PROGRAMA DE ESTUDIO:

LABORATORIO CLINICO

● UNIDAD DIDÁCTICA: Métodos y Técnicas de Estudio Bacteriológico II

● PRACTICA: Análisis microbiológico del agua y determinación de coliformes

por filtro de membrana

● PERÍODO ACADÉMICO: 4to Ciclo

● SECCIÓN: 4NLA21

● DOCENTE RESPONSABLE: Purizaca Navarro, Miguel Angel

● ALUMNOS:

o Ferragut, María de los Ángeles

o Mateo Yaulli, María Alexandra

o Silva Bances, Brenda Antonell

o Zúñiga López, Luis Anthony

2023-I
ANÁLISIS MICROBIOLOÓGICO DEL AGUA Y DETERMINACIÓN DE COLIFORMES
POR FILTRO DE MEMBRANA

INTRODUCCIÓN

El control de calidad del agua es muy importante, ya que es la materia prima más
utilizada. Por ello, es parte de nuestros modos de producción en diversas áreas
manufactureras y en la población, ya sea, como agua suavizada, agua desionizada,
agua destilada, agua potable, etc.

Por lo que se debe estudiar a los microorganismos que podrían estar presentes en el
agua, para así disminuir probabilidades de que ésta sea un foco infeccioso para futuros
brotes de enfermedades y así minimizar los riesgos en la población.

De este modo se debe garantizar la calidad microbiológica del agua, mediante distintas
técnicas como el número más probable (nmp) y determinación de coliformes por filtro
de membrana que nos puedan permitir realizar el recuento de bacterias coliformes en
nuestra investigación.

MARCO TEÓRICO

El control microbiológico del agua es un conjunto de técnicas y procedimientos

utilizados para garantizar la calidad sanitaria del agua destinada al consumo humano,
así como a diferentes actividades industriales y procesos de laboratorio. Es
fundamental realizar un control riguroso para prevenir la presencia de
microorganismos patógenos y otros contaminantes microbiológicos que puedan
representar un riesgo para la salud.

 Importancia del control microbiológico del agua:

El agua es un recurso vital para la vida y su consumo seguro es esencial para
prevenir enfermedades transmitidas por agua. La presencia de
microorganismos patógenos en el agua puede causar infecciones
gastrointestinales, enfermedades transmitidas por vectores y otras
enfermedades relacionadas con el agua. Por lo tanto, es esencial implementar
medidas de control microbiológico para garantizar la seguridad del agua.

 Fuentes de contaminación del agua:

El agua puede ser contaminada por diferentes fuentes, como la contaminación
fecal de origen humano o animal, la descarga de aguas residuales no tratadas,
la presencia de microorganismos en el suelo y las aguas subterráneas, y la
contaminación cruzada durante el almacenamiento y distribución del agua. Es
 importante identificar las fuentes de contaminación para establecer medidas de
control eficaces.

 Parámetros microbiológicos a evaluar:

En el control microbiológico del agua, se deben evaluar diferentes parámetros
para determinar la calidad microbiológica. Algunos de los parámetros comunes
incluyen el recuento total de bacterias, la presencia de coliformes fecales como
indicador de contaminación fecal, la detección de microorganismos patógenos
específicos y la evaluación de la presencia de endotoxinas bacterianas. Estos
parámetros permiten evaluar la presencia y nivel de contaminación
microbiológica del agua.

 Métodos de muestreo y análisis:

Los métodos de muestreo y análisis para el control microbiológico del agua se
basan en normas y técnicas establecidas por organismos reguladores y
estándares internacionales. El muestreo debe ser representativo y se deben
tomar precauciones para evitar la contaminación durante la recolección de
muestras. Los métodos de análisis pueden incluir técnicas de cultivo, como el
recuento en placa, así como métodos moleculares, como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), para la detección específica de
microorganismos patógenos.

 Estrategias de control y prevención de la contaminación:

Para garantizar la calidad microbiológica del agua, se deben implementar
estrategias de control y prevención. Estas estrategias pueden incluir el
tratamiento adecuado del agua mediante procesos de desinfección, como la
cloración o la radiación ultravioleta, así como la implementación de sistemas de
filtración y purificación. También es importante establecer programas de
monitoreo regular, mantenimiento de infraestructuras y capacitación del
personal involucrado en el manejo y suministro de agua.

 Cumplimiento de normativas y regulaciones:

El control microbiológico del agua se rige por normativas y regulaciones
específicas que varían según el país o la región. Es fundamental cumplir con
estas normativas y asegurarse de que se cumplan los estándares establecidos
para garantizar la calidad microbiológica del agua. Esto implica la realización
 de pruebas y análisis periódicos, así como el seguimiento de los límites
establecidos para los diferentes parámetros microbiológicos.

AGAR ENDO

El agar Endo es un medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado en microbiología

para el aislamiento y la diferenciación de bacterias coliformes, especialmente
Escherichia coli, a partir de muestras clínicas, ambientales o alimentarias. El medio
lleva el nombre de su desarrollador, el micrbiólogo japonés Dr. Shigella Endo.

El agar Endo contiene varios componentes clave que permiten su selectividad y

diferenciación:

 Lactosa: El agar Endo contiene lactosa como fuente de carbono. Las bacterias
coliformes, como E. coli, tienen la capacidad de fermentar la lactosa, lo que
resulta en la producción de ácido láctico y la acidificación del medio.
 Rojo de fenol: Este indicador de pH se añade al medio para facilitar la
detección de la fermentación de la lactosa. En condiciones ácidas
(fermentación positiva de lactosa), el agar adquiere un color rojo.
 Sales biliares y cristal violeta: Estos componentes inhiben el crecimiento de
bacterias Gram positivas y de muchas bacterias Gram negativas no coliformes,
lo que confiere al medio una selectividad para los coliformes.

Además de estos componentes principales, el agar Endo puede contener otros

aditivos, como el azul de metileno, que actúa como un inhibidor de bacterias Gram
positivas y como un indicador de la presencia de colonias de E. coli.

El agar Endo se utiliza en el laboratorio clínico para el aislamiento y la diferenciación

de bacterias coliformes en muestras como heces, orina, agua y alimentos. Las
colonias de bacterias coliformes en el agar Endo se distinguen por su coloración roja o
rosada, indicando una fermentación positiva de la lactosa. A menudo, las colonias de
E. coli presentan una coloración verde metálica debido a la producción de sulfuro de
hidrógeno.

AGAR CETRIMIDE

El agar cetrimide es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y la

identificación de Pseudomonas aeruginosa, una bacteria patógena y oportunista que
puede causar infecciones graves en humanos.

El agar cetrimide contiene varios componentes que le confieren su selectividad y

capacidad para distinguir a Pseudomonas aeruginosa de otros microorganismos:
  Cetrimida: Es un agente selectivo clave en el medio. La cetrimida es un
tensioactivo catiónico que inhibe el crecimiento de la mayoría de los
microorganismos, pero permite el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa.
 Glicerol: Se utiliza como fuente de carbono en el agar cetrimide y favorece el
crecimiento de Pseudomonas aeruginosa.
 Sales biliares y cristal violeta: Estos componentes también se incluyen para
inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas y de otros Gram negativos, lo
que contribuye a la selectividad del medio.

El agar cetrimide es de color verde y transparente. Pseudomonas aeruginosa crece en

este medio y produce una pigmentación verde metálica característica debido a la
producción de un pigmento llamado piodina. Este es un criterio importante para la
identificación preliminar de Pseudomonas aeruginosa.

CALDO BRILA

El agar verde brillante (Brila)es un medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado en

microbiología para el aislamiento y la identificación de bacterias Gram negativas,
especialmente Salmonella y algunas especies de Shigella, en muestras clínicas,
alimentarias y ambientales.

El agar verde brillante contiene varios componentes que le confieren sus propiedades
selectivas y diferenciales:

 Verde brillante: Es un colorante selectivo que inhibe el crecimiento de bacterias

Gram positivas, permitiendo el crecimiento de bacterias Gram negativas.
 Lactosa: Se utiliza como fuente de carbono. Algunas bacterias, como la
mayoría de las especies de Salmonella, fermentan la lactosa y producen ácido,
lo que genera cambios de color en el medio
 Sales biliares y sulfato de sodio: Estos componentes también contribuyen a la
selectividad del medio, inhibiendo el crecimiento de bacterias Gram positivas y
algunas bacterias Gram negativas no deseadas.
 Rojo neutro y cristal violeta: Son indicadores de pH y se utilizan para
diferenciar las colonias de bacterias que fermentan la lactosa de aquellas que
no lo hacen. Las colonias de bacterias lactosa positivas pueden presentar un
color verde oscuro o negro, mientras que las bacterias lactosa negativas
aparecen incoloras o rosadas.

El agar verde brillante se utiliza comúnmente en el aislamiento y la identificación de

Salmonella y algunas especies de Shigella, patógenos importantes relacionados con
enfermedades transmitidas por alimentos y gastrointestinales. Las colonias
sospechosas se someten a pruebas bioquímicas y serológicas adicionales para
confirmar su identidad.

MATERIALES Y EQUIPOS

Reactivos:

 Tubos de ensayo
 Mechero
 Probeta
 Filtrado al vacío
 Filtro de membrana
 Gradilla
 Asa de siembra
 Pinza
 Placa petri

Medios de cultivo:

 Agar cetrimide
 Agar ENDO
 Caldo brila

Observación: en nuestra mesa de trabajo se nos dio los agares y caldos preparados.

PROCEDIMIENTO

1. Tomar muestra de agua de distinta procedencia en recipiente estéril de 500ml

(caso: agua hervida).
2. Colocar al personal correctamente los EPP.
3. Esterilizar los tubos de ensayo, las campanas, y las placas petri en la
autoclave
4. Preparar el agar ENDO, agar cetrimide y caldo brila con agua destilada.
5. Ingresar en la incubadora los medios de cultivo.
6. Refrescar los materiales esterilizados y los medios de cultivo
COLIFORMES TOTALES

1. Preparación de campana Durkan por el caldo brila

 En un tubo, insertar 9ml de caldo brilla
 Luego, se introduce un tubo de ensayo más pequeño de manera inversa
dentro del tubo con caldo.
 Hacer inversiones para sacar el aire
2. Inocular 9 ml de agua peptonada con la dilución decimal de la muestra de agua
10-1, 10-2, 10-3, en 3 tubos de ensayo.
3. Inocular el tubo 10-2 con 1ml hacia el caldo brila.
4. Incubar a 37ºC a 24-48 horas.

COLIFORME FECALES

1. Preparar agar ENDO en placas Petri, dejar enfriar

2. Encender el equipo de filtración para calentar.
3. Colocar un filtro de membrana estéril con pinzas esterilizadas, sobre el embudo
con soporte de filtración que se coloca en la maquina filtradora.
4. Filtrar 100ml muestra de agua en el embudo conectado con el matraz.
5. Pasar el agua sobre el papel filtro estéril, mientras el equipo eléctrico hace la
filtración.
6. Sacar con las pinzas esterilizadas el papel filtro-
7. Sembrar en el agar ENDO el papel filtro de modo que la filtración quedé hacia
arriba, con mechero prendido
8. Pegar los bordes del papel con la pinza.
9. Cerrar y llevar a incubar a 37° a 24-48 horas.

Para el medio de cultivo Cetrimide

1. Esterilizar el asa de siembra, dejar enfriar.

2. Introducir el asa de siembra en el caldo brila.
3. Sembrar a estría simple.
4. Dejar incubar a 37° a 24-48 horas.
 RESULTADOS

 Tanto el agar cetrimide, agar endo y el clado brilla fueron enviados a incubación
el día martes 20 de junio a las 9:00 pm y fueron leídos el día jueves 22 de junio
a las 11:30 pm dado los siguientes resultados:

AGAR ENDO

 Color del agar: ámbar.

 Color del papel filtro: vino

 NO SE OBSERVA PRESENCIA DE
COLONIAS

 Se observaron 2 pequeños círculos

ligeramente arrugados.
AGAR CETRIMIDE

 Color del agar: amarillo pálido.

 NO SE OBSERVA PRESENCIA DE
COLONIAS.

CALDO BRILA

 Color del caldo: verde

 No se observa gases, ni turbidez en

el caldo.

 Claro y limpio

CONCLUSIONES

El análisis microbiológico del agua para la búsqueda de microorganismos y la filtración

para la determinación de coliformes nos dio como resultados de una observancia
negativa ante la presencia de alguna bacteria en el agar Endo, caldo brila y en el agar
cetrimide de nuestro trabajo experimental.
 BIBLIOGRAFÍA

1. Britanialab. Caldo Bilis Verde Brillante [Internet]. Britanialab.com. [citado el 25 de

junio de 2023]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6054e8cd82576.pdf

2. Racchumi M. Agar Endo [Internet]. microbiologiamedica. 2013 [citado el 25 de junio de

2023]. Disponible en: http://microbiologiamedica.web16.top/medios/medios-
especiales/medios-selectivos/agar-endo

3. Britanialab. Agar Cetrimide [Internet]. Britanialab.com. [citado el 25 de junio de 2023].

Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6070668da829e.pdf

4. Análisis microbiológico del agua [Internet]. Agua Inmaculada. 2022 [citado el 25 de

junio de 2023]. Disponible en: https://www.aguainmaculada.com/blog/analisis-
microbiologico-del-agua/