Biofilm u prehrambenoj industriji

Biofilmovi su jedan od ključnih problema u industriji proizvodnje hrane i pića, a nastaju

kontaminacijom bakterijskih stanica i organizama. Biofilmovi uzrokuju ne samo degradaciju
performansi opreme, već i neuspješnu kontrolu higijene. Naknadni procesi čišćenja povećavaju
potrošnju vremena, energije i vode, što dovesti do većih troškova proizvodnje. Kako bi se
izbjegao rizik od cross kontaminacije i biokorozije, potrebno je bolje razumijevanje mehanizama
razvoja biofilma. Formiranje biofilma definira se kao početni proces u kojem pojedinačne
bakterije prianjaju na površinu i proizvode izvanstanične polimere koji olakšavaju rast. Kada se
jedna bakterija koja se vezala na površinu prebaci s reverzibilne adhezije na ireverzibilnu
adheziju, biofilm raste eksplozivno sve dok bakterije ne postignu ravnotežu s raspoloživim
resursima. Početna stopa prianjanja bakterija (Staphylococcus aureus ATCC 12600 ili S. aureus)
na površinu supstrata je samo 10e6 bakterija po cm i pokriva manje od 1% površine. Nasuprot
tome, zreli biofilm ima debljinu do 200 μm u cijevi za preradu mlijeka, što znači da sadrži 10e10
bakterija po cm. Zbog eksponencijalne prirode rasta biofilma, sprječavanje početnog stvaranja
biofilma učinkovita je opcija za kontrolu kontaminainacije u preradi hrane. Stvaranje biofilma je
integrirani proces reguliran svojstvima površine supstrata, mikrobiološkim čimbenicima i
uvjetima okoline. Prehrambeni proizvodi pružaju utočište i hranjive tvari bakterijama. Zauzvrat,
bakterijska stanica prianja na površine i potom kolonizira, što zauzvrat olakšava površinske
uvjete za taloženje hrane. Biofilm se može opisati kao «metabolički aktivna matrica ćelija i
ekstracelularnih komponenti» ili kao «matrica priljubljene bakterijske populacije koja pristaje
jedna drugoj i/ili površinama ili kontaktima». Oni mogu sadržavati bakterije koje izazivaju
kvarenje kao Pseudomonas fragi, Enterococcus spp. i Pseudomonas fluorescens kao i patogene
poput Listeria monocytogenes, Staph. aureus, E. coli O157:H7 ili Salmonella. Teško ih je
odstraniti s obzirom da se otporni na standardne sanitacione procedure i mogu da dovedu do
štetnih procesa i efekata. Čak i kada je površina izgleda čista, prisustvo biofilma je potencijalna
šteta koja mora biti eliminisana i spriječena ponovna pojava. Oko 85 - 96% biofilma sastoji od
vode, što znači da se na suhim površinama može otkriti samo 2 - 5% ukupnog volumena
biofilma. Biofilm općenito mogu stvoriti bilo koji mikrobi pod prikladnim uvjetima, iako neki
mikrobi prirodno imaju veću tendenciju stvaranja biofilma od drugih.

Biofilm se sastoji od nakupina mikrobnih stanica s mrežom unutarnjih kanala ili praznina u
izvanstaničnom polisaharidnom i glikoproteinskom matriksu. Ovo omogućuje da se hranjive
tvari i kisik transportiraju u stanice.

Biofilmovi počinju sa sasušenim slojem organskih (proteini) i neorganskih materija koji se

formiraju na inače vidljivo čistim površinama u kontaktu sa hranom. Akumulacija organskog i
neorganskog materijala na procesnim površinama stvara okruženje u kojem se bakterije mogu
razvijati. Istraživanja usmjerena na razumijevanje nastanka i rasta biofilma otkrivaju složenost
dvosloja. Sugerira se da se mehanizmi vezanja mikroba i nakupljanja biofilma javljaju u
procesima od dva, tri, pet i osam koraka. Proces od dva koraka podijeljen je na reverzibilno i

1
nepovratno stvaranje biofilma. Reverzibilna faza uključuje povezivanje stanica u blizini, ali ne u
dodiru s površinom. Stanice povezane s površinom sintetiziraju egzopolsaharide, koji nepovratno
vežu stanice za površinu.

Characklis (KARAKLIS) (1981) opisao je nakupljanje biofilma u pet koraka:

1. transport stanica na vlažnu površinu,
2. apsorpcija stanica u kondicionirajući film,
3. prianjanje mikrobnih stanica na vlažnu površinu,
4. reakcija stanica u biofilmu i
5. odvajanje biofilma od površine.

Bryers i Weightman (BRAJRS i VEIGMAN) (1995.) podijelili su nakupljanje biofilma u

sljedećih osam koraka:
1. predkondicioniranje površine makromolekulama,
2. transport stanica na površinu,
3. reverzibilna i ireverzibilna adsorpcija na površinu,
4.replikacija stanica,
5.transport hranjivih sastojaka i
6. metabolizam,
7. proizvodnja izvanstaničnih polimera i, konačno,
8. odvajanje.

Žive, oštećene ili mrtve ćelije mogu se zakačiti kako bi započele kolonizaciju. Sasušeni sloj
počinje kao tanki otporni sloj mikroorganizama, bilo koja kombinacija bakterija koje izazivaju
kvarenje hrane ili patogenih koji se formira i prekriva površinu sasušenog sloja. Kako sloj
bakterija liježe na površinu, a zatim slijedeći na njega oni hvataju nanose i nutrijente i biofilm
počinje dobivati obrise. Bakterijski privjesci (fimbrie, i flagele) mogu takoĎe pomoći prijanjanje
drugih ćelija ili materijala formirajući kolonije.Tijekom prijanjanja ćelije u koloniji, koja se
formira, rade zajedno u koordinaciji i kooperaciji. Ovo uključuje usmjeravanje nutrijenata ka
filmu i odstranjivanje otpadnih produkata. Pošto kolonije nastavljaju da vežu stanice, javlja se
proizvodnja ekstracelularnih polisaharida i promjene u morfologiji ćelija. Formiranje
ekstracelularnih polisaharida pomaže adheziji ćelija na film i štiti bakterijski sloj od sredstava za
čišćenje i dezinfekciju. Polisaharidi takoĎe vežu druge ćelije. Ekstracelularni polisaharidni
materijal formira most izmeĎu bakterija i sasušenog sloja kombinacijom elektrostatičkih i
kovalentnih veza. Razvoj i rast bez intervencija odstranjivanja rezultira filmom koji biva
ireverzibilno zakačen na supstrat ili površinu ili jedan na drugi, okruženi matricom
ekstracelularnih supstanci koje su same proizvele. Film postiže ravnotežu pri kojoj se oslobaĎa
kisik, hrana i nutritijenti dok istovremeno odlaze proizvodi fermentacije i mrtve ćelije. Posljedni
sluzavi sloj filma služi kao zamka koja hvata dodatne kontaminante i djeluje kao zaštita

2
zatvarajući bakterije unutra tako da zaštićene bakterije mogu biti do 100 puta otpornije na
sanitaciona sredstva. Npr. L. monocytogenes u biofilmu je rezistentna na sanitaciona sredstva na
koja inače nije rezistentna kada se ne nalazi u biofilmu. Neorganski i organski materijal koji
prelazi preko biofilma obezbjeĎuje hranjive materije koloniji. Unutar biofilma, oštećene ili male
ćelije mogu imati dovoljno vremena da se oporave i reprodukuju. Film je ireverzibilan i sada
zahtijeva specijalnu proceduru čišćenja da bi se odstranio. Biofilmovi se formiraju polako ali s
vremenom postajući teži za čišćenje. Oni se najvjerovatnije formiraju na grubim poroznim
površinama ali se mogu stvoriti na bilo kojoj vlažnoj površini. Mogu se zakačiti na sve tipove
površina u prehrambenim pogonima, od nehrĎajućeg čelika (posebno na istrošenim ili oštećenim
površinama) do polipropilena. Biofilmovi se mogu formirati na teško-dostupnim mjestima kao
što su donje strane, konvejer pojasevi ili zatvarači. Iz ovog razloga neophodno je redovno
nadgledati i mijenjati dijelove mašina kao što su brtvila (gumice), prstenove i ventile. Kada je
god moguće u pogonu se moraju identificirati i eliminirati područja koja ne mogu biti potpuno
očišćena sanitacionim postupkom i aparaturom.. Prošireni kapacitet u proizvodnji koji radi sa
minimalnim čišćenjem može povećati šanse i učestalost razvoja filmova usljed povećanog
vremena kontakta organskog materijala i formiranja sasušenog sloja. Ovaj produženi rad takoĎe
skraćuje vrijeme sanitacije i reducira mogućnost sanitarnom osoblju da rade svoj posao kao što je
propisano.

Dodatni uzroci za formiranje biofilma uključuju nedostatak striktnih režima čišćenja, ektremne
pH vrijednosti i visoke temperature kontaktne površine koje uzrokuju denaturaciju proteina što
će olakšati formiranje sasušenog sloja, nizak stepen protoka tečnosti i raspoloživost nutrijenata.
Postoji nekoliko problema kod kojih nije zanemarljiva kontaminacija proizvoda koja se javlja
zbog formiranja biofilma. Kontaminaciju proizvoda uzrokuju naslage bakterija koje se
periodično skidaju sa filma i mogu doći na druga mjesta na procesnoj opremi u protoku
proizvoda ili napraviti prolaz u hranu. Ako se radi o organizmima koji uzrokuju kvarenje, rok
trajanja proizvoda može biti reduciran i kupovina od strane potrošača, posebno kada se radi o
ponoljenoj kupovini može biti upitna tj ima tendenciju pada. MeĎutim, ako su patogeni, proizvod
se može smatrati patvorenim i biti predmet povrata ili može biti odgovoran za trovanje hranom.
Drugi problemi vezani za biofilm su ubrzano habanje opreme kroz koroziju izazvanu celularnim
nus-proizvodima. Može se takoĎe javiti reduciranje transfera toplote i popuštanje mjernih
instrumenata kako film naruši transmisiju (npr. praćenje temperature). Prikačene ćelije mogu
razviti povećanu otpornost na sredstva za čišćenje i sanitaciona sredstva, vjerojatno zbog zaštite
koju pruža polisaharidni sloj. Smanjenje efektivnosti hemikalija može biti rezultat naslojavanja
ćelija i redukcije izlaganja površine na koju kemikalije djeluju. Ako se radi o organizmima koji
uzrokuju kvarenje, rok trajanja proizvoda može biti reduciran i kupovina od strane potrošača,
posebno kada se radi o ponoljenoj kupovini može biti upitna tj ima tendenciju pada. MeĎutim,
ako su patogeni, proizvod se može smatrati patvorenim i biti predmet povrata ili može biti
odgovoran za trovanje hranom. Drugi problemi vezani za biofilm su ubrzano habanje opreme
kroz koroziju izazvanu celularnim nus-proizvodima. Može se takoĎe javiti reduciranje transfera
toplote i popuštanje mjernih instrumenata kako film naruši transmisiju (npr. praćenje

3
temperature). Prikačene ćelije mogu razviti povećanu otpornost na sredstva za čišćenje i
sanitaciona sredstva, vjerojatno zbog zaštite koju pruža polisaharidni sloj. Smanjenje efektivnosti
hemikalija može biti rezultat naslojavanja ćelija i redukcije izlaganja površine na koju kemikalije
djeluju

Polimerne tvari koje proizvodi nekoliko vrsta mikroorganizama štite kolonije i osiguravaju
odgovarajuće uvjete za rast. Promatranja laserskom mikroskopijom otkrivaju konfiguraciju nalik
gradu, u kojoj se kolonije bakterija uzdižu iz sloja polisaharida, alginskih i glikoproteinskih
polimera. Sloj metabolita prianja uz površinu, obavijajući kolonije bakterija i tvoreći stožasti ili
gljivični oblik kao što je prikazano na slici. Prostor izmeĎu ovih struktura tvori mrežu kanala
kroz koje teku hranjive tvari, kisik i tvari potrebne za mikrobni metabolizam. Nasumično se
oslobaĎaju mali dijelovi ovih stožastih struktura mikroorganizama, koji brzo koloniziraju cijelu
površinu. Čini se da se biofilmovi dinamički razlikuju, a njihov sastav se može s vremenom
promijeniti.

Shematski prikaz strukture biofilma na površini.

Uloga bakterijskih biofilmova

Osim što bakterijski biofilmovi imaju važnu ulogu u zaštiti bakterija od antibiotika, oni mijenjaju
i ekspresiju gena onih stanica koje ulaze u bakterijski biofilm te je njihova fenotipska osobina
jedna od adaptivnih karakteristika koja im omogućava da se prilagode nepovoljnim uvjetima u
okolišu. Konjugacija (prijenos plazmida) se javlja u većoj količini izmeĎu bakterija u biofimu
nego kod “planktonskih” bakterija. Konjugacija je horizontalan prijenos genetičkog materijala iz
stanice davatelja (donor) u stanicu primatelja (recipijent). Tim procesom prenose se geni koji
najčešće donose bakteriji neke prednosti kao što su otpornost na antibiotike ili neke kemijski
aktivne tvari.

Formiranje biofilmova u prehrambenoj industriji

Okolišni uvjeti u proizvodnim pogonima hrane, kao što su prisutnost vlage, hranjivih sastojaka i
mikroorganizama u sirovini takoĎer pogoduju formiranju bakterijskih biofilmova. Takvi

4
biofilmovi su potencijalni izvor kontaminacije hrane koja dovode do kvarenja hrane ili pak
bolesti izazvanih bakterijama koje se prenose hranom. Osim toga postoji velika mogućnost da se
bakterije odvajanjem s abiotske površine vrlo lako prošire po većim površinama proizvodnog
pogona. Svojstva abiotičkih površina u proizvodnim pogonima kao i njihovo stanje, odnosno
prisutnost organskih molekula, proteina iz mlijeka ili mesa ključni su faktori za formaciju
biofilmova, jer utječu na početno povezivanje bakterijskih stanica.

Interakcije bakterija i površina za obradu hrane tijekom stvaranja biofilma mogu se razlikovati
na specifičnu adheziju i nespecifičnu adheziju kako bi se odgovorilo na različite karakteristike
interakcijskih sila.

Neke od bakterija koje formiraju zajednice u

proizvodnim pogonima hrane

Dominantne sile su Lifshitz–Van der Waals (LW), električni dvostruki sloj (EDL) i kiselo-bazna
interakcija (AB). Na njega utječu fizikalno-kemijska svojstva bakterija, površine i okoliša blizu
površine, uključujući kemiju, topografiju, mehanička svojstva, hidrofobnost i površinski naboj
bakterijske stanice i površine u kontaktu s hranom.Ova svojstva nisu konstantna.Okoliš blizu
površine mijenjat će se na temelju postupaka rada s hranom, uključujući promjenu temperaturnih
hidrodinamičkih uvjeta i procesa čišćenja opreme.Nadalje, nepovratno organsko onečišćenje će
zauzvrat promijeniti svojstva površine. S druge strane, specifična adhezija odgovara aktivnom
pričvršćivanju bakterijske stanice kroz osjet površine i komunikaciju s drugim stanicama. U
prisutnosti specifičnih doprinosa, sile interakcije bakterija su oko 2 do 3 puta jače od onih bez
specifičnih doprinosa. Specifične interakcije će uključivati specifične informacije ovisno o
prirodi bakterijske vrste. Bakterije otkrivaju kemikalije u tekućini i degradaciju odreĎenih
površinskih komponenti. Ove kemijske distribucije imaju veliki utjecaj na fizikalno-kemijske
interakcije i specifične receptore interakcije. Bakterije zarobljavaju ione i male molekule kako bi
promijenile pH u mikrookolini i promijenile brzinu transformacije DNK u bakterijskim
stanicama. bakterije osjećaju i reagiraju na ograničeno kretanje kroz privjeske. Postojanje
kvoruma je vrsta komunikacije izmeĎu pojedinačnih stanica razmjenom malih izvanstaničnih
molekula kao glasnika. Važnu ulogu u ovoj interakciji imaju egzopolimerne tvari (EPS).

5
Različite strukture biofilma odgovaraju potpuno različitim mehanizmima rasta. “Tanki”
biofilmovi nastaju u malim protočnim stanicama pri umjerenim do visokim hidrodinamičkim
brzinama protoka i oslobaĎaju novo stanično potomstvo čim se stanica pričvrsti na supstrat
biofilma. Tada se u velikim prostorima s EPS-om formiraju “debeli” biofilm. To su potpuno
različite vrste biofilma jer je rast tankog biofilma ograničen brzinom opskrbe supstrata koji
ograničavaju hranjive tvari, dok je debeli biofilm ograničen zbog svoje debljine i gustoće zbog
ograničenja difuzije hranjivih tvari. Brzina rasta spojenih i odvojenih bakterijskih stanica ključni
je čimbenik za procjenu prostorne morfologije biofilma, što je važno za razumijevanje fenomena
biofilma

Zbog otpornosti koja nastaje kao rezultat formiranja biofilmova, za dezinfekciju su potrebne
daleko veće koncentracije (10-1000 puta veće) nego one koje inaktiviraju planktonske bakterije.
MeĎutim, pranje vodom ili dezinfekcija površina u proizvodnji nije dovoljna kako bi se uklonili
ili inaktivirali bakterijski biofilmovi.

Za uspješnu inhibiciju formiranja biofilmova prvi korak je prevencija vezanja bakterija za

površine

U prehrambenoj industriji koriste se različite metode: česta sanitacija, implementacija dobre

proizvoĎačke prakse i HACCP sustav, dezinficijensi kao što su hidrogen peroksid, kvartarni
amonijevi spojevi, klor, natrij hiperklorit, peroctena kiselina i EDTA (etilendiamintetraoctena
kiselina). Navedene kemikalije imaju različito djelovanje na biofilmove, npr. djelotvornost klora
je manja na biofilmove koji su formirani od različitih vrsta bakterija (Pseudomonas spp. i
Listeria monocytogenes). Upotreba tradicionalnih kemijskih dezinficijensa predstavlja poteškoće
izazivajući onečišćenje okoliša. Postoje i fizikalne metode uklanjanja biofilmova (Slika) koje se
danas često koriste u prehrambenoj industriji; automatsko ispiranje, pranje pod tlakom,
ionizirajuće zračenje i tretman ultrazvukom.

Uzorkovanje i otkrivanje stvaranja biofilma na mjestima za preradu hrane

Metode za proučavanje stvaranja biofilma uključuju mikrobiološke, kemijske, mikroskopske i

molekularno biološke metode. Praktične metode za procjenu mikroba i organskih soli na
površinama koje su u dodiru sa hranom, potrebne su za utvrĎivanje optimalne učestalosti
čišćenja opreme. Praćenje higijene trenutno se temelji na konvencionalnom uzgoju zasijavanjem
na ploče. Uzorkovanje površine može se poboljšati prethodnim kvašenjem površine.

U metodama koje koriste briseve, odvajanje površinski vezanih mikroba ograničavajući je faktor.
U uzgoju biofilmnih mikroba važno je da se uzorak pravilno odvoji i pažljivo
izmiješa/homogenizira. Ukoliko je odvajanje sprovedeno neadekvatno (prevelika sila
upotrebljena) stanice se mogu oštetiti i na taj način ih učiniti nesposobnim za rast na pločama sa
hranjivim agarom, a nedovoljno miješanje može rezultirati nakupinama i netačnim rezultatima.
Izbor agara i uvjeta inkubacije tijekom uzgoja, reguliran je karakteristikama mikroba koje se

6
smatraju najvažnijima. Ultrazvuk odvaja približno deset puta veći broj stanica s površine u
usporedbi s brisom.

Uobičajene tehnike uzgoja koriste se za mjerenje broja živih stanica koje mogu rasti na
odabranom agaru u datim okolnostima. Ploče se obično inkubiraju na 25 - 30 ºC tijekom 2 do 3
dana. Agari su ili hranjivi agari, koji mogu sadržavati triptozu, kvasac, glukozu i agar-agar, ili
selektivni agari na bazi inhibitora rasta, npr. prehrambeni, antibiotski ili kisele komponente.
MeĎunarodne standardne metode za otkrivanje i odreĎivanje mikroorganizama uzročnika
kvarenja i patogenih mikroorganizama, temelje se na tehnikama uzgoja.

Kemijske metode koje se koriste u procjeni stvaranja biofilma su indirektne metode koje se
temelje na korištenju ili proizvodnji specifičnih spojeva, npr. organski ugljik, kisik, polisaharidi i
proteini, ili na mikrobiološkoj aktivnosti biofilma, npr. žive stanice i sadržaj ATP-a. Mjerenje
ATP-a je metoda luminiscencije koja se temelji na reakciji luciferin-luciferaza. Sadržaj ATP u
biofilmu proporcionalan je broju živih stanica u biofilmu i pruža informacije o njihovoj
metaboličkoj aktivnosti. ATP metoda je neosjetljiva i stoga nije pogodna za odreĎivanje higijene
u opremi gdje je potrebna apsolutna sterilnost, jer je za većinu danas korištenih reagensa
potrebno brojanje od najmanje 103 bakterijskih stanice da bi se dobila pouzdana vrijednost ATP.

Važnija ispitivanja u modernim istraživanjima vezanim uz biotehnologiju temelje se na

mikroskopskim tehnikama. Jedna od prednosti mikroskopske analize je u tome što može mjeriti
stanice koje su zaostale na površini, a ne stanice koje su se odvojile od površine.

Razne mikroskopske tehnike koje se koriste za proučavanje adhezije stanica i dostupnosti

stvaranja biofilma na površinskim materijalima, uključuju: epifluorescenciju,elektronsku
mikroskopiju, Infracrvena spektroskopija s Fourierovom transformacijom, infracrvenu
spektroskopiju, kao i laserska konfokalna mikroskopija i mikroskopija atomske sile.

Fluorescencija je vrsta luminiscencije u kojoj se svjetlost emitira iz molekula kratko vrijeme

nakon apsorpcije svjetlosti. Fluorescencija se dogaĎa kada se pobuĎeni elektron vrati u nižu
energetsku orbitu i emitira foton svjetlosti. Mnogo različitih fluorokroma korišteno je za
odreĎivanje broja mikroba u uzorcima hrane, biofilmovima i uzorcima okoliša. Protočna
citometrija pomoću fluorescentnih sondi direktna je optička tehnika za mjerenje funkcionalnih i
strukturnih svojstava pojedinih stanica u staničnoj populaciji. Ova se tehnika koristi za
odreĎivanje održivosti protozoa, gljivica i bakterija. Mjeri se održivost statistički značajnog broja
organizama (5000 - 25 000 stanica/uzorak). Prednosti protočne citometrije su točnost, brzina,
osjetljivost i ponovljivost.

U prehrambenoj industriji prvi je korak identificirati probleme s biofilmom u odreĎenom dijelu

procesu odnosno mjestu. Nakon toga, važno je koristiti najbolje moguće metode za izolaciju i
detekciju biofilma za daljnju karakterizaciju u laboratorij koji koristi molekularnu biologiju i
biokemijske metode.

7
 Patogeni u biofilmovima

Salmonella biofilmovi
Hrana koja se obično povezuje s bolešću salmoneloza uključuje sirovo meso, perad, jaja, mlijeko
i mliječne proizvode. Salmoneloza koja se prenosi mlijekom česta je u dijelovima svijeta gdje
mlijeko nije ni kuhano ni pasterizirano. Javlja se, ali mnogo rjeĎe, u razvijenim zemljama u
kojima su glavni proizvodi pasterizirano mlijeko, mlijeko u prahu i odreĎeni sirevi.

Mnoge su studije provedene o formiranju biofilmova od strane Salmonella, i sve su pokazale da

Salmonella spp. mogu stvarati biofilmove na površinama u kontaktu s hranom i da su stanice u
biofilmovima puno otpornije na sredstva za dezinfekciju u usporedbi sa stanicama koje nisu u
biofilmu. U studiji koja je provedena 1998 godine, proučavana je otpornost Salmonella spp. koja
je izolirana iz klaonice peradi i otkriveno je da može nesmetano rasti pri koncentracijama
hipoklorične kiselina i to u onim koncentracijama u kojim je pristutna u sredstvima za čišćenje.
Prisutnost Pseudomonas fluorescens u biofilmu rezultirala je povećanom otpornošću Salmonella
enterica (s.typhimurium) na klor.

Escherichia coli izolirana je iz velikog broja hrane i pića, npr. fermentirana mesna kobasica,
mliječni proizvodi, povrće, meso, perad i riblji proizvodi i voda. Prisustvo ove bakterije uzrokuje
pojavu dijareje. Nepasterizirano mlijeko predstavlja najčešći izvor E. coli O157: H7 na ljude,
može preživjeti dulje vrijeme u nekim kiselijim namirnicama (nizak pH) kao što je sir i jogurt.
Kiselinama prilagoĎena E. coli O157: H7 pokazala je pojačano preživljavanje i prevalenciju u
biofilmovima na površinama od nehrĎajućeg čelika pri proizvodnji, sir i jogurt.

U istraživanju provedenom 2002 god, sojevi mikroba, na pr. E. coli i L. monocytogenes,

pronaĎeni su ili na površinama ili u proizvodima ili i u proizvodima i na površini, a neki od tih
sojeva bili su jako postojani. TakoĎer istraživanje koje je provedeno tijekom 2002 i 2003 godine,
je pokazalo da stanice E. Coli, slabo prijanjaju za površinu. Stanice su uklopljenje u organsku
matricu biofilma, što pokazuje da struktura nastalog biofilma utječe na način čišćenja površina.
Čišćenje koje se bazira na upotrebi proteolitičkih i glikolitičkih enzima zajedno u kombinaciji sa
ultrazvukom pojačava uklanjanje biofilma E. coli iz nehrĎajućeg čelika zaprljanog mlijekom.

Campylobacter biofilmovi
U laboratorijskim ispitivanjima pokazalo se da Campylobacter, u optimalnim uvjetima, tvori
biofilm na nehrĎajućem čeliku u 2 dana. U studijama koje su provedene 1994 pokazalo se da
biofilmovi tvore zone s malim udjelom kisika u aerobnom okruženju i Campylobacter spp. stoga
mogu lakše preživjeti u biofilmovima. U studiji provedenoj u 2002, pokazali su da su uzgojene
stanice C. jejuni ne površini polivinilklorida smanjivale se s vremenom, a najveće smanjenje
dogodilo se na površinama bez već postojećeg biofilma. Mikrobiološkim ispitivanjima se
pokazalo, da biofilmovi pospješuju preživljavanje C. jejuni tijekom 7-dnevnog razdoblja pri 12

8
ºC i 23 ºC. Ostaci hrane ili vlaga poboljšavaju preživljavanje kampilobakterija na površinama. C.
jejuni dobro preživiljava na drvenim površinama jer pore u drvetu štite stanice od kisika.

Listeria monocytogenes biofilmovi

Nadzor higijene u prehrambenoj industriji važan je jer L. monocytogenes, posebno, može
kolonizirati i stvarati biofilme u okruženjima za preradu hrane i na površinama. Izvori listerije u
pogonima za preradu su transportne trake, rezači, strojevi za slanje i pakiranje, hladnjaci i
zamrzivači, kao i podovi i odvodi. UtvrĎeno je da L. monocytogenes tvori biofilme na
uobičajenim površinama u kontaktu s hranom poput plastike, polipropilena, gume, kao i od
nehrĎajućeg čelika, a takoĎer i na staklu.

Staphylococcus aureus biofilmovi

Staphylococcus aureus je patogen koji takoĎer može utjecati na mliječne proizvode, može ga se
naći u velikoj koncentraciji u sirovom mlijeku. stafilokoki se brzo razvijaju na početku
fermentacije, i kod sira i jogurta. Ova bakterija je otporna na sušenje i može kolonizirati na
opremi koja je ostala u vlažnim uvjetima. TakoĎer se može naći u ventilacionim sistemima.
Otpornost na oksidacijske dezinficijense uglavnom je povezana s stvaranjem biofilma. Za
biofilm S. aureus koji je nastao na nehrĎajućem čeliku, polistirenu i staklu u protoku hranjivih
sastojaka, potrebno je primjeniti 50 puta veće koncentracije benzalkonijevog klorida i 600 puta
veće koncentracije hipoklorita kako bi se postiglo ubijanje 4 logaritma (104 stanica) aureus u
usporedbi sa stanicama u suspenzijama

Bacillus cereus biofilmovi

U istraživanju mliječnih proizvoda (1998) pokazano je da je B. cereus pronaĎen u 52%
sladoleda, 29% mlijeka u prahu, 17% fermentiranog mlijeka i 2% pasteriziranog mlijeka i
mlijeka s okusom voća. Biofilm B. cereus se može formirati i u stroju za punjenje. Različiti
Bacillus spp., a meĎu njima i B. cereus, pronaĎeni u dijelu za ambalažiranje, što bi moglo biti
dodatni izvor biofilmova koji sadrže Bacillus spp. Spore B. cereus posjeduju izraženu sposobnost
prianjanja na površinu od nehrĎajućeg čelika a to je materijal koji se koristi za opremu u preradi
hrane. Biofilm koji sadrži Bacillus i Pseudomona species veže se za površine opreme za preradu, čak i
ako su tretirane koncentracijom dezinficijensa u uporabi, uspijevaju preživjeti i rasti. Ova je pojava još
izraženija kada su u pitanju mješoviti biofilmovi. Povezane stanice B. cereus mogu naknadno stvoriti a
biofilm na površini od nehrĎajućeg čelika i predstavljaju glavni problem za prehrambenu industriju.

9
Mycobacterium biofilmovi
Za ispitivanje toplinske otpornosti M. avium subsp. Paratuberculosis korišten je pilot
pasterizator. tijekom kratkotrajne pasterizacije pri visokoj temperaturi (HTST) korištenjem
uzoraka sirovog mlijeka u različitim vremenskim i temperaturnim uvjetima. Rezultati su pokazali
da je mali broj M. Paratuberculosis može preživjeti ekstremne HTST tretmane. U provedenoj
studiji (2004) proučavano je 16 distribucijskih sustava pitke vode u Finskoj na rast
mikobakterija, uzimanjem uzoraka vode iz vodovoda i u različitim dijelovima sustava. U
eksperimentalnom dijelu proučavana je kolonizacija mikobakterija kao biofilmova na
epruvetama od polivinilklorida. Gustoća mikobakterija u biofilmima u razvoju bila je najveća na
distalnim (udaljenim) mjestima sustava.

Prevencija stvaranja biofilma i uklanjanja biofilma

Kontaminirajući mikrobi mogu ući u proizvodni proces i doći do krajnjeg proizvoda na nekoliko
načina, npr. kroz sirovine, zrak u proizvodnom području, upotrijebljene kemikalije, površine za
obradu ili preko zaposlenih . Jednom kad se biofilm formira, bilo u kontaktu s hranom ili na
površinama, on može biti izvor kontaminacije hrane koja prolazi kroz istu liniju postrojenja. U
prehrambenoj industriji dizajn opreme i izbor površinskih materijala važni su u borbi protiv
stvaranja mikrofilnog biofilma. TakoĎer treba obratiti pozornost na kvalitetu aditiva i sirovina,
kao i na vodu za obradu, paru i druge aditive, jer upotreba nekvalitetnih materijala dovodi do
oštećenja.

Cilj mikrobne kontrole u procesnoj liniji je dvojak: smanjiti ili ograničiti broj mikroba u
tekućinama i proizvodima i smanjiti ili ograničiti njihovu aktivnost te spriječiti i kontrolirati
stvaranje biofilmova na površinama. Trenutno su najučinkovitija sredstva za ograničavanje rasta
mikroba dobra higijena proizvodnje, racionalno upravljanje linijom procesa i dobro osmišljena
uporaba procesa čišćenja i dekontaminacije. Čistoća površina, obučenost osoblja i dobra
proizvodna praksa važni su u borbi protiv problema s biofilmom u prehrambenoj industriji

Dizajn opreme (sa higijenskog stajališta)

dizajn opreme i procesnih linija u industriji prerade hrane i pakiranja važan je u spriječavanju
stvaranja biofilma u cilju poboljšanja procesa i higijene proizvodnje. Najznačajniji zakoni koji se
odnose na prehrambenu industriju su EU direktiva 98/37/EU i standard EN 1672-2: 1997. EN
1672 ukazuje na mrtve prostore, uglove, pukotine, ventile, pričvršćivače i spojeve zbog njihove
sposobnosti da sadrže mikroorganizme koji kasnije mogu podnijeti nepovoljne / štetne uvjete
procesa. Oprema koja stvara probleme u preradi i pakiranju hrane uključuje opremu za rezanje, strojeve
za punjenje i pakiranje, transportere, pločaste izmjenjivače topline i spremnike s cjevovodima. Ove vrste

10
opreme mogu se kontaminirati mikrobima i patogenima, jer ih je teško očistiti, npr. Listeria
monocytogenes često je povezan sa nakupljanjima u loše dizajnirnoj opremi.

Uklanjanje biofilma

Eliminacija biofilmova vrlo je težak i zahtjevan zadatak, jer mnogi faktori utječu na odvajanje,
poput temperature, vremena, mehaničkih sila i kemijskih sila. Sanitacija, tj. čišćenje i
dezinfekcija, provodi se u pogonima za preradu hrane kako bi se proizveli sigurni proizvodi s
prihvatljivim rokom trajanja i kvalitetom. Ključ učinkovitog čišćenja prehrambenog pogona
podrazumijeva poznavanje i razumijevanje vrste i prirode onečišćenja i rasta mikroorganizama
na površinama koji se uklanjaju. Mehaničku i kemijsku snagu, temperaturu i vrijeme kontakta u
režimu čišćenja treba pažljivo odabrati kako bi se postigao odgovarajući učinak čišćenja.
Učinkovit postupak čišćenja sastoji se od slijeda ispiranja i upotrebe deterdženata i dezinficijensa
u različitim kombinacijama temperature i koncentracije, konačno ostavljajući opremu i procesne
linije da se osuše u dobro prozračenim prostorima

Osnovni zadatak deterdženata je smanjiti meĎufaznu napetost nečistoće koja se nalazi na

površini opreme. Učinak tenzida povećava se mehaničkim učinkom turbulentnog protoka ili
tlaka vode ili abrazivnim sredstvima, na primjer kristalima soli. Dugotrajno izlaganje površina
deterdžentu čini uklanjanje učinkovitijim. Deterdženti koji se koriste u čišćenju otvorenih
sustava formulirani su tako da djeluju na temperaturama u rasponu od 35 - 50 ºC. U zatvorenim
sustavima deterdženti su formulirani za upotrebu na temperaturama u rasponu od 55 - 80 ºC.

Eliminacija biofilmova u otvorenim sustavima izvodi se na sljedeći način: nečistoće treba

ukloniti suhim metodama, na pr. četkanjem, struganjem ili usisavanjem, a ako je proces mokar,
nečistoće se mogu isprati vodom pod niskim pritiskom. Učinkovito uklanjanje biofilmova iz
otvorenih sustava postiže se demontažom opreme u tehnološkoj liniji, a čišćenje se zatim vrši
pomoću pjene ili gela. Pjene su najučinkovitije u situacijama kada je potreban dulji kontakt
površinom. Površinski aktivne tvari, koje će suspendirati zalijepljene čestice i mikrobe s površina
u vodi, dodaju se kako bi se povećao učinak čišćenja, koji se takoĎer povećava upotrebom vode
dovoljnog volumena pri odgovarajućoj temperaturi i tlaku. Demontiranu opremu i pribor nakon
toga treba čuvati na policama i stolovima, a ne na podu. Čišćenje se uglavnom provodi u
kombinaciji s završnom dezinfekcijom, jer bi preživjeli mikrobi na površinama predstavljali
izvor kontaminacije.

U režimu čišćenja za zatvorene procese, vrši se prethodno ispiranje hladnom vodom kako bi se
uklonile površinske nečistoće. Tretman za čišćenje na mjestu (CIP) obično se izvodi pomoću
vrućih otopina za čišćenje, ali se mogu koristiti i hladne otopine kada je u pitanju proces u kojem
nema masnoća.

11
Topla alkalna otopina za čišćenje, obično 1% natrijev hidroksid, zagrijava se na 75 - 80 ºC, a
vrijeme čišćenja je 15 ± 20 min.

Oprema se ispira hladnom vodom prije nego što se provede korak koji podrazumijeva obrada
kiselinom na približno 60 - 70ºC tijekom 5 minuta. Učinak sredstava na bazi klora može se
podijeliti u tri faze: opuštanje biofilma s površine, lomljenje biofilma i dezinfekcijski učinak
aktivnog klora. Otopine za čišćenje ne bi se trebale ponovno koristiti u procesima kako bi se
postigla ukupna sterilnost, jer ponovno upotrijebljena otopina za čišćenje može kontaminirati
opremu. Jednofazni CIP danas se češće koristi jer preraĎivačka industrija želi uštedjeti vrijeme.
U jednofaznim postupcima čišćenja može se uštedjeti vrijeme potrebno za provoĎenje jednog
postupka čišćenja, koji podrazumijeva korak sa kiselinom i korak ispiranja. Fotobakterijskim
testom se može provjeriti je li ispiranje pravilno provedeno

12