Imunologie L. P.

Reacţia imunoenzimatică ELISA pentru detecţia antigenelor. Reacţia imunoenzimatică

ELISA pentru detecţia anticorpilor. Principiu, tehnica, aplicabilitate practica

ELISA = ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY = EIA = ENZYME

IMMUNOASSAY

PRINCIPIU:
ELISA = test imunoenzimatic cu elemente marcate, care determina Ac sau Ag prin reactia
specifica Ag – Ac; prezenta complexelor Ag –Ac poate fi vizualizata si masurata, deoarece
unul dintre reactivi este conjugat cu o enzima, iar dupa adaugarea in mediul de reactie a unui
substrat cromogen specific enzimei marker, densitatea optica a mediului de reactie se va
modifica, iar valoarea densitatii optice se poate masura spectrofotometric.

ISTORIC:
Marcarea enzimatica a fost introdusa pentru prima oara in histochimie in 1966 de catre Wide
si Porath, ca alternativa la RIA, eliminindu-se complet riscurile expunerii la radiatii. In 1971,
doua echipe de cercetatori (Peter Perlmann si Eva Engvall – Suedia si Anton Schuurs si
Bauke van Weeman – Olanda) au publicat separat lucrari in care au prezentat folosirea
marcarii enzimatice in cazul reactiilor Ag – Ac.

CLASIFICARI:

1
In functie de scopul urmarit:
- determinari de Ag
- determinari de Ac – din ser, LCR sau alte lichide biologice
In functie de tipul si ordinea reactivilor introdusi in reactie:
- reactii necompetitive
- reactii de competitie directe sau indirecte

In functie de complexitatea tehnicii:

- clasice
- simple / rapide
In functie de modificarea activitatii markerului enzimatic:
- reactii in faza omogena
- reactii in faza heterogena ( activitatea markerului enzimatic nu este influentata de
catre reactia Ag -Ac) – mai frecvent utilizate

AVANTAJE:
1. Specificitate buna si in unele cazuri chiar foarte buna
2. Sensibilitate comparabila cu RIA
3. Preturi competitive
4. Tehnica de lucru simplificata, automatizare
In unele cazuri, rezultatele obtinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai specifice
(ex. infectia HIV).

MATERIALE NECESARE:

2
 - truse comerciale care contin toti reactivii si martorii specifici
- apa distilata
- pipete automate
- virfuri
- aparat de spalat automat
- spectrofotometru
- incubator
- agitator
Pot fi inlocuite de o linie ELISA automatizata.

PROBE:
- ser
- exsudate
- secretii

TEHNICA:
In general, reactiile imunoenzimatice se realizeaza in urmatoarea succesiune:
- primul reactiv (Ag sau Ac in functie de ce dorim sa determinam) este fixat pe un
suport solid, foarte frecvent reprezentat de godeurile unor placi de microtitrare din
plastic;

3
- adaugam proba de cercetat,(Ac sau Ag);
- in cazul in care exista complementaritate structurala si electrochimica intre cei doi
reactivi, are loc cuplarea si formarea complexului Ag – Ac; pentru eliminarea
rectivilor care nu au intrat in complex are loc o prima spalare;
- reactivul adaugat in urmatoarea etapa variaza in functie de tipul de tehnica ELISA; de
ex. se poate adauga un reactiv care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este la
rindul lui cuplat cu enzima ( conjugat enzimatic); in continuare are loc o noua spalare;
- pentru vizualizarea reactiei, adaugam un substrat cromogen pe care enzima poate
actiona si conduce la aparitia unei culori care se poate vedea si cu ochiul liber, dar se
citeste cu ajutorul unui spectrofotometru;
- valorile inregistrate pentru proba se compara cu valorile inregistrate pentru martorul
pozitiv si martorul negativ, se aplica formula de calcul indicata de producator, iar
interpretarea se face asa cum este indicat in protocolul tehnic care insoteste trusa
ELISA

4
5
6
Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalina (substrat cromogen – p-nitro-fenil-
fosfatul), peroxidaza extrasa din hrean – HRP ( o-fenilen-diamina in solutie de apa
oxigenata).
DETERMINAREA ANTIGENELOR
Cea mai comuna tehnica pentru detectia Ag este ELISA sandwich. Tehnica utilizeaza doua
tipuri de Ac, ce reactioneaza succesiv cu Ag a carui concentratie se determina. O anumita
cantitate dintr-un anticorp este fixata la o serie de suporturi solide (placute de plastic).

Probele in care se determina Ag se adauga in godeuri, unde se combina specific cu Ac fixati,

iar Ag nelegat se indeparteaza prin spalare.

7
Se adauga al II-lea Ac conjugat cu o enzima, specific pentru un alt epitop al Ag. Ac secundari
nereactanti sunt indepartati prin spalare si se adauga substratul specific enzimei. Se masoara
spectrofotometric densitatea optica a produsului rezultat colorat. Cu cit proba de analizat
contine o cantitate mai mare de Ag, cu atit va lega o cantitate mai mare de Ac marcati cu
enzima.
Conditia esentiala pentru aceasta tehnica: Ag de dozat trebuie sa prezinte cel putin 2 epitopi,
identici sau nu, de aici denumirea de tehnica cu dublu sens sau “sandwich”.

APLICABILITATE PRACTICA:
- diagnosticul rapid al unor infectii (ex. Streptococcus pyogenes si Chlamydia
trachomatis)
- diagnosticul unor viroze la care agentul etiologic este necultivabil sau dificil de
cultivat ( Ag HBs, Ag Hbe, Ag p 24 pt HIV, rotavirusuri, virusul Norwalk)
- diagnosticul bronsiolitei sugarului cu virusul sincitial respirator pentru orientarea
rapida spre tratamentul cu Ribavirin si evitarea excesului de antibiotice
- diagnosticul rapid al gripei, infectiilor herpetice, gastroenteritelor (Ag Helicobacter
pylori, Ag Giardia)

DETERMINAREA ANTICORPILOR
ELISA indirecta este varianta pentru determinarea calitativa sau cantitativa a Ac. Serul
sau o alta proba care contine Ac primari (Ac1) se adauga la godeurile tapetate cu Ag ale unei
microplaci. Dupa incubare, Ac liberi se indeparteaza prin spalare, iar prezenta Ac 1 legat de
Ag se detecteaza adaugind un Ac secundar (Ac 2) conjugat cu o enzima, specific fata de Ac 1.
Ac2 se indeparteaza prin spalare si se adauga substratul enzimei. Cantitatea produsului colorat
de reactie care se formeaza, se determina la spectrofotometru, care citeste absorbtia fiecarei
probe.

APLICABILITATE PRACTICA:
ELISA indirecta se foloseste pentru detectarea prezentei Ac specifici anti-HIV.
In aceasta varianta, proteinele invelisului si proteinele regiunii centrale, obtinute prin
tehnologia ADN recombinant, sunt adsorbite pe godeurile unei microplaci si reprezinta Ag in
faza solida.
Ac serici anti-HIV se pot detecta prin metoda ELISA indirecta la 6 saptamini dupa infectie.

8
 Prin tehnica ELISA se pot diagnostica o gama larga de boli infectioase, prin punerea in
evidenta a anticorpilor specifici:
- hepatite virale A, B, C, D, E – Ac anti HAV, anti HBc, anti HBe, anti HBs, anti HCV,
anti HDV, anti HEV
- HIV– Ac anti HIV 1 si 2
- Infectii cu Chlamydia, Helicobacter pylori
- Sifilis, Leptospiroza,
- TORCH – Ac anti Toxoplasma, Rubeola, Citomegalovirus, Herpes virus
- Oreion, rujeola, infectia varicela- zona zoster
- Difterie, tetanos
- Infectii respiratorii: adenovirusuri, influenza, Legionella, Mycoplasma, virusul
sincitial respirator, TBC
- Infectii cu Candida
- Infectii cu v. Epstein-Barr
- Enteroviroze
- Parazitoze: Toxoplasmoza

9
10