UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO FACULTAD DE QUMICA

ASIGNATURA: VIROLOGA PROFESOR: JONATHAN GUADALUPE SANTILLN ALUMNO: ALEJANDRO JAIR RUIZ MADRIGAL ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (HIV-1,2) PROTOCOLO
14 de Noviembre de 2010

INDICE MARCO TERICO ................................................................................................................. 3 Elisa tipo sndwich doble anticuerpo ............................................................................................. 3 ELISA tipo sndwich directo ........................................................................................................ 3 ELISA tipo sndwich indirecto ..................................................................................................... 4 Antigenos de HIV ........................................................................................................................... 4 Fase solida de ELISA ................................................................................................................... 4 Como se producen los antgenos recombinantes .................................................................... 5 ANTECEDENTES ................................................................................................................... 5 ORIGEN DEL HIV-1 ...................................................................................................................... 5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................................... 6 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................ 6 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 6 MATERIAL Y MTODOS ....................................................................................................... 7 Mtodo ................................................................................................................................... 7 Punto de corte ................................................................................................................................ 8 Interpretacin de resultados ........................................................................................................ 8 BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 8

MARCO TERICO
Elisa tipo sndwich doble anticuerpo
En la actualidad existen dos tipos de ELISA tipo sndwich o de captura (directo e indirecto). ELISA tipo sndwich directo

Se agrega una dilucin conocida de anticuerpo, despus de la incubacin se realiza un lavado para remover las el anticuerpo que no fue adherido, despus se agrega el antgeno diluido o un rango de antgenos diluidos junto con un buffer que previene la unin inespecfica de las protenas del suero a las partes plsticas o solidas de los pocillos, se realiza otro lavado donde se descartan los antgenos no unidos, el antgeno es detectado por un conjugado enzima-marcada anticuerpo especifico para el antgeno; el anticuerpo del conjugado puede ser el mismo utilizado para adherirse a la parte solida o producido por la misma especie del suero o por alguna especie diferente del suero que sea especifica para el antgeno del suero, se incuba y se lava el conjugado no unido se agrega el cromgeno y finalmente se para la reaccin y se lee por absorbancia. Nota: el antgeno debe de poseer dos epitopos capaces de unirse al anticuerpo para cumplir con la regla de captura. Elisa: Theory
and Practice Methods in Molecular Biology, 1997, Volume 42

ELISA tipo sndwich indirecto

En este ELISA la presencia de un segundo anticuerpo (de diferente especie) que puede ser detectado por un conjugado (antisuero especifico de especies) que no reacciona con el anticuerpo fijado a la fase solida. Elisa: Theory and Practice Methods in Molecular Biology, 1997, Volume 42

Antigenos de HIV Los antgenos para la prueba de ELISA de HIV-1,2 fueron obtenidos de antgenos recombinantes obtenidos de Escherichia coli (HIV1 gp41, 120 recombinante, HIV2 gp36 recombinante).
DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. BLOOD VIRUS SCREENING HIV 1,2 ELISA 23961 Craftsman Road, Suite D/E/F, Calabasas, CA 91302 Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383 (kit para ELISA).

Fase solida de ELISA Para el desarrollo de ELISA se han desarrollado varios componentes en los pocillos en los cuales los de mayor importancia son los de PVC (flexibles) y poliestireno (rgido) los cuales proveen mejoras en la adhesin de antgenos y anticuerpos asi como la lectura de los

resultados de este ensayo que se puede determinar por espectrofotmetro (se recomienda fondo plano) o por la simple observacin visual (fondo redondeado).

Como se producen los antgenos recombinantes En resumidas cuentas la produccin de Ag recombinantes se rige por los siguientes pasos: aislamiento de DNA de virus, fragmentacin de DNA por enzimas de restriccin (vector y DNA ajeno), combinacin de ambos para formar el rDNA, introducir rDNA a un husped (Escherichia coli) y monitoreo del husped buscando el fragmento especifico de DNA. Este proceso se lleva a cabo mediante equipos de induccin y de represin con triptfano y anlogos de triptfano (trp promoter) que inducen la expresin del gen de la protena gp36 (HIV2) y gp41, 120 (HIV1) por la represin del genes de las 5 enzimas encargadas de la biosntesis de triptfano, existen varios parmetros de confirmacin de la expresin de la induccin del rDNA como el sistema x-gal, la hibridacin nuclear y el escaneo inmunolgico (ELISA O RADIOINMUNOENSAYO). http://www.studentsguide.in/animal-biotechnology/gene-cloning/(todoslosarchivos).

ANTECEDENTES
Citado en la literatura hasta los aos 70s el inmunoensayo (EIA) fue desarrollado independientemente por Eva Engall y Peter Pearlman de la universidad de Suecia en Estocolmo y Bauke Van Weemen en Holanda que vino a sustituir al RIE (radioinmunoensayo) descrito por primera vez en los aos 60s por Solomon Berson y Rosalyn Yalow del hospital de veteranos de Nueva York y ganaron el premio nobel de medicina por el desarrollo de esta prueba.
Clinical Chemistry. 2005;51:2415-2418.) 2005 American Association for Clinical Chemistry, Inc. History Enzyme Immunoassay (EIA)/EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA). Rudolf M. Lequin

ORIGEN DEL HIV-1 Marilyn Importada de frica (juvenil), pas de origen desconocido. 1959. Utilizada como hembra lactante hasta su muerte a los 26 aos. Seropositiva para anticuerpos anti HIV en 1985. En 1985 muere al dar a luz a mellizos. HIV Liliana Martnez Peralta

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El VIH/SIDA es un problema epidemiolgico de inters mundial, en Mxico no parece ser relevante comparado con otras enfermedades sin embargo el seguimiento de este virus que afecta a la sociedad mexicana desde los ltimos 10 aos podemos observar que muestra una tasa de infeccin elevada aunque los la relacin de casos nuevos ha ido en deceso en los ltimos 3 aos y tambin se puede observar que el mayor numero de casos reportados data entre 2002 -2008 por lo que se considera un riesgo importante para la poblacin.

OBJETIVO GENERAL
Analizar y dar a conocer los principios bsicos de la prueba de ELISA.

OBJETIVOS
Conocer los antgenos que son detectados en la prueba de ELISA para VIH1 Y VIH2, Conocer la manera en que se producen los antgenos para esta prueba. Reafirmar los conocimientos sobre cada una de las etapas y reflexionar sobre el mejor mtodo para el anlisis de VIH mediante un ensayo inmunolgico.

MATERIAL Y MTODOS
Micro placas: tiras de micro pocillos blanco fijo en soporte de tiras de color blanco. La placa est sellado en la bolsa de aluminio con desecante. Cada pocillo contiene antgenos recombinantes VIH 1 / 2 (recombinantes del VIH-1 gp41, gp120, y recombinantes del VIH-2 gp36). Las tiras se pueden romper para ser utilizadas por separado. Control negativo: lquido de color amarillo lleno en un vial con tapn de rosca verde. Protenas estabilizado tampn probado ser no reactivos para no reactivos para el VIH 1 / 2, HBsAg, VHC y los anticuerpos TP. Control positivo-1: lquido de color rojo lleno en un vial con tapn de rosca amarillo. Protenas solucin estabilizada tampn dieron positivo para los anticuerpos de HIV-1 Control positivo-2: lquido de color rojo lleno en un vial con tapn de rosca rojo. Protenas solucin estabilizada tampn dieron positivo para los anticuerpos de VIH -2 Hrp-conjugado: lquido de color rojo en un frasco blanco con tapn de rosca rojo. Rbano conjugada con peroxidasa recombinante VIH 1 2 antgenos. Tampn de lavado: Lquido incoloro llena en una botella transparente con tapn de rosca blanco. PH 7.4, 20 PBS El concentrado debe ser diluido 1 a 20 con agua destilada / desionizada antes de su uso. Una vez diluida, estable durante una semana a temperatura ambiente. Cromgeno solucin a: Lquido incoloro llena en un frasco blanco con tapn de rosca verde. Solucin de perxido de urea. Cromgeno solucin b: Lquido incoloro llena en un vial de negro con una solucin de negro cap.TMB tornillo (tetrametilo bencidina disuelto en cido ctrico). Solucin de paro: Lquido incoloro de un frasco blanco con tapa amarilla. solucin diluida de cido sulfrico (H2SO4 2.0M).

Mtodo
Marcar controles negativos y positivos en los pocillos Aadir 100ul de suero y controles en los pocillos correspondientes. Incubar 30 minutos a 37C Primer lavado (5 veces) y dejar secar durante 60 segundos. Agregar 100ul del conjugado (peroxidasa de rabano picante con antgenos recombinantes HIV1, 2). Incubar 30 minutos a 37C

Segundo lavado Agregar 50ul de TMB y 50ul de perxido de urea e incubar 15 minutos a 37C Agregar 50ul de H2SO4 Leer absorbancia a 450nm si se utiliza un blanco o a 630nm si se cuenta con un espectrofotmetro dual. Punto de corte Se hace un promedio de los tres controles negativos y se suma la absorbancia del control negativo ms alto. Interpretacin de resultados Se divide la absorbancia de la muestra entre el punto de corte, resultado mayor a 1 positivo, menor a 1 negativo, entre 1.1 y 0.9 borde (requiere repetir anlisis).

BIBLIOGRAFA
1. Elisa: Theory and Practice Methods in Molecular Biology, 1997, Volume 42 2. DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. BLOOD VIRUS SCREENING HIV 1,2 ELISA 23961 Craftsman Road, Suite D/E/F, Calabasas, CA 91302 Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383 (kit para ELISA). 3. http://www.studentsguide.in/animal-biotechnology/gene-cloning/(todoslosarchivos). 4. Clinical Chemistry. 2005;51:2415-2418.) 2005 American Association for Clinical Chemistry, Inc. History Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Rudolf M. Lequin 5. HIV Liliana Martnez Peralta 6. Comit de Monitoreo y Evaluacin Boletn del Grupo de Informacin Sectorial en VIH/SIDA(Diciembre 2008)No. 6. 7. 25 aos de SIDA en Mxico Logros, desaciertos y retos Jos ngel Crdova Villalobos, Samuel Ponce de Len Rosales y Jos Luis Valdespino. 8. Panorama Epidemiolgico del VIH/SIDA e ITS en Mxico Consejo Nacional para la Prevencin y Control del VIH/SIDA 31 de diciembre del 2005.