TESIS Estudio Comparativo de La Inmovilización de La Lipasa Termoalcalófila

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANÁLISIS
Estudio comparativo de la inmovilización de la lipasa termoalcalófila

recombinante LipMatCCR11 de Geobacillus thermoleovorans CCR11 por
dos métodos de inmovilización.
TESIS
QUÍMICO CLÍNICO
PRESENTA:
Tamara Amneris Semería Maitret
Dra. Ma. Guadalupe Sánchez Otero Dr. Jorge G. Domínguez Chávez
M.C. Giselle Lilian Badillo Zeferino
H. VERACRUZ, VER. Febrero – Julio 2017

ÍNDICE GENERAL
Portada…………………………............……………………………………………………i
Índice general ........................................................................................................................ii
Índice de cuadros .................................................................................................................vii
Índice de figuras ..................................................................................................................viii
Agradecimientos ...................................................................................................................x
Dedicatoria ............................................................................................................................xi
Resumen ...............................................................................................................................xii
Introducción………………………………………………………………………………....2
I. Marco teórico…………………………………..……………………………..…4
1.1 Enzimas y biocatálisis…………………………………………………….................4
1.1.1 Limitaciones en el uso de los biocatalizadores …………………………………6
1.2 Extremófilos y sus extremoenzimas…………………………………………….….7
1.2.1 Importancia de las enzimas y extremoenzimas en la industria y

biotecnología…………………………………………………………………………….9
1.3 Lipasas…………………………………..……………………………………….....13
1.3.1 Estructura de las lipasas……...……….………………………………………..13
1.3.2 Mecanismo catalítico de las lipasas…………..………………………………..14
1.3.3 Reacciones catalizadas por lipasas…………………...…………….…………..16
1.3.4 Fuentes de lipasas……………………………………………………………....18
1.3.5 Lipasas de origen microbiano…………………………………….………..…..18
1.3.6 Aplicaciones de las lipasas en la industria y biotecnología……………….…...19

ii
1.4 Inmovilización de enzimas…………………………………..…………………….21
1.4.1 Generalidades sobre la inmovilización……………………………….……..…21
1.4.2 Métodos de inmovilización reversible……………………………….……..….24
1.4.2.1 Inmovilización por adsorción a soporte……………………………….........24
1.4.3 Métodos de inmovilización irreversible………………………………………..26
1.4.3.1 Entrecruzamiento – Cross-linking………………………………………..…26
1.4.3.2 Cristalización y reticulado de enzimas – Cross-linked enzymes crystals

(CLECs)……………………………………………………………………………………27
1.4.3.3 Agregados enzimáticos reticulados – Cross-liked enzymes aggregates

(CLEAs)……………………………………………………………………………………28
1.5 Inmovilización de lipasas…………………………………………………………..31
1.6 Lipasas termoalcalófilas de Geobacillus thermoleovorans CCR11…………….…32
1.6.1 Lipasa nativa y recombinantes de Geobacillus thermoleovorans

CCR11…………………………………………………………………………………...…32
1.6.2 Reacciones de síntesis catalizadas por LipMatCCR11…………………………33
1.6.3 Inmovilización de lipasa provenientes de Geobacillus thermoleovorans

CCR11……………………………………………………………………………………...33
Justificación………………………………………………………………………………..34
Hipótesis……………………………...……………………………………………………35
Objetivos…………………………………………………………………………………...36
II. Materiales y Métodos……………………………………………………………….37
2.1 Reactivos y cepas……………...………….……………………………………..…37
2.1.1 Cepa………………………………………………………………….…………37
iii
2.2 Producción y obtención del extracto crudo enzimático……………………………37
2.3 Técnicas analíticas………………………………………...……………………….37
2.3.1 Determinación de la actividad enzimática…………………..………………….37
2.3.2 Determinación de la concentración de proteína………………………….….….39
2.3.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida…………………………………….…39
2.3.4 Zimograma………………………………………………………………….…..39
2.4 Inmovilización……………………………………………….……………………..40
2.4.1 Condiciones de inmovilización……………………………………………....…40
2.4.2 Evaluación de la inmovilización………………………………..........................41
2.5 Caracterización de los inmovilizados………………….……………...……………42
2.5.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados……………...42
2.5.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………….43
2.5.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados……..…………………..43
2.5.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados…………………….....43
2.5.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento…………………..44
2.5.6 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y la

LipMatCCR11 soluble……………………………………………………………………..44
2.5.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP…………………….44
2.6 Estabilidad química de la enzima en los inmovilizados …………………………...45
2.7 Análisis morfológico de los inmovilizados …………………………………....…..46
III. Resultados …………………………………….……………………………….47
3.1 Inmovilización…………………………………………...........................................47
iv
3.1.1 Evaluación de la inmovilización……………………..…………………………47
3.2 Caracterización de los inmovilizados………………………………………….…...47
3.2.1 Efecto de la temperatura sobre los inmovilizados………………………….…...47
3.2.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………....48
3.2.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados………………………....49
3.2.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados……………………….50
3.2.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento…………………..51

3.2.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP………………….....54
3.3 Estabilidad química de la enzima en los agregados ……………………………….55
3.4 Análisis morfológico de los inmovilizados ………………………………………..58
IV. Discusión…………………………………………………………………….....64
4.1 Evaluación de la inmovilización sobre la LipMatCCR11………………………….64
4.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados………………....65
4.3 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………..........66
4.4 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados……………………...…......67
4.5 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados………………..……….…68
4.6 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento………………...........69
4.7 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y la

4.8 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP……………………......72
v
4.9 Estabilidad química de la enzima en los agregados………………………………..73
4.10 Análisis morfológico de los inmovilizados……………………………………….75
VI. Conclusión………………………………………………………………………....78
Referencias………………………………………………………………………………....79
Anexo1. Curva de p-nitrofenol.
Anexo 2. Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Anexo 3. Procedimientos para la producción de los inmovilizados.
vi
ÍNDICE DE CUADROS
Tabla 1. Diferencias entre la biocatálisis y la catálisis química..............................................5
Tabla 2. Clasificación de los extremófilos..............................................................................8
Tabla 3. Posibles aplicaciones de las enzimas provenientes de extremófilos en la industria y

la biotecnología.....................................................................................................................11
Tabla 4. Aplicaciones industriales de las lipasas..................................................................19
Tabla 5. Ventajas y desventajas de la inmovilización...........................................................22
Tabla 6. Comparación de los principales métodos de inmovilización de enzimas………...23
Tabla 7. Condiciones para la producción de los LipMatCC11-CLEAs................................40
Tabla 8. Condiciones para la producción del LipMatCCR11-PP………………….............41
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Plegamiento canónico α/β de las hidrolasas..........................................................14
Figura 2. Mecanismo catalítico de las lipasas.......................................................................16
Figura 3. Reacciones catalizadas por lipasas........................................................................17
Figura 4. Tipos de reticulación y sus diferentes estrategias de producción..........................27
Figura 5. Proceso de formación de los agregados enzimáticos reticulados o CLEAs……..29
Figura 6. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la lipasa soluble y los

inmovilizados….…………………………………………………………………………...48
Figura 7. Termoestabilidad de los inmovilizados y LipMatC CR11 soluble……………...49
Figura 8. Efecto del pH sobre LipMatCCR11-CLEAs, LipMatCCR11-PP y la enzima

soluble……….......................................................................................................................50
Figura 9. Efecto del pH sobre la estabilidad de LipMatCCR11-CLEAs, LipMatCCR11-PP

y la enzima soluble………………………………………………………………………....51
Figura 10. Estabilidad durante el almacenamiento de LipMatCCR11-CLEAs,

LipMatCCR11-PP y la enzima soluble a 25°C…………………………………………….52

LipMatCCR11-PP y la enzima soluble a 4°C……………………………………………...52
Figura 12. Afinidad de LipMatCCR11-PP, LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11 soluble

a ésteres de p-nitrofenil……………………………………………………………….……54
Figura 13. Estabilidad de LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP durante el reuso....55
Figura 14. Análisis de LipMatCCR11-CLEAs – protocolo SDS………………….……....56
Figura 15. Análisis de LipMatCCR11-PP – protocolo SDS……………………………….57
Figura 16. Prueba de desorción de LipMatCCR11-PP………………………………….…58
viii
Figura 17. Micrografías-SEM de LipMatCCR11-CLEAs…………………………...….....59
Figura 18. Micrografías-SEM Accurel EP 100 inmovilizado y sin enzima……………….60
Figura 19. Micrografías-SEM Accurel EP 100 sin enzima………………………………...62
Figura 20. Micrografías-SEM morfología del Accurel EP 100…………………………… … .…...63
ix
AGRADECIMIENTOS
A mis asesores la Dra. María Guadalupe Sánchez Otero, a la M.C. Giselle Lilian Badillo
Zeferino y al Dr. Jorge Guillermo Domínguez Chávez por su tiempo, comentarios
y paciencia para la realización de esta tesis.
A la Dra. Rosa María Oliart Ros (UNIDA-ITVer) por su enorme apoyo en la realización de
todo este proyecto, muchas gracias sin usted esto no hubiese sido posible.
A la Biol. Greta Hanako Rosas Saito (INECOL) por su gran apoyo con la obtención de las
imágenes del microscopio electrónico de barrido, muchas gracias por contribuir con
este proyecto.
A Giselle Lilian Badillo Zeferino y Paola Carolina Mora González por su apoyo,
sus consejos y comentarios tan acertados, su ayuda fue más de lo que podía pedir y un
simple gracias no alcanza para expresar mi agradecimiento, sin ustedes este trabajo
hubiese sido muy difícil.
A mis amigos del laboratorio de bioquímica: Paola, Abril, Graciela, Esteban y Alejandra,
por todas las risas, comidas y buenos momentos que pasamos, ustedes han sido
muy importantes en mi vida y las palabras no alcanzan a expresar lo que siento,
siempre los llevare en mi mente.
x
DEDICATORIA
A mis padres, abuelos, tía y hermanos por estar a mi lado todos estos años, gracias por su
apoyo y comprensión, por ser mi hogar, los amo.
A Tamara Maitret Luna, mi madre, por ser mi cómplice, mi apoyo, mi ejemplo, mi heroína
y por cuidarme, te debo parte de lo que soy y siempre estaré orgullosa de ti, te amo por
sobre todo.
A mi hermana, Karla Leslie Semería Maitret por proveerme de comida y diversión durante
lo que parecían horas interminables de escritura y trabajo, gracias.
A la Dra. Ma. Guadalupe Sánchez Otero, quien hubiese imaginado que conocerla cambiaria
mi vida y ampliaría mi perspectiva, usted me abrió el camino a la investigación, y es a
usted a quien le deberé siempre el convertirme en investigadora, no puedo poner en
palabras el enorme agradecimiento y cariño que le tengo, haberla conocido es lo mejor de
mi camino por la universidad, la llevaré siempre en mi mente.
A Giselle Lilian Badillo Zeferino, una maravillosa mujer que sentó en mí las bases de
investigadora, a ti te debo mi formación y mi enseñanza, gracias por tu paciencia,
comprensión, por las pláticas, por tu mente brillante y consejos, y sobre todo por ser a
quien con orgullo llamo mi amiga, espero que en tu camino de la ciencia nos encontremos
de nuevo.
A Paola Carolina Mora González, gracias por tu ayuda, tiempo, consejos, pláticas, apoyo y
frases tan acertadas, me ayudaste a encontrar un nuevo camino para escribir este trabajo.
Gracias por eso y mucho más, me enorgullece llamarte amiga y espero que estos 2 cortos
años de amistad se conviertan en muchos más.
xi
RESUMEN
Semeria Maitret Tamara Amneris. 2017. Estudio comparativo de la inmovilización de la

lipasa termoalcalófila recombinante LipMatCCR11 de Geobacillus thermoleovorans
CCR11 por dos métodos de inmovilización. Asesores: Dra. María Guadalupe Sánchez
Otero, Dr. Jorge Guillermo Domínguez Chávez, M.C. Giselle Lilian Badillo Zeferino.
Tesis. Facultad de Bioanálisis, Universidad Veracruzana. Veracruz, Veracruz, México.
La LipMatCCR11 es una lipasa termoalcalófila recombinante la cual fue clonada a partir de

la lipasa nativa (LipCCR11) de Geobacillus thermoleovorans CCR11, y ha demostrado ser
un biocatalizador prometedor, con el fin de proveerle ciertas ventajas y aumentar su
capacidad catalítica esta enzima fue inmovilizada; los métodos de inmovilización que se
emplearon fueron: adsorción hidrofóbica en Accurel EP 100 (LipMatCCR11-PP), y
agregados enzimáticos reticulados o CLEAs (LipMatCCR11-CLEAs). Ambos métodos de
inmovilización fueron comparados bioquímica fisicoquímica y morfológicamente, en
donde, LipMatCCR11-CLEAs dio como resultado una actividad específica de 7750 U/g
siendo superior a LipMatCCR11-PP además de haber mostrado una alta estabilidad en la
mayoría de los parámetros bioquímicos y fisicoquímicos medidos. Las micrografías SEM
de LipMatCCR11-CLEAs lograron clasificarlo como CLEAs tipo 2. Mientras que
LipMatCR11-PP tuvo un pH óptimo de 10 y desorbió un 4% de enzima en condiciones no
desnaturalizantes; las micrografías SEM de este inmovilizado mostraron un aspecto
aglomerado en la superficie del Accurel EP 100.
La metodología de CLEAs resultó la mejor estrategia de inmovilización para la

LipMatCCR11, por lo que futuros estudios deberían enfocarse en la optimización de este
proceso. Sin embargo, debido a las ventajas que presenta la inmovilización por adsorción
en lipasas y, LipMatCCR11-PP mostró una actividad específica considerablemente alta, por
lo que futuros estudios podrían con otras clases de soportes investigar la conducta de esta
lipasa asociada a la adsorción hidrofóbica.
Palabras clave: CLEAs, adsorción, inmovilización, Accurel EP 100, lipasas.
xii
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que poseen actividad catalítica, y que
tienen la capacidad de disminuir la energía de activación de una reacción favoreciendo a
esta, sin que la enzima se consuma o sea alterada por la reacción y que tampoco se afecte el
equilibrio químico entre los reactivos y los productos1.
Las lipasas o triacilglicerol hidrolasas (EC 3.1.1.3) son enzimas ubicuas que in vivo
hidrolizan los enlaces éster de los triacilglicéridos liberando ácidos grasos y glicerol. Estas
enzimas además de ser quimio, regio, y enantioselectivas respecto a una gran variedad de
sustratos, son capaces de efectuar todas sus actividades sintéticas en sistemas no acuosos o
bajo condiciones micro-acuosas2, lo que las ha colocado dentro de los grupos más
importantes de biocatalizadores empleados a nivel industrial.
Sin embargo, como cualquier proteína soluble su aplicación en procesos de síntesis a gran
escala se ve limitada debido a factores como su alta disolución en el medio de reacción, y
su baja estabilidad frente a las condiciones drásticas de algunos procesos industriales. Por
esta razón se ha incrementado el interés en la búsqueda de alternativas para superar dichos
inconvenientes, como lo es el empleo de técnicas de inmovilización enzimática3, 4, 5.
La inmovilización confiere a las enzimas solubles la posibilidad de ser recuperadas una vez
terminada la reacción, facilitando la separación del producto y permitiendo su posterior
reutilización4-5. A pesar de que existen diversos métodos de inmovilización, los más
utilizados son aquellos que involucran la unión de la enzima a un soporte sólido. En el caso
particular de las lipasas, una de las estrategias más empleadas consiste en la adsorción de
estas enzimas sobre soportes poliméricos de carácter hidrofóbico, sin embargo, la desorción
de la enzima de dichos soportes es la principal desventaja asociada al uso de este tipo de
estrategias6, 7, 8.
La formación de agregados enzimáticos reticulados (CLEAs) es un método relativamente

simple y rápido que consiste en la formación de enlaces covalentes entre un agente
reticulador y las cadenas proteicas a inmovilizar, debido a ello estos agregados no presentan
la desventaja de la desorción y dependiendo del protocolo seleccionado es posible obtener
2
biocatalizadores con un contenido mínimo de masa no catalítica y una alta estabilidad9,
siendo un método relativamente simple y rápido.
Geobacillus thermoleovorans CCR11 es una bacteria termófila aislada por Rodríguez10 de

las aguas termales de “El Carrizal”, Veracruz el cual posee un sistema hidrolítico
conformado por al menos tres enzimas termófilas, una de ellas es una lipasa termoalcalófila
con una temperatura de actividad optima de 60°C y un pH de 9.0, el gen que codifica para
esta lipasa fue clonado y sobreexpresado por Quintana Castro11, dando como resultado una
lipasa recombinante (LipMatCCR11).
Debido al creciente interés en la búsqueda de alternativas para inmovilizar enzimas de

manera más eficiente, que sean accesibles y fáciles de generar, el objetivo de esta
investigación fue el comparar dos métodos de inmovilización: el primero, por medio
adsorción sobre polipropileno poroso (Accurel EP 100) y el segundo a través de la
formación de agregados enzimáticos reticulados, ambos aplicados sobre la lipasa
termoalcalófila recombinante LipMatCCR11.
3
I. Marco Teórico
1.1 Enzimas y biocatálisis.
Las enzimas son macromoléculas de naturaleza proteica que constituyen una parte
fundamental del metabolismo de toda célula. Estas biomoléculas poseen dos propiedades
básicas: reducen la energía de activación de la reacción sin ser consumidas o alteradas y lo
hacen sin alterar el equilibrio químico entre reactantes y productos, por lo que se les conoce
como “catalizadores biológicos”1.
Desde que el hombre descubrió la fermentación ha aprovechado la capacidad de

transformación de las enzimas, a pesar de no comprender como funcionaba el proceso ni el
agente que lo causaba. En la actualidad se conoce como biocatálisis al uso de enzimas o
microorganismos para llevar a cabo reacciones químicas12, 13
bajo condiciones
experimentales y/o controladas. A pesar de que tanto microorganismos completos como
enzimas puedan promover reacciones, el uso de los primeros puede dar lugar a productos
indeseables durante la reacción debido a su metabolismo, además de que comúnmente
requieren equipos especiales para lograr grandes cantidades de biomasa, en comparación
con las enzimas, que son catalizadores más eficientes debido a propiedades tales como
estabilidad, selectividad y especificidad de sustrato, además de que llevan a cabo reacciones
más simples de seguir, productos más fáciles de purificar y poseen una mayor
productividad debido a su alta disponibilidad3, 13.
Como respuesta a los problemas ambientales que actualmente se presentan y aunado a la

presión pública por la implementación de tecnologías verdes en la industria, la promoción
del desarrollo de procesos más limpios, seguros y amigables con el medio ambiente ha
cobrado importancia en las últimas décadas3, por tal razón, las enzimas han resultado ser
una atractiva opción para su aplicación en procedimientos industriales ya que son capaces
de reducir los tiempos de reacción, el número de pasos de síntesis y la cantidad de
subproductos, lo que resulta en ahorro de energía y procesos industriales sustentables3, 14.
Por todo ello, la biocatálisis se ha postulado como sustituto de la catálisis química o
convencional, al ofrecer ciertas características únicas13 (Tabla 1).
4
Actualmente se han identificado alrededor de 4000 enzimas, de las cuales, cerca de 200 se
han comercializado para su uso industrial y biotecnológico15; de igual forma tan solo en la
industria farmacéutica, química, agrícola y alimenticia se han implementado más de 150
diferentes procesos biocatalíticos13, 16. A pesar de este gran avance y el potencial que tienen
las enzimas, existen ciertas limitaciones que frenan su aplicación en los procesos
industriales y biotecnológicos más robustos, como la síntesis química y la elaboración de
biosensores. Gracias a los continuos avances tecnológicos y científicos, nuevas técnicas de
DNA recombinante y el descubrimiento de enzimas proveniente de extremófilos se han
abierto nuevas oportunidades para la biocatálisis en la biotecnología16, 17, 18.
Tabla 1. Diferencias entre la biocatálisis y la catálisis química (convencional)1, 3, 12-13, 19,

20,21
.
Biocatálisis Catálisis química
Se pueden producir reacciones no

Alta especificidad.
específicas.
Alta actividad en condiciones “moderadas”

o “suaves” (pH 5 – 8 y temperatura 20 – 40 Productos finales tóxicos y contaminantes.
°C).
Puede llevarse a cabo en condiciones de

Biodegradables. altas temperaturas, con disolventes y pH
extremos.
Requiere en la mayoría de los casos

Reusables.
diversos pasos de síntesis para un producto.
Generalmente más eficientes, en lo que En ciertas ocasiones la purificación de los

concierne a concentración de catalizador. productos finales es compleja.
5
Pueden modificarse las enzimas para
Bajo rendimiento, es decir, poca
incrementar su estabilidad, selectividad y
productividad.
actividad.
Las enzimas son quimio-selectivas, regio-
Alta concentración de catalizador.
selectivas y estéreo-selectivas
(enantioselectivas).
Comúnmente son afines a un sustrato
Reacciones más lentas.
específico.
1.1.1 Limitaciones en el uso de los biocatalizadores.
A pesar del gran potencial de las enzimas para su uso en la biocatálisis, aún existen ciertas
limitaciones que impiden su implementación en ciertas aplicaciones biotecnológicas, tales
como aquellas en las cuales el medio de reacción necesita de condiciones fisicoquímicas
severas que puedan provocar desnaturalización de las enzimas provocando la subsecuente
pérdida de actividad catalítica3, 12, 19.
Algunos biocatalizadores no son capaces de sintetizar un solo isómero, por lo que dan
como resultado mezclas racémicas que son poco útiles en industrias tales como la
farmacéutica, algunos también presentan una pobre regio-selectividad, es decir no siempre
son específicos en la ruptura o creación de un determinado enlace; existe la posibilidad de
que la enzima sea susceptible a sufrir inhibición por sustrato y/o producto, debido a la alta
concentración de los mismos en el medio de reacción12-13, 18. De igual manera, los costos de
producción de estos biocatalizadores pueden ser económicamente inviables para la
industria, ya que requieren posterior purificación, o bien provienen de microorganismos
difíciles de cultivar12-13, 18-19.
A pesar de todo lo anterior, ciertas enzimas pueden trabajar bajo condiciones de moderadas
a fuertes y éstas representan una opción viable si se desea expandir el campo de aplicación
de los biocatalizadores. Por ejemplo, las enzimas provenientes de organismos extremófilos
han demostrado ser útiles en este sentido, por lo que, para su óptima aplicación se requiere
6
resolver los inconvenientes y limitaciones que presenten mediante avances en el
entendimiento de su estructura y función catalítica19-18.
1.2 Extremófilos y sus extermoenzimas.
Los extremófilos, (nombre dado por MacElroy22 en 1974), son aquellos microorganismos
capaces de vivir en condiciones ambientales que serían consideradas inhabitables o
extremas desde una perspectiva antropocéntrica23-24. Dentro de los extremófilos existen
otros denominados poliextremófilos, los cuales pueden sobrevivir en ambientes que
presenten más de una condición extrema25. La mayoría de los extremófilos pertenecen al
dominio Archaea, aunque también se han identificado miembros de los dominios Bacteria
y Eucariota23, 25-26.Los extremófilos se pueden dividir en dos categorías: 1) los extremófilos
verdaderos u obligados, que son aquellos los cuales requieren de condiciones extremas para
vivir; y 2) los extremófilos facultativos, que pueden tolerar ambientes extremos e
igualmente tener un crecimiento óptimo en condiciones normales. Una clasificación más
extensa la proporciona Singh23 en la que agrupa a estos organismos en 10 tipos (Tabla 2
modificada).
La capacidad de estos microorganismos de vivir en condiciones no convencionales ha

despertado un gran interés en su estudio por diversos motivos: su posible relación con los
primeros organismos en la tierra y el origen de la vida; la búsqueda de vida en otros
planetas, y finalmente por sus potenciales aplicaciones biotecnológicas27, esta última tal vez
no sea aplicable al microorganismo completo, debido a las difíciles condiciones de cultivo
que presentan algunos de ellos pero si a sus enzimas, mismas que han evolucionado para
sostener la vida bajo condiciones extremas28, por lo que son vistos como potenciales
biocatalizadores robustos.
7
Tabla 2. Clasificación de los extremófilos (modificada) 23, 25.
Categoría Ambiente Clase Condiciones de crecimiento

Hipertermófilo >80°C
1 Temperatura Termófilo 60 – 80 °C
Psicrófilo/Criófilos <15°C
Acidófilo pH <3
2 pH
Alcalófilo pH >9
3 Salinidad Halófilo 0.2M (concentración) de NaCl.
Microscópicos espacios en las

Criptoendolito
rocas.
Barreras geológicas Debajo de las rocas de desiertos
4 Hipólito
con clima frío.
Condiciones extremadamente
Xerófilo
secas – resistente a la desecación.
Resistente a niveles altos d
5 Radiación Radioresistente
radiación ionizante.
6 Presión Piezófilo o Barófilo Presión hidrostática alta.
Altos niveles de metales pesados

Metalotolerantes
Sustancias en solución.
7
toxicas/dañinas Altas concentraciones de agentes
Toxitolerantes
tóxicos (disolventes orgánicos).
8 Barreras osmóticas Osmófilos Altas concentraciones de azúcar.
Fuente de carbono proveniente del

Litoautótrofos CO2 y por oxidación inorgánica
Fuentes de nutrición
9 (exergónica).
extremas
Ambientes nutricionales
Oligótrofos
limitados.
8
Extremófilos que caen en diversas
10 Poliextremófilos Termoacidófilos
categorías.
1.2.2 Importancia de las enzimas y extremoenzimas en la industria y biotecnología.
La aplicación de las enzimas en procesos industriales y biotecnológicos resulta en una

estrategia atractiva debido a las ventajas catalíticas que implica y a que es una alternativa
de bajo impacto ambiental; a pesar de ello pocos avances se han tenido en su aplicación.
Una de las limitantes más importantes es la falta de robustez de las enzimas necesarias para
llevar a cabo estos procesos, el uso de las proteínas extremófilas se ha presentado como una
solución a esta problemática ya que, dependiendo de su origen, pueden presentar
características altamente compatibles con las condiciones y necesidades de estos procesos
29-30
. En la tabla 3 se pueden apreciar los tipos de extremófilos en los cuales se han
encontrado diversas extremoenzimas con posibles aplicaciones a nivel industrial y
biotecnológico.
Actualmente el área de diagnóstico clínico se ve beneficiada por el uso de diversos métodos

enzimáticos disponibles para la determinación de analitos de importancia médica, la
especificidad hacia un determinado sustrato permite medir la concentración de la molécula
de interés en una mezcla compleja evitando así la necesidad de purificar antes de que se
lleve a cabo la determinación, además las condiciones medias de reacción permiten el
análisis de compuestos lábiles que serían degradados con métodos químicos
convencionales31. Sin embargo, para su uso se requieren de ciertas condiciones de
almacenamiento (<15°C), en este sentido las extremoenzimas podría subsanar esta
desventaja y la aplicación de técnicas de inmovilización permitiría el reuso de estas,
además de abrir la posibilidad a que ciertas técnicas analíticas como aquellas empleadas en
la clínica se llevasen a cabo fuera de laboratorios especializados. Avances en áreas como la
electrónica, biología molecular, materiales, entre otras ha permitido la creación y
mejoramiento de biosensores y reactivos secos, los cuales se emplean para análisis clínicos
en unidades médicas y clínicas privadas, así como para automonitoreo por parte del
paciente en ciertas condiciones médicas, como es el caso de los glucómetros que ocupan la
9
glucosa oxidasa para la determinación de glucosa32-33. Las tiras reactivas son un elemento
de reconocimiento (del analito) y detección muy común y simple; se usan una vez,
contienen tanto enzimas como antígenos y anticuerpos secos unidos a un soporte listos para
ser utilizados. Un ejemplo de ello es el presentado por el grupo de trabajo de Hovda34
quienes lograron diseñar una tira reactiva para el diagnóstico de envenenamiento por
metanol e identificación de acidosis metabólica de origen desconocido por medio de la
inmovilización de la formiato deshidrogenasa. Biosensores con enzimas inmovilizadas para
la identificación de deshidrogenasa láctica (LDH) y alcohol deshidrogenasa (ADH)
mostraron un alta sensibilidad y estabilidad operacional (95% de la actividad retenida
después de 300 mediciones)35.
El uso de enzimas no solo se ha delimitado al diagnóstico de enfermedades, sino que

también se ha explorado sus aplicaciones en el tratamiento de ciertas condiciones médicas.
Ya que la inmovilización permite la implementación de las enzimas en aparatos
extracorporales como la hemodiálisis; por ejemplo, la fenilalanina amonio liasa ha sido
inmovilizada para remover la fenilalanina en pacientes con fenilcetonuria, la heparinasa ha
sido utilizada para eliminar la heparina de pacientes anticoagulados. De igual manera la
bilirrubina oxidasa se ha empleado para la remoción de la bilirrubina de la circulación36-39.
La asparaginasa se ha ocupado en la eliminación de la asparagina, un aminoácido esencial
en la síntesis de proteínas en muchos tumores36.
Las extremoenzimas también han encontrado diversas aplicaciones en el campo de la

biotecnología, el ejemplo más famoso es la TaqDNA polimerasa, la cual fue aislada del
microorganismo Thermus aquaticus y que permitió el desarrollo de la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa o PCR. Otra enzima utilizada en biología molecular es la
fosfatasa alcalina, empleada en técnicas de clonación para linearizar el fragmento de DNA
y prevenir el cierre del vector. La uracil-DNA-N-glicosilasa que libera el uracilo del DNA,
se ocupa como control de contaminación en la PCR y RT-PCR16, 40-41.
A pesar de todas las aplicaciones potenciales y beneficios que implica el uso de este tipo de
proteínas en el desarrollo de procesos biotecnológicos el cultivo de los microorganismos
extremófilos representa uno de los mayores problemas para la identificación y
caracterización de nuevas extremoenzimas por lo que la expresión de estas en huéspedes
10
mesófilos representa un método muy empleado para la caracterización, estudio y aplicación
de enzimas provenientes de estos microorganismos24,26, 42-43.
Tabla 3. Posibles aplicaciones de las enzimas provenientes de extremófilos en la industria

y la biotecnología25-26, 28, 30, 41, 44.
Tipo Condiciones Enzimas Aplicación

Temperatura
>80°C Detergentes, hidrólisis en
Termófilo (Hipertemófilo) Proteasas alimentos, fermentación de la
60-80°C cerveza y repostería.
(Termófilo)
Glucosil hidrolasas
Hidrólisis y modificación de
(amilasas,
almidón, celulosa, quitina,
pullanasas,
pectina e industria textil.
glucoamilasas).
Modificación de quitina en
Quitinasas
comida y productos de salud.
Xilanasas Blanqueamiento del papel.
Detergentes, reacciones
Lipasas
estéreo-específicas y
Esterasas
Talabartería.
DNA polimerasa Biología molecular (PCR).
Deshidrogenasas Reacciones de oxidación.
Psicrófilos <15°C Protesas Detergentes y alimentos.
Amilasas Detergentes y panadería.
Detergentes, industria
Celulasas
alimenticia y textil.
Detergentes, comida,
Lipasas
diagnóstico y cosméticos.
11
Alta
concentración de
Halófilos Deshidrogenasas Biosensores.
sales (2-5M
NaCl)
Detergentes, alimentos y
Lipasas
cosméticos.
Proteasas Síntesis de péptidos.
Biocatálisis en medio
Deshidrogenasas
orgánico.
Detergentes, industria
Proteasas y
Alcalófilos pH >9 alimenticia, modificaciones
Celulasas
de la celulosa y hemicelulosa.
Amilasas y
Desulfuración del carbón.
glucoamilasas
Proteasas y
Acidófilos pH <2-3 Componentes alimenticios.
celulasas.
Hidrólisis y modificación de
Oxidasas
almidón.
Altas presiones:
Piezófilos arriba de 130 Hidrogenasa Producción de biodiesel.
MPa
DNA polimerasa Fármacos.
α-
Procesos alimenticios.
maltotetrahidrolasa
Remoción de metales
Altos niveles de Proteasas
Metalófilos contaminantes
metales pesados. Oxidasas
(Biorremediación).
Concentraciones Peroxidasas Degradación de sustancias
Toxitolerantes elevadas de Oxidasas tóxicas contaminantes
disolventes y/o Proteasas (pesticidas, colorantes, etc.).
12
sustancias
toxicas.
1.3 Lipasas.
Las lipasas o triacilglicerol hidrolasas (EC 3.1.1.3) pertenecen a la clase de las hidrolasas y
se ubica como miembro de la familia de las serin-hidrolasas. Para que una enzima lipolítica
se considere como una lipasa verdadera tiene que cumplir con dos características:
1) Ser activada en presencia de una interface acuosa - orgánica, a este fenómeno se le

conoce como activación interfacial.
2) Poseer una tapa que cubre el sitio activo de la enzima45-46.
Sin embargo, Polaina41 define a las lipasas como carboxil esterasas que catalizan la
hidrólisis y síntesis de cadenas larga de acilgliceroles, está es la descripción más adecuada
para todas ellas ya que hace referencia al comportamiento de la enzima en sustratos
insolubles (cadenas largas de ácidos grasos), al igual que a su capacidad de actuar sobre
sustratos solubles de cadenas cortas de ácidos grasos.
1.3.1 Estructura de las lipasas.
La estructura de las lipasas se le conoce por tener un plegamiento α/ β hidrolasa, que

consiste en 8 láminas - β paralelas, con la segunda hebra anti -paralela y las láminas de la
β3 a la β8 conectadas por medio de α-hélices (Fig. 1). El sitio activo de las lipasas
generalmente está conformado por tres residuos catalíticos: un residuo nucleofílico (serina,
cisteína o aspartato), un residuo ácido “catalítico” (aspartato o glutamato) y una histidina,
en conjunto llamados “triada catalítica”, comúnmente formada por: serina,
aspartato/glutamato e histidina en las serin-hidrolasas. El residuo nucleofílico se localiza en
un giro de 90° conocido como codo nucleofílico el cual es identificado por la secuencia
consenso Sm-X-Nu-X-Sm, donde: Sm, es un residuo de aminoácido (aa) pequeño; X, es
cualquier residuo aa y Nu, es el nucleófilo. La geometría del codo nucleofílico contribuye a
la formación de un enlace oxianión, el cual es un rearreglo espacial formador de enlaces de
13
hidrógeno conocido como agujero oxianión que durante la catálisis ayuda a estabilizar las
cargas negativas que se generan. Este se encuentra formado por la amida protonada del
residuo siguiente al nucleófilo, el cual es una parte conservada del agujero oxianión,
mientras que el resto puede constituirse de átomos de hidrógeno pertenecientes a una amida
y por cadenas laterales de aminoácidos entre la lámina β3 y el αA –hélice47-48. El centro
catalítico de la enzima se encuentra cubierto por un segmento helicoidal de naturaleza
anfipática conocido como tapa o solapa25, 45.
Figura 1. Plegamiento canónico α/β de las hidrolasas. Las α-hélice están representadas por
los cilindros y las lámina-β por las flechas. Los puntos negros sólidos son los aminoácidos
del sitio catalítico, el residuo nucleofílico se ubica después de la lámina-β 5, mientras que el
residuo de Asp/Glu se encuentra después de la lámina-β 7; la histidina se puede localizar en
el bucle entre la lámina- β 8 y el αF –hélice45.
1.3.2 Mecanismo catalítico de las lipasas.
Debido a que la gran mayoría de las lipasas poseen una estructura que cubre el sitio activo
conocida como tapa, estas presentan dos conformaciones; “abierta”, donde la tapa es
desplazada del sitio activo dejándolo expuesto, mientras que la segunda conformación, en
la cual es común encontrarlas, el segmento helicoidal se localiza cubriendo el centro
catalítico denominándose “cerrada”, siendo estas dos formas fundamentales en la actividad
catalítica de la lipasa. Es un hecho que la actividad de las lipasas se incrementa en
14
presencia de sustratos insolubles, un ejemplo de ello es una interface agua-lípido la cual
promueve cambios conformacionales que resultan en la forma abierta de la lipasa
provocando que el sitio activo sea más accesible, a este fenómeno se le conoce como
activación interfacial, y esta no solo se induce en interfaces líquido-líquido sino también en
presencia de sólidos y proteínas hidrofóbicas47, 49-50.
El mecanismo por el cual las lipasas hidrolizan los enlaces éster en medio acuoso se ilustra
en la Fig. 2.
En el primer paso conocido como acilación se lleva a cabo inmediato a la formación del
complejo enzima-sustrato, la serina es activada al ser desprotonada por el aspartato y la
histidina, el grupo hidroxilo resultante del residuo de serina inicia un ataque nucleofílico al
átomo de carbono del grupo carbonilo del enlace éster del sustrato (RCONu1) formándose
así un intermediario acil-enzima o tetraédrico (T1) la carga negativa del átomo de oxígeno
del grupo carbonilo del sustrato será estabilizada por medio de la formación de puentes de
hidrógeno por los residuos del agujero oxianión. En el siguiente paso la porción del alcohol
del sustrato (Nu1OH) es liberada, mientras que el componente ácido permanece unido
covalentemente al residuo serina en forma de un intermediario acil-enzima (T2). El último
paso o deacilación es controlado por la electronegatividad de las moléculas que se
encuentran en la interface, durante este proceso un nucleófilo ataca a la enzima acetilada
hidrolizándola provocando que la porción acida del sustrato se libere y la enzima se
reconstituya51-54.
15
Figura 2. Mecanismo catalítico de las lipasas: hidrólisis de enlace éster54.
1.3.3 Reacciones catalizadas por lipasas.
La reacción general catalizada por lipasas in vivo es la hidrólisis de enlaces éster en los
triacilgliceroles (TAG), para producir ácidos grasos libres (AGL), glicerol e intermediarios
como: di- y monoacilgliceroles. La esterificación es la reacción contraria a la hidrólisis y
las lipasas pueden llevarla a cabo en medios con bajo contenido de agua; un medio poco
acuoso promueve la esterificación y viceversa, la baja actividad de agua (a w) puede dar
lugar a diferentes reacciones de transesterificación dependiendo del nucléofilo que se
encuentre en los sustratos del medio21, 46(Fig. 3).
16
Figura 3. Reacciones catalizadas por lipasas55.
Las lipasas poseen selectividad por sus sustratos, ésta, puede ser:
A) Quimio-especificidad, que tiene que ver con que AGL libera tomando en cuenta su
tamaño o el grado de insaturaciones que posea, al igual que su preferencia a hidrolizar tri-,
di- o monoacilgliceroles (TAG, DAG o MAG). También hace referencia por el grupo
funcional que se reconoce en síntesis.
B) Regio-especificidad, se clasifican como inespecíficas, si hidrolizan completa o

parcialmente los triacilgliceroles; y especificas si hidrolizan en la posición 1 o 3 de los
TAG.
C) Enantioselectividad, hace referencia a la capacidad de la lipasa para reconocer un

enantiómero de otro en mezclas racémicas21.
17
1.3.4 Fuentes de lipasas.
Las lipasas fungen como actores fisiológicos en el transporte, almacenamiento y uso de los
lípidos en animales, por lo que las lipasas de origen animal fueron las primeras en
conocerse; sin embargo, se encuentran distribuidas de manera ubicua en la naturaleza; se
conocen lipasas de plantas, bacterias, levaduras y hongos46.
Las lipasas de origen animal se dividen en pancreáticas o digestivas, de tejidos y de la

leche45. A pesar de su utilidad no son muy viables debido a su dificultad en la obtención y
su poca bioseguridad41.
Al igual, las plantas también producen lipasas y han sido caracterizadas para posibles
aplicaciones en la industria y biotecnología, ya que una de sus características más
prominentes es ser muy activas en ambientes con baja actividad de agua. La lipasa más
representativa es la que proviene de la Carica papaya, se ha reportado su uso en la
modificación de grasas y aceites, reacciones de esterificación e interesterificación en
presencia de disolventes orgánicos y resolución asimétrica de compuesto quirales21.
1.3.5 Lipasas de origen microbiano.
Las lipasas de origen microbiano presentan ventajas como lo son su facilidad de producción
en grandes volúmenes y su alta estabilidad respecto a sus contrapartes animales y vegetales,
sobre todo aquellas provenientes de organismos extremófilos2, 15, 56.
Microorganismos como bacterias, levaduras y hongos son productores de lipasas

extracelulares, y son comúnmente más termoestables en comparación de sus contrapartes
vegetales y animales, aunque esto dependerá de las fuentes de las que se aísle la enzima2, 46,
56
. Los hongos más representativos para la producción comercial de lipasas son: Rhizopus
sp., Aspergillus sp., Penicillum sp., Geotrichum sp., Mucor sp., y Rhizomucor sp. Se han
reportado lipasas extracelulares e intracelulares producidas por Rhizopus delemar, y se ha
demostrado que las lipasas producidas por este género presentan una marcada regio-
selectividad56-57. Otro grupo de microorganismos productores de lipasas son las levaduras,
el género Candida y su amplia gama de especies es de las más estudiadas, ejemplo de ello
son las enzimas producidas por Candida antarctica (extremófilo) y la de Candida rugosa
ya que se ha reportado acerca de su robustez y su uso en diversas reacciones; otros géneros
18
de levaduras como Rhodotorula, Yarrowia, Pichia, Torulaspora y Saccharomycopsis
también son productores de lipasas56.
Las bacterias productoras de lipasas mejor caracterizadas y documentadas han sido las
pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus, este último género produce lipasas
que han sido ampliamente estudiadas56, 58. La mayoría de las lipasas que se han aislado de
bacterias provienen de mesófilos, lamentablemente sus enzimas son poco o nada
específicas y solo algunas poseen termoestabilidad57. A partir de microorganismos
termófilos y psicrófilos se han obtenido lipasas que son resistentes a ciertas condiciones
severas en las cuales las lipasas mesófilas serían desnaturalizadas o inactivadas, por lo que
representan un gran potencial para su aplicación industrial y biotecnológica58, 2.
1.3.6 Aplicaciones de las lipasas en la industria y biotecnología.
Cerca del 75 % de las enzimas utilizadas en la industria y la biotecnología son de naturaleza

hidrolítica, esto es debido al amplio espectro de reacciones que estas enzimas pueden
catalizar, siendo las lipasas del mismo tipo estas han encontrado cabida en procesos
industriales2,58.
Las áreas de la industria en las cuales las lipasas sirven como biocatalizadores se presentan
en la tabla 4.
Tabla 4. Aplicaciones industriales de las lipasas2, 15, 19, 24, 30, 41, 58-60.
Industria Fuentes/Microorganismo Aplicaciones

Producción de aditivos,
Termófilos:
modificaciones y mejoramiento de
Thermomyces lanuginosus
sabor/aroma (vino y whisky),
Alimenticia Thermosyntropha lipolytica
productos de panadería, bebidas,
Psicrófilos:
síntesis de colorantes comestibles,
Pseudomonas P38
hidrólisis de las grasas en leche.
Psicrófilos: Síntesis de ésteres, resolución de
Química fina
Candida antarctica estereoisómeros.
19
Termófilos:
Parte de la fórmula del detergente
Thermomyces lanuginosus
Detergentes para degradar aceites-grasas
Alcalófilo:
(hidrólisis).
Pseudomonas alcaligenes
Termófilos:
Remoción y degradación de aceites
Aguas residuales Bacillus stearothermophilus
y grasas, y suelos contaminados de
y biorremediación Psicrófilos:
petróleo.
Mrakia blollopsis
Blanqueamiento del papel,
Mesófilos:
Papelera degradación de la resina en la pulpa
Aspergillus oryzae*
del papel.
Remoción de lubricantes, abrasión
Psicrófilos:
Textil de la mezclilla, degradación de
Pseudomonas sp.
poliamidas.
Desechos Termófilos:
Degradación de lípidos.
industriales Pyrococcus horikoshii
Psicrófilos:
Remoción de grasas en carnes y
Candida antarctica
pescados, enriquecimiento de
Nutracéuticos Mucor miehei
aceites, modificación de la leche de
Termófilos:
soya.
Rhizomucor miehei
Psicrófilos: Síntesis de ésteres emolientes para
Cosméticos Candida antarctica B productos de la piel o aceites
Pseudomonas cepacia corporales y para baño.
Resolución de mezclas racémicas de

Psicrófilos:
Farmacéutica diversos fármacos, síntesis de
Geotrichum candidum
emulsificantes.
Psicrófilos:
Modificaciones de aceites
Oleoquímica Candida antarctica
(transesterificación).
Mucor miehei
20
Psicrófilos:
Residuos Degradación de residuos de la
Micrococcus roseus
agrícolas trituración de semillas oleaginosas.
Pseudomona sp.
Termófilos:
Geobacillus
Producción de thermocatenulatus
Producción de biodiesel.
biodiesel Psicrófilos:
Pseudomonas fluorescens
B68
Síntesis de Termófilos: Biodegradación de co-polímeros,

polímeros Bacillus pumilus funcionalización y síntesis de bio-
biodegradables Humícola insolens polímeros.
Psicrófilos:
Del cuero* Candida antarctica A Remoción de la grasa cutánea
Talabartería Termófilos: (desgrasado).
Humícola insolens
*La lipasa de este microorganismo se considera termoestable, por lo que a pesar de que su
origen mesófilo se incluye en la clasificación.
La aplicación de lipasas sobre todo de aquellas provenientes de microorganismos

extremófilos aún no se encuentra por completo extendida en la industria o en aplicaciones
biotecnológicas, a pesar de las grandes ventajas catalíticas y fisicoquímicas que le confiere
su origen. Sin embargo, se prospecta una mayor demanda con forme la industria vaya
sustituyendo los procesos convencionales por aquellos más sustentables. De igual forma en
el ámbito clínico el requerimiento de técnicas de detección más rápidas y accesibles hará
necesario que se empleen esta clase de enzimas2.
1.4 Inmovilización de enzimas.
1.4.1 Generalidades sobre la inmovilización.
21
Brena y col.61 definen a la enzima inmovilizada como, él confinamiento físico de la
enzima o su localización en una determinada región del espacio, en el cual retienen su
actividad catalítica y puede ser usada continuamente o repetidamente´. En la búsqueda de
hacer más eficientes a los biocatalizadores, la inmovilización es una estrategia que permite
que la enzima sea más manejable, facilita la separación del medio de reacción por lo que le
proporciona el poder de ser reutilizada; otro beneficio es el mejoramiento en el desempeño
de la enzima que se refleja en su alta productividad4-5, 62.
El éxito o el fracaso del método de la inmovilización dependerá de factores tales como: las
interacciones de la enzima con el soporte, las condiciones de inmovilización, el tipo de
enlaces que se formen, entre otras variables que determinarán las características
fisicoquímicas y la actividad de la enzima inmovilizada, por lo que al seleccionar
estrategias de inmovilización se deben considerar las propiedades que desean ser
conservadas y el hecho de que no existe un método ideal para todas las enzimas y/o
aplicaciones62-64.
Actualmente se requiere del desarrollo de protocolos de inmovilización de bajo costo,

simple, eficiente y que realcen las propiedades catalíticas de la enzima, sin menoscabar su
estabilidad estructural (Tabla 5). Se requiere de un trabajo multidisciplinario para la
creación de estas nuevas técnicas de inmovilización y del mejoramiento de las ya
existentes5, 8, 63.
Tabla 5. Ventajas y desventajas de la inmovilización5, 61, 63.
Ventajas Desventajas
Pérdida o reducción de la actividad
Catalizador reusable.
enzimática.
Operación sencilla en reactores. Limitación en la transferencia de masa.
Separación del producto de manera sencilla. Costo adicional.
Soporte y/o protocolo de inmovilización
Amplia gama de opción de reactores.
dependiente de cada aplicación.
Estabilización de enzimas multiméricas. Desorción
22
Mejoramiento y modulación en la
Impedimento estérico
selectividad.
Reducción de inhibidores.
Existen diversas formas de clasificar los métodos de inmovilización (Tabla 6), de acuerdo a
la naturaleza de los enlaces (físicos o químicos), el método empleado para la
inmovilización (asociados a soporte, entrampamiento y entrecruzamiento)4, 65
, y por su
capacidad para liberar la enzima del soporte (reversible e irreversible), esta última fue
propuesta por Brena y col.61, y se describirá a continuación.
Tabla 6. Comparación de los principales métodos de inmovilización de enzimas61, 66.
Método y naturaleza de la
Ventajas Desventajas
unión
 Simple.
Adsorción física.
 Barato.  Desorción.
Enlaces débiles como: Van
 Pequeños cambios  Adsorción no
der Waals, hidrofóbicos o
conformacionales en específica.
interacciones iónicas.
la enzima.
 Inmovilización simple
Afinidad.
y orientada.
Unión por afinidad entre  Muy costoso.
 Remarcada
dos compuestos afines.
selectividad.
 El soporte (matriz)
 Probable
Enlace o unión covalente. y la enzima no
estabilización de la
Unión química entre pueden ser
enzima.
grupos funcionales del regenerados.
 No hay pérdidas de
soporte y la enzima.  Perdida de
enzima.
actividad.
23
 Modificación
química de la
enzima.
 Limitaciones en la
Atrapamiento.  Amplio uso transferencia de
Oclusión de la enzima  No modifica las masa.
dentro de una red propiedades químicas  Perdida de enzima.
polimérica. de la enzima.  Poca o ninguna
estabilidad.
 Poco útil en
Entrecruzamiento o reactores de lecho
reticulación.  Estabilización del empacado.
Las enzimas son biocatalizador.  Limitaciones en la
entrecruzadas por un  No requiere de transferencia de
reactivo bifuncional o soporte. masa.
funcionalizado.  Pérdida de
actividad.
1.4.2 Métodos de inmovilización reversible.
Se le conoce como inmovilización reversible a aquellos métodos en los que la enzima

puede separarse del soporte bajo condiciones suaves que no dañan a este. Usualmente son
métodos económicamente atractivos, pues al decaer la actividad enzimática se puede volver
a recargar el soporte con enzima nueva y representan una ventaja para aquellas enzimas que
son lábiles. En esta clase de métodos lo más importante es la elección del soporte con base
a su costo y propiedades. Las estrategias que se agrupan en esta clase de inmovilización
son: adsorción (interacciones no covalentes), unión iónica, unión por afinidad, quelación o
unión a metales y formación de enlaces disulfuro61.
1.4.2.1 Inmovilización por adsorción a soporte.
24
El método por adsorción a soportes ha sido el más empleado para inmovilización de
enzimas debido a la facilidad en su preparación, es aplicable a una amplia variedad de
proteínas, la activación si es que se requiere es mínima por lo que no se requiere de
reactivos complejos, y en comparación a otros métodos es económica, además mejora
ciertas propiedades de la enzima como su estabilidad o selectividad8, 63, 67.
La adecuada elección del material de soporte es crucial para que el proceso de adsorción
sea exitoso; el soporte ideal debe poseer una alta proporción superficie-volumen, una
elevada capacidad de carga proteica, compatibilidad e insolubilidad con el medio de
reacción en el cual serán empleadas las enzimas, estabilidad química y mecánica, así como
una buena capacidad de recuperación y bajo costo61, 68. En la práctica el soporte “ideal” no
existe ya que depende de la naturaleza de la enzima y condiciones de reacción, es por ello
que una gran variedad de soportes con diversas características físicas y químicas (diámetro
de poro, naturaleza hidrofóbica y/o hidrofilica, y modificaciones químicas) existen62. Los
soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos8, 61, 69:
 Soportes inorgánicos: Estos son económicos e inertes, con gran resistencia

mecánica y presentan una baja propensión a la contaminación microbiana. Este tipo
de materiales pueden ser naturales (zeolitas, sílice y celita) o manufacturados
(óxidos de metales, cerámicas, gel de sílice).
 Soportes orgánicos, estos a su vez pueden clasificarse en:
o Polímeros naturales: como polisacáridos (alginato, quitosano, carragenano,
sefarosa), proteínas estructurales (colágeno, queratina y albumina) y carbón.
o Polímeros sintéticos: resinas de intercambio iónico, poliolefinas
(poliestireno y polipropileno), polímeros acrílicos (poliacrilatos,
poliacrilamidas, polimetacrilatos) y otros tipos (alcohol polivinílico,
poliamidas).
Los enlaces por los cuales se pueden llevar a cabo la unión enzima/soporte son: fuerzas
electrostáticas, puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas70, 68
. La adsorción
hidrofóbica no conlleva la formación de enlaces químicos sino una serie de interacciones
entrópicas son las que toman lugar entre las partes del soporte con esta naturaleza y las
regiones hidrofóbicas de la enzima, es decir, cuando una molécula de enzima desplaza un
25
gran número de moléculas de agua del soporte y su propia superficie durante la
inmovilización, resulta en una ganancia entrópica para producir las interacciones
hidrofóbicas entre ambas partes61-62, 71.
La capacidad de adsorción del soporte depende de factores tales como su estructura, la

presencia de activadores o inhibidores, el medio de inmovilización, las propiedades
químicas del soporte y la naturaleza de la enzima. De igual manera la retención de la
actividad enzimática se encontrará en función de diversos aspectos, tales como la carga
proteica, la hidrofobicidad del soporte, el tamaño del sustrato, limitaciones en la difusión
del medio y la densidad de los sitios de unión en el soporte72. Una modulación más fina de
las interacciones hidrofóbicas entre el soporte y la enzima se logra a través del ajuste del
pH, la temperatura, la concentración de sales o mediante el uso de moléculas hidrofóbicas
como activadores durante la inmovilización de la enzima62.
1.4.3 Métodos de inmovilización irreversible.
Este tipo de método se refiere a que una vez que la enzima (biocatalizador) se encuentre
unido al soporte no podrá separarse de este último sin dañarlo ni perder la enzima su
conformación y con ello su actividad catalítica. Usualmente esta clase de inmovilización se
emplea cuando se requiere que el producto no se encuentre contaminado con la enzima o
que la reacción sea detenida de forma rápida. Los métodos que se engloban en esta
categoría son: unión covalente, atrapamiento, microencapsulación y
61
entrecruzamiento/reticulación .
1.4.3.1 Entrecruzamiento – Cross-linking.
El entrecruzamiento o reticulación es un método de inmovilización irreversible que no

requiere de soporte, fue desarrollado en 1960 como parte de las investigaciones para la
inmovilización de enzimas en soporte4, 72.
El entrecruzamiento se lleva a cabo al adicionar a la enzima en solución acuosa un

reticulador o entrecruzador, que es un agente bifuncional o polifuncional; el más común y
económico es el glutaraldehído, el cual reacciona con los grupos -NH2 presentes en la
superficie de la enzima dando como resultado la reticulación enzimática o CLEs (cross-
26
linked enzymes), este tipo de inmovilización mejoraba la termoestabilidad del
biocatalizador, pero presentaba serios problemas como una retención de actividad baja,
poca reproducibilidad, baja estabilidad mecánica, además de que presentaba ciertos
problemas en su manejo debido a la consistencia gelatinosa que adquiere4, 72-74.
Existen otros tres tipos de entrecruzamiento: 1) cristalización y reticulado de enzimas o

CLECs - Cross-linked enzyme crystal, 2) agregados enzimáticos reticulados conocidos
como CLEAs - Cross-linked enzyme aggregates, y 3) reticulación de enzima secada por
aspersión o por sus siglas en inglés CSDEs - Cross-linked spray-dried enzymes72, 75(Fig. 4).
Figura 4. Tipos de reticulación y sus diferentes estrategias de producción. a) Cristalización,

CRY- cristales; b) agregación, AGG- agregados; c) secado por aspersión, SDE- enzima
secada por aspersión; d) reticulación directa72.
1.4.3.2. Cristalización y reticulado de enzimas – Cross-linked enzyme crystals (CLECs).
Los CLECs se forman a partir de la cristalización de la enzima y la posterior adición del

reactivo bifuncional, que retícula los cristales. A diferencia de su antecesor el CLE, con los
CLECs se logra una mayor retención de la actividad enzimática, mayor estabilidad ante
condiciones desnaturalizantes, además de una gran estabilidad mecánica, fácil reuso y un
27
controlado tamaño de partícula, por lo que se considera un inmovilizado robusto4, 72, 75. A
pesar de estas ventajas, este tipo de reticulación requiere el uso de enzimas con una alta
pureza y que hayan sido previamente cristalizadas. Por lo que cada enzima requiere de un
protocolo único de cristalización, al igual que de un proceso de purificación, todo ello
representa una fuerte inversión de tiempo y dinero, lo que lo hace un método poco atractivo
de emplear76-77.
1.4.3.3 Agregados enzimáticos reticulados - Cross-linked enzymes aggregates (CLEAs).
Los CLEAs fueron desarrollados recientemente por Cao y col.78 con el fin de inmovilizar la
penicilina-G-acilasa, sin embargo este método ha demostrado ser muy efectivo y aplicable
a un amplio rango de enzimas ya que a diferencia de los CLECs no requiere de la previa
purificación del biocatalizador78.
La metodología para producir CLEAs es bastante sencilla, ya que requiere de solo dos
pasos: en el primero se lleva a cabo la precipitación de la enzima soluble mediante el uso de
sales inorgánicas, disolventes orgánicos miscibles en agua (como alcoholes) y polímeros no
iónicos, esto con el fin de agregar las moléculas de enzima sin perturbar su estructura
terciaria. El segundo paso implica la adición del agente reticulador, el cual es un reactivo
bifuncional, que se emplea en un proceso conocido como reticulación que es el resultado de
la reacción entre los grupos reactivos de la superficie de la enzima (grupos aminos libres de
los residuos de lisina, grupos carboxilo, tiol, aminas primarias y con aminoácidos
específicos) 79 teniendo como resultado agregados insolubles con una súper estructura pre-
organizada73, 75-78, 80-81. El hecho de precipitar (purificación enzimática) y al mismo tiempo
inmovilizar, hace que la preparación de los CLEAs sea un proceso poco laborioso (Fig. 5).
28
Figura 5. Proceso de la formación de los agregados enzimáticos reticulados o CLEAs. La
enzima soluble se le añade un precipitante (sales inorgánicas o polímeros no iónicos) o un
disolvente orgánico, se forman agregados y a estos se la añade glutaraldehído u otro agente
reticulador dando como resultado la formación de los CLEAs77.
En cuanto al agente reticulador, al igual que en otros protocolos de entrecruzamiento, el

glutaraldehído es la primera opción, ya que funciona adecuadamente con la mayoría de las
enzimas que han sido inmovilizadas por medio de la metodología de CLEAs. Sin embargo,
se han reportado que ciertas enzimas como las nitrilasas, al ser reticuladas con
glutaraldehído presentan nula o baja actividad. Esto puede ser debido a que el
glutaraldehído reacciona con los residuos de los aminoácidos que son cruciales para que la
enzima sea activa, la solución a este problema es sustituir al glutaraldehído por otro agente
reticulador como los polialdehídos80.
Otro aspecto a tomar en cuenta al momento de realizar la inmovilización por medio de la

metodología de CLEAs es la cantidad de los residuos de lisina en la superficie de la
enzima, por lo que para aquellas enzimas electronegativas en las que sus residuos de lisina
se encuentran muy dispersos en su superficie, la reticulación no es muy efectiva; para
29
compensar la falta de grupos amino de la enzima se puede co-precipitar con polímeros
que posean grupos amino libres (poli-L-lisina, polietilenimina, entre otros)73, 81.
Los CLEAs exhiben ciertas ventajas sobre otros métodos de inmovilización

especialmente si se busca la aplicación industrial de la enzima, se ha reportado un
alta actividad volumétrica (μmoles de sustrato liberado por minuto entre los mililitros de
enzima, μmoles/min/ml o U/ml), pues no existe dilución de esta misma, presenta gran
estabilidad, bajos costos de producción, su recuperación es sencilla, además de que es
reusable, pueden llevar a cabo reacciones en disolventes orgánicos sin pérdida de
actividad y no requiere de la enzima pura, por lo que se puede utilizar el extracto
enzimático e incluso extracto crudo celular de caldos de fermentación para realizar la
inmovilización73,-74, 82.
Como biocatalizadores, los CLEAs han reportado una alta productividad, así como una
mejorada estabilidad durante su almacenamiento y resistencia a desnaturalización por calor
y/o autólisis. Entre otras ventajas los CLEAs permiten estabilizar enzimas multiméricas73,
76, 80-81
. El aprovechamiento de esta característica ha permitido co-inmovilizar dos o más
enzimas con el fin de ser utilizadas en procesos de cascada catalítica, a esta nueva
técnica se le conoce como “combi-CLEAs”, Sheldon y col.81 reportaron la inmovilización
de catalasa con glucosa oxidasa o galactosa oxidasa para la oxidación de la glucosa
o galactosa respectivamente.
Los CLEAs presentan excelentes características que las hacen atractivas para su aplicación
en procesos a gran escala en la industria y con ello, la biocatálisis puede extender su
aplicación a más áreas. Una amplia variedad de enzimas como: hidrolasas83,
proteasas84, tirosinasa85, entre otras se han inmovilizado con este método, algunos han
sido un éxito mientras otros no tanto, esto debido a que todas las enzimas poseen
características diferentes, por lo que una comprensión más amplia de los fenómenos
implicados entre los elementos de la inmovilización resultaría en el mejoramiento de
este método. Pese a las desventajas, por el momento los CLEAs parecen ser una opción
muy viable ante la demanda de biocatalizadores inmovilizados en busca de una
industria más sustentable con el ambiente y de bajo costo.
30
1.5 Inmovilización de lipasas.
Las lipasas provenientes de diversas fuentes han sido inmovilizadas en una gran variedad
de métodos con el fin de incrementar sus propiedades catalíticas y observar el efecto de los
diferentes parámetros de inmovilización sobre estas64.
La inmovilización por adsorción hidrofóbica es uno de los métodos más usados para
inmovilizar lipasas, ya que los soportes hidrofóbicos promueven la ocurrencia del
fenómeno de activación interfacial lo que cuando se traduce en un incremento en la
actividad del inmovilizado, se conoce como hiperactivación64. Las lipasas de Candida
antarctica (fracción B), Candida rugosa y Mucor miehie se han absorbido en octadecil-
sefarosa con lo que se obtuvo un incremento de la actividad enzimática, además de una
mayor estabilidad térmica y resistencia a disolventes orgánicos en comparación con otras
estrategias de inmovilización en soporte (unión covalente)86. La inmovilización en soportes
de diferentes grados de hidrofobicidad ha sido explorada por Vieira Branco y col.87 con la
lipasa termoestable recombinante de Pyrococcus furiosus, en todos los casos se observó
una hiperactivación de la enzima, así como una mayor estabilidad térmica y en
almacenamiento. Otras propiedades de los soportes tales como el tamaño de poro, la
geometría de los canales y el tamaño de partícula se han estudiado con el fin de entender su
efecto sobre las lipasas inmovilizadas88-91.
Otro método de inmovilización que se ha empleado sobre las lipasas ha sido la metodología
de agregados enzimáticos reticulados o CLEAs. El uso de diferentes métodos de
precipitación y reticulación, así como el empleo de co-adyuvantes (feeder ) para obtener un
entrecruzamiento efectivo ha sido reportado para las CLEAs de la lipasa B de Candida
antarctica en la cual se ocupó albumina sérica bovina para proveer de residuos de lisina a la
enzima y mejorar las uniones covalentes entre enzima-reticulador-enzima92, también se ha
reportado la adición de detergentes en la síntesis de estos inmovilizados con el fin de
incrementar la actividad de la lipasa, exhibiendo una buena estabilidad y reusabilidad93. La
síntesis de CLEAs a partir de extracto crudo enzimático ha sido reportado por Jamwal y
col.94, ellos inmovilizaron la lipasa de Geobacillus sp. para usarla en la síntesis de aspirina,
de la cual se logró una mayor conversión que con la enzima soluble.
31
Ya que las lipasas son enzimas de interés industrial debido a las reacciones que pueden
llevar a cabo, se han estudiado diferentes estrategias de inmovilización sobre una misma
enzima, este fue el caso de la lipasa G de Penicillium camembertii la cual es de uso
comercial, las estrategias que se utilizaron para inmovilizar esta enzima consistieron en
adsorción hidrofóbica a soportes como octil-agarosa, poli(hidroxibutirato) y Amberlita
XDA-4; por adsorción iónica en la resina aniónica MANAE-agarosa y por medio de
enlaces covalentes en glioxil-agarosa, MANAE-agarosa-glutaraldehído y epoxi-SiO2-PVA
(epoxi-silica-polivinil alcohol) en medio orgánico. La lipasa G mostró diferentes valores de
actividad específica y porcentajes de actividad retenida dependiendo del método de
inmovilización y el tipo de soporte. El epoxi-SiO2-PVA se presentó como la mejor
estrategia de inmovilización para esta lipasa95.
1.6 Lipasas termoalcalófilas de Geobacillus thermoleovorans CCR11.
1.6.1 Lipasa nativa y recombinantes de Geobacillus thermoleovorans CCR11.
Geobacillus thermoleovorans CCR11 es un microorganismo termófilo proveniente de las

aguas termales de “El Carrizal”, Veracruz, México. Fue aislado y caracterizado por
Rodríguez10, este microorganismo es aerobio, no motil, formador de esporas, capaz de
crecer a temperaturas entre 40 – 70 °C, con una temperatura y pH óptimos de 55 °C y 6.5
respectivamente. Posteriormente Castro Ochoa y col.96 caracterizaron la lipasa
termoalcalófila que produce este microorganismo.
La lipasa nativa de G. thermoleovorans CCR1, lipCCR11 sirvió como base (secuencia),

para la construcción de 4 sistemas de expresión siendo insertados en E. coli con el fin de
producir lipasas recombinantes, sí se obtuvo la LipMatCCR11 (lipasa madura sin péptido
señal) de 43kDa, esta lipasa mostró una actividad lipolítica específica 40 veces más elevada
(2.15 x 105 U/mg) que a la enzima nativa (5,500 U/mg) 11, 96
. Badillo Zeferino y
Col.97optimizaron la producción de esta lipasa termoalcalófila, reportando 7.29 x 106 U/mg
de actividad enzimática específica, lo que representó un incremento de 36.4 veces en
comparación con la producida en condiciones no optimizadas. Así, se logró un incremento
global de 1325.5 veces la expresión de la actividad lipolítica tomando en cuenta lo exhibido
por la enzima nativa97.
32
1.6.2 Reacciones de síntesis catalizadas por LipMatCCR11.
Debido a la preferencia de la LipMatCCR11 por sustratos de C:6-C:10 de p-nitrofenil

ésteres y su estabilidad en disolventes orgánicos , por ello, en 2010, Sánchez Otero y col.98
probaron la capacidad biocatalítica de la LipMatCCR11 (liofilizada) en reacciones de
transesterificación: acidólisis y alcohólisis, y esterificación para la síntesis de n-butil
caproato, así como la aminólisis para la síntesis de N-(benzil) caproamida en dos
disolventes (hexano y xileno). Con el fin de comparar los parámetros cinéticos ocuparon la
CAL-B (Novozyme® 435), una enzima lipolítica comercial inmovilizada proveniente de
Candida antarctica (Novo Nordisk). El estudio mostró que la LipMatCCR11 posee una
buena capacidad catalítica en hexano, similar e incluso superior en reacciones de
alcohólisis y esterificación que CAL-B, por lo que se demostró que la LipMatCCR11 es
biocatalizador prometedor para la síntesis de ésteres y aminas de ácido caproico,
comparable en rendimiento a CAL-B98.
1.6.3 Inmovilización de lipasas provenientes de Geobacillus thermoleovorans CCR11.
En el 2008, Sánchez Otero y col.99 inmovilizaron la enzima termoalcalófila nativa de

Geobacillus thermoleovorans CCR11 en polipropileno poroso (vía adsorción) en presencia
y ausencia de Tritón X-100, esto con el fin de mejorar la actividad específica de la enzima
inmovilizada y observar el comportamiento de la enzima ante esa técnica de
inmovilización. Al inmovilizar en presencia de Tritón X-100 se logró un incremento de 4 a
5 veces la actividad lipolítica por gramo de inmovilizado, así mismo se mostró un aumento
de 10°C en la temperatura óptima (inmovilizado s/Tritón X-100) con respecto a la enzima
soluble (60°C a 70°C), y un aumento de la termoestabilidad en ambos inmovilizados, sin
cambios en el pH óptimo96, 99.
33
Justificación.
Debido al creciente interés en las enzimas como catalizadores en la industria y sus

aplicaciones en áreas biomédicas y de diagnóstico clínico, se han realizado diversas
investigaciones en cuanto a mejoramiento de las cualidades catalíticas y bioquímicas de
estas con el fin de masificar sus aplicaciones, la mayoría de estas enzimas provienen de
microorganismos mesófilos lo cual limita su campo de aplicación. Las enzimas
recombinantes de organismos extremófilos tienen pocas aplicaciones en la industria y casi
ninguna en el área clínica a pesar de las ventajas que presentan (estabilidad y robustez),
esto se atribuye a los costos de producción y de purificación de estas, los cuales son poco
costeables para el sector industrial y de salud tanto público como privado. Métodos como la
inmovilización de enzimas presentan una gran posibilidad tanto de mejorar las propiedades
catalíticas de la enzima como reducir costos a los usuarios al poder ser reutilizadas; sin
embargo, no existe un método universal de inmovilización este se verá determinado por las
características que se deseen del biocatalizador, es decir de su aplicación y a la naturaleza
de la enzima.
Por lo que es necesario evaluar distintos métodos de inmovilización, que permitan

implementar mejoras en cada técnica con el fin de que estas realcen las características
deseables del biocatalizador. Debido a lo anterior se propuso la comparación de dos
métodos de inmovilización: adsorción a soporte hidrofóbico y agregados enzimáticos
reticulados (CLEAs) de la lipasa termoalcalófila recombinante LipMatCCR11 con el fin de
conocer la influencia de estos sobre las propiedades catalíticas y bioquímicas de esta
enzima, además de sentar las bases para futuras posibles aplicaciones de a esta enzima tanto
en el área médica y diagnóstica, así como en la industrial.
34
Planteamiento del problema.
¿Qué efectos tendrá la inmovilización de la LipMatCCR11 mediante de dos métodos de

inmovilización sobre su capacidad catalítica y propiedades bioquímicas?
Hipótesis.
El uso de diferentes métodos de inmovilización sobre la lipasa termoalcalófila

recombinante de Geobacillus thermoleovorans CCR11, LipMatCCR11 provocará
diferentes efectos en las propiedades bioquímicas y catalíticas de la enzima.
35
Objetivos.
Objetivo general.
Evaluar y comparar dos métodos de inmovilización y su efecto sobre las propiedades

bioquímicas y catalíticas de la lipasa termoalcalófila recombinante de Geobacillus
thermoleovorans CCR11, LipMatCCR11.
Objetivos específicos.
Inmovilizar la lipasa LipMatCCR11 mediante la formación de agregados enzimáticos

reticulados (CLEAs) y adsorción a soporte.
Evaluar el efecto de ambos métodos de inmovilización sobre las propiedades

fisicoquímicas y bioquímicas de LipMatCCR11.
Analizar los resultados obtenidos de los inmovilizados entre sí y con la enzima soluble en
las mismas condiciones de ensayo.
Caracterizar la morfología de los inmovilizados por medio de microscopia electrónica.
36
II. Material y Métodos.
2.1 Reactivos y cepas.
Los reactivos empleados en los protocolos y técnicas descritos en el presente trabajo fueron
obtenidos de las marcas comerciales Sigma-Aldrich S.A de C.V (México), J.T Baker, Bio-
Rad y Millipore-Merck.
2.1.1 Cepa.
Para la obtención de la lipasa recombinante LipMatCCR11 se ocupó una cepa de

Escherichia coli BL21 (DE3) transformada con el vector pET-3b-LipMatCCR11 que
codifica para secuencia de la lipasa madura de LipCCR11 de Geobacillus thermoleovorans
CCR1111. Para la preservación de la cepa recombinante se usó glicerol al 8% a -70°C.
2.2 Producción y obtención del extracto crudo enzimático.
Para la preparación del cultivo iniciador se inocularon células recombinantes de E.coli

BL21 (DE3) pET3b- LipMatCCR11 (0.8% v/v) en tubos de ensaye con medio Luria-
Bertani (LB) estéril al que se adicionó ampicilina (100μg/ml), previamente esterilizada por
filtración con una membrana de nitrocelulosa (0.22 μm) éste cultivo inicial se dejó crecer
durante 12 horas a 37°C con agitación a 90 rpm en un baño orbital. Posteriormente se
inoculó con este cultivo iniciador (2.5% v/v) un matraz con medio LB con ampicilina
(100μg/ml), se incubó a 37°C (120 rpm) en agitación orbital hasta que alcanzó la fase
exponencial (O.D 600nm= 0.6), al llegar a este punto se indujo la expresión de la enzima
con Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (0.6mM), y se incubó por 18 horas (16°C,
200 rpm). Al final de la inducción, se colectaron las células por centrifugación (13000xg,
15min, 4°C) y se resuspendieron en amortiguador CHES pH 9 (0.05 M) posteriormente se
lisaron por medio de sonicación (60 Hz, 12 pulsos, 20s), la suspensión se mantuvo en hielo
durante todo el proceso; el lisado obtenido se centrifugó (16000xg, 15 min, 4°C), y el
sobrenadante fue recuperado.
2.3 Técnicas analíticas.
2.3.1 Determinación de la actividad enzimática.
37
Para la valoración de la actividad hidrolítica de la enzima soluble y los inmovilizados se
utilizó el método espectrofotométrico reportado por Nawani y col.100 (modificado),
empleando como sustrato p-nitrofenil laurato (p -NFL). La mezcla de reacción para la
enzima soluble se llevó a cabo en tubos eppendorf de 1.5 ml, a los cuales se les añadió 800
μl de amortiguador de fosfato a pH 6.5 0.05M, 100 μl de solución etanólica de p-NFL a una
concentración de 10 mM y 100 μl de la dilución de extracto enzimático. Se incubó a 40°C
por 5 min a 1000 rpm en un bloque térmico con agitación (Eppendorf ThermoMixer® C),
al término de la incubación se agregaron 250 μl de Na2CO3 al 0.1M, se homogeneizó la
mezcla y se centrifugó a 16000xg, 15min a 4°C en una microcentrifuga (Eppendorf
Centrifuge 5415R). Del sobrenadante obtenido se tomaron 250 μl que fueron colocados en
los pocillos de una micro placa (96 pozos) y posteriormente se midió la absorbancia a 405
nm en un lector de micro placas StatFax®-2100 (Awareness Technology, INC.).
Para la determinación de actividad hidrolítica de cada inmovilizado se pesaron

aproximadamente 0.0005g en tubos Eppendorf de 5 ml, se llevó a cabo el protocolo antes
mencionado, adecuando el volumen de reacción para 5 ml. La mezcla de reacción consistió
de: 3.6 ml de amortiguador de fosfatos a pH 6.5 0.05M, 400 μl de la solución etanólica de
p-nitrofenil laurato (10 mM) y al término de la incubación se añadió 1 ml de Na2CO3 a
0.1M. La reacción fue homogeneizada con ayuda de en vórtex, posteriormente se tomaron
dos alícuotas de 1 ml cada una, las cuales fueron colocadas en tubos tipo Eppendorf de 1.5
ml y centrifugadas. Se corrieron los blancos correspondientes.
El coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol en las condiciones de nuestro ensayo fue
determinado mediante la realización de curvas de calibración (véase anexo 1), y con éste, se
calculó la actividad enzimática volumétrica y másica mediante las siguientes fórmulas:
Para la enzima soluble:
Para el inmovilizado:
38
Todos los ensayos de determinación de actividad hidrolítica fueron realizados por
triplicado.
2.3.2 Determinación de la concentración de proteína.
La concentración de proteína fue determinada por el método de Bradford101, en una micro

placa (96 pozos) en la que se colocaron 5μl de muestra, como blanco se empleó
amortiguador de fosfatos pH 6.5 (0.05M) en los pozos, se agregaron 250 μl del reactivo de
Bradford (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente y se agitó la placa en el lector de micro
placas StatFax®-2100 (Awareness Technology, INC.) durante 45 seg, con un tiempo total
de incubación de 5 min. Se leyó la absorbancia (ABS) de las muestras a 600 nm en el
equipo previamente mencionado.
Para el cálculo de la concentración de proteína se utilizó una curva tipo de albumina sérica
bovina fracción V disuelta en amortiguador de fosfatos pH 6.5 (0.05 M) a una
concentración final de 1 mg/ml. Las concentraciones que formaron los puntos de la curva
fueron: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg/ml. Todas las muestras se realizaron por triplicado.
2.3.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Para la identificación de la presencia de la LipMatCCR11 se emplearon geles de

poliacrilamida en condiciones disociantes (SDS-PAGE) a fin de llevar a cabo la
electroforesis; la metodología ocupada fue la propuesta por Laemmil102. La preparación de
las fases del gel se realizó a una concentración de acrilamida al 12% en la fase de
resolución y al 4% para la de empaquetamiento. La electroforesis se llevó a cabo en una
cámara vertical Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad) a un voltaje de 60V durante 30 min
y posteriormente a 120V por una hora. Para la identificación y revelado de las bandas de
proteína, los geles fueron teñidos con solución de Azul de Coomasie R250.
En el anexo 2 se muestran las formulaciones de los geles y soluciones empleadas.
2.3.4 Zimograma.
39
La detección in situ de la actividad lipolítica de las bandas de proteína en los geles de
poliacrilamida fue determinada mediante zimogramas de acuerdo a la técnica propuesta por
Prim y col.103, para lo cual se empleó 4-Metilumbeliferil-butirato (MUF) como sustrato.
Una vez concluida la electroforesis los geles fueron incubados en una solución de Tritón X-
100 al 2.5% (v/v) a temperatura ambiente durante 30 min a 70 rpm. Terminado el tiempo se
retiró la solución de Tritón X-100 y se realizaron a 2 lavados con amortiguador de fosfatos
a pH 7 a una concentración de 0.05 M, cada lavado se llevó a cabo por 20 min en agitación
(70 rpm). Después del segundo lavado, se retiró el amortiguador y se cubrió el gel con una
solución de 10 ml del mismo amortiguador de fosfatos pH 7 al cual se le adicionó
previamente 100 μl de MUF (concentración de 100 μM), y se incubo por 20-30 segundos,
realizando movimientos circulares inmediatamente se observaron las bandas con actividad
lipolítica por fluorescencia bajo luz UV a A325.
2.4 Inmovilización.
2.4.1 Condiciones de inmovilización.
Para la producción de los CLEAs de la lipasa LipMatCCR11 se empleó la combinación de

factores de la condición maximizada (Tabla 7), la cual fue reportada por Badillo Zeferino104
en un estudio previo.
Tabla 7. Condiciones usadas para la producción de los LipMatCCR11-CLEAs.
FACTOR
Proteína (mg/ml) 3.25

(NH4)2SO4 (%) 40
pH 9
Glutaraldehído (mM) 40
Temperatura °C 20
Tiempo (horas) 7.5
En el caso de las condiciones para el inmovilizado LipMatCCR11 en polipropileno poroso

(Accurel® EP-100) se emplearon las condiciones con mejor variable de respuesta obtenidas
40
por Tiburcio Guzmán105 con la misma enzima recombinante. Para lo cual se llevó a cabo el
mismo método de inmovilización, modificándose el pre-tratamiento de etanol del soporte
de polipropileno con una mezcla etanol: agua al 50% (v/v) en lugar del 30% el cual había
sido reportado previamente. En la tabla 8 se muestran las condiciones de inmovilización
para la lipasa LipMatCCR11, las cuales pertenecen al tratamiento que mostró mejor
variable de respuesta en el estudio previamente realizado por el autor.
Tabla 8. Condiciones usadas para la producción del LipMatCCR11-PP.
FACTOR
Proteína (mg/ml) 2
pH 6
Temperatura °C 25
Tiempo (horas) 3
Aunado a la modificación del pre-tratamiento de etanol del método de inmovilización de

Tiburcio Guzmán105, se realizó un lavado extra al inmovilizando, llevándose a cabo 3
lavados con amortiguador de fosfatos pH 6 (0.05 M) con un volumen igual al de la
inmovilización, después de haberse filtrado.
Los procedimientos de inmovilización se encuentran en el anexo 3.
2.4.2 Evaluación de la inmovilización.
Los parámetros empleados para la evaluación de los métodos de inmovilización fueron el

% de actividad recuperada (%R), la proteína inmovilizada y la actividad específica, los
cuales son definidos a continuación:
Para % de actividad recuperada en polipropileno (pp):
Para los CLEAs:
41
Donde AEinmo, es la actividad específica del inmovilizado (CLEAs o PP); AEsoluble, es la
actividad específica del extracto enzimático que se ocupó para la inmovilización, y AEsus es
la actividad específica de la suspensión con la que las CLEAs son preparadas.
La proteína inmovilizada se define como los miligramos de proteína sobre gramo de

inmovilizado, la expresión matemática es la siguiente:
Donde mg/mlPinm es la concentración de proteína que se ocupó para inmovilizar; mg/mlPre

es la concentración total de proteína residual correspondiente a la que se determinó en cada
lavado y filtrado; por último, ginmo son los gramos de inmovilizado (seco) obtenido.
Mientras que la actividad específica para los fines de este estudio se definió como las
unidades de actividad enzimática sobre los gramos de inmovilizado empleado para la
determinación de la actividad.
2.5 Caracterización de los inmovilizados.
Para la caracterización de los inmovilizados se evaluó el efecto de la exposición a

diferentes temperaturas, valores de pH, almacenamiento y ciclos de reuso sobre la actividad
enzimática de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP. De igual forma se realizó la
caracterización morfológica mediante microscopia electrónica de barrido (SEM),
bioquímica (pH y temperatura de actividad óptimos), de estabilidad (reuso,
almacenamiento, pH, temperatura, de las uniones en el inmovilizado y desorción) y
catalítica (afinidad a sustratos de ésteres de p -nitrofenil).
2.5.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados.
El efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados, se determinó realizando

ensayos de actividad enzimática a diferentes temperaturas (30°C a 100°C). Para ello se
emplearon 100 μl de extracto crudo y cantidades aproximadas de 0.0005g de cada
42
inmovilizado. La actividad hidrolítica fue determinada como se detalló previamente en el
apartado 2.3.1. La actividad se expresó como actividad relativa (%).
2.5.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados.
Para determinar la estabilidad frente a la temperatura, se tomaron alícuotas de 500 μl de

extracto enzimático con una concentración de 5 mg/ml de proteína y cantidades
aproximadas de 0.0100 g de cada inmovilizado las cuales fueron incubadas a diferentes
temperaturas de 30°C a 100°C durante una hora. Al concluir el tiempo de incubación, se
realizó el ensayo de actividad hidrolítica antes mencionado. La actividad se expresó como
actividad residual (%).
2.5.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados.
La determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática se llevó a cabo mediante
el ajuste del sistema de amortiguador a distintos valores de pH durante la determinación de
la actividad hidrolítica. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando alícuotas de 100 μl del
extracto enzimático previamente diluido en el amortiguador correspondiente, o aprox.
0.0005 g de inmovilizado, para lo cual se utilizaron los siguientes sistemas amortiguadores:
ácido acético – acetato de sodio (pH 4 y 5), fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) y
monobásico (KH2PO4) (pH 6, 6.5 y 7), Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (pH 8), ácido
N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico-NaOH o CHES-NaOH (pH 9 y 10). Todos ellos a una
concentración de 0.05 M. La actividad hidrolítica fue medida de acuerdo a la sección 2.3.1
y expresada como actividad relativa (%).
2.5.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados.
La estabilidad de los inmovilizados a la exposición en distintas condiciones de pH se

realizó empleando alícuotas de 100 μl de extracto enzimático (5 mg/ml) y
aproximadamente 0.0100 g de inmovilizado, los cuales fueron incubados durante 24 h a
25°C, en 1000 μl del amortiguador correspondiente a diferentes valores de pH: 4, 5, 6, 7, 8,
9 y 10, todos a una concentración de 0.05M los cuales fueron ajustados previamente a
25°C. Previo a la determinación de actividad hidrolítica, a los inmovilizados se les retiro el
amortiguador y fueron secados al vacío en un miVac DNA concentrator; posteriormente se
43
pesaron 0.0005 g de los mismo y a las alícuotas de extracto enzimático se les determinó
actividad hidrolítica conforme a las condiciones previamente descritas en la sección 2.3.1.
La actividad enzimática se expresó en porcentaje de actividad residual con respecto a la
enzima e inmovilizados sin tratamiento en amortiguador de fosfatos pH 6.5.
2.5.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento.
Se evaluó la estabilidad durante el almacenamiento de ambos inmovilizados y al enzima

soluble, por lo que se procedió a incubar en dos temperaturas: 4°C y 25°C, para ello se
emplearon dos alícuotas de 500 μl de extracto enzimático a una concentración de 10 mg/ml
de proteína y dos muestras de 200 mg de los inmovilizados (LipMatCCR11-CLEAs y
LipMatCCR11-PP). De los cuatro lotes se tomaron muestras cada cinco días en un periodo
de 30 días, y durante el cual se les determinó actividad hidrolítica. Los resultados obtenidos
se expresaron en porcentajes tomando como la actividad máxima aquella medida de cada
lote el día 0.

LipMatCCR11 soluble.
La afinidad de los inmovilizados y la enzima soluble a diferentes sustratos se realizó

mediante la evaluación de la actividad hidrolítica hacia diferentes sustratos de ésteres de p-
nitrofenil por medio de un método espectrofotométrico. Los sustratos probados fueron los
siguientes ésteres: p-nitrofenil acetato (C:2), p-nitrofenil butirato (C:4), p-nitrofenil
caproato (C:6), p-nitrofenil miristato (C:14), p-nitrofenil laurato (C:12) y p-nitrofenil
palmitato (C:16), los cuales fueron disueltos en etanol absoluto a una concentración de 10
mM. La determinación de actividad hidrolítica se llevó a cabo utilizando 0.0005 g
(aproximadamente) de cada inmovilizado y 100 μl de la dilución correspondiente del
extracto enzimático, el ensayo se realizó con cada uno de los sustratos como se describió
anteriormente. La actividad hidrolítica se expresó en unidades de actividad específica
(U/mg).
2.5.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP.
44
El reuso se llevó a cabo de la siguiente manera; previo al primer ciclo de actividad se
determinó la actividad hidrolítica inicial de los inmovilizados una vez concluido el primer
ciclo de actividad, se llevó a cabo la recuperación de los CLEAs y el PP respectivamente
mediante lavados. Para ello se realizó un total de tres lavados con amortiguador de fosfatos
pH 6.5 (0.05 M), posteriormente fueron filtrados y secados al vacío a temperatura ambiente
durante 18 h en un desecador. Finalizado el secado los inmovilizados fueron sometidos a
las mismas condiciones de reacción, en repetidas ocasiones hasta que su actividad
hidrolítica fuese 0. La actividad hidrolítica residual se expresó en porcentaje.
2.6 Estabilidad química de la enzima en los inmovilizados.
La estabilidad química de LipMatCCR11-PP y LipMatCCR11-CLEAs se determinó

siguiendo el protocolo establecido por López Gallego y col.106. Para las CLEAs se pesaron
20 mg, los cuales fueron resuspendidos en 200 μl de amortiguador de carga al 3% y 10% de
SDS; para el PP se pesaron 50 mg los cuales también se resuspendieron en 350 μl de
amortiguador de carga con las mismas concentraciones de SDS, ambas muestras fueron
calentadas a 95°C por 5 min, posteriormente se centrifugaron 15 min, 4°C a 16,000xg.
De igual manera, se evaluó la capacidad de desorción de la enzima del polipropileno, para

lo cual se empleó el protocolo de desorción propuesto por Kolling y col.107, el cual fue
modificado. Se pesaron 50 mg de LipMatCCR11-PP y se agregó 500 μl de amortiguador de
fosfatos pH 6.5 (0.05 M), el inmovilizado resuspendido fue incubado a 40°C por 2 h a 1000
rpm en un bloque térmico (Eppendorf ThermoMixer® C). Al término de la incubación se
fueron centrifugados, del sobrenadante recuperado se tomaron 20 μl y le fue agregado 10 μl
de amortiguador de carga enseguida fue calentado a 95°C durante 5 min.
Los sobrenadantes fueron analizados por medio de electroforesis SDS-PAGE la cual se

llevó a cabo en una celda Mini-Protean tetra (Bio-rad). La actividad lipolítica de los geles
SDS-PAGE fue determinada empleando 4-Metilumbeliferil-butirato (MUF) como sustrato,
y observada la aparición de bandas en un transiluminador de luz UV. Finalmente, los geles
fueron teñidos con una solución de azul de Coomasie, para la detección de la proteína.
Para calcular el porcentaje de desorción del inmovilizado LipMatCCR11-PP se ocupó la

siguiente fórmula:
45
2.7 Análisis morfológico de los inmovilizados.
La morfología y el tamaño de partícula de ambos inmovilizados se analizaron mediante

micrografías de escaneo electrónico empleando un microscopio electrónico de barrido
(SEM). Para los LipMatCCR11-CLEAs se utilizó un microscopio marca JEOL modelo
JSM-7600F con el apoyo del Centro de Investigación en Micro y Nanotecnología
(MICRONA) Región Veracruz. Previo a su observación los LipMatCCR11-CLEAs fueron
almacenaron en un desecador al vacío, las micrografías se realizaron sin ningún
recubrimiento, por lo que la columna del equipo se ajustó en modo Gentle Beam con un
voltaje operativo de 1.0 y 2.0 kV.
En el caso del LipMatCCR11-PP y polipropileno con/sin pre-tratamiento de etanol (EtOH)

las muestras fueron colocadas en un portamuestras de aluminio que contenía cinta
conductiva de carbón, posteriormente fueron recubiertos con oro (Au) en un equipo
ionizador de metales marca Quorum modelo Q150R S. Se utilizó un microscopio marca
FEI™ modelo Quanta™ 250 FEG propiedad del Instituto de Ecología, A.C. (INECOL,
Xalapa Enríquez, Veracruz). Las micrografías se realizaron con un voltaje operativo de
2.00 y 5.00 kV, la columna del equipo fue ajustada a modo alto vacío (High vacuum).
Para medir el tamaño de partícula y poro con base a las micrografías proporcionadas por el
SEM, se utilizó la herramienta Object Extraction y Measurements dentro de la interfaz del
programa Aphelion™ Lab versión 4.3.2 proporcionado por: ADCIS
(http://www.adcis.net/es/index.html).
46
III. Resultados.
3.1 Inmovilización.
3.1.1 Evaluación de la inmovilización.
Para evaluar la influencia del método de inmovilización sobre la actividad enzimática de la

LipMatCCR11 se consideraron dos parámetros: el porcentaje (%) de actividad retenida y la
actividad específica. Como dato extra se tomó en cuenta la cantidad de proteína
inmovilizada.
Para el inmovilizado LipMatCCR11-CLEAs el valor de actividad retenida fue de 2.77 % y

su actividad específica fue de 7750 U/g, para el caso del inmovilizado en polipropileno
LipMatCCR11-PP, la actividad retenida y la actividad específica fue del 0.067 % y 3133
U/g respectivamente; estas fueron expresadas en función a los gramos de soporte. Mientras
que la cantidad de proteína que fue inmovilizada fue para LipMatCCR11-CLEAs 520 mg
de proteína/ gramo de inmovilizado (mgP/gI), mientras que para LipMatCCR11-PP fue de
51.54 mgP/gI.
3.2 Caracterización de los inmovilizados.
3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados.
Se analizó el efecto de la temperatura sobre la actividad de ambos inmovilizados y la lipasa

soluble mediante el ensayo de hidrólisis con p-nitrofenil laurato; las pruebas fueron
realizadas a diferentes temperaturas en un rango de 30 a 100°C. Los resultados de los
experimentos reportados en actividad relativa se presentan en la fig. 6.
La temperatura óptima de los inmovilizados fue igual que la enzima soluble (40°C).
47
Figura 6. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la lipasa soluble e inmovilizada
(CLEAs y Polipropileno). Las letras (a, b, c) son los grupos formados en la comparación de
la prueba de Tukey, aquellos tratamientos que no comparten una letra son
significativamente diferentes (p<0.05).
3.2.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados.
Se evaluó el efecto de cada inmovilizado sobre la termoestabilidad de la lipasa en un rango

de temperaturas de 30°C a 100°C. En el gráfico (Fig. 7) se muestran los resultados de esta
prueba, donde el inmovilizado LipMatCCR11-CLEAs fue el que presentó mayor
estabilidad a la exposición prolongada a 30°C, conservando un 80% de su actividad
después de una hora de incubación, mientras que para la lipasa soluble y el LipMatCCR11-
PP se observó una pérdida del 70% de actividad a la misma temperatura y mismo tiempo de
exposición.
48
Figura 7. Termoestabilidad de los inmovilizados y LipMatCCR11 soluble.
3.2.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados.
Se analizó el efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados a 40°C, en soluciones

amortiguadoras con valores de pH en el rango de 4 a 10. En la fig. 8 se muestran los
resultados obtenidos durante el ensayo; para el caso de la enzima soluble LipMatCCR11
esta mostró el mismo valor de pH óptimo previamente reportado por Quintana Castro y
col.11. En cuanto a los inmovilizados LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP su pH
óptimo fue de 8 y 10, respectivamente. En valores de pH ácido (5 y 6) LipMatCCR1-PP
exhibió el doble de la actividad con respecto a la enzima soluble, esta última a un pH neutro
(siete) presentó una actividad significativamente mayor a la de ambos inmovilizados
(p<0.05).
El LipMatCCR11-CLEAs mostró una pérdida del 20% de su actividad a un pH de 10, en

comparación con la LipMatCCR11 que mantuvo más del 90% de su actividad enzimática.
A pH 9 ambos inmovilizados: polipropileno y CLEAs, exhibieron una actividad similar, y
no mostraron diferencias significativas al ser comparados con la lipasa soluble a su pH de
máxima actividad.
49
Figura 8. Efecto del pH sobre LipMatCCR11-CLEAs, LipMatCCR11-PP y la enzima
soluble.
3.2.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados.
La estabilidad de los inmovilizados con respecto a la lipasa soluble se evaluó mediante la

exposición de los inmovilizados a distintos valores de pH (4-10) durante un periodo de
incubación de 24 hrs a temperatura ambiente. Los resultados de la prueba se muestran en la
fig. 9.
El inmovilizado LipMatCCR11-PP presentó una baja estabilidad en todo el rango de pH

probado en comparación con LipMatCCR11-CLEAs y la lipasa soluble, la cual mostró ser
significativamente (p<0.05) más estable a pH´s por arriba de 6 que LipMatCCR11-PP. Para
LipMatCCR11-CLEAs y la enzima soluble se observó una estabilidad significativamente
igual a un valor de pH 10, mientras que el LipMatCCR11-PP exhibió una reducción
significativa de su actividad en este pH.
Los datos obtenidos se sometieron a la prueba de Tukey, el inmovilizado LipMatCCR11-

CLEAs exhibió una mayor estabilidad en el rango de pH probado, con ello muestra un
desempeño significativamente mayor en comparación con los datos obtenidos de la lipasa
soluble y el LipMatCCR11-PP.
50
Figura 9. Efecto del pH sobre la estabilidad de LipMatCCR11-CLEAs, LipMatCCR11-PP
y la enzima soluble.
3.2.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento.
Se evaluó este parámetro sometiendo los inmovilizados de polipropileno y CLEAs, así

como la enzima soluble a un periodo de almacenamiento de 30 días a dos diferentes
temperaturas (4°C y 25°C), la actividad fue medida en intervalos de 5 días.
Los gráficos que se muestran en las figs. 10 y 11 representan el comportamiento de

LipMatCCR11-CLEAs, LipMatCCR11-PP y la lipasa soluble durante el almacenamiento.
El comportamiento frente al almacenamiento de LipMatCCR11-PP presentó a los 20 días

posteriores al almacenamiento un decremento significativo (p<0.05) en su actividad del
55% a 25°C con respecto al día inicial (día 0). Mientras, a 4°C el LipMatCCR11-PP tuvo
un descenso del 24% de su actividad inicial a los 15 días y que se mantuvo constante
durante los 30 días de almacenamiento que al término fue del 81%. En el caso de
LipMatCCR11-CLEAs su actividad fue constante y no mostró decrementos durante el
periodo de almacenamiento en ninguna de las temperaturas probadas. Por su parte la
enzima soluble almacenada a 25°C y 4°C mostró una disminución significativa (p<0.05)
con respecto al día 0 a los 30 días. En general, los inmovilizados mantuvieron una buena
51
estabilidad durante los 30 días de almacenamiento en comparación con la lipasa soluble que
perdió hasta el 65% de su actividad inicial al término del ensayo.

LipMatCCR11-PP y la enzima soluble a 25°C.
Figura. 11. Estabilidad durante el almacenamiento de LipMatCCR11-CLEAs,

LipMatCCR11-PP y la enzima soluble a 4°C.
52
3.2.6 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y
Se evaluó la afinidad de los inmovilizados, mediante el uso de diferentes ésteres de p-

nitrofenil como sustratos. En la fig. 12 se muestran los datos obtenidos en el ensayo de
afinidad a sustrato.
La lipasa soluble presenta una afinidad significativamente mayor (p<0.05) hacia el p-

nitrofenil laurato (C:12) en comparación con los otros sustratos probados, con una actividad
significativa de 1180.76 U/mg. En el caso del sustrato con el residuo acilo de 14 carbonos
(p-nitrofenil miristato), la lipasa presentó una actividad específica de 26 U/mg de proteína,
otro sustrato que mostró una baja actividad enzimática y por lo tanto una menor afinidad,
fue el p -nitrofenil caproato que presento una actividad específica de 298 U/mg. Para los
ésteres de p -nitrofenil acetato (C:2), butirato (C:4) y palmitato (C:16) no hubo diferencia
significativa en cuanto a su actividad específica al ser comparados entre ellos por medio de
la prueba de Tukey.
En el caso de los inmovilizados, LipMatCCR11-CLEAs mostró una actividad específica

significativamente (p<0.05) más alta en su capacidad hidrolítica hacia el p-nitrofenil
butirato (C:4) en comparación con la mostrada por LipMatCCR11-PP que también tuvo
afinidad por el mismo sustrato pero esta no fue significativa al compararse ambos, sin
embargo la enzima soluble presentó una mayor capacidad hidrolítica que los inmovilizados
en todos los ésteres de p-nitrofenil incluso en el sustrato que presenta la cadena acilo de 14
átomos de carbono en el cual tuvo una actividad específica baja.
53
Figura 12. Afinidad de LipMatCCR11-PP y LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11
soluble a ésteres de p-nitrofenil. Acetato (C:2), butirato (C:4), caproato (C:6), laurato
(C:12), miristato (C:14) y palmitato (C:16).
3.2.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP.
Se evaluó la capacidad de reuso de ambos inmovilizados, mediante a ciclos continuos de

hidrólisis, hasta la pérdida o disminución total de su actividad. En la fig. 13 se muestra el
comportamiento de los inmovilizados frente a los diferentes ciclos continuos de hidrólisis.
LipMatCCR11-CLEAs presentó una pérdida gradual de actividad, al conservar una

actividad de solo el 37% en el noveno ciclo de uso con respecto a la inicial, y con una
pérdida total de la misma en el décimo ciclo de uso. En el caso de LipMatCCR11-PP la
actividad relativa (AR) del inmovilizado disminuyó un 88% después del primer ciclo de
reuso, con una posterior pérdida gradual de su actividad hasta el quinto ciclo de reuso con
solo un 1% de AR, antes de la pérdida completa de actividad en el octavo ciclo. Al
comparar los inmovilizados de ambas pruebas LipMatCCR11-CLEAs presentó mayor
estabilidad ante el desgaste sufrido por el reuso y una retención de su actividad por un
número mayor de ciclos.
54
Figura 13. Estabilidad de LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP durante el reuso.
Se evaluó la estabilidad de ambos inmovilizados mediante su exposición a diferentes

concentraciones de SDS (3 % y 10 %). El LipMatCCR11-CLEAs fue comparado con la
fracción soluble y precipitada del extracto enzimático en presencia de sulfato de amonio al
40%, ya que es el protocolo de precipitación de la enzima. De igual forma se le determinó
la capacidad de la enzima inmovilizada LipMatCCR11-PP para desorberse del soporte, al
ser incubada en amortiguador de trabajo (pH 6.5, 0.05 M) durante 2 h. a 40°C. Los
sobrenadantes de los inmovilizados fueron analizados por electroforesis SDS-PAGE
(sección 2.3.3) y zimograma in situ (sección 2.3.4) para corroborar la presencia de la
enzima activa.
Los resultados para ambos inmovilizados de la liberación de la enzima con SDS se

muestran en las figs. 14 y 15, mientras que la fig. 16 muestra los resultados de la prueba de
desorción del LipMatCCR11-PP.
Como se puede observar en el zimograma (Fig. 14) se aprecia la presencia de la lipasa. El

carril 2 que corresponde al extracto enzimático precipitado con (NH4)2SO4 al 40%, el cual
55
fue tomado como control positivo para determinar la presencia de la lipasa LipMatCCR11
en la mezcla de inmovilización de los CLEAs. En el carril 4 se observa la presencia de la
lipasa en el sobrenadante de LipMatCCR11-CLEAs tratados con SDS al 10%,
comprobando que fue posible liberar la enzima de las uniones covalentes
(entrecruzamiento). Como se puede observar en el gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) la
presencia de la lipasa fue confirmada de acuerdo a su peso molecular (43 kDa).
Figura 14. Análisis de LipMatCCR11-CLEAs – protocolo SDS. Gel SDS-PAGE

(Derecha) y zimograma (Izquierda) Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2:
(NH4)2SO4 40% (precipitado). Carril 3: LipMatCCR11-CLEAs (SDS 3%). Carril 4:
LipMatCCR11-CLEAs (SDS 10%). Carril 5: (NH4)2SO4 40% (sobrenadante).
En el zimograma de la fig. 15 que corresponde a la presencia de la banda obtenida de la

liberación de enzima del inmovilizado con polipropileno, se observa la presencia de la
lipasa obtenida del sobrenadante de LipMatCCR11-PP, el cual fue sometido a
concentraciones del 3 y 10% de SDS, para romper las uniones formadas por la enzima con
el soporte. En el gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig. 15) se muestran las bandas
correspondientes a lipasa LipMatCCR11 siendo más intensa la observada en el carril 3 que
a la obtenida mediante SDS al 3%, mostrada en el carril 2, por lo que la concentración de
SDS al 10% fue más eficiente en el tratamiento para la liberación de la enzima del soporte.
56
Figura 15. Análisis de LipMatCCR11-PP – protocolo SDS. Gel SDS-PAGE (Derecha) y
Zimograma (Izquierda). Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2: sobrenadante de
LipMatCCR11-PP (SDS 3%). Carril 3: sobrenadante LipMatCRR11-PP (SDS 10%).
Por último, se evaluó la capacidad de desorción de la lipasa del inmovilizado

LipMatCCR11-PP, en la fig. 16, el análisis del zimograma (izquierda) reveló la presencia
de las bandas correspondientes a la enzima LipMatCCR11, en todos los carriles. En el
carril 2, se colocó como referencia una muestra del extracto enzimático, el cual contiene a
la enzima de interés, en el carril 3 se encuentra la muestra obtenida del ensayo de
desorción, como blanco de este ensayo se calentó una muestra del inmovilizado a 95°C
durante 5 min, este proceso debilitó las interacciones entre el soporte y la lipasa liberando
una fracción de la enzima de dicho soporte y reflejándose en la aparición de una banda en
el carril 4. En el gel SDS-PAGE (derecha) no fueron observadas bandas adicionales al
marcador de peso molecular (carril 1) y el extracto enzimático (carril 2). El porcentaje de
desorción fue 4% de la lipasa liberada del soporte al incubarse 2 h a 40°C en amortiguador
de fosfatos pH 6.5 (0.05M), este se calculó conforme a la fórmula mencionada en la sección
2.5.8.
57
Figura 16. Prueba de desorción de LipMatCCR11-PP. Gel SDS-PAGE (Derecha) y
zimograma (Izquierda) Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2: extracto enzimático
(lipasa soluble 43 kDa). Carril 3: LipMatCRR11-PP-tratamiento de desorción (2h – 40°C;
sobrenadante). Carril 4: sin tratamiento de desorción LipMatCCR11-PP (95°C por 5 min;
sobrenadante).
Se evaluaron los inmovilizados, mediante el análisis y observación de las micrografías

obtenidas por medio de microscopia electrónica de barrido (MEB o SEM).
Con respecto al LipMatCCR11-CLEAs, se observó que su morfología estaba formada por

agregados individuales de aproximadamente 0.25 μm de diámetro (Fig. 17), con la
formación de clúster ramificados con tamaños que van desde los 10 a 100 μm, lo cual los
ubica en el grupo de los CLEAs tipo 2 definidos como agregados asociados en grandes
grupos con tamaño individual menor de 1 μm.
58
Figura 17. Micrografías-SEM de LipMatCCR11-CLEAs. Arriba, se muestra el tamaño
aprox. de los agregados individuales (Mag. 20,000x); Abajo, clúster formado de agregados
individuales, CLEAs tipo 2 (Mag 5000x).
En cuanto a la morfología de LipMatCCR11-PP se observaron las partículas de

polipropileno menos definidas con un aspecto colapsado y aglomerado. En las micrografías
de mayor aumento se pudo observar este fenómeno de aglomeración, debido a la presencia
de la enzima, ya que, al ser comparado con las micrografías de polipropileno sin enzima, la
apariencia observada fue más definida, con mayor detalle de los poros del soporte y con
ausencia del aspecto aglomerado, observado en la enzima inmovilizada (Fig. 18).
59
Figura 18. Micrografías-SEM Accurel EP 100 inmovilizado y sin enzima. a) inmovilizado
LipMatCCR11-PP (Mag. 3800x). b) partícula de polipropileno con pre-tratamiento, sin
enzima (Mag. 2500x).
60
El análisis del tamaño de partículas observadas en las micrografías de la enzima
inmovilizada y del Accurel EP 100 (sin enzima) se llevó a cabo mediante el software
Aphelion™ Lab 4.3.2 (http://www.adcis.net/es/index.html). En ambas muestras analizadas
el polipropileno mostró un tamaño de partícula heterogéneo (Fig. 19); en el LipMatCCR11-
PP se observaron tamaños de partícula que iban de 30 μm a 100 μm e incluso de mayor
tamaño, mientras que las demás muestras presentaron partículas con rangos aproximados
de 100 a 300 μm. De igual forma, se obtuvieron micrografías de muestras de polipropileno
con y sin pre-tratamiento de etanol, las cuales fueron analizadas mediante el mismo
software, para realizar una determinación aproximada del tamaño de poro. El análisis de las
micrografías de PP sin pre-tratamiento arrojo un tamaño de poro de 0.03 a 5 μm. En el caso
de los datos obtenidos a partir de las muestras de PP con pre-tratamiento, se obtuvo un
tamaño de poro de 2 a 8 μm, mostrando un incremento del tamaño de poro. Dicho
incremento no pudo ser apreciado a simple vista en las micrografías. El aspecto del
polipropileno mostró que los poros superficiales estaban conectados a otros poros y a
pequeñas fisuras internas, se visualizaron poros de contornos amorfos además de una
textura trabecular-esponjosa (Fig. 20).
61
Figura 19. Micrografía-SEM Accurel EP 100 sin pre-tratamiento (sin enzima). Tamaño
heterogéneo de las partículas de polipropileno (Mag 500x).
62
Figura 20. Micrografía–SEM morfología del Accurel EP 100. Arriba.; estructura de los
poros y canales del polipropileno (Mag. 10000x) sin pre-tratamiento. Abajo; detalle de la
textura trabecular-esponjosa (Mag.30000x), pre-tratado con etanol.
63
V. Discusión.
4.1 Evaluación de la inmovilización sobre la LipMatCCR11.
Los parámetros que comúnmente se reportan en la literatura para comunicar el efecto de la

inmovilización sobre la enzima libre son la actividad específica (AE, U/g de soporte), la
proteína inmovilizada (o absorbida), y la actividad retenida (%R), esta última indica cuanta
actividad enzimática se retuvo en el inmovilizado, lo que da una idea de la eficiencia del
proceso108. Los valores de estos parámetros obtenidos para el inmovilizado LipMatCCR11-
CLEAs en el presente trabajo, contrastan con otros reportados en la literatura: Torres y
col.76 produjeron CLEAs de la lipasa de Thermomyces lanuginosa su mejor condición
obtuvo un %R del 11.1% y una AE de 7 U/mg; por el contrario, Kartal y col.109 reportaron
para los CLEAs de la lipasa de Candida rugosa un 26% R. La diversidad en estos
parámetros se ha presentado incluso entre una misma enzima, Wang y col.110 sintetizaron
CLEAs de Penicilina-G-acilasa con diferentes azúcares como adyuvantes en la
precipitación de la enzima, y obtuvieron distintas actividades específicas y porcentajes de
eficiencia en la inmovilización en los inmovilizados con y sin azúcar. En este trabajo,
LipMatCCR11-CLEAs presentó una baja %R.
Para el LipMatCCR11-PP; la proteína absorbida y la AE obtenida fue mayor que lo

reportado para otros inmovilizados en soportes hidrofóbicos. Un ejemplo de esto es el
estudio de Cesarini y col.111 que inmovilizaron cuatro lipasas provenientes de Pseudomonas
(no comercial) en tres tipos de soportes: Accurel EP 100, MP 1000 (ambos polipropileno) y
Celita®545, para el caso específico de Accurel EP 100 reportaron actividades de 6.8 U/g
(LipA), 42.7 U/g (LipC), 28.6 U/g (LipCmut) y 34.3 U/g (LipI.3), para cada una de las
cuatro enzimas. Cunha y col.90 reportaron la inmovilización de la lipasa de CAL-B en
diferentes soportes, para el Accurel MP 1000 se reportó una AE de 10 U/g, y una proteína
absorbida de 7.1 mg/g soporte.
El valor de %R observado para LipMatCCR11-PP son inferiores a los que otros autores han
reportado utilizando soportes similares, Kolling y col.107 inmovilizaron la esterasa
recombinante de Lactobacillus plantarum con un 83% de eficiencia en la inmovilización y
12.4 mg de proteína/ g de soporte adsorbida. En cuanto a la inmovilización en otros
64
soportes diferentes al Accurel pero de la misma naturaleza hidrofóbica, Vieira Branco y
col.87 inmovilizaron a la lipasa recombinante de P. furiosus en octil-Sepabead con un 30%
de la proteína absorbida y un 74% de actividad retenida. Otro ejemplo es Karra-Châabouni
y col.112 que inmovilizaron por adsorción en celulosa a la lipasa de Rhizopus oryzae con un
70% en eficiencia en la inmovilización, 15% de actividad retenida y un 66% de proteína
adsorbida. Entre los factores que influyen la actividad retenida (%) es la naturaleza de la
enzima, el método de inmovilización, el medio en el que se llevó a cabo, y a pesar de que
no existe una relación inmediata entre las características del poro esta también influye108.
Estudios realizados por Badillo Zeferino y col.97 sobre la inmovilización de LipMatCCR11

en Accurel EP 100, permitieron la maximización de la cantidad de proteína adsorbida (89.8
mg de proteína/g de soporte). Estos valores difieren de lo obtenido en el presente estudio,
esto se podría adjudicar a la diferencia en el pre-tratamiento de etanol el cual se realizó a
una concentración (50%) diferente a la reportada (30%).
Al comparar LipMatCCR11-CLEAS contra LipMatCCR11-PP, los agregados enzimáticos

muestran mejores parámetros de respuesta a la inmovilización, la cantidad tan elevada de
enzima inmovilizada, puede asociarse a dos factores importantes: (1) en los CLEAs la
enzima no posee soporte además que la unión al Accurel es selectiva para proteínas
hidrofóbicas y (2) la cantidad de proteína que se carga no es la misma que en el Accurel,
además de que en los CLEAs a pesar de que el extracto enzimático pasa por un proceso de
purificación para la enzima de interés antes de formar la red de entrecruzamiento, una
cantidad considerable de proteínas contaminantes del microorganismo hospedero se
encuentran todavía presentes en el precipitado, y finalmente forman parte del inmovilizado.
Aun así, los resultados obtenidos sugieren que la metodología de agregados enzimáticos
reticulados podría ser la más adecuada para la LipMatCCR11, si se quiere un biocatalizador
con buena estabilidad y capacidad de operar en condiciones medias.
4.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados.
La resistencia a la desnaturalización térmica de las enzimas inmovilizadas, suele asociarse a

la capacidad de soportar el estrés mecánico y químico del ambiente al que ésta es
expuesta113. Los resultados obtenidos para los inmovilizados LipMatCCR11-CLEAs y
65
LipMatCCR11-PP, mostraron que la temperatura óptima para la enzima en sus
inmovilizados y su forma soluble, es de 40°C. LipMatCCR11-CLEAs presenta una
resistencia significativa (p<0.05) a la perdida de actividad partir de los 50°C con respecto a
la lipasa soluble, y a partir de los 60°C está es significativa (p<0.05) comparada contra el
LipMatCCR11-PP, esto ha sido reportado con el mismo método de inmovilización
(CLEAs) para otras enzimas, y es atribuido a la disminución de la flexibilidad
conformacional de la enzima al enlazarse covalentemente debido a la acción del agente
reticulador85, 114. De igual manera, LipMatCCR11-PP presentó una temperatura óptima de
40°C; a pesar de ello el inmovilizado mostró la capacidad de operar en un rango de
temperatura de 30°C a 60°C estos valores son similares a los reportados por Bussamara y
col.115 para la lipasa de Pseudozyma hubeiensis la cual fue inmovilizada por adsorción y
presentó un alta actividad a temperaturas de 36°C a 70°C; aunque existen reportes donde
las enzimas inmovilizadas por este método aumentaron su temperatura óptima en
comparación a su contraparte soluble99, 112, 116
. Ambos inmovilizados mantuvieron la
temperatura óptima de la enzima soluble, por lo que se puede asumir que los cambios
conformacionales sufridos por los procesos de inmovilización no tuvieron un impacto
considerable en su temperatura de actividad máxima.
4.3 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados.
De manera general el LipMatCCR11-PP muestra un perfil de termoestabilidad similar al de

la enzima soluble, pero comparado con esta, la enzima inmovilizada conserva su actividad
un 10% más a temperaturas de 50°C y 60°C. Para el caso del inmovilizado LipMatCCR11-
CLEAs este mostró una mayor estabilidad, reteniendo su actividad enzimática en las
mismas condiciones hasta un 50% y 30% más con respecto a la enzima soluble a 50°C y
60°C, y un 38% a 20% más con respecto a la LipMatCCR11-PP. Incrementos similares han
sido reportados para la lipasa de Rhizopus orizae, cuyos CLEAs conservaron el 50% de su
actividad posterior a su incubación a 60°C, por el contrario su forma no inmovilizada
perdió por completo su actividad al ser sometida 15 min a las mismas condiciones114.
Por otra parte, LipMatCCR11-PP presentó una baja termoestabilidad al perder más del 60%
de su actividad al ser incubada 1h a 30°C, estudios de otros métodos de inmovilización han
reportado el decremento en esta propiedad, un ejemplo es Tümtürk y col.117 que
66
inmovilizaron la lipasa de Candida rugosa mediante dos métodos: atrapamiento y uniones
covalentes, ambos después de ser incubados a 45°C durante 25 min mantuvieron
únicamente el 23% y 29% de su actividad respectivamente. Este fenómeno puede ser
asociado a la desestabilización de la estructura de la proteína al interactuar con el soporte87.
Sin embargo, LipMatCCR11-PP mostró un incremento significativo en la estabilidad a
50°C y 60°C comparado con la forma soluble, estos resultados coinciden con los reportados
por otros autores donde las enzimas que fueron inmovilizadas por medio de adsorción
presentaron una mejora en su estabilidad a estas mismas temperaturas con respecto a sus
formas solubles112, 115, 118.
Cabe destacar que los resultados obtenidos del estudio de los inmovilizados difieren con
respecto al perfil de termoestabilidad reportado previamente por Sánchez Otero y col.99
para el inmovilizado de la lipasa nativa de Geobacillus thermoleovorans CCR11, la cual
solo redujo su actividad al ser incubada una hora en temperaturas superiores a 50°C; al
realizar la clonación de la LipCCR11 en Escherichia coli Quintana Castro y col.11 atribuyó
la disminución en la termoestabilidad de la LipMatCCR11 a la incapacidad del organismo
hospedero de realizar los plegamientos propios de la proteína nativa.
4.4 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados.
Los diferentes rangos de pH en los cuales una enzima puede llevar a cabo su actividad
catalítica son determinados por las interacciones que se forman entre las cadenas laterales
de sus aminoácidos, las cuales son las que dan forma a la estructura de la proteína. Estas
interacciones que dan estabilidad y forma a las proteínas, y las cuales resultan
principalmente afectadas por los cambios de pH son los puentes salinos y los enlaces de
hidrógeno; por ello se evaluó el efecto de la inmovilización de LipMatCCR11 sobre este
parámetro.
El pH óptimo que exhibió la lipasa soluble fue de 9, y coincide con lo previamente

reportado por Quintana Castro y col.11 Mientras que el pH óptimo que se obtuvo después de
inmovilizar la LipMatCCR11 por CLEAs y adsorción en polipropileno fue de 8104 y 10
respectivamente. Aumentos en el valor de pH óptimo sobre todo con tendencia hacia la
alcalinidad de enzimas inmovilizadas en soportes hidrofóbicos e hidrofílicos han sido
67
reportadas por varios autores118-120. Este comportamiento de la LipMatCCR11-PP puede ser
atribuido a la mayor exposición del sitio activo al medio (disolvente) como consecuencia de
la inmovilización por lo que el microambiente del sitio catalítico resulta más ácido y por
ende se requiere de un medio más alcalino para que la enzima logre expresar su máxima
actividad, otra de las razones para la variación de pH es la naturaleza del soporte ya que
juega un papel importante en la determinación de esta característica119. En contraste
Sánchez Otero y col.99 en un estudio previo con la lipasa nativa de Geobacillus
thermoleovorans CCR11 reportó un pH de 9 para la enzima soluble e inmovilizada.
En la literatura existen diversos reportes sobre variaciones del valor de pH entre las
enzimas libres e inmovilizadas, este fenómeno se presenta comúnmente en los protocolos
de inmovilización que hacen uso de materiales con carácter poliónico121. A pesar de que la
síntesis de los CLEAs no involucra el uso de algún soporte, como en el caso de los
LipMatCCR11-PP, estudios previos han reportado cambios en el pH óptimo de distintas
hidrolasas inmovilizadas mediante este método, estos cambios en los valores de pH pueden
mostrar una tendencia ambivalente, es decir se pueden dirigir tanto a la alcalinidad114 como
hacia la acidez84-85. En cuanto a la tendencia a valores más ácidos en inmovilizados,
Mahmod y col.84 observaron un cambio del valor de pH óptimo de la enzima libre (proteasa
de Ictalurus punctatus) de 8 a 6.8 al ser inmovilizada como CLEAs, similares resultados
fueron obtenidos por Aytar y col.85 al inmovilizar por este mismo método a la tirosinasa de
Agaricus bisporus cuyo pH de actividad óptima paso de 7 a 6.5. Esto puede ser
consecuencia del microambiente al interior de los CLEAs el cual se encuentra determinado
por todas las moléculas distintas a la proteína de interés presentes en su formulación122. Los
LipMatCCR11-CLEAs, fueron producidos a partir de un extracto enzimático que contenía
tanto la enzima de interés (lipasa) como las proteínas del organismo hospedero, por lo que
al formar parte de la red de entrecruzamiento pudo haber influido en el microambiente de la
LipMatCCR11 confiriéndole un carácter más alcalino, que hizo necesario someter a la
enzima a un pH más ácido en el medio para que esta exhibiera su máxima actividad
catalítica104.
4.5 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados.
68
La exposición prolongada a ambientes con distintos valores de pH, sobre todo en aquellos
los cuales no son los ideales para la enzima conlleva a la desnaturalización y disminución o
pérdida de su actividad catalítica. En el caso de las lipasas su activación no solo depende de
la presencia de interfaces, el estado de ionización de los residuos ubicados en la región de
la tapa también juega un papel importante en este mecanismo123.
LipMatCCR11-CLEAs presentó una estabilidad superior en ambientes con un rango de pH

de 4 a 10 al compararse con LipMatCCR11-PP y su contra parte soluble, estos mantuvieron
casi el 100% de su actividad para aquellos valores de pH que fueron de 5 a 7 lo anterior va
en concordancia con lo reportado por Badillo Zeferino104 para estas mismas condiciones de
inmovilización. La región de estabilidad en valores de pH ácidos (4-6) del LipMatCCR11-
CLEAs es debido a la disminución de su pH óptimo104. Reportes sobre casos similares de
estabilidad superior de lipasas en rangos de pH cercanos su valor óptimo se han descrito124.
La baja estabilidad que presentó el LipMatCCR11-PP a los diferentes valores de pH puede

ser atribuido a diversos factores como a los posibles cambios en la estructura tridimensional
de las enzimas como consecuencia de su inmovilización115, el efecto contrario ha sido
reportado por otros autores en estudios de inmovilización en soportes hidrofóbicos por
medio de adsorción99, 115, 118. Factores como las condiciones en las cuales se lleva a cabo la
inmovilización influyen en la formación de enlaces entre el soporte y la enzima. Por lo que
cambios de pH entorno al punto isoeléctrico de la enzima tendrá un impacto importante en
la unión de la proteína al soporte al momento de la inmovilización ya que las fuerzas
electrostáticas serán las que gobiernen la adsorción en lugar de las hidrofóbicas125. Ya que
la carga proteica de LipMatCCR11-PP está condicionada por el pH de inmovilización105,
las fuerzas electrostáticas son las predominantes en la adsorción de esta lipasa, y debido a la
naturaleza débil de estos enlaces la enzima es desestabilizada fácilmente por factores
externos.
4.6 Estabilidad durante el almacenamiento de los inmovilizados.
La estabilidad durante el almacenamiento es uno de los criterios más importantes para la

aplicación de una enzima a escala comercial115, y la inmovilización es una estrategia para
mejorarla63. Por ello se estudió la estabilidad de ambos inmovilizados durante un periodo
69
de almacenamiento de 30 días a 4°C y 25°C, los resultados mostraron que tanto la
LipMatCCR11-CLEAs, de igual manera LipMatCCR11-PP a 4°C no presentó cambios
significativos en su actividad durante este periodo con respecto a su actividad inicial. Lo
anterior concuerda con lo reportado por Yang y col.126 en donde CLEAs de la lipasa de
Thermomyces lanuginosus después de 20 días de almacenamiento a 4°C no presentaron un
decremento significativo de su actividad con respecto a su control. Cuhna y col.90
analizaron por un periodo de 2 meses la actividad del inmovilizado de CALB en Accurel
MP 1000 a 4°C y 20°C, y este no presentó perdida alguna en su actividad; Vieira Branco y
col. inmovilizaron la lipasa recombinante (Pf2001) de Pyrococcus furiosus en butil-
Sepabeads y octadecil-Sepabeads, las cuales almacenaron durante 50 días, tras los cuales
detectaron 60% y 100% de su actividad inicial respectivamente. Aytar y col.85 determinaron
la actividad de los CLEAs de tirosinasa de champiñón común durante un almacenamiento
de tres meses a 4°C y 25°C mostraron actividad residual de 84 y 83% respectivamente.
Con respecto a LipMatCCR11-PP almacenado a 25°C, este mostró variaciones

significativas en su actividad durante los 30 días, existen reportes de alteraciones durante el
almacenamiento en diferentes enzimas y métodos de inmovilización, Eldin y col.127
reportaron la inmovilización de glucoamilasa por medio de uniones covalentes en perlas de
alginato activadas que fueron almacenadas durante 35 días a 4°C, estas presentaron
oscilaciones en su actividad concluyendo en un aumento del 50% con respecto a su
actividad inicial, el comportamiento de este inmovilizado fue atribuido a la elasticidad de la
red iónica del hidrogel y su capacidad para contraerse y expandirse. En el caso del
LipMatCCR11-PP las variaciones observadas se relacionaron a los cambios
conformacionales ocurridos durante el proceso de inmovilización y la distribución de la
enzima en las partículas de Accurel, además de que la enzima de interés se encontraba en
conjunto a otras proteínas contaminantes, interacciones entre proteína-proteína pudieron
continuar y debido a que la adsorción no es exclusiva de las superficies hidrofóbicas sino
también proteínas pueden promoverla, además esta es influenciada por la temperatura y al
encontrase el inmovilizado a 25°C se promovió cambios conformacionales y por ende la
reorientación de la enzima y proteínas, ya que después de todo la estabilidad es el resultado
de un decremento en el espacio disponible para que la enzima se una y reoriente, al tener la
70
posibilidad las proteínas del inmovilizado de reacomodarse la estabilidad del inmovilizado
se ve influenciada127, 128, 129, 130
. Badillo Zeferino104 demostró que la temperatura de
almacenamiento no era significativa sobre la estabilidad de los LipMatCCR11-CLEAs. Las
pruebas de Tukey de los resultados obtenidos de LipMatCCR11-PP mostraron que si hay
una influencia significativa (p<0.05) de la temperatura de almacenamiento sobre la
estabilidad del inmovilizado, esto se atribuyó a la inestabilidad de la enzima debido a
interacciones débiles entre ésta y el soporte.
4.7 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y la

Se ha reportado que la LipMatCCR11 presenta preferencias por sustratos de ocho átomos

de carbono11; en comparación LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP presentaron un
decremento de su actividad específica para la mayoría de los sustratos de p-nitrofenil que
fueron ensayados. Entre los factores a que pudieron afectar la capacidad catalítica de
LipMatCCR11-PP son la baja concentración de sustrato en el microambiente de la enzima
inmovilizada debido a limitaciones en la difusión del medio o a que el sitio de la enzima se
encontró inaccesible, de igual manera los cambios conformacionales consecuencia de la
inmovilización por medio de activación interfacial pudieron haber provocado cambios en la
afinidad a sustrato112, 131, 132, 133 otro factor importante y poco evidente es la influencia del
soporte en la capacidad catalítica de una enzima inmovilizada, un ejemplo de esto es el
estudio realizado por Sabbani y col.89 en el cual inmovilizaron la lipasa de Candida rugosa
en diferentes tamaños de partículas de Accurel (grados) ocupándolos en una reacción de
esterificación enantioselectiva, ellos observaron que los valores más altos de proporción de
enantiómero (E-valor) fueron obtenidos por el Accurel con un tamaño de partícula < 200
μm; de igual manera el tamaño de poro también ha sido reportado por diversos autores
como un factor importante en la transferencia de masa90, 134, 135, 136
. Por su parte el
comportamiento presentado por LipMatCCR11-CLEAs se puede asociar a impedimentos
estéricos que afectan la cantidad de sustrato que puede interactuar con la parte interna de
los CLEAs, siendo esto resultado de la morfología del inmovilizado o a cambios en la
orientación de la enzima133, 137.
71
LipMatCCR11-CLEAs mostró un incremento en su actividad específica hacia el sustrato de
cuatro átomos de carbono (p-nitrofenil butirato). El cambio en la preferencia de sustrato en
los agregados enzimáticos ha sido reportado por varios autores en reacciones para la
resolución de mezclas racémicas114, 138, 139, la razón detrás de esta mejora puede asociarse a
una conformación de la enzima en los agregados enzimáticos que fue la ideal para ese
sustrato114, el aumento en la actividad esterasa de las lipasas ha sido reportada para otros
métodos de inmovilización como los de absorción en soportes hidrofóbicos119, este fue el
caso de LipMatCCR11-PP, a pesar de ello este incremento no fue significativo en
comparación con LipMatCCR11-CLEAs.
En general, los problemas de difusión son uno de los inconvenientes que puede presentar
cualquier inmovilizado, García Galán y col.133 describen el fenómeno, explicando que el
sustrato que permite la actividad máxima será el que sufra el mayor problema de difusión
siendo accesible para las moléculas de enzima que se encuentran en la parte externa de los
poros, partículas o fibras; mientras que otros sustratos no se encontraran con el mismo
problema por lo que estarán disponibles en concentraciones casi iguales para todas las
moléculas de enzima del catalizador tal vez interactuando en el centro de este sin ninguna o
muy poca competencia con el otro sustrato afín.
La disminución de la actividad hidrolítica fue reportada por Bosley y col.134 cuando

inmovilizaron la lipasa de Rhizomucor miehie en Accurel EP 100 mientras que su
capacidad de esterificación se incrementó en valores elevados de carga enzimática, los
autores relacionaron este fenómeno de depresión catalítica a dos posibles casusas: 1) los
cambios conformacionales resultantes de la inmovilización , y 2) que la actividad
hidrolítica está dominada por la difusión del sustrato heterogéneo dentro de los poros del
biocatalizador, por lo que si esta no se lleva acabo de manera eficiente conlleva a una
reducción en la actividad hidrolítica.
4.8 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP.
Desde un punto de vista económico la posibilidad de reutilizar las enzimas constituye una
de las principales ventajas de la inmovilización112. En el presente trabajo, los resultados
mostraron que LipMatCCR11-CLEAs presentó 9 ciclos de uso continuo en reacción de
72
hidrólisis decayendo su actividad al décimo ciclo, esto coincidió con lo reportado por
Badillo Zeferino104. Similares resultados fueron obtenidos por Jamwal y col.94 en agregados
reticulados de la lipasa termoestable de Geobacillus sp., inactivándose al cabo de 10 ciclos
de reúso, sin embargo, previo a la pérdida de su actividad estos solo conservaron el 6% de
su actividad inicial, mientras que los LipMatCCR11-CLEAs retuvieron un 37% de su
actividad.
Estudios sobre la reutilización de los agregados enzimáticos de lipasas en reacciones de

hidrólisis han reportado una gran robustez que va desde un 40% de su actividad residual
después de 15 ciclos de reúso109 hasta un 90% de su actividad residual al cabo de 10 ciclos
de uso en hidrólisis de triglicéridos93. La capacidad de reuso de los CLEAs se ve afectada
por diversos factores como lo son la naturaleza de la enzima empleada en la
inmovilización, el proceso de producción del inmovilizado y las condiciones de ensayo, un
ejemplo del efecto de estos factores sobre la reusabilidad de los CLEAs fue el trabajo
realizado por Dalal y col.140 que sintetizaron a partir de una mezcla de enzimas de tejido
pancreático de bovino agregados enzimáticos reticulados, los cuales presentaron
actividades residuales variadas del 10 % al 50 % al quinto ciclo de reuso dependiendo del
tiempo de reticulado al cual habían sido sometidos.
En comparación, LipMatCCR11-PP perdió más 80% de su actividad después del primer

ciclo de reuso, decayendo por completo en el séptimo ciclo. Foresti y col. 141 estudiaron el
inmovilizado de la lipasa de Candida rugosa en polipropileno de baja densidad el cual
emplearon en la síntesis de etil-oleato, ellos se percataron que largos periodos de agitación
reducía el tamaño de las partículas del inmovilizado haciendo que fuese más difícil su
recuperación y por ende la reutilización. Otra causa como la desorción debido al tipo de
interacciones que existen entre la enzima y el soporte es un factor crucial y es posible
debido a que estas son de naturaleza débil (interacciones hidrofóbicas y electrostáticas)142,
otros autores también han reportado la perdida de actividad en inmovilizados producidos
por este mismo método, aunque de forma menos abrupta99, 107, 112, 143.
73
La electroforesis en geles de poliacrilamida ha sido previamente reportada para probar la
estabilidad del producto de inmovilización en condiciones desnaturalizantes92, 106, 144. En el
presente estudio tanto LipMatCCR11-CLEAs como LipMatCCR11-PP liberaron las
moléculas de enzima al sobrenadante en dos posibles formas como agregados de alto peso
molecular o en monómeros en dichas condiciones104.
La liberación de enzimas en forma monomérica ha sido reportada por Wilson y col. 145, y
Cruz y col.92 en sus respectivos estudios, considerándose un indicador de un
entrecruzamiento deficiente de la lipasa B de Candida antartica, atribuido en ambos casos
a la baja cantidad de lisinas (6) presentes en esa proteína, esto se solucionó mediante el uso
de proteínas o polímeros ricos en residuos de lisina. En el caso de la LipMatCCR11 que
posee una cantidad mayor de lisinas en su estructura (10) esa deficiencia podría deberse a
que esta enzima tiene que competir con las proteínas presentes en el extracto crudo durante
la formación de la red de entrecruzamiento para poder integrarse a ella, dando como
resultado una formación ineficiente de los enlaces covalentes entre las moléculas de
LipMatCCR11, aunado a su tendencia de formar agregados esta podrían integrarse
mayoritariamente a la red de entrecruzamiento mediante interacciones no covalentes
formando una súper estructura catalíticamente activa pero no poseería la fuerza y
estabilidad para resistir condiciones desnaturalizantes similares a las del ensayo97, 104, 106.
En el caso de la liberación de la LipMatCCR11 del polipropileno, en la literatura se ha

reportado el uso de detergentes con el fin de desorber a la enzima del soporte, el más
ocupado es el Tritón X-100131, 145
, en cambio el SDS es un detergente iónico que se ha
ocupado precisamente para el estudio de proteínas ya que es capaz de desnaturalizarlas146.
La desorción de la enzima del soporte se atribuyó principalmente a esta capacidad
desnaturalizante del SDS provocando una interrupción en la estructura terciaria de las
proteínas a una concentración sub-micelar, mientras que la extensión de la cadena
polipeptídica se lleva a cabo a una concentración micelar del detergente donde las
interacciones que se dan con la proteína son de naturaleza hidrofóbica147. De igual forma se
debe tomar en consideración como quizá el principal y si no como co-adyuvante de los
factores que influyeron en la remoción de la enzima del polipropileno a la naturaleza
anfipática de los detergentes, ya que estos (en especial el SDS) poseen en su estructura
74
cadenas alquílicas (colas) que pueden unirse por medio de interacciones hidrofóbicas a
soportes de la misma naturaleza146, siendo el Accurel un polímero hidrofóbico, las
moléculas de SDS pudieron haber desplazado a las moléculas de LipMatCCR11 dando
como resultado su liberación al medio. Este resultado más que un inconveniente presenta la
posibilidad de reuso del soporte, ya que se puede remover la enzima “desgastada” por una
preparación nueva, ahorrando costos en el reuso del inmovilizado.
El fenómeno de desorción en inmovilizados como LipMatCCR11-PP no ocurre únicamente

por acción de detergentes, sino también puede deberse a la intensidad de las interacciones
que unen a la enzima con el soporte, la cantidad de sitios en la proteína que puedan
interactuar con este, la naturaleza del propio soporte y el proceso de inmovilización juegan
un papel importante en la estabilidad final del inmovilizado119, 125, 134, 143, esta conjunción de
factores dio como resultado que las uniones entre el polipropileno y la enzima fuesen lo
suficientemente débiles como para que en condiciones “suaves” a las cuales se sometieron
durante el ensayo de desorción estas no pudiesen haber mantenido a la lipasa unida al
soporte, lo anterior se confirmó con la exposición del LipMatCCR11-PP a 95°C por 5 min
y su posterior observación de la presencia de la enzima en el sobrenadante por medio de
electroforesis (SDS-PAGE).
Al comparar a LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP ambos mostraron poca

estabilidad como productos de inmovilización. En el caso de LipMatCCR11-CLEAs la
condición de inmovilización con la que se sintetizaron no fueron las optimizadas, si no la
de mejor respuesta en una primera fase experimental104, de igual manera el LipMatCCR11-
PP solo se maximizaron ciertas variables y no su optimización97, 105
, y sin tomarse en
consideración el tipo de soporte o la naturaleza de la propia lipasa.
Uno de los aspectos importantes de un inmovilizado y que en pocas ocasiones es tomado en

cuenta es su morfología, esta hace referencia a las partículas que se producen durante la
inmovilización, su tamaño y constitución determinarán las modificaciones de las
propiedades catalíticas y fisicoquímicas siendo estas una consecuencia del método de
inmovilización empleado.
75
La observación de los LipMatCCR11-CLEAs permitió la caracterización de sus agregados
ubicándolos en los CLEAs tipo 2 (agregados asociados en grandes grupos con tamaño
individual menor a 1μm)104. La formación de los agregados ramificados que se mostraron
en las micrografías son consecuencia de la creación de enlaces covalentes entre los grupos
reactivos en la superficie de los agregados individuales9. De igual manera el agente
reticulador es un factor que afecta la morfología de los agregados enzimáticos, esto lo
demostró Zhen y col.137 que probaron diferentes agentes reticulantes en la síntesis de los
CLEAs de β-Manasa, estos al ser observados por medio de microscopia electrónica de
barrido mostraron marcadas diferencia en su morfología y diferentes %R dependiendo del
reticulador.
La eficiencia de un polímero como soporte para inmovilización de enzimas se encuentra

relacionada con su composición química, la cual determinara la naturaleza de su superficie
(inerte o hidrofóbica), igualmente su morfología y su textura así como a otras propiedades
como: el diámetro (tamaño) de poro, el cual definirá el tamaño de las proteínas que podrán
ser inmovilizadas en el soporte, así como el área de superficie determinará la capacidad
volumétrica del soporte que corresponderá a la cantidad de proteína que puede ser
absorbida por este90.
Con base a lo anterior, la caracterización que se realizó por medio de microscopia

electrónica de barrido (SEM) de las partículas de Accurel EP 100 (con y sin enzima) sirvió
para clasificarlo como un polímero macroporoso, es decir, que sus poros miden más de 50
nm de acuerdo a la IUPAC148. En la literatura existen diversos reportes que discrepan sobre
las características del Accurel EP 100, mostrando una variedad de tamaños de partícula, e
incluso siendo mayores a los que se obtuvieron en este estudio, de igual manera el diámetro
de poro tuvo variaciones dependiendo del método que se ocupó para medirlo, así como su
clasificación88-89, 125, 143. De acuerdo a los resultados que se obtuvieron del diámetro de poro
(0.03 μm a 8 μm) en este trabajo, son similares a los reportados por Bosley y col. 134 que
para Accurel EP 100 reportaron diámetros de poro de 0.01 μm en adelante, así como
canales macroporosos de aprox. 5 μm y mayores. Los diversos tamaños de poro y partículas
de un material varían dependiendo del grado de Accurel sin embargo, Foresti y col.141
reportaron que el tratamiento de etanol en polipropileno de baja densidad previo a la
76
inmovilización de la enzima influyó en el tamaño de partícula, esto dependía de la
concentración de etanol a la que fue expuesto el material. Estudios como el anterior son
muy escasos en la literatura, ya que el pre-tratamiento de etanol es reportado por varios
autores con el propósito de excluir el aire de los poros del polipropileno90, 131, 143.
Para poros con diámetros menores a 10 nm se observa un decremento en la proteína

absorbida esto debido a que las moléculas de enzima encuentran restricciones físicas para
acceder a toda la superficie, mientras que en aquellas con poros mayores a 100 nm la
reducción de la proteína absorbida se atribuye a una disminución del área superficial
disponible108, Por otra parte la forma en la que se acomode la enzima en el soporte
dependerá también del tamaño de la molécula de LipMatCCR11 que presenta un volumen
teórico aproximado de 52 nm3, 149 por lo que pudo haber penetrado en aquellos poros con
un diámetro mayor 0.1 μm con facilidad, a pesar de ello el variado tamaño de poro del
Accurel EP 100 y los canales existentes en el material hacen suponer que su estructura
interna es compleja, la enzima pudo haber presentado dificultades en encontrar espacio
suficiente tanto para unirse al soporte como para distribuirse en él debido a la naturaleza de
la LipMatCCR11 de agregarse97 y aunado a una conformación poco favorable de esta pudo
haber resultado en la formación de agregados o clústers enzimáticos144; entre estos y otros
factores fueron causantes de los problemas de transferencia de masa.
Por último, al comparar ambos inmovilizados mostraron morfologías muy diferentes al ser
observados mediante SEM, siendo consecuencia directa de cada método de inmovilización
y en el caso de los LipMatCCR11-PP del soporte (Accurel EP 100).
77
VI. Conclusión.
La inmovilización de LipMatCCR11 en Accurel EP 100 le confirió un aumento en su pH

óptimo, así como estabilidad térmica a temperaturas de 50°C y 60°C, en tanto en
almacenamiento se mejoró la estabilidad de la enzima.
La LipMatCCR11 inmovilizada por medio de la metodología de CLEAs aumento su

termoestabilidad en un rango de 30 a 70°C, de igual manera su estabilidad a diferentes pH´s
y durante su almacenamiento se incrementó.
El LipMatCCR11-CLEAs demostró una afinidad por sustratos de cuatro átomos de carbono

(p-nitrofenil butirato) mientras que LipMatCCR11-PP no mostró afinidad significativa por
algún sustrato en específico.
En cuanto al LipMatCCR11-PP este demostró ser poco estable frente a la desorción

causada por agentes físicos y químicos, aunque no puede descartarse por completo esta
metodología debido a que solo se ha probado en un tipo se soporte, por lo que si se quiere
investigar más extensamente el comportamiento de esta lipasa por la técnica de absorción
hidrofóbica se debe considerar el uso de soportes con diferentes grados de hidrofobicidad
para posteriores estudios.
La microscopia electrónica de barrido (SEM) fue muy útil en la caracterización del Accurel
EP 100, su morfología presento un tamaño heterogéneo de partícula y poro, conteniendo
estructuras como canales porosos y un aspecto esponjoso-trabecular en la parte interna del
soporte, en cuanto al LipMatCCR11-PP el aspecto aglomerado se atribuyó al proceso de
inmovilización. Mediante esta misma técnica se permitió clasificar a LipMatCCR11-
CLEAs en base a su tamaño de partícula y estructura como CLEAs tipo 2.
La comparación bioquímica y fiscoquímica de ambos métodos arrojó que la metodología

de agregados enzimáticos reticulados (CLEAs) es la más adecuada para mejorar la
estabilidad de la LipMatCCR11. Futuros estudios para la optimización de este método
deben considerar el uso de diferentes estrategias de precipitación, así como otros agentes
reticulantes.
78
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94
ANEXOS
Anexo 1
Curva de p-nitrofenol.
La concentración de p -nitrofenol de la muestra se calcula por medio de la interpolación en

la curva estándar.
95
Anexo 2
Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Reactivos:
Soluciones stock:
 Bis/acrilamida (30% T, 2.67% C): 146 g de acrilamida (29 g/ 100 ml), 4 g de NŃ-
metilen-bis-acrilamida (0.8 g/ 100 ml). Aforar a 500 ml con agua destilada y
almacenar a 4°C.
 Tris-HCl 1.5M, pH 8.8: Disolver 92 g Tris base con agua destilada. Ajustar a pH
8.8 con HCl 1N. Aforar a 500 ml con agua destilada y almacenar a 4°C.
 Tris-HCl 0.5M, pH 6.8: Disolver 12 g Tris base con agua destilada. Ajustar a pH
6.8 con HCl 1N. Aforar a 200 ml y almacenar a 4°C.
 SDS 10% (p/v): Disolver 10 g de SDS en agua destilada y aforar a 100 ml.
 Persulfato de amonio 10% (p/v): Disolver 100 mg de persulfato de amonio en 1 ml
de agua destilada. Esta solución debe prepararse al momento.
Amortiguador de carga 2x:
Agua destilada 3.0 ml

Tris-HCl 0.5M, pH 6.8 1.0 ml
Glicerol 1.6 ml
SDS 10% (p/v) 1.6 ml
β-mercaptoetanol 0.4 ml
Azul de Bromofenol 0.05%(p/v) en agua 0.4 ml
Amortiguador de corrida 5x:
Tris base 45 g
216
Glicina
g
SDS 15 g
96
Llevar a 3 L con agua destilada y almacenar a 4°C.
Preparación del gel de separación al 12% - Tris 0.375M, pH 8.8.

SDS 10% (p/v) 100 µl
Bis/acrilamida 4.4 ml
Sol. Persulfato de amonio 10% (p/v) 50 µl
TEMED 10 µl
Preparación del gel de empaquetamiento al 4% - Tris 0.125M, pH 6.8.

SDS 10% (p/v) 50 µl
Bis/acrilamida 488 µl
Sol. Persulfato de amonio 10% (p/v) 25 µl
TEMED 5 µl
97
Anexo 3
Procedimientos para la producción de los inmovilizados.
Para LipMatCCR11-CLEAs.
El proceso de elaboración de los agregados enzimáticos reticulados de la lipasa

recombinante LipMatCCR11 (LipMatCCR11-CLEAs) se llevó a cabo de la siguiente
manera:
1. El extracto enzimático de E.coli pET-3b-LipMatCCR11 se diluyó con

amortiguador CHES-NaOH ((ciclohexilamino) etanosulfónico) a pH 9 0.01M
con el fin de ajustar la concentración de proteína a 3.25 mg/ml.
2. A la anterior solución se le añadió la cantidad necesaria de Tritón X-100 para
asegurar una concentración final de 0.15% en la mezcla de reacción; de igual
forma, se agregó la cantidad necesaria de solución saturada de sulfato de amonio
para alcanzar el 40% de saturación final.
3. Inmediatamente, el proceso de reticulación se inició con la adición de un
volumen determinado de una solución acuosa de glutaraldehído al 25% para
alcanzar una concentración final de 40 mM.
4. La reacción se llevó a cabo a 20°C durante 7.5 h a 1000 rpm (Thermomixer),
una vez transcurrido el tiempo el tiempo de reacción, esta se detuvo por medio
de la adición de un volumen de amortiguador (pH 9, 0.01M) tal que la
concentración de saturación de sulfato de amonio no fuera superior al 15%.
5. La mezcla de reacción fue centrifugada a 9230g por 15 min a 4°C, los CLEAs
fueron separados de la fase soluble por decantación; y posterior a ello los
agregados se sometieron a tres lavados usando solución amortiguador pH 9
0.01M.
6. Se cuantificó el contenido de proteína en los sobrenadantes como se describe en
la sección 2.3.2 para posteriormente determinar la cantidad de proteína
entrecruzada total por medio de balances de masa.
98
7. Los LipMatCCR11-CLEAs recuperados fueron secados al vacío por 12 h
(liofilizados), se les determinó su actividad hidrolítica y, previo a su uso, fueron
almacenados a -4°C.
Para el LipMatCCR11-PP.
Pre-tratamiento de etanol:
Previo al proceso de inmovilización, el Accurel EP 100 (polipropileno poroso) se trató con

una solución de etanol: agua al 50%. El pre-tratamiento se llevó a cabo de la siguiente
manera; a 30 mg de Accurel EP 100 se le agregaron 200 μ l de solución de etanol al 50%,
se agito a 80 rpm durante 30 min, posteriormente se separó el polipropileno por medio de
filtración. El Accurel recuperado fue secado a 50°C durante 1 h, y hasta su uso se mantuvo
en un desecador al vacío.
El procedimiento por el cual se llevó a cabo la absorción de la LipMatCCR11 en Accurel

EP 100 se describe a continuación:
1. El extracto enzimático de E.coli pET-3b-LipMatCCR11 se diluyó en

amortiguador de fosfatos pH 6, 0.05M con el fin de alcanzar una concentración
de proteína de 2 mg/ml.
2. En un matraz Erlenmeyer de 25 ml, se pesaron 30 mg de Accurel EP 100 pre-
tratado al cual se le adicionó la mezcla buffer-extracto enzimático. El matraz se
tapó y sello con parafilm.
3. La reacción se llevó a cabo en un baño orbital a 25°C a 250 rpm durante 3 h,
transcurrido el tiempo de reacción, la mezcla se filtró y, ese primer filtrado se
reservó.
4. El LipMatCCR11-PP recuperado se sometió a tres lavados empleando
amortiguador pH 6, 0.05M; los cuales fueron recuperados.
5. A los lavados y el filtrado se les cuantifico la cantidad de proteína y actividad
enzimática como se describieron en las secciones 2.3.1 y 2.3.2, esto con el fin de
99
determinar la cantidad de proteína y actividad total absorbida por medio de un
balance de masa.
6. El LipMatCR11-PP fue secado al vacío en un desecador durante 18 h, se le
determinó su actividad hidrolítica y, previo a su uso, fueron almacenados a -
4°C.
100

TESIS Estudio Comparativo de La Inmovilización de La Lipasa Termoalcalófila

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TESIS Estudio Comparativo de La Inmovilización de La Lipasa Termoalcalófila

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Estudio comparativo de la inmovilización de la lipasa termoalcalófila

Tamara Amneris Semería Maitret

Dra. Ma. Guadalupe Sánchez Otero Dr. Jorge G. Domínguez Chávez

M.C. Giselle Lilian Badillo Zeferino

H. VERACRUZ, VER. Febrero – Julio 2017

Índice general ........................................................................................................................ii

Índice de cuadros .................................................................................................................vii

Índice de figuras ..................................................................................................................viii

1.1 Enzimas y biocatálisis…………………………………………………….................4

1.1.1 Limitaciones en el uso de los biocatalizadores …………………………………6

1.2 Extremófilos y sus extremoenzimas…………………………………………….….7

1.2.1 Importancia de las enzimas y extremoenzimas en la industria y

1.3.1 Estructura de las lipasas……...……….………………………………………..13

1.3.2 Mecanismo catalítico de las lipasas…………..………………………………..14

1.3.3 Reacciones catalizadas por lipasas…………………...…………….…………..16

1.3.4 Fuentes de lipasas……………………………………………………………....18

1.3.5 Lipasas de origen microbiano…………………………………….………..…..18

1.3.6 Aplicaciones de las lipasas en la industria y biotecnología……………….…...19

1.4.1 Generalidades sobre la inmovilización……………………………….……..…21

1.4.2 Métodos de inmovilización reversible……………………………….……..….24

1.4.2.1 Inmovilización por adsorción a soporte……………………………….........24

1.4.3 Métodos de inmovilización irreversible………………………………………..26

1.4.3.1 Entrecruzamiento – Cross-linking………………………………………..…26

1.4.3.2 Cristalización y reticulado de enzimas – Cross-linked enzymes crystals

1.4.3.3 Agregados enzimáticos reticulados – Cross-liked enzymes aggregates

1.5 Inmovilización de lipasas…………………………………………………………..31

1.6 Lipasas termoalcalófilas de Geobacillus thermoleovorans CCR11…………….…32

1.6.1 Lipasa nativa y recombinantes de Geobacillus thermoleovorans

1.6.2 Reacciones de síntesis catalizadas por LipMatCCR11…………………………33

1.6.3 Inmovilización de lipasa provenientes de Geobacillus thermoleovorans

II. Materiales y Métodos……………………………………………………………….37

2.1 Reactivos y cepas……………...………….……………………………………..…37

2.3 Técnicas analíticas………………………………………...……………………….37

2.3.1 Determinación de la actividad enzimática…………………..………………….37

2.3.2 Determinación de la concentración de proteína………………………….….….39

2.3.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida…………………………………….…39

2.4.1 Condiciones de inmovilización……………………………………………....…40

2.4.2 Evaluación de la inmovilización………………………………..........................41

2.5 Caracterización de los inmovilizados………………….……………...……………42

2.5.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados……………...42

2.5.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………….43

2.5.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados……..…………………..43

2.5.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados…………………….....43

2.5.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento…………………..44

2.5.6 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y la

2.5.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP…………………….44

2.6 Estabilidad química de la enzima en los inmovilizados …………………………...45

2.7 Análisis morfológico de los inmovilizados …………………………………....…..46

III. Resultados …………………………………….……………………………….47

3.2 Caracterización de los inmovilizados………………………………………….…...47

3.2.1 Efecto de la temperatura sobre los inmovilizados………………………….…...47

3.2.2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………....48

3.2.3 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados………………………....49

3.2.4 Efecto del pH sobre la estabilidad de los inmovilizados……………………….50

3.2.5 Estabilidad de los inmovilizados durante el almacenamiento…………………..51

3.2.6 Afinidad a sustratos de ésteres de p-nitrofenil de los inmovilizados y la

3.2.7 Reuso de los LipMatCCR11-CLEAs y LipMatCCR11-PP………………….....54

3.3 Estabilidad química de la enzima en los agregados ……………………………….55

3.4 Análisis morfológico de los inmovilizados ………………………………………..58

4.1 Evaluación de la inmovilización sobre la LipMatCCR11………………………….64

4.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los inmovilizados………………....65

4.3 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los inmovilizados…………..........66

4.4 Efecto del pH sobre la actividad de los inmovilizados……………………...…......67