Curso: Química Analítica

Práctica de laboratorio 12: Cromatografía

1. Propósito /Objetivo: Separar la mezcla de varios compuestos aplicando la técnica de

cromatografía.
2. Fundamento teórico:
La cromatografía es una técnica de separación en la que los componentes de una muestra se separan
en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil. El objetivo de la fase
estacionaria es retrasar el paso de los componentes de la muestra. Cuando los componentes pasan a
través del sistema a diferentes velocidades, estos se separan en determinados tiempos. Cada
componente tiene un tiempo de paso característico a través del sistema, llamado tiempo de retención.
La separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención del analito difiere del resto de
componentes de la muestra.
En la separación cromatográfica, la fase móvil (disolvente o eluyente), la fase fija y los
componentes de la mezcla que se está separando o analizando, interaccionan entre sí
constituyendo un sistema cromatográfico.

Cromatografía en columna
La cromatografía en columna es útil en la separación de una cantidad apreciable de mezclas de
sustancias y puede hacerse por adsorción, reparto o intercambio iónico. Es una técnica de
purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla.

En la cromatografía en columna se debe rellenar cuidadosamente una columna cromatográfica

(tubo de vidrio con una llave en el extremo inferior) con la fase fija.

Se deposita o siembra la muestra a separar (en solución) por la parte superior de la columna
y luego se va adicionando la fase móvil (proceso de elución). El eluyente tratará de arrastrar
las sustancias hacia abajo, mientras que la fase fija tratará de retenerlas. Según el equilibrio
adsorción desorción o según el coeficiente de solubilidad de cada compuesto, algunos
serán eluidos más rápidamente que otros, y los recibiremos primero.
El método de separación por cromatografía en columna consta de 3 etapas:
➢ Llenado de la columna.
➢ Sembrado de la muestra.
➢ Proceso de elución.
El llenado tiene por objeto preparar una columna uniformemente compacta, sin rajaduras ni
burbujas de aire. Puede hacerse de 2 maneras:
a. Suspender el adsorbente agitándolo con un solvente adecuado y verter poco a poco
esta suspensión. El adsorbente va sedimentando y formando una columna uniforme.
b. Añadir el adsorbente seco, en pequeñas porciones y dando golpes a la columna para
que el adsorbente se deposite en forma uniforme.
La cantidad de adsorbente y tamaño de la columna depende de la cantidad de muestra a
separar. Generalmente se requiere unos 20 a 30 g de adsorbente por cada gramo de
muestra, aunque en algunos casos puede necesitarse relaciones mucho mayores (1:100).
También es importante la relación entre diámetro de la columna y su altura. Si la columna
es demasiado corta, la distancia recorrida por la muestra no es suficiente para permitir una
separación adecuada.

3. Procedimiento experimental:
La muestra a separar por cromatografía en columna es una mezcla de azul de metileno
con anaranjado de metilo.
3.1 Preparación de la columna cromatográfica

3.1.1 Introducir un trozo de algodón hasta el fondo de la columna.

3.1.2 Adicionarle unos 10 mL de etanol a la columna que contiene el algodón en
el fondo de la columna.
3.1.3 Agregar una suspensión formada al agitar 5 g de silicagel en unos 10 mL de
etanol.
3.1.4 Abrir la llave de la columna hasta que la altura del solvente sea de 1 mm por
encima de la superficie del adsorbente.
3.1.5 Cerrar la llave.
3.2 Sembrado de la muestra problema
3.2.1 Depositar 1 mL de la mezcla de colorantes a separar (la mezcla está en
solución alcohólica).
3.2.2 Abrir la llave hasta que todo el colorante sea adsorbido por la fase fija.
3.3 Proceso de elución
3.3.1 Adicionar más etanol y observar que uno de los colorantes se desplaza más
que el otro.
3.3.2 Seguir agregando etanol hasta que se eluya este colorante.
3.3.3 Recolectar el primer colorante separado en un vaso de 50 mL.
3.3.4 Eluir el segundo colorante, de ser necesario puede cambiar el etanol por
agua acidulada para eluir este segundo colorante.
3.3.5 Recolectar el segundo colorante en otro vaso de 50 mL

4. Cuestionario
1. Según lo visto en la práctica de laboratorio ¿Cuál de los compuestos eluyó primero y
por qué?
2. ¿Es importante la longitud y diámetro de la columna en la separación de mezclas?
3. ¿Qué características debe tener la fase móvil para realizar una correcta separación
cromatográfica de una muestra desconocida?
4. Mencione 2 aplicaciones prácticas de la cromatografía en columna.