UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E
BIOTECNOLOGIA

ALEXANDRA SARNACKI
GABRIEL BALLA
IGOR PIAZENSKI
ISRAEL ASSIS
JOÃO PEDRO M CANDELÁRIO

RELATÓRIO PARCIAL - ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

PRODUTORAS DE ÁCIDOS ORGÂNICOS

CURITIBA
2021
 ALEXANDRA SARNACKI
GABRIEL BALLA
IGOR PIAZENSKI
ISRAEL ASSIS
JOÃO PEDRO MÂNICA

RELATÓRIO PARCIAL - ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

PRODUTORAS DE ÁCIDOS ORGÂNICOS
TURMA D

Relatório referente às três primeiras

aulas práticas da disciplina de
Processos Fermentativos Industriais:
Fundamentos e Aplicações (TEB054);
Departamento de Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia;
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial de avaliação pela
Profª. Dra Adriane Bianchi Pedroni
Medeiros.

CURITIBA
2021
 1. INTRODUÇÃO

Os microrganismos são seres microscópicos (bactérias, fungos

filamentosos, leveduras, protozoários e microalgas) de vasta importância
devido suas aplicações no desenvolvimento de diversos produtos importantes
comercialmente e devido suas funções de manutenção de equilíbrio ambiental
em relação aos demais seres vivos e elementos químicos (TORTORA et al.,
2010). São muito importantes na indústria, pois a partir dos microrganismos
podem ser produzidos compostos químicos nunca antes sintetizados em
laboratório, de forma mais econômica, usando substratos mais baratos gerando
produtos de alto valor agregado (PAUL, P. E. Vijay et al., 2019). O mercado de
bioprodutos global vai representar, até 2025, quase 870 bilhões de dólares
(BCC Publishing, 2021).

Isolar um microrganismo consiste na obtenção de culturas puras a partir

uma amostra que tenha altas chances de conter o microrganismo de interesse,
como solo, água ou alimentos (OKAFOR, 2007). Suas necessidades
nutricionais devem ser consideradas na escolha do microrganismo para
utilização industrial e para a escolha do meio de cultivo, porém como se deseja
minimizar gastos, é interessante que condições de cultivo muito complexas
sejam evitadas (SOCCOL et al., 2013).

É possível, utilizando técnicas de isolamento e meios artificiais de

cultura, o crescimento e o isolamento de diferentes microrganismos para
estudo ou desenvolvimento de processos industriais, além disso é possível
encontrar microrganismos de interesse utilizando meios específicos de seleção
e diferenciação.

Ácidos orgânicos (ou carboxílicos) obtidos por rotas biotecnológicas se

tornaram, no último século, um insumo industrial valioso. Seja para seu uso
como blocos de síntese na indústria química para produção de poliésteres,
poliamidas, plastificantes, solventes e componentes para ajuste de pH ou na
indústria farmacêutica e alimentícia como condimentos, conservantes,
efervescentes, aromatizantes, anticoagulantes, anti-inflamatórios, acidulantes e
antibióticos; entre outras aplicações (PAUL, P. E. Vijay et al., 2019).

Entre os ácidos orgânicos que podem ser obtidos através de

bioprocessos com microrganismos, nomeadamente com bactérias, estão, mas
não se limitam a: ácido cítrico (utilizado em larga escala na indústria alimentícia
como acidulante, flavorizante, antioxidante, controle de pH e como composto
para controle microbiano); ácido acético (condimento e conservante); ácido
lático (acidulante, flavorizante, e blocos para síntese de biopolímeros); ácido
glicônico (realçante de sabor, solubilizante, coagulante proteico, removedor de
manchas, tintas e vernizes, entre outros); ácido fumárico (flavorizante,
antioxidante); ácido málico (formulação de cosméticos de uso externo e
flavorizante em alimentos); entre muitos outros (CARVALHO, W., 2005).

O desenvolvimento de um processo de produção desses compostos em

escala industrial que seja economicamente vantajoso é de grande interesse.
Um microrganismo não-patogênico capaz de produzir ácidos orgânicos em
grandes quantidades com alta tolerância para diferentes substratos e para
esses produtos em condições amenas seria o considerado ideal para um
processo como esse. Para isso, se faz necessária a bioprospecção de novas
espécies com as características desejadas e, portanto, os procedimentos
experimentais realizados em laboratório descritos neste relatório.

Para isso, foi utilizado um meio seletivo diferencial, ou seja, um meio

capaz de inibir o crescimento de um grupo de microrganismos e também capaz
de facilitar a diferenciação de diferentes colônias na mesma placa (TORTORA,
G.J. FUNKE, B.R.; CASE, C.L., 2010). O meio utilizado foi o meio Foster, um
meio composto de glicose, peptona, fosfato monopotássico, sulfato de
magnésio, ágar e verde de bromocresol, este corante é um indicador de pH,
que em condições ácidas fica amarelo e em condições de pH acima de 5,4 fica
azul. Quando o microrganismo coletado fermenta ele produz ácidos que irão
deixar o meio amarelo, indicando qualitativamente que houve a produção de
ácido (RODRIGUES, C. et al, 2006).

Diversas técnicas de isolamento podem ser utilizadas para obter-se

culturas puras, neste relatório foram utilizadas as técnicas diluição seriada,
spread plate e pour plate. Para o sucesso de todas essas técnicas é crucial a
esterilidade no processo com o uso de uma capela de fluxo laminar para todo o
manejo do material.

O uso correto do fluxo exige limpeza e manutenção constante assim

como uma desinfecção rotineira. Todos os materiais a serem utilizados no
interior da capela de fluxo laminar devem ser desinfetados com a utilização de
autoclave, incluindo vidraria e meios (LINCOLN, C K; GABRIDGE, M G., 1998).

A diluição seriada ou diluições sucessivas consiste em uma técnica em

que o inóculo original é diluído em uma série de tubos, obtendo um número
menor de colônias no inóculo, uma vez que quando muitas colônias estão
presentes em uma amostra, algumas células podem ser reprimidas e não se
desenvolverem. A contagem de colônias que cresceram nas placas de Petri
após a diluição estima a quantidade de microrganismo presente na amostra
(TORTORA, G.J. FUNKE, B.R.; CASE, C.L., 2010).

As técnicas de semeadura por spread plate e pour plate estão

relacionados à incorporação do meio junto ao inóculo em placas de cultivo. No
caso do pour plate, 1 mL da suspensão escolhida é inoculada em uma placa de
Petri, o meio líquido e aquecido é então despejado em cima da amostra. Em
seguida, a amostra é misturada ao meio de cultivo a partir de uma agitação
lenta. No spread plate, o inóculo é destinado à superfície de um ágar
previamente solidificado e uniformemente espalhado, com todos materiais
esterilizados e em condições assépticas (TORTORA, G.J. FUNKE, B.R.; CASE,
C.L., 2010).
 Os microrganismos cultivados precisam ser devidamente caracterizados,
identificados e classificados. Essas informações são importantes para
determinar o potencial de um microrganismo em um processo biotecnológico.

A microscopia foi uma das primeiras ferramentas a ajudar na

identificação de microrganismos a partir de suas características morfológicas,
como formato e tamanho, além de observar os tipos de corantes que os
microrganismos são capazes de absorver (TSANG, J, 2020).

Além disso, as características visuais a olho nu podem ajudar muito na

identificação de um microrganismo, como o formato da colônia, sua elevação,
suas margens, características da superfície, opacidade, cor e mais, o uso de
diagramas de identificação é muito útil nessa etapa (SPOLIDORIO, D. ET AL,
2013).

O microscópio ótico é o mais básico, ele consiste de uma fonte de luz,

focalizada por um condensador, essa luz passa pelo analito, é coletada pela
lente objetiva, que tem um aumento de 10 até 100 vezes, e é transmitida pela
lente ocular, que garante um aumento de 10 até 30 vezes. Ou seja, o
microscópio ótico pode aumentar até 3000 vezes, o cálculo pode ser feito
multiplicando o aumento da lente objetiva pela lente ocular (MADIGAN, M. T., et
al., 2019).

A coloração de gram é uma ferramenta fundamental para caracterização

fenotípica de microrganismos como as bactérias. Após uma série de
colorações e lavagens, é capaz de diferenciar células gram positivas, com uma
camada espessa de peptidoglicano, que ficam de cor azul/roxa, e células gram
negativas com uma camada menor, ficando de cor rosa/vermelho (SMITH, A.C.
et al, 2005).
 2. OBJETIVO

O objetivo é isolar bactérias produtoras de ácidos orgânicos a partir de

uma amostra escolhida pelo grupo, no caso, foram utilizadas frutas em estado
de degradação. Ainda, busca-se encontrar o valor de unidades formadoras de
colônias (UFC) e realizar a análise por microscopia óptica das colônias
cultivadas, comparando-as com padrões após diferentes procedimentos de
coloração. Por fim, as cepas isoladas serão devidamente identificadas e
classificadas na medida do possível.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.ESCOLHA DA AMOSTRA DE COLETA

O início do procedimento de isolamento dos microrganismos de

interesse deu-se a partir de frutas com aspecto de estágios iniciais de
decomposição, mas que não apresentavam indício visual de crescimento
fúngico. Foram escolhidos um pêssego e morangos estragados trazidos pelos
integrantes da equipe como amostra inicial. Partes dessas frutas foram
retiradas utilizando-se de uma espátula de alumínio previamente esterilizada
em calor úmido (autoclave, 121°C, 1,1 atm por 15 min) e colocadas em
suspensão em água peptonada 0,1% também previamente esterilizada da
mesma maneira.

3.2. DILUIÇÕES SUCESSIVAS PARA POSTERIOR INOCULAÇÃO

Foi utilizado o método de diluições sucessivas (TORTORA, G.J; FUNKE,

B. R; CASE, C. L 2012) em outros tubos de ensaio contendo água peptonada
(9 ml, 01%) também previamente esterilizados para o preparo das amostras em
diferentes concentrações. As concentrações escolhidas para serem preparadas
(10-1 ,10-2 ,10-3 ,10-4 ,10-5 e 10-6 em relação à suspensão original) foram obtidas
transferindo 1 ml do tubo com concentração de ordem de grandeza superior
para um tubo com 9 ml de água peptonada previamente autoclavada, com
subsequente agitação para homogeneizar a amostra para preparo das
soluções com concentrações menores.

3.3. INOCULAÇÃO E INCUBAÇÃO

O conteúdo desses tubos em diferentes concentrações foi então

inoculado em placas de petri contendo meio Foster (FOSTER e DAVID, 1949)
previamente esterilizado (descrito anteriormente) acrescido de verde de
bromocresol, utilizado nesse caso como indicador colorimétrico de pH para
indicar crescimento de microrganismos produtores de ácidos orgânicos. Foram
inoculadas 4 placas, 2 pelo método de spread plate (LACAZ-RUIZ, R., 2000)
(utilizando-se 0,1 mililitros das respectivas soluções e alça de Drigalski estéril)
e 2 placas pelo método de pour plate (LACAZ-RUIZ, R., 2000) (utilizando-se 1
mililitro das respectivas soluções). Para o método de pour plate foram
escolhidos os tubos com concentração 10-5 e 10-6; enquanto que para o método
de spread plate foram utilizados os tubos de concentração 10-1 e 10-3. Os tubos
com outras concentrações foram descartados.

Todos os procedimentos de inoculação foram realizados em uma capela

de fluxo laminar desligada com suas superfícies internas previamente
esterilizadas com álcool 70° e com exposição por 15 minutos à luz UV. Os
procedimentos foram realizados com uma micropipeta para aferição e
transferência de volumes líquidos, num raio de 15 cm de uma chama de bico
de Bunsen para evitar possíveis contaminações. Os alunos da equipe se
revezaram na realização dos procedimentos. As 4 placas foram então
incubadas em estufa a cerca de 28°C por 48 horas.

3.4. ISOLAMENTO DE COLÔNIA PURAS

 As 2 placas incubadas que apresentaram crescimento visual de colônias
bacterianas foram então selecionadas para uma repicagem pelo método de
esgotamento de alça, novamente em meio Foster com indicador de
bromocresol, com o objetivo de isolar-se colônias puras da bactéria de
interesse. Foram escolhidas 4 colônias aparentemente isoladas e puras para a
repicagem, que foi feita em 4 placas de petri diferentes contendo o meio
supracitado, também previamente esterilizados (autoclave, 121°C a 1,1 atm por
15 min) e resfriados e após a inoculação foi realizada a incubação por 48 horas
em uma temperatura aproximada de 28°C em estufa de cultivo microbiológico.

3.5. MICROSCOPIA E IDENTIFICAÇÃO

Os organismos cultivados em meio Foster provenientes da repicagem

para isolamento de colônias puras que tiverem um bom desenvolvimento
(apresentando descoloração do meio, indício de produção de ácidos orgânicos)
foram então selecionados para coloração e análise microscópica. Duas das
quatro placas one foi feita a repicagem apresentaram crescimento.
Chamaremo-as de placa 2 e placa 3.
Para o processo de análise por microscopia, foram feitas 4 lâminas.
Uma delas com método de preparação a seco (A., VERMELHO, et al., 2019) e
coloração simples com azul de metileno (retirada do isolado da placa 2 e
nomeada “isolada 2 simples”; a segunda foi retirada também da placa 2 e
preparada por fixação a seco (utilizando-se chama de bico de Bunsen) e
realizada posterior coloração de Gram (C., FADER; R. BURTON, 2021). Essa
lâmina foi denominada “isolada 2 gram”; A terceira e quarta lâminas foram
preparadas com amostras do crescimento da placa denominada 3, uma de
cada colônia com crescimento visível a olho nu (colônia A e B, ver figura). A
amostragem da colônia A foi nomeada “isolada 3A Gram” e preparada por
fixação (a seco) e colorada por Gram. A segunda lâmina preparada da placa 3,
da colônia B, e que foi identificada como “isolada 3B fresco”, foi preparada a
fresco (A., VERMELHO, et al., 2019), com uma alça de platina e uma gota de
água destilada.
Além dessas 4 lâminas do nosso isolado, foram preparadas mais duas
para servirem de padrão para a coloração de Gram. Uma delas contendo
Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e uma levedura (para
controle como gram-positivo). As duas lâminas para padrão foram fixadas a
seco (chama) e passaram pelo procedimento de coloração. Foram identificadas
como “padrão” (P. aeruginosa) e “levedura” (ver figura).
Todas as 6 lâminas foram então analisadas por microscopia óptica de
imersão com óleo, 100x, e os microrganismos foram então classificados.

4. RESULTADOS
4.1. ISOLAMENTO DE COLÔNIAS PURAS

As imagens abaixo mostram os meios de cultivo obtidos após a

inoculação e incubação (Materiais e Métodos: item 3.3).
 Figura 1: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de
bromocresol, de concentração 10-1 em relação à solução inicial (método de
spread plate).

Figura 2: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de

bromocresol, de concentração 10-3 em relação à solução inicial (método de
spread plate).
 Figura 3: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de
bromocresol, de concentração 10-5 em relação à solução inicial (método de
pour plate).

Figura 4: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de

bromocresol, de concentração 10-6 em relação à solução inicial (método de
pour plate).

Como a mudança de coloração do meio indica, o crescimento de

colônias ocorreu apenas nas duas placas menos diluídas 10-1 e 10-3, as quais
tiveram duas colônias repicadas na etapa 3.4 Isolamento de colônias puras
(Materiais e Métodos).
Da metodologia apresentada no item 3.4 foram obtidas duas placas com
um bom crescimento e estão disponíveis logo abaixo.
Figura 5: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de
bromocresol, Placa número 2 da metodologia apresentada no item 3.4
apresentando crescimento após a técnica de esgotamento e incubação.

Figura 6: Placa de Petri contendo meio Foster acrescido de verde de

bromocresol, Placa número 3 da metodologia apresentada no item 3.4
apresentando crescimento após a técnica de esgotamento e incubação.
 Conforme mostrado nas figuras 5 e 6 a metodologia 3.4 proporcionou
duas placas com crescimento de microrganismos. É importante salientar que a
metodologia que se seguiu (item 3.5) relacionada à microscopia teve como
esfregaços isolada 3A gram e isolada 3B fresco, referentes às duas colônias
bem definidas da placa 3 (figura 6), e a Isolada 2 simples e Isolada 2 gram
referentes a duas porções isoladas da placa 2 (figura 6) que apresentou um
crescimento bem definido ao longo do esgotamento feito na placa.

4.2. MICROSCOPIA E IDENTIFICAÇÃO

Conforme foi colocado no item 3.5 a análise por microscopia e
consequente identificação do microrganismo isolado foi realizada e pode ser
observada nas imagens a seguir.

Figura 7: Identificação prévia das lâminas de vidro para realização do

esfregaço, coloração e microscopia óptica.
 Figura 8: Imagem obtida da lâmina identificada como isolada 2 simples,
corada pelo método do azul de metileno e vista com auxílio de um microscópio
óptico de imersão com óleo (aumento de 1000x).

Figura 9: Imagem obtida da lâmina identificada como isolada 2 gram,

corada pelo método de gram e vista com auxílio de um microscópio óptico de
imersão com óleo (aumento de 1000x).
 Figura 10: Imagem obtida da lâmina identificada como isolada 3A gram,
corada pelo método de gram e vista com auxílio de um microscópio óptico de
imersão com óleo (aumento de 1000x).

Figura 11: Imagem obtida da lâmina identificada como isolada 3B fresco,

vista com auxílio de um microscópio óptico de imersão com óleo (aumento de
1000x).
 Figura 12: Imagem obtida da lâmina identificada como padrão, corada
pelo método de gram e vista com auxílio de um microscópio óptico de imersão
com óleo (aumento de 1000x).

Figura 13: Imagem obtida da lâmina identificada como levedura, corada

pelo método de gram e vista com auxílio de um microscópio óptico de imersão
com óleo (aumento de 1000x).
 5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A partir do que foi observado até agora, ocorreu alteração de cor do
meio nas placas 10-1 e 10-3 indicando uma mudança de pH e consequente
produção de ácidos orgânicos.
Portanto, é possível afirmar que nessas placas estão presentes
microrganismos produtores de ácidos orgânicos, porém será necessário
obtenção de uma colônia pura (com o mínimo de contaminantes após vários
repiques) para assim concluir a etapa de isolamento do microrganismo.
Dos resultados da microscopia óptica apresentados no item 4.2
anteriormente, seis lâminas de vidro foram utilizadas (figura 5), sendo quatro
lâminas para os isolados da placa 2 e 3 mais dois padrões (um padrão gram
negativo e um padrão gram positivo).
A figura 12 é uma imagem de microscopia obtida a partir do esfregaço e
coloração de gram de uma amostra do gênero Pseudomonas e foi utilizada
como padrão gram negativo das microscopias. A Figura 13 é uma imagem de
microscopia obtida a partir do esfregaço e coloração de gram de uma amostra
de leveduras e foi utilizada como padrão gram positivo. Dadas essas
informações, é muito fácil de identificar que nas duas lâminas das isoladas 2 e
3 foram observadas após a coloração de gram uma proximidade com o padrão
gram negativo, logo as bactérias isoladas são gram negativas.
Além de ser possível diferenciar se as bactérias são gram positivas ou
são gram negativas , as colorações permitem uma visualização com mais
realce do que está sendo observado no microscópio fazendo uma comparação
da figura 11 com as demais microscopias. Outro detalhe que vale mencionar é
que foi possível identificar os microrganismos isolados pela morfologia de
bacilos, tanto nos isolados 2 quanto nos isolados 3 (este último apresentando
também alguns filamentos nas imagens de microscopia 3A e 3B figura 10 e
11).
REFERÊNCIAS

BCC PUBLISHING. Biorefinery Products: Global Markets. United States:

BCC Publishing, 2021.

LINCOLN, Carolyn Kay; GABRIDGE, Michael G. Chapter 4 Cell Culture

Contamination: Sources, Consequences, Prevention, and Elimination. In:
MATHER, Jennie P.; BARNES, David (Orgs.). Methods in Cell Biology. [s.l.]:
Academic Press, 1998, v. 57, p. 49–65. (Animal Cell Culture Methods).

RODRIGUES, Cristine; et al. Desenvolvimento De Bioprocesso Para

Produção De Ácido Cítrico Por Fermentação No Estado Sólido Utilizando
Polpa Cítrica. Dissertação apresentada como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre, 2006.

PAUL, Pandeeti Emmanuel Vijay; SANGEETHA, Veeraiah; DEEPIKA, Routhu

Gyana. Emerging Trends in the Industrial Production of Chemical
Products by Microorganisms. In: Recent Developments in Applied
Microbiology and Biochemistry. [s.l.]: Elsevier, 2019, p. 107–125.

CAPLICE, E., FITZGERALD, G.F. Food fermentations: role of

microorganisms in food production and preservation. International Journal
of Food Microbiology. 50, 131-149, 1999.

CARVALHO, W., SILVA, D. Aditivos alimentares produzidos por vias

fermentativas parte l: ácidos orgânicos. Revista Analytica, N° 18,
agsoto/setembro, 2005.

TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiology:

an introduction. 10th ed. San Francisco, CA: Pearson Benjamin Cummings,
2010.

LACAZ-RUIZ, Rogério. Manual prático de microbiologia básica. São Paulo:

Editora da Universidae de São Paulo, 2000.

SILVA,D.; JUNQUEIRA, V.A.; TANIW, N. Manual de métodos de análise

microbiológica de alimentos e água. Editora Blucher, 2017. Disponível em:
<https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788521212263/>. Acesso
em: 12 out. 2021.

VERMELHO, A. E. Práticas de Microbiologia. São Paulo: Grupo GEN, 2019..

Disponível em: <
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788527735575/> Acesso
em: 12 out. 2021.

CRUEGER W. A. Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology.

Science Tech Publishers, Madison, 2nd ed., 134-149, 1989.
OKAFOR, N. Modern industrial microbiology and biotechnology. Science
Publishers, 2007.

SOCCOL, C.R. Fermentation Processes Engineering in the Food Industry.

Capítulo 2. Taylor & Francis Group. 2013.

TSANG, JENNIFER. Identifying Bacteria Through Look, Growth, Stain and

Strain. American Society for Microbiology.

SPOLIDORIO, DENISE M. PALOMARI; DUQUE, CRISTIANE; PÓVOA,

HELVÉCIO CARDOSO CORRÊA. Microbiologia e Imunologia Geral e
Odontológica. [s.l.]: Artes Médicas, 2013.

MADIGAN, Michael T.; BENDER, Kelly S.; BUCKLEY, Daniel H.; et al. Brock
Biology of Microorganisms. 15th edition. [s.l.]: Pearson, 2019.

SMITH, Ann C.; HUSSEY, Marise A. Gram Stain Protocols. United States:
American Society for Microbiology, 2005.