad interno (IQC). El índice de refracción (IR) de los soportes después del secado (1,498 a 1,55) es similar al del vidrio (1,50 a 1,58), y
la mejor calidad óptica se logra con el uso de aceite de inmersión, que tiene un IR similar (1,515).
2.4.9.4 Tratamiento del frotis de eyaculado teñido antes del montaje
Hay dos tipos de fluidos para montar la preparación: medios de montaje solubles en etanol e insolubles en etanol.
• Utilice medios de montaje solubles en etanol directamente sobre frotis aún húmedos con etanol.
• Si utiliza medios de montaje insolubles en etanol, tome los portaobjetos directamente desde el paso 19 anterior hasta los
siguientes pasos (a realizar en una vitrina de gases):
o Sustituto de xileno6:etanol, 1+1 (1:2) 1 minuto
o 100% sustituto de xileno 1 minuto.
o Retire un portaobjetos a la vez del recipiente de tinción con sustituto de xileno y deje que se escurra durante solo 1 o 2
segundos, ya que el portaobjetos debe estar bastante húmedo con xileno durante el montaje.
2.4.9.5 Montaje de los frotis de eyaculado teñidos
1. Coloque el cubreobjetos (24 mm × 50 mm o 24 mm × 60 mm) sobre una toalla de papel doblada
2. Coloque el soporte en forma de mancuerna en el cubreobjetos
3. Luego coloque el portaobjetos, con el frotis hacia abajo, sobre el cubreobjetos.
4. Presiona el portaobjetos para esparcir el medio de montaje
5. Deje que el frotis montado se seque horizontalmente, con el cubreobjetos hacia arriba, en una gradilla de secado de portaobjetos o sobre papel absorbente durante la
noche en una campana extractora de gases.
2.4.9.6 Examen de la preparación teñida

2.4.9.6.1 Clasificación de la morfología de los espermatozoides
Para una evaluación útil de la morfología de los espermatozoides, es esencial que sea realizada por personal de laboratorio capacitado
que realice un control de calidad interno regular. Para realizar comparaciones interlaboratorios e implementaciones de técnicas y
límites de decisión desarrollados en otros centros es fundamental participar también en evaluaciones externas de calidad adecuadas.
La clasificación recomendada aquí es la de los espermatozoides como ideales ("típicos de los espermatozoides capaces de llegar al sitio
de la fertilización") o anormales, con base en el reconocimiento de anomalías en todas las ubicaciones del
6El xileno es un peligro para la salud y no debe utilizarse; ahora existen sustitutos, por ejemplo, NeoClear.
73
espermatozoide. Para realizar una evaluación morfológica adecuada, el individuo debe estar familiarizado con todos los
criterios, lo que significa que incluso si el laboratorio elige informar solo la proporción ideal o anormal, IQC y EQA deben
evaluar la capacidad de reconocer correctamente las anomalías en todas las ubicaciones. Se deben aplicar los siguientes
criterios al evaluar la normalidad morfológica del espermatozoide (Coetzee, et al., 1998, Kruger, et al., 1986, Menkveld, et
al., 1990).
Los espermatozoides están formados por una cabeza y una cola. La parte de la cola que está conectada a la cabeza y la parte
más gruesa que contiene las mitocondrias se llama pieza intermedia. El resto de la cola está formado por la pieza principal (un
axonema o estructura ciliar rodeada de fibras densas externas y una vaina fibrosa con columnas longitudinales (Inaba y Mizuno,
2016) y la pieza final. Como la pieza final es difícil de ver con un microscopio óptico, se puede considerar que la célula
comprende una cabeza (y cuello) y una cola (pieza intermedia y pieza principal). Para que un espermatozoide se considere sin
anomalías, la cabeza, la pieza intermedia, la cola y el residuo citoplasmático deben considerarse normales. Se deben considerar
todas las formas limítrofes. anormal:
En general, la forma de la cabeza parece ser más importante que el tamaño exacto (Sección 2.5.16 ). Cabe señalar que las cabezas
anormalmente grandes no son normales: los espermatozoides diploides existen con un área lateral plana de la cabeza ~ 1,6 del tamaño de una
cabeza de espermatozoide ideal. La evaluación de la morfología normal de los espermatozoides se puede aplicar mejor aprendiendo a
reconocer las variaciones sutiles en la forma de todo el espermatozoide (cabezas y colas de los espermatozoides normales/en el límite;Higos
2.13 - 2.15).
La espermatogénesis defectuosa y algunas patologías del epidídimo se asocian comúnmente con un mayor porcentaje de
espermatozoides con formas anormales. Los defectos morfológicos suelen ser mixtos. Los espermatozoides anormales
generalmente tienen un potencial fertilizante más bajo, según los tipos de anomalías, y también pueden tener ADN anormal.
Los defectos morfológicos se han asociado con una mayor fragmentación del ADN (Gandini, et al., 2000), una mayor incidencia
de aberraciones cromosómicas estructurales (Lee, et al., 1996), cromatina inmadura (Dadoune, et al., 1988) y aneuploidía
( Devillard, et al., 2002, Martin, et al., 2003). Por lo tanto, se hace hincapié en la forma de la cabeza, aunque también es
importante tener en cuenta la cola del espermatozoide (pieza intermedia y pieza principal) para comprender el aparato
reproductor masculino.
Las gotitas citoplasmáticas (Mortimer y Menkveld, 2001) son componentes normales de los espermatozoides humanos fisiológicamente
funcionales. Las gotitas citoplasmáticas son osmóticamente sensibles y no se conservan bien mediante los procedimientos rutinarios
de secado al aire (Chantler y Abraham-Peskir, 2004, Cooper, et al., 2004). No son evidentes en las preparaciones teñidas, donde pueden
aparecer como pequeñas distensiones de la pieza intermedia. Si están hinchados, pueden extenderse a lo largo de la pieza intermedia,
como se observa por contraste de fase, contraste de interferencia diferencial y microscopía de rayos X de células vivas en semen, moco
cervical y medio (Abraham-Peskir, et al., 2002, Fetic, et al., 2006). El exceso de citoplasma residual (ERC) está asociado con
espermatozoides anormales producidos a partir de una espermiación defectuosa.
74
proceso. Este exceso anormal de citoplasma no debe confundirse con gotitas citoplasmáticas más fisiológicas que se
pueden observar en microscopía directa del eyaculado pero no en frotis de morfología secos, fijados y teñidos (Cooper,
2005).
Las colas enrolladas (más de 360°, fig. 2.11) pueden indicar una disfunción del epidídimo (Pelfrey, et al., 1982).
Figura 2.11 Dibujos esquemáticos de algunas formas anormales de espermatozoides humanos
Tabla 2.6 Clasificación de la morfología de los espermatozoides
Ubicación Apariencia normal (ideal/típica) Anormal

Cabeza La cabeza debe ser lisa, de contorno regular y - acrosoma inferior al 40% o superior al 70% del
generalmente de forma ovalada. Debe haber una área normal de la cabeza, o
región acrosomal bien definida que comprenda del - relación de largo a ancho inferior a 1,5
40 al 70% del área de la cabeza (Menkveld, et al., (redonda) o superior a 2 (alargada), o
1991). La región acrosomal no debe contener - forma: forma piriforme (en forma de pera),
vacuolas grandes y no más de dos vacuolas amorfa, asimétrica o no ovalada en la parte
pequeñas, que no deben ocupar más de 1/5 de la apical, o
cabeza del espermatozoide. La región post- - las vacuolas constituyen más de 1/5 del área de la
acrosómica no debe contener vacuolas. cabeza o están ubicadas en el área post-
acrosómica, o
- cabezas dobles, o
- cualquier combinación
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pieza intermedia La pieza intermedia debe ser delgada, regular y aproximadamente - forma irregular, o
del mismo largo que la cabeza del espermatozoide. El eje principal - delgado o grueso, o
de la pieza intermedia debe estar alineado con el eje principal de - inserción asimétrica o en ángulo en la cabeza, o
la cabeza del espermatozoide. - muy doblado, o
- cualquier combinación
Cola La pieza principal debe tener un calibre uniforme en - curvas con ángulos pronunciados, o
toda su longitud, ser más delgada que la pieza - curvas cerradas suaves o
intermedia y tener una longitud aproximada de 45 µm - enrollado, o
(alrededor de 10 veces la longitud de la cabeza). Se - corto (roto), o
puede enrollar sobre sí mismo, siempre que no haya - ancho irregular, o
una angulación pronunciada que indique un flagelo - o colas múltiples, o
roto. - cualquier combinación
citoplasmático Las gotitas citoplasmáticas (menos de 1/3 del tamaño normal - El citoplasma residual se considera una anomalía solo
residuo de la cabeza de un espermatozoide) son normales cuando supera un tercio del tamaño normal de la cabeza
del espermatozoide.
2.4.9.6.2 Categorías de anomalías espermáticas.
Las categorías, o regiones, de interés son:
• Cabeza (%H),
• Cuello y pieza intermedia (%NM)
• Cola (%T)
• Exceso de citoplasma residual (%C)
Se puede utilizar un contador de teclas múltiples, con una tecla para normal (ideal, típica), una para anormal y una para cada una de las
cuatro categorías anormales (H, NM, T, C). Se puede usar un contador mecánico para ingresar múltiples anormalidades manteniendo
presionada la primera tecla mientras ingresa las otras anormalidades observadas en un solo espermatozoide. Mediante esa operación,
cada espermatozoide se cuenta una sola vez y cada una de sus anomalías se puntúa por separado.
• De la evaluación final de 200 espermatozoides, es posible obtener el porcentaje de espermatozoides
ideales y anormales (las dos cifras deben sumar 100%), así como el porcentaje con cada tipo de
anormalidad, es decir, %H, %NM, %T y %C (la suma de estas últimas cifras debe ser superior al 100% si la
evaluación se realiza correctamente).
• El porcentaje de espermatozoides en estas clases de anormalidad se obtiene dividiendo el número total de espermatozoides
con defecto en la categoría por el número total de espermatozoides puntuados. Estos números se utilizan para calcular el
índice de teratozoospermia (Sección 3.2 ).
2.4.9.6.3 Descripciones de otros defectos espermáticos específicos y otros tipos de células
Ocasionalmente, muchos espermatozoides tendrán un defecto estructural específico. Por ejemplo, el acrosoma puede no
desarrollarse, dando lugar al “defecto de cabeza redonda” o “globozoospermia”. Si la placa basal no se adhiere al núcleo
en el polo opuesto al acrosoma en la espermiación, las cabezas se absorben y solo se encuentran colas en
76
semen (el llamado defecto de cabeza de alfiler). Las cabezas de alfiler (colas libres) no se cuentan como defectos de cabeza, ya que no poseen
cromatina ni estructura de cabeza anterior a la placa basal. Los pacientes cuyos espermatozoides presentan uno de estos defectos suelen ser
estériles. Tales casos son raros, pero es fundamental que se identifiquen y se notifiquen correctamente. Si hay muchas cabezas de alfiler o
cabezas libres, se puede determinar su prevalencia en relación con los espermatozoides (Sección 2.5.17-18 ). Informar la presencia y prevalencia
relativa a los espermatozoides de:
• defectos específicos de esperma, por ejemplo, cabezas de esperma libres, cabezas de alfiler (colas libres), cabezas que carecen de acrosomas;
• células germinales inmaduras (Figura 2.16 y2.17 );
• células no espermáticas (Figura 2.16 y2.17 ).
Si hay muchos defectos de este tipo o células no espermáticas, se puede determinar su prevalencia en relación con los espermatozoides (
Sección 2.5.18 ).
2.4.9.6.4 Orden estructurado para la evaluación de la morfología del esperma humano
La evaluación secuencial didáctica de cada espermatozoide es útil tanto a la hora de entrenar como a la hora de realizar análisis
de rutina (Rothmann, et al., 2013):
77
Figura 2.12 Orden estructurado para la evaluación de la morfología del esperma humano
78
2.4.9.6.5 Evaluación microscópica y cálculos de resultados
Con el paradigma de evaluación de la morfología recomendado aquí, se deben considerar todas las regiones funcionales del
espermatozoide. No es necesario distinguir todas las variaciones en el tamaño y la forma de la cabeza o los diversos defectos de la
pieza central y la pieza principal. Incluso si el laboratorio solo informa la proporción ideal de espermatozoides, el examinador en el
laboratorio debe poder identificar todas las anomalías. La evaluación morfológica debe realizarse en cada espermatozoide evaluable en
varias áreas seleccionadas sistemáticamente del portaobjetos, para evitar la selección sesgada de espermatozoides particulares.
Es recomendable comenzar examinando el frotis, por ejemplo, con un aumento total de ×400 (óptica de campo brillante) para obtener una
impresión general de la distribución y apariencia de los espermatozoides, otras células, desechos, etc.
• La evaluación detallada se realiza utilizando un objetivo de campo claro de inmersión en aceite de ×100 y al menos un ocular de ×10. El
aceite de inmersión es esencial para obtener la mejor imagen en el microscopio (índice de refracción, RI ~1,5).
• Evalúe todos los espermatozoides en cada campo, moviéndose de un campo microscópico a otro.
a. Evaluar sólo los espermatozoides intactos (aquellos con cabeza y cola). No incluya células inmaduras en el recuento de
espermatozoides. Las cabezas sin cola deben contarse por separado y anotarse en el informe si hay más de 20/100
espermatozoides.
b. No evalúe campos con espermatozoides superpuestos o con un espermatozoide lateral. Solo si todos los campos tienen
tal problema, se evalúan los espermatozoides en dichos campos, y luego con un comentario adicional sobre el
informe.
• Evaluar al menos 200 espermatozoides, para lograr un error de muestreo aceptablemente bajo.
• Cuente el número de espermatozoides típicos o normales y anomalías en las cuatro regiones con la ayuda de un
contador de laboratorio.
• Calcular
a.las proporciones de formas típicas y las proporciones de anormalidades en las diferentes regiones.
b.el índice de teratozoospermia (TZI = suma de todas las anormalidades dividida por la suma de
espermatozoides anormales; siempre entre 1,00 y 4,00).
• Reporte los porcentajes de formas típicas al número entero más cercano y TZI con dos decimales.
79
Figura 2.13 Placa de Papanicolaou 1
80
Tabla 2.7 Placa de Papanicolaou 1
esperma en general
Forma de la cabeza Otros comentarios de cabeza Comentarios de pieza intermedia Comentarios de la obra principal clasificación
1 normal normal normal normal
2 anormal amorfo normal normal anormal
3 anormal amorfo grueso normal anormal
4 anormal normal normal anormal
5 anormal no ovalado grueso normal anormal
6 anormal no ovalado normal normal anormal
7 anormal aspiradora PA grueso normal anormal
9 anormal vacaciones normal normal anormal
11 anormal no ovalado grueso normal
13 anormal grueso / doblado normal anormal
14 anormal pequeño normal normal anormal
15 anormal grueso normal anormal
dieciséis anormal normal N/A anormal
19 normal grueso normal anormal
23 anormal grueso N/A anormal
26 anormal cónico grueso N/A anormal
28 normal grueso normal normal
30 anormal no ovalado grueso duplicado
31 anormal asimétrico normal anormal
32 anormal no oval / PA vac normal normal anormal
81
82
esperma en general
2 anormal normal normal normal
8 anormal normal asimétrico anormal
10anormal normal N/A anormal
11anormal grueso normal anormal
12anormal grueso asimétrico anormal
13normal normal N/A anormal
14anormal normal normal anormal
15anormal pequeño grueso / asimétrico normal anormal
anormal
dieciséis grueso normal anormal
18normal normal normal normal
23anormal grueso anormal anormal
24anormal demasiado ancho grueso anormal anormal
30anormal pequeño normal normal anormal
32anormal grueso asimétrico anormal
33anormal cónico grueso normal anormal
83
84
esperma en general
2 anormal grueso doblado anormal
3 anormal grueso / asimétrico N/A anormal
9 anormal aspiradora PA grueso normal anormal
dieciséis anormal grueso normal anormal
18 anormal normal N/A anormal
22 anormal cónico normal normal anormal
23 anormal grueso doble anormal
24 anormal pequeño grueso normal anormal
28 anormal grueso doblado anormal
42 anormal asimétrico normal anormal
47 anormal grueso duplicado anormal
85
Celúla Tipo de célula
1 macrófago
2 espermatozoide anormal
3 citoplasma
5 espermatocito
86
7 espermatozoide anormal? ¿Cabeza suelta en el citoplasma?
8 citoplasma
9 dividiendo la espermátida
10 espermatocito
11 espermátida degenerada
12 espermátide
14 división de espermatocitos
15 citoplasma
dieciséis espermátida degenerada
17 división de espermatocitos
19 citoplasma
21 espermátide
22 macrófago fagocitador
23 espermatocito
24 citoplasma
Figura 2.17 Placa Papanicolaou 5
87
Tabla 2.11 Placa Papanicolaou 5
Celúla Tipo de célula
1 macrófago
3 (dividiendo) espermátide
4 (dividiendo) espermátide
5 citoplasma
88
6 no clasificable
8 espermátida degenerada?
11 macrófago
dieciséis macrófago
2.5 Información adicional y comentarios
2.5.1 Antecedentes para la evaluación del volumen de eyaculación
• El volumen medido con una pipeta medidora siempre se verá afectado por una pérdida de 0,3 a 0,9 ml (Brasil, et al.,
2004, Cooper, et al., 2007, Iwamoto, et al., 2006). Además, se pierde algo de volumen en la propia pipeta, lo que puede
causar dificultades para otras evaluaciones en eyaculados de bajo volumen.
• El bajo volumen de semen es característico de la obstrucción del conducto eyaculador o ausencia bilateral congénita de
los conductos deferentes (CBAVD) (Daudin, et al., 2000, de la Taille, et al., 1998, von Eckardstein, et al., 2000, Weiske, et
al., 2000), una condición en la que las vesículas seminales también están poco desarrolladas.
• El bajo volumen de semen también puede ser el resultado de problemas de recolección (pérdida de una fracción del eyaculado),
eyaculación retrógrada parcial o deficiencia de andrógenos.
• Un alto volumen de semen puede reflejar una exudación activa en casos de inflamación activa de los órganos accesorios.
2.5.2 Problemas de licuefacción
• Ocasionalmente, las muestras pueden no licuarse, lo que hace prácticamente imposible la evaluación diagnóstica del semen.
En estos casos, el tratamiento adicional, la mezcla mecánica o la digestión enzimática pueden permitir evaluaciones
adicionales, pero las manipulaciones afectarán la bioquímica del plasma seminal, la motilidad y la morfología de los
espermatozoides, y su uso debe informarse. La dilución del semen con el medio debe tenerse en cuenta al calcular la
concentración de espermatozoides.
• Algunas muestras se pueden inducir a licuar mediante la adición de un volumen igual de medio fisiológico (por
ejemplo, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, verSección 8.4.5 ), seguido de pipeteo SUAVE repetido.
89

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ii. Producción de espermatozoides severamente limitada o transporte de espermatozoides obstaculizado

b. La ausencia de espermatozoides sugiere:

i. Posible ausencia completa de espermatozoides (azoospermia), probablemente causada por

1. Producción nula o extremadamente baja de espermatozoides

2. No hay paso de los testículos a la uretra

2.4.9 Morfología espermática

reproductores masculinos, no es suficiente determinar únicamente la proporción de espermatozoides “normales”. Es importante

unirse a la zona pelúcida, se desarrollaron los criterios presentados aquí.

ejemplo cola inmóvil o ADN dañado.

para el pronóstico de la fertilidad.

por personal altamente capacitado.

(Liu, et al., 2003),

exhaustiva de la ultraestructura y la función de los espermatozoides (Mortimer, 2018).

• Preparación de un frotis de eyaculado en un portaobjetos (Sección 2.4.9.1 )

• Secar al aire, fijar y teñir el portaobjetos (Sección 2.4.9.2 )

• Evaluando aproximadamente 200 espermatozoides (Sección 2.4.9.6 ).

Espermatozoides teñidos con Papanicolaou

2.4.9.1 Preparación de frotis de eyaculado

secado al aire de frotis de semen está asociado con:

vivos visualizados en el semen (Katz, et al., 1986);

• expansión de cabezas de espermatozoides inmaduros (Soler et al., 2000); y

se retienen grandes cantidades de exceso de citoplasma residual.

• Mezcle bien la muestra de semen.

• Vuelva a mezclar la muestra de semen antes de retirar las alícuotas duplicadas.

• Se pueden usar diferentes métodos de frotis en diferentes condiciones (Figura 2.9 ).

2.4.9.1.1 Eyaculados con características normales

higos. 2.9a ,2.10 ).

limpiando con etanol.

la marca no puede hacerse ilegible por la fijación, tinción o montaje

se superpongan entre sí;

C. la velocidad de frotar cuanto más rápido es el movimiento, más delgado es el frotis.

Fotografías cortesía de C Brasil.

2.4.9.1.2 Eyaculados con características anormales

2.4.9.1.2.1Eyacula con baja concentración de esperma

Si la concentración de espermatozoides es baja (por ejemplo, menos de 2×106/ml), concentrar la muestra:

1. Centrifugar la muestra a 600gramodurante 10 minutos.

2. Retire la mayor parte del sobrenadante.

3. Vuelva a suspender el sedimento en el resto del sobrenadante pipeteando suavemente.

4. Obtener la mayor concentración de espermatozoides posible, no superando aproximadamente 50 × 106/ml.

5. Tratar como una muestra normal (Sección 2.4.9.2 ).

manipulaciones pueden afectar la morfología de los espermatozoides y su uso debe registrarse.

2.4.9.1.2.3Eyaculaciones cargadas de desechos o viscosas

2. Centrifugar a 800×gramodurante 10 minutos.

3. Decantar la mayor parte del sobrenadante.

pipeta Pasteur (Figura 2.9b ).

2.4.9.2 Fijación y tinción

descrita adaptada para espermatozoides humanos.

2.4.9.3 Fijación y Papanicolaou1pasos de tinción Esto

Tabla 2.5 Pasos de fijación y tinción de Papanicolaou

1Tinciones constituyentes de Papanicolaou: comercialmente disponibles o verSección 8.4.13 ).

2.4.9.4 Tratamiento del frotis de eyaculado teñido antes del montaje

siguientes pasos (a realizar en una vitrina de gases):

o Sustituto de xileno6:etanol, 1+1 (1:2) 1 minuto

o 100% sustituto de xileno 1 minuto.

2.4.9.5 Montaje de los frotis de eyaculado teñidos

1. Coloque el cubreobjetos (24 mm × 50 mm o 24 mm × 60 mm) sobre una toalla de papel doblada

2. Coloque el soporte en forma de mancuerna en el cubreobjetos

3. Luego coloque el portaobjetos, con el frotis hacia abajo, sobre el cubreobjetos.

4. Presiona el portaobjetos para esparcir el medio de montaje

noche en una campana extractora de gases.

2.4.9.6 Examen de la preparación teñida

todas las formas limítrofes. anormal: