UNIVERSIDAD JOSE FAUSTINO SANCHES

CARRION

TRABAJO DE INVESTIGACION: 5 ARTICULOS SOBRE TECNICAS QUIMICAS PARA

ANALISAR LA COMPOSICION ALIMENTARIA MARINA

ALUMNO: CRUZ TELLO JUAN CARLOS

CICLO: II

INGENIERO: OCROSMA DUEÑAS ROBERT WILLIAM

 II

DEDICATORIA

Dedico este trabajo a mis padres, quienes han sido mi inspiración y apoyo incondicional en cada

paso de mi educación. Su amor, paciencia y dedicación han sido fundamentales para mi

desarrollo académico y personal. Agradezco profundamente su constante aliento y sacrificio para

brindarme las mejores oportunidades. Este logro no habría sido posible sin su amor y guía.

También dedico este trabajo a INGENIERO, cuya sabiduría y dedicación han dejado una huella

indeleble en mi aprendizaje. A todos aquellos que han influido positivamente en mi camino

educativo, gracias por su apoyo y por creer en mí.

Finalmente, dedico este trabajo a mí mismo, por mi perseverancia, dedicación y esfuerzo en la

búsqueda constante del conocimiento. Este logro es el resultado de mi compromiso y

determinación.
 III

AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que han contribuido de

alguna manera en la realización de este trabajo.

En primer lugar, agradezco a mi familia por su inquebrantable apoyo y comprensión. Gracias por

estar siempre ahí, brindándome aliento y palabras de aliento en los momentos más difíciles. Su

amor y confianza en mí han sido mi mayor fortaleza.

Agradezco también a mis profesores y asesores, quienes me han guiado y brindado valiosos

conocimientos a lo largo de este proceso. Sus enseñanzas y retroalimentación han sido

fundamentales para mi crecimiento académico.

No puedo dejar de mencionar a mis amigos y compañeros de clase, quienes han compartido

conmigo risas, debates y horas de estudio. Gracias por el apoyo mutuo y por ser una fuente

constante de motivación.

Agradezco a todas las fuentes bibliográficas y materiales de investigación que he utilizado para

enriquecer mi trabajo. Sus contribuciones han sido fundamentales para respaldar mis argumentos

y ampliar mi comprensión sobre el tema.

Por último, quiero agradecer a aquellos que han dejado una huella en mi vida, pero que tal vez no

estén presentes físicamente. A aquellos autores, investigadores y figuras inspiradoras que han

influenciado mi pensamiento y han despertado mi pasión por el conocimiento.

 IV

INDICE
1. Capítulo I.................................................................................................................................7

2. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos: un enfoque

integrado combinado con la determinación de contaminantes elementales....................................7

2. Materiales y métodos...............................................................................................................8

2.1.1. Muestras, reactivos y materiales................................................................................8

2.2. Instrumentación..................................................................................................................10

2.3. Protocolo de resistencia de MPs al ácido........................................................................11

2.4. digestión de mariscos......................................................................................................12

2.5. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos.......................12

2.6. Determinación de los contaminantes elementales por ICP-OES e ICP-MS...................14

2.7. Seguro de calidad............................................................................................................15

3. Resultadosy discusión.........................................................................................................15

3.1. Evaluación del comportamiento de MP expuestas al protocolo de digestión ácida.......16

3.1.1. concentración de HNO3..............................................................................................16

3.....................................................................................................................................................17

3.1. 3.1.3. El tiempo de mantenimiento a la temperatura máxima de digestión....................19

4.....................................................................................................................................................22

5.....................................................................................................................................................27

6.....................................................................................................................................................27
 V

7.....................................................................................................................................................27

8.....................................................................................................................................................27

9.....................................................................................................................................................27

10. Capítulo II...........................................................................................................................28

11. Método multiresiduo para determinar productos de cuidado personal seleccionadosde

cinco clases de pescado basadas en dispersión en fase sólida de matriz miniaturizada y.............28

12. microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de

masas 28

2. Experimental.......................................................................................................................29

2.1. Productos químicos, reactivos, materiales y muestras....................................................29

...................................................................................................................................................30

Figura 1. Procedimiento optimizado para el método MSPD-SPME-GC-MS............................30

2.2. Instrumentación...............................................................................................................30

2.3. Microextracción en fase sólida (SPME).........................................................................32

2.4. Dispersión de matriz en fase sólida (MSPD)..................................................................32

2.5. Condiciones óptimas.......................................................................................................33

2.6. validación del método.....................................................................................................33

3. Resultados y discusión........................................................................................................34

3.1. Optimización del procedimiento SPME.........................................................................34

3.2. Optimización del procedimiento MSPD.........................................................................36

 VI

13. Caracterización del Perfil de Ciguatoxina en Muestras de Pescado del Oriente................40

14. Océano Atlántico usando cromatografía líquida capilar de alta resolución.......................40

15. espectrometría de masas.....................................................................................................40

16...................................................................................................................................................40

2. Materiales y métodos..........................................................................................................40

2.1. Materiales de referencia de normas.................................................................................40

2.2. Muestras..........................................................................................................................41

2.3. preparación de la muestra................................................................................................42

2.4. Análisis cLC-HRMS.......................................................................................................43

3. Resultados...........................................................................................................................44

2. Materiales y métodos..........................................................................................................49

2.1. Muestras, reactivos y materiales.....................................................................................49

2.3. Protocolo de resistencia de MPs al ácido........................................................................52

2.4. digestión de mariscos......................................................................................................53

2.5. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos.......................54

2.6. Determinación de los contaminantes elementales por ICP-OES e ICP-MS...................55

2.7. Seguro de calidad............................................................................................................56

3. Resultadosy discusión.........................................................................................................56

3.1. Evaluación del comportamiento de MP expuestas al protocolo de digestión ácida.......57

3.1.1. concentración de HNO3..............................................................................................57

 VII

Evaluación de la temperatura máxima del programa de calefacción.........................................59

3.1.3. El tiempo de mantenimiento a la temperatura máxima de digestión...........................60

3.1.4. Efecto del tamaño de los MP presentados a latratamiento ácido................................61

16.1. Eficiencia de la digestión de pescados y mariscos utilizando un programa de

calentamiento optimizado para la determinación de la cantidad de PM....................................63

16.2............................................................................................................................................63

17. CONCLUCIONES.............................................................................................................67

18. REFERENCIAS.................................................................................................................68
 7

1. Capítulo I

2. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos: un enfoque

integrado combinado con la determinación de contaminantes elementales

Se propone un método para la determinación del contenido de microplásticos (MP) en pescados

y mariscos basado en la digestión selectiva de pescados y mariscos sin la degradación de MP. Se

desarrolló un enfoque simple utilizando ácido diluido con digestión húmeda asistida por

microondas. Se evaluaron los siguientes parámetros: concentración de ácido nítrico (0,5 a 14,4

mol L−1), temperatura de digestión (180 a 220 °C), tiempo de mantenimiento del programa de

irradiación (10 a 30 min), tamaño de partícula MP (0,3 a 5 mm), y la masa de marisco (0,5 a 2 g).

Para desarrollar un método fiable para la determinación de la cantidad de MP, se añadieron hasta

2 g de una muestra de marisco in natura con una cantidad conocida de MP (100 mg de MP

mezclada). Las condiciones adecuadas se obtuvieron utilizando 1 mol L-1 HNO3 a 200 °C

(tiempo de mantenimiento de 10 min). Los digestos se filtraron y el contenido de plástico se

determinó gravimétricamente. El programa de calentamiento fue de 20 min, lo que representa

una reducción significativa en el tiempo normalmente reportado en la literatura para el análisis

de MP (desde unas pocas horas hasta 3 días). El método propuesto permitió la determinación

gravimétrica de ocho tipos de plásticos (tereftalato de polietileno, poliestireno, poliestireno

expandido, polipropileno, polietileno de alta y baja densidad, policarbonato y cloruro de

polivinilo) con tamaño de partícula ≥0,3 mm. Se digirieron eficientemente hasta 2 g de una

muestra de mariscos in natura (especies de tiburón, corvina acoupa, atún, trahira y camarón

rosado), lo que abrió la posibilidad de utilizar el método de digestión propuesto para la

determinación de contaminantes elementales (Al, As, Ca , Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, La, Mg, Mn,
 8

Mo, Ni, Pb y Zn). Así, como característica principal del método de digestión propuesto está la

posibilidad de determinar MP y contaminantes elementales utilizando el mismo protocolo de

digestión, ahorra tiempo y reactivos y proporciona información precisa y exacta sobre las

diferentes clases de contaminantes marinos (MP y contaminantes elementales).

2. Materiales y métodos

2.1.1. Muestras, reactivos y materiales

Para evaluar la degradación de MP al someterse a digestión ácida se utilizaron nueve muestras

plásticas: tereftalato de polietileno (PET), poliestireno (PS), poliestireno expandido (EPS),

polipropileno (PP), polietileno de alta densidad (HDPE), polietileno de baja densidad polietileno

(LDPE), policarbonato (PC), cloruro de polivinilo (PVC) y poliuretano (PU). Todos los plásticos

utilizados como MP se obtuvieron como productos nuevos en el mercado local. Las muestras de

plástico se cortaron manualmente para obtener un tamaño de partícula inferior a 5 mm.

Posteriormente, las MP se tamizaron en un tamizador (número de serie 8708, Bertel, Brasil) para

separar el tamaño de partícula entre 0,3 y 0,8 mm, 0,81 a 1,69 mm y 1,7 a 5 mm. Todas las

optimizaciones de digestión y separación de MP del músculo de pescado se realizaron con una

especie de tiburón Prionace glauca seleccionada como muestra modelo para el desarrollo del

método. El método optimizado se aplicó para la determinación de PM en camarón rosado

(Panaeus brasiliensis), corvina acoupa (Cynoscion acoupa), atún (Thunnus spp.) y trahira

(Hoplias malabaricus). Todos los músculos de pescado y los camarones se compraron en un

mercado local. Para todos los experimentos se utilizó la muestra in natura (tejido fresco). Para

evaluar la precisión del método de determinación de contaminantes elementales, se utilizó un

material de referencia certificado (CRM) de músculo de mielga (DORM-2).

 9

El agua se purificó en un sistema Milli-Q (Merck Millipore Corp., Bedford, EE. UU., 18,2

MΩ·cm) y se utilizó para la limpieza de materiales y para la preparación de todos los estándares,

soluciones y diluciones. Para la digestión de la muestra se utilizó ácido nítrico (65%, Merck,

Darmstadt, Alemania). Cuando se realizó la cuantificación de contaminantes elementales, el

ácido nítrico se destiló utilizando un sistema de sub-ebullición (DuoPur, Milestone, Sorisole,

Italia). Se utilizó hidróxido de potasio (Merck, Darmstadt, Alemania) para la digestión alcalina,

que se utilizó como método comparativo. Para la preparación de los estándares analíticos en

HNO3 al 5% se utilizó una solución madre de referencia multielemento (solución de calibración

PlasmaCal, 10 mg L−1, SCP33MS, SCP Science, Quebec, Canadá). Para la determinación de Hg

por generación química de vapor (CVG), se utilizó ácido clorhídrico (37%, Merck, Darmstadt,

Alemania) destilado en un sistema de sub-ebullición y tetrahidroborato de sodio (NaBH4,

Vetec). Los estándares analíticos para Hg se prepararon a partir de una solución madre de 1000

mg L−1 (Merck, Darmstadt, Alemania). Las soluciones de referencia de carbono utilizadas para

la determinación del carbono disuelto se prepararon mediante disolución de ácido cítrico (Merck)

en agua (25 a 500 mg L−1 de C). Se utilizó itrio (1,0 mg L-1, Spex CertPrep, Metuchen, Nueva

Jersey, EE. UU.) como estándar interno en todas las muestras, blancos y soluciones de referencia

para la determinación de carbono disuelto.

Para la filtración se utilizó un papel de filtro con un tamaño de poro inferior a 2 μm (Whatman

No. 589/3 Florham Park, MI). Antes de cualquier filtración, el papel filtro se lavó con agua para

eliminar cualquier partícula retenida y se secó a 105 °C durante 1 h en estufa (Nova Ética,

Vargem Grande Paulista, Brasil).

 10

La evaluación estadística se realizó mediante una prueba t (Statistica StatSoft Inc., versión 10)

con un nivel de confianza del 95 % para todas las comparaciones. Para el desarrollo del método,

se utilizó una cantidad conocida de MP en cada evaluación. Luego, se realizaron comparaciones

estadísticas entre la recuperación de cada experimento y la cantidad añadida (t-test) y entre las

recuperaciones (ANOVA) para todas las condiciones en un rango optimizado.

2.2. Instrumentación

Todos los procedimientos de digestión se realizaron en un sistema de cámara de reacción única

asistido por microondas (Ultrawave™, Milestone, Sorisole, Italia). Se colocó una gradilla de

quince recipientes (recipientes de vidrio desechables, 15 ml) en un revestimiento de

politetrafluoroetileno. La tapa se colocó en una cavidad de microondas (1 L), que se selló y

presurizó con 40 bar de Ar (99,996%, White Martins, São Paulo, Brasil) antes de la irradiación

con microondas. El sistema se configuró para operar a una potencia máxima de 1500 W, con una

temperatura y presión máximas de operación de 270 °C y 160 bar, respectivamente.

Se utilizaron un espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (Spectro

Cirus CCD, Spectro Analytical Instruments, Kleve, Alemania) y un espectrómetro de masas de

plasma acoplado inductivamente (NexION 300×, Perkin Elmer, Thornhil, EE. UU.) para la

determinación de contaminantes elementales. Los parámetros operativos para las mediciones

mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) y

espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) se muestran en la Tabla

1. El carbono disuelto se determinó a través de ICP-OES al monitorear la longitud de onda de

193.030 nm ( el itrio fue el patrón interno a 371,029 nm). El mercurio se determinó mediante la

generación de vapor químico junto con ICP-MS (CVG-ICP-MS). Para ello se utilizó un sistema
 11

de flujo-inyección (FI) casero, compuesto por una bomba peristáltica (Ismatech, Zurich, Suiza),

una válvula de inyección equipada con un loop de muestra de 100 μL y un separador gas-líquido

tipo U para gases. Se utilizaron soluciones de NaBH4 al 0,05 % m/v y HCl 1 mol L−1.

2.3. Protocolo de resistencia de MPs al ácido

Se evaluó la degradación de MPs sometidos al protocolo ácido paraconcentraciones de ácido

nítrico de 0,5 a 14,4 mol L−1 HNO3. Para ello, 100 mg de cada MP (sin tejido de pescado) se

sometieron a un procedimiento de digestión con 6 mL de solución de digestión. El recipiente de

digestión con MP y HNO3 se colocó en el sistema SRC (revestido con TFM, que contenía 130

mL de agua y 5 mL de HNO3) con la ayuda de una gradilla. A continuación, el sistema se selló y

presurizó con 40 bar de Ar. La temperatura de digestión se evaluó de 180 a 220 °C, con una

presión y potencia máxima de 160 bar y 1500 W, respectivamente. También se evaluó el tiempo

de calentamiento, variando de 10 a 30 min (tiempo de rampa de 10 min hasta temperatura

máxima).

Después de la digestión, las soluciones obtenidas se enfriarona temperatura ambiente y luego se

transfirió a matraces de polipropileno pasando por un papel de filtro para la retención y

separación de las MP. En este paso, se utilizó un sistema de vacío para aumentar la velocidad del

proceso de filtración. Después de la

filtración y retención de MP en el papel de filtro, el papel de filtro se secó a 120 °C durante 1 h

en un horno. El papel de filtro seco que contenía las MP se pesó con una balanza analítica

(modelo AY 220, 0,1 mg de resolución, Shimadzu, Kyoto, Japón). Se obtuvo una muestra en

blanco filtrando únicamente ácido nítrico en todas las concentraciones evaluadas para comprobar

una posible degradación del papel de filtro. El papel de filtro seco se pesó antes y después de la
 12

filtración. La recuperación de MP en todos los experimentos se calculó utilizando la ecuación.

(1).

Recuperaciónd%Þ ¼ Wa−Wb × 100 ð1Þ

donde “Wa” es el peso del papel de filtro seco después de la filtración, “Wb” es el peso del papel

de filtro seco antes de la filtración y “Wi” es el peso inicialpeso de los diputados.

2.4. digestión de mariscos

Evaluar la eficiencia del método propuesto para la degradación dedel material biológico, la

muestra de marisco se digirió selectivamente utilizando el método previamente optimizado para

el ahorro de MP (condición de mínima degradación de MP). Para ello, se añadieron de 0,5 a 2 g

de músculo de tiburón in natura (sin MPs) a cada recipiente de digestión, el cual se llenó con 6

mL de 1 mol L−1 HNO3. Después del programa de calentamiento (rampa de 10 min hasta 200

°C y 10 min de tiempo de mantenimiento a 200 °C), los productos de la digestión se transfirieron

a matraces volumétricos y se diluyeron con agua ultrapura hasta 25 ml para una determinación

adicional del carbono disuelto por ICP-OES, que se utilizó para evaluar la eficiencia de la

digestión.

2.5. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos

Se mezcló una cantidad conocida de MP con una muestra de tiburón in natura (llamada muestra

enriquecida) y se digirió usando HNO3 diluido. Para ello, a 2 g de una muestra in natura se les
 13

añadió 100 mg de una mezcla de ocho MP (PET, PS, EPS, PP, HDPE, LDPE, PC y PVC). Este

enfoque se realizó para evaluar la eficiencia del protocolo de separación (digestión de tejido de

mariscos seguida de filtración para separación MP). La muestra enriquecida se transfirió a un

recipiente de digestión con 6 ml de 1 mol L−1 HNO3 y se siguió el mismo protocolo

previamente optimizado para ahorrar MP (rampa de 10 min hasta 200 °C y 10 min de tiempo de

espera a 200 °C). ). Los extractos se transfirieron a matraces volumétricos y se filtraron usando

un sistema de vacío. Las MP retenidas en el papel filtro se pesaron para calcular la recuperación

de MP (según la Ec.(1)).

Para evaluar la aplicabilidad del método propuesto, se sometieron a un protocolo de digestión

optimizado tres especies de peces más (coupa, atún y trahira) y camarones. La eficiencia de la

digestión ácida se evaluó mediante la determinación de carbono disuelto en digestos a través de

ICP-OES. Además, todas las muestras de mariscos se enriquecieron con una mezcla de 100 mg

de MP y se sometieron al mismo protocolo optimizado. Después del programa de digestión, la

solución final se filtró al vacío para retener las MP y evaluar la eficiencia del protocolo

propuesto. Para la comparación de los resultados obtenidos por el método de digestión ácida

propuesto, un método de digestión alcalina, adaptado deKarami et al. (2017), también se llevó a

cabo. Para ello, se enriquecieron 5 g de músculo de tiburón in natura con una mezcla de 0,5 g de

MP (HDPE, LDPE, PET, PVC, PS y PP) y se transfirieron a un recipiente de polipropileno.

Como solución de digestión se utilizaron 60 mL de KOH al 10%, que estuvo en contacto con la

muestra de pescado enriquecida con MP a 40 °C durante 48 h. Después de la digestión, las

partículas de PM se filtraron al vacío y se secaron a 50 °C durante 5 h. El filtro seco

Se pesó el papel y se calculó la recuperación de MP utilizando la ecuación.1.

 14

2.6. Determinación de los contaminantes elementales por ICP-OES e ICP-MS

Teniendo en cuenta la ingestión de pescados y mariscos, que representaríauna fuente de

elementos tóxicos para los humanos (de los mariscos y los elementos adsorbidos en MP), las

soluciones digeridas obtenidas después de la

protocolo propuesto fueron evaluados para la determinación de con-contaminantes Por lo tanto,

los productos de digestión obtenidos de muestras de tiburones antes de la filtración se recogieron

en matraces volumétricos y se diluyeron hasta 25 ml con agua para una mayor determinación de

contaminantes elementales mediante ICP-OES e ICP-MS (Hg mediante CVG-ICP-MS).

Para evaluar la posibilidad de contaminantes elementales simultáneamente con la determinación

de MPs, se llevaron a cabo los siguientes procedimientos de preparación de muestras con el uso

de 6 mL de 1 mol L−1 HNO3 como solución de digestión:

i). digestión de músculo de tiburón in natura (sin MPs) utilizando 2 g de muestra y

ii). digestión de músculo de tiburón in natura (2 g) enriquecido con 100 mg de la mezcla de

MPs.

Estos pasos combinados (i y ii) permitieron determinar la cantidad de contaminantes elementales

presentes en la muestra de tiburón (paso “i”). Además, en el paso “ii”, fue posible estimar los

elementos de lixiviado de MP al aumentar la contaminación de la muestra de tiburón. Para

evaluar la precisión del procedimiento propuesto para la determinación de contaminantes

elementales, se utilizó un MRC de músculo de mielga (DORM-2).

 15

2.7. Seguro de calidad

La robustez del protocolo de preparación de muestras se evaluó tomandoen cuenta las

variaciones en los siguientes parámetros: relación MP/masa de pescados y mariscos (en %), masa

de la muestra, tiempo de retención de la irradiación, temperatura de digestión y concentración de

la solución ácida. La precisión intradía (repetibilidad) y la precisión interdía (precisión

intermedia) se estimaron con base en la desviación estándar relativa (RSD) analizando la

aplicación del protocolo propuesto a cada muestra de mariscos en tres días diferentes y con tres

análisis replicados. por día. La precisión del método propuesto se evaluó comparando el

protocolo propuesto con un método basado en digestión alcalina realizada de acuerdo con la

literatura previa, así como utilizando CRM de músculo de mielga (DORM-2).

3. Resultadosy discusión

Debido a la preocupación mundial por los riesgos que los MP pueden traer para la salud

ambiental y humana, se requiere el desarrollo de protocolos para determinar el contenido de MP

en el músculo de pescado. Aunque ya se han desarrollado varios métodos, la mayoría no son

factibles para la rutina del laboratorio porque, dado que suelen requerir largos tiempos de

pretratamiento, el uso de reactivos concentrados (normalmente HNO3 o HCl) para la

degradación total de la materia orgánica, o reactivos específicos y específicos. equipo costoso,

como SEM y Py-GC-MS (Schwaferts et al., 2019). Además, estos métodos pueden resultar en la

solubilización o degradación de MP, lo que lleva a resultados finales subestimados (Avio et al.,

2015).
 16

3.1. Evaluación del comportamiento de MP expuestas al protocolo de digestión ácida

Para cada MP, se evaluó el efecto del tratamiento con ácido (concentración de ácido,

temperatura, tiempo de calentamiento y tamaño de partícula de MP) sobre la recuperación de

MP. En este paso, cada MP se evaluó solo y fue posible seleccionar la condición más adecuada

para proporcionar una condición de digestión mínima o cualquier degradación de MP. Los

parámetros evaluados se describen en las siguientes secciones.

3.1.1. concentración de HNO3

Cabe mencionar que el papel filtro utilizado para la filtraciónno sufrió ninguna degradación

apreciable de la solución ácida. Se evaluó usando la solución ácida a temperatura ambiente, y el

proceso de filtración ocurre bastante rápido (menos de 5 s). Usando esta condición,

independientemente de la concentración de la solución ácida, no se observó un cambio

significativo en la masa del papel de filtro al pesarlo antes y después del contacto con la solución

ácida. Se supuso que este procedimiento no interfería en determinación de la cantidad de MP.

Además, la degradación de MP se evaluó utilizando diferentes concentraciones de HNO3. Como

se observa en elFigura 1a, al utilizar HNO3 concentrado (14,4 mol L−1) todos los MP evaluados

se disolvieron casi por completo (superiores al 80%). La única excepción fue el PVC, que

presentó una recuperación cercana al 60%. El PET se disolvió completamente usando 7 mol L−1

y HNO3 concentrado y permaneció como un precipitado blanco después del programa de

calentamiento. Este precipitado blanco condujo a una evaluación sobreestimada de la resistencia

del PET al tratamiento con ácido, y estas dos concentraciones de ácido no se consideraron para el
 17

PET. PU, por ejemplo, era muy propenso al ataque ácido. Se obtuvieron recuperaciones de todas

las concentraciones de HNO3 por debajo del 20% (masa del PU no disuelto), y este tipo de

plástico no se utilizó para experimentos posteriores. A pesar de PU, al considerar soluciones de

HNO3 más diluidas.

3.

Fig. 1.

Evaluación de los parámetros de mínima degradación de MPs por tratamiento MAWD-SRC y

determinación gravimétrica del contenido de MPs. A) Concentración de ácido nítrico; B)

 18

temperatura de digestión; C) Tiempo de mantenimiento a temperatura máxima. Condiciones: A)

180 °C como temperatura de digestión y tiempo de mantenimiento de 10 min;

B) 1 mol L−1 HNO3 como solución de digestión y tiempo de mantenimiento de 10 min; C) 1

mol L−1

HNO3 como solución de digestión y digestióntemperatura de 200 °C. La línea punteada

representa la recuperación del 100%. Las barras de error representan la desviación estándar (n =

3). Las letras sobre las columnas representan marcas de significancia, donde las condiciones con

la misma letra no tienen una diferencia significativa (ANOVA, 95% del nivel de confianza).

3.1.2. Evaluación de la temperatura máxima del programa de calefacción

Como se reporta en la literatura, cuando la temperatura de digestión es más alta, la oxidación de

la materia orgánica es más eficiente (Bizzi et al., 2017b). Por el contrario, considerando que las

MP deben recuperarse cuantitativamente, la temperatura utilizada en el protocolo propuesto debe

ser lo suficientemente baja para evitar cualquier posible degradación. Por lo tanto, al buscar un

protocolo para MP y determinar los contaminantes elementales en el tejido de pescado, se debe

encontrar una condición de compromiso de temperatura máxima para una mejor eficiencia de la

digestión sin degradación de MP.

En este sentido, se evaluaron 180, 200 y 220 °C (Figura 1b). PC y PVC no se degradaron incluso

cuando se sometieron a la temperatura más alta evaluada (220 °C). Para los demás MP, cuando el

programa de calentamiento se fijó a 200 °C, se obtuvieron recuperaciones cercanas al 100 %. La

excepción a este comportamiento fue el LDPE, que presentó baja resistencia a temperaturas más

altas. Para este PM, la recuperación se reduce gradualmente de 90, 70 y 50%, mientras que la

temperatura aumenta de 180, 200 y 220 °C, respectivamente. A pesar de la baja recuperación

obtenida para LDPE, aún ajustando la temperatura a 220 °C la recuperación de PET, PS, EPS,
 19

PP y HDPE fue cercana al 90%. Entre los ocho MP evaluados, es posible suponer que solo el

LDPE presentó un comportamiento que podría requerir el uso de temperaturas más bajas.

3.1. 3.1.3. El tiempo de mantenimiento a la temperatura máxima de digestión.

El tiempo de calentamiento es un parámetro crucial para lograr una mayor eficiencia de

digestión.deficiencia de materia orgánica. Un tiempo de calentamiento prolongado conduce a un

contacto más efectivo entre el agente oxidante y la materia orgánica (giancarlo et al., 2017). Sin

embargo, mientras que la eficiencia de la digestión del tejido de pescado es mejor con un tiempo

de irradiación prolongado, este enfoque podría aumentar la degradación de MP. Con el fin de

evaluar cómo se comportan los MP al aumentar el tiempo de calentamiento, los MP se

sometieron a tiempos de espera que aumentaron de 10 a 30 min (temperatura máxima establecida

en 200 °C, con un tiempo de rampa de 10 min).

Como se muestraenFigura 1c, PS, EPS, PP, HDPE, PC y PVC presentaron un comportamiento

similar que es resistente para todos los tiempos de permanencia evaluados, conrecuperaciones

superiores al 90%. El PET, por ejemplo, presentó una reducción significativa en su recuperación

cuando se expuso a un mayor tiempo de calentamiento (del 85 al 67% cuando el tiempo de

mantenimiento aumenta de 15 a 30 min, respectivamente). El LDPE, como era de esperar,

presentó recuperaciones que oscilaron entre el 70 y el 20 % cuando se incrementó el tiempo de

espera de 10 a 30 min, respectivamente.

Aunque un tiempo de espera de 30 min puede contribuir a una mejor eficiencia para la digestión

de los tejidos, se obtuvo una condición de compromiso para ahorrar MP con 10 min de tiempo de

espera a 200 °C usando 1 mol L−1 HNO3 (recuperacionesestaban cerca del 100%, excepto para

LDPE). Esta condición representa una reducción drástica en el tiempo mencionado en la

 20

literatura para la determinación de MP, el cual debería ser de hasta 72 h (Karami yal., 2017).

Ante la posibilidad de determinar el mayor número de MPs, con recuperaciones cercanas al

100% (excepto PEBD), se seleccionó el tiempo de espera de 10 min.

3.1.4. Efecto del tamaño de los MP presentados a latratamiento ácido

Dado que la definición MP considera una amplia gama de tamaños (partículas plásticas menores

a 5 mm), lo cual fue propuesto por la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica en 2008

(Arturo et al., 2009), se vuelve esencial evaluar cómo se comportarían partículas de diferentes

tamaños bajo tratamiento ácido a temperaturas relativamente más altas.

En este sentido, cada MP se separó en tres rangos de tamaño (0,3 a 0,8, 0,81 a 1,69 y 1,7 a 5

mm). Cada rango de tamaño se sometió al programa de calentamiento optimizado (rampa de 10

min hasta 200 °C, seguido de 10 min de mantenimiento a 200 °C) utilizando 1 mol L−1 HNO3.

Como es posible observar enFigura 2, todos los MP evaluados no sufrieron influencia del

tratamiento ácido propuesto, independientemente del rango de tamaño de MP (de 90 a 100 %

para PET, PS, EPS, PP, HDPE, PC y PVC, así como 70 % para PEBD). En base a este resultado,

el enfoque propuesto demostró ser factible para MP con un rango de tamaño tan bajo como 0,3

mm.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la evaluación sobre el comportamiento de cada

MP cuando se somete a condiciones de digestión de la muestra, es posible suponer que las

recuperaciones cuantitativas son posibles. La digestión ácida propuesta se optimizó utilizando 1

 21

mol L−1 HNO3 como solución de digestión, temperatura máxima de digestión de 200 °C, con un

tiempo de espera de 10 min (20 min de programa de calentamiento total), que es capaz de

obtener recuperaciones de aproximadamente 70% para LDPE y superior al 90% para PET, PS,

EPS, PP, HDPE, PC y PVC.

3.2. Eficiencia de la digestión de pescados y mariscos utilizando un programa de

calentamiento optimizado para la determinación de la cantidad de PM

Después de optimizar lacondiciones relacionadas con la digestión ácida (concentración de

HNO3, temperatura máxima y tiempo de retención, y tamaño de partícula de MP), así como

cómo afectan la recuperación de MP, se llevó a cabo la evaluación de la eficiencia del protocolo

optimizado. Aunque la mayoría de los protocolos para la digestión de mariscos tienden a utilizar

HNO3 concentrado (Duarte et al., 2009;Schmidt et al., 2013), con el fin de mantener la

integridad de los MP, se hace necesario el uso de ácido diluido para el desarrollo de este método.

El uso de HNO3 diluido se ha informado para digerir materia orgánica en varios informes

dedicados a la preparación de muestras para espectrometría atómica. La eficiencia del HNO3

diluido se puede mejorar utilizando oxígeno o peróxido de hidrógeno como reactivos auxiliares

(Bizzi et al., 2014, 2017a;González et al., 2009;Yopuka et al., 2017). A pesar de esto, el uso de

auxiliares no fue evaluado en el presente trabajo porque contribuiría a la degradación de MP.

Al mirar la literatura previa centrada en el aislamiento de MP con ni-

ácido trico,Naidoo et al. (2017)investigó su eficiencia para la digestión de peces juveniles y la

extracción de MP. La digestión completa se obtuvo usando 10 mL de HNO3 al 55% (aprox. 12

mol L-1) para 1 g de pescado entero bajo incubación durante la noche a temperatura ambiente (o
 22

3 g a 80 °C, en 30 min). Se informó que el nailon estaba totalmente degradado mientras que el

HDPE, PS, poliéster y PVC eran resistentes. Además, la evaluación de la degradación del tejido

de pescado para el aislamiento de MP usando HNO3 al 5 % (aprox. 0,7 mol L−1) y concentrado,

o HCl concentrado al 5 % (aprox. 0,7 mol L−1) a temperatura ambiente por 96 h fue realizado

porKarami et al. (2017).

4.

Fig. 2.

Evaluación del tamaño de partícula de las MP sometidas al pretratamiento MAWD-SRC y

determinación del contenido de MP por gravimetría. Condiciones: 1 mol L−1 HNO3 como

solución de digestión, temperatura de digestión de 200 °C y tiempo de mantenimiento de 10 min.

La línea punteada representa una recuperación del 100%. Las barras de error representan la

desviación estándar (n = 3). Las letras sobre las columnas representan marcas de significancia,

donde las condiciones con la misma letra no tienen una diferencia significativa (ANOVA, 95%

Aunque la digestión eficientese logró utilizando reactivos concentrados, el nylon sufrió altos

efectos destructivos causados por los ácidos. Cuando se usó ácido diluido (5%), los autores
 23

informaron una baja eficiencia de digestión, con las partículas sólidas restantes propensas a

bloquear la membrana del filtro, y esto hizo que el uso de ácidos diluidos no fuera factible.

Como ya se informó, el uso de reactivos diluidos tiende a requerir una temperatura de digestión

más alta. Esta es la razón principal por la que se optimizó una condición de compromiso entre

una temperatura de digestión más alta con una concentración de ácido más baja con el objetivo

de lograr una degradación insignificante de MP. Debido a la temperatura de digestión

relativamente alta utilizada en el protocolo propuesto (200 °C), el uso de ácido diluido para la

digestión de mariscos se convirtió en un enfoque factible. Luego, se digirieron de 0,5 a 2 g de

músculo de tiburón in natura usando 1 mol L−1 de HNO3, siguiendo exactamente el mismo

protocolo ya evaluado para ahorrar la cantidad de MPs presentes en la muestra. La eficiencia de

la digestión se evaluó determinando el carbono disuelto en los digestos finales. Como era de

esperar, el aumento en la masa de la muestra de pescado provocó un aumento en el carbono

disuelto (Higo.3), y la solución se vuelve gradualmente amarillenta. Sin embargo, incluso cuando

se utilizó una masa de muestra de hasta 2 g, no se observó un digesto final con partículas

suspendidas, lo que se confirmó visualmente después de un proceso de filtración.

Además, cuando la masa de la muestra es mayor, el límite de cuantificación (LOQ) tanto para los

contaminantes elementales como para los MP es menor. El LOQ utilizado para MP depende de

la capacidad de la balanza, calculada a partir de la masa mínima que se puede pesar en una

balanza analítica.Utilizando una masa de pescado de hasta 2 g, se puede obtener un LOQ de 0,5

% p/p de MP en el músculo del pescado utilizando una balanza analítica. Ya sea que se utilice

una balanza microanalítica, con un peso mínimo de 2 mg, el LOQ puede reducirse a solo 0,1 %

p/p de MP en tejido de pescado.

 24

Después de evaluar la eficiencia de la digestión utilizando 1 mol L−1 de HNO3, se digirió una

muestra de tiburón con púas para evaluar la eficiencia de la determinación de MP en el tejido. Se

realizó utilizando 2 g de músculo de tiburón in natura enriquecido con una mezcla de MP (PET,

PS, EPS, PP, HDPE, LDPE, PC y PVC). Como se observa enFig. 3, se obtuvieron

recuperaciones cercanas al 100%.El método de digestión propuesto demostró ser eficiente para

digerir hasta 2 g de músculo de tiburón in natura y se obtuvieron recuperaciones cuantitativas de

MP.

Para comprobar la precisión del método de preparación de muestras propuesto para la

determinación de MP, se realizó la adaptación del método alcalino (Karami et al., 2017) para

obtener valores de referencia. Para ello, se añadió a la muestra de tiburón una mezcla de seis MP

(HDPE, LDPE, PET, PVC, PS y PP) mezclándolos con la muestra. Se obtuvo una recuperación

del 99 ± 5%, similar a la obtenida por el método propuesto (96 ± 15%). A pesar de que ambos

protocolos (alcalino y ácido) presentaron recuperaciones cuantitativas para MP, el protocolo

propuesto tardó solo 20 min, mientras que el método alcalino necesitó 48 h. Además, el método

de digestión ácida demostró ser eficiente para oxidar

Fig. 3. Carbono disuelto (eje y izquierdo, línea

gris claro) con el aumento de la masa de

muestra de tiburón (eje x) y recuperaciones de

 25

3.3. Evaluación del método de preparación de muestras propuesto para la

determinación de contaminantes elementales

Los PM y los contaminantes elementales se clasifican comúnmente como dos clases diferentes

de contaminantes en el agua de mar. Debido a la gran área superficial de las MP, pueden

adsorber varios elementos (incluso elementos tóxicos, como As, Cd, Cr, Hg y Pb) y luego

liberarlos en organismos marinos, como los peces (es decir, bajo un pH apropiado). condición).

Por lo tanto, los peces pueden ser una fuente de contaminantes, contaminantes elementales y PM

para los humanos (Brennecke et al., 2016;Cole et al., 2011). Los residuos industriales y las

acciones antropogénicas (pinturas antiincrustantes, combustión de combustibles, etc.) son las

principales fuentes de contaminantes elementales en el medio marino (Deheyn y Latz, 2006). Ya

se ha demostrado que algunos elementos, como Al, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb y Zn,

pueden estar presentes o adsorbidos del medio acuático en PET, HDPE, LDPE, PP , PS y PVC

(Brennecke et al., 2016;Karbalaei et al., 2020;Rochman et al., 2014). También está bien

documentado que los peces pueden acumular especies tóxicas de As y Hg (Olmedo et al., 2013).

En vista de los riesgos de los contaminantes elementales para los organismos marinos y los seres

humanos, el método propuesto, optimizado para la determinación de MP, también se exploró

para la determinación elemental. Tal posibilidad solo se consideró porque los PM se

determinaron con precisión y la digestión del músculo de pescado fue eficiente.

La muestra de tiburón se digirió usando las condiciones optimizadas para

La determinación de MP y los contaminantes elementales (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, La,

Mg, Mn, Mo, Ni, Pb y Zn) se determinaron directamente mediante ICP-OES o ICP-MS, mientras

que el Hg se determinó por CVG-ICP-MS. Para evaluar el efecto promovido por la presencia de
 26

MPs, se evaluaron dos condiciones: i) digestión de muestra de tiburón in natura (libre de MPs);

y, ii) digestión de una muestra de tiburón in natura enriquecida con una mezcla de MP. Ambos

resultados se presentan enTabla 2.

Los niveles máximos de Cd, Pb y Hg en el músculo de pescado han sido establecidos por la

Unión Europea, de acuerdo con la CE No 1881/2006. Aunque los límites se establecieron según

la especie de pescado, el Cd, el Pb y el Hg son tolerados en concentraciones de hasta 0,05, 0,3 y

1,0 μg g−1, respectivamente. A pesar de los conocidos efectos nocivos del As, la Unión Europea

no ha establecido ningún límite. En Brasil,

1,0 μg g−1 es el nivel máximo considerado para el As (RDC n° 42, publicada por la Agencia

Nacional de Vigilancia Sanitaria - ANVISA), mientras que el Cd, el Pb y el Hg tienen los

mismos límites establecidos por la CE 1881/2006.

Teniendo en cuenta la muestra de pescadodigerido sin MP (Tabla 2), los resultados obtenidos

para Cd, Pb y Hg estaban por debajo de los niveles máximos establecidos (CE nº 1881/2006 y

RDC nº 42). Sin embargo, el valor obtenido para As es aproximadamente 10 veces mayor que el

Tabla 2 Resultados obtenidos para contaminantes elementales en tiburón y en tiburón mezclado

con 100 mg de una mezcla de MP (5 % p/p) después de la descomposición por MAWD-SRC y

posterior determinación por ICP-OES o ICP-MS. La digestión se realizó usando 2 g de músculo

de pescado, 1 mol L-1 HNO3 como solución de digestión y 10 min de tiempo de mantenimiento

a 200 °C (resultados en μg g-1, media ± desviación estándar, n = 3).

 27

5.

6.

Elementos Muestra de Muestra de tiburó n + MP Nivel má ximo (μg g−1 de tejido

tiburó n (5 % p/p) fresco)

Alabamaa <1.17 <1.17 –

Comob 12,5 ± 1,5 10,6 ± 1,7 1.0mi
Californiaa 37,3 ± 7,0 621 ± 108 –
Cdb <0.006 <0.006 0.05Delaware
Cob <0.005 <0.005 –
crb 0,535 ± 0,032 0,529 ± 0,077 –
cobreb <0.120 0,475 ± 0,026 –
Fea 0,815 ± 0,028 3,36 ± 0,05 –
HgC 0,828 ± 0,216 1,17 ± 0,12
1.0Delaware
Laa <0.039 <0.039 –

magnesio
a
265 ± 42 275 ± 49 –

Minnesot <0.040 0,159 ± 0,020 –

ab

Mesa <0.068 <0.068 –

Nib <0.085 <0.085 –

7.

8.

9.
 28

10. Capítulo II

11. Método multiresiduo para determinar productos de cuidado personal seleccionadosde

cinco clases de pescado basadas en dispersión en fase sólida de matriz

miniaturizada y

12. microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de

masas

Un método que presenta dispersión de matriz en fase sólida combinada con microextracción en

fase sólida acoplada a gas

Se desarrolló cromatografía-espectrometría de masas para determinar parabenos, almizcles,

antimicrobianos, filtros UV y un repelente de insectos en peces. La optimización y validación del

método se realizó en tilapia y salmón.

muestras Linealidad aceptable (R2> 0,97), precisión (desviaciones estándar relativas < 13 %) y

exactitud (recuperación > 80 %) a dos niveles de concentración para todos los analitos se

obtuvieron utilizando ambas matrices. Los límites de detección oscilaron entre 0,01 y

1,01mgramo gramo—1 (húmedo peso) para todo analitos excepto para metilo parabeno El

SPME

Se aplicó el formato de flecha para aumentar la sensibilidad del método y se obtuvieron límites

de detección más de diez veces inferiores a los alcanzados con el SPME tradicional. El método
 29

miniaturizado se puede aplicar a varias especies de peces, independientemente de su contenido

en lípidos, y representa una herramienta útil para el control de calidad y la seguridad alimentaria

2. Experimental

2.1. Productos químicos, reactivos, materiales y muestras

Los PCP estudiados y determinados en este trabajo incluyeron dos antimicrobianos, dos

almizcles, cuatro filtros UV, dos conservantes y un repelente de insectos. Los analitos N,N-

dietil-meta-toluamida (DEET, 98,5 %),

clorofeno (CP, >95 %), tonalida (TON, >97,0 %), metilparabeno

(MP, 100,0 %, patrón analítico), propilparabeno (PP, 100,0 %, patrón secundario farmacéutico),

oxibenzona (OXY, >97,5 %) y 3-(4-metilbencilideno)alcanfor (4-MBC, >98,0 %) se adquirieron

de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los analitos triclosán (TCS,

>98,0 %), octocrileno (OCT, >98,0 %), 4-(dimetilamino) benzoato de 2-etilhexilo (EHPABA,

>98,0 %) y galaxolida (GAL, 50 % en ftalato de dietilo) de Tokyo Chemical Industry (TCI ,

Chuo-

ku, Tokio, Japón). Los patrones internos (IS) de antraceno (ANT, 99 %) y benz[a]antraceno

(B[a]A, 99 %) también se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Se prepararon soluciones madre

individuales de los analitos y los IS.

en acetonitrilo (ACN, > 99,9 %, Sigma-Aldrich) a una concentraciónde 2000 mg L—1.

Soluciones intermedias que contienen todos los analitos

se prepararon en acetonitrilo por dilución de las soluciones madre individuales. Las soluciones

de trabajo se prepararon agregando cantidades adecuadas de las soluciones intermedias a la

 30

muestra o al agua ultrapura, según el experimento. Todas las soluciones se almacenaron en viales

de vidrio a 4 ◦C y se cubrieron para protegerlos de la luz.

Se obtuvo agua ultrapura (resistividad de 18,2 MΩ⋅cm) de un sistema de purificación de agua

Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). El cloruro de sodio (NaCl, ≥99,5 %) se adquirió de

Fisher Scientific (FairLawn, Nueva Jersey, EE.

Figura 1. Procedimiento optimizado para el método MSPD-SPME-GC-MS.

2.2. Instrumentación
 31

Los análisis se llevaron a cabo utilizando un sistema GC 7890B equipado con

Detector MS 5977A (cuadrupolo simple) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.).

Una columna capilar Rtx-5 ms (30 m × 0,25 mm I.

D. Se utilizó un espesor de película de 25 μm) de Restek (Bellefonte, PA, EE. UU.)

para la separación de analitos. Se utilizó helio ultrapuro como gas portador a un caudal de 1 mL

min—1. La entrada se operó en modo splitless durante 1 min con una temperatura de 270 ◦C. Se

utilizó el siguiente programa de temperatura del horno para separar los analitos: temperatura

inicial de 120 ◦C durante 1 min, luego se aumentó la temperatura a 10 ◦C min—1 a 300 ◦C, y se

mantuvo durante 5 min. La línea de transferencia del GC al MS se mantuvo a 280 ◦C. El MS se

hizo funcionar en modo de ionización electrónica (EI) a 70 eV. Las temperaturas de la fuente de

iones y del cuadrupolo fueron de 230 ◦C y 150 ◦C, respectivamente. Los datos fueron adquiridos

en monitoreo de iones simples (SIM)

modo. Para la identificación del analito se consideraron los siguientes tres parámetros de

identificación: el tiempo de retención, la presencia de tres iones característicos de cada analito y

su relación. Los iones monitoreados para cada analito y los estándares internos fueron los

siguientes (ion cuantificador en negrita): MP 93, 121, 152 m/z; DEET 91, 119, 190m/z; PP 121,

138, 180;

ANT (ES) 76, 152, 178 m/z; GAL y TON 159, 213, 243, 258 m/z; PC

140, 183, 218 m/z; OXY 77, 151, 228 m/z; 4-MBC 105, 128, 254 m/z;

TCS 146, 218, 288m/z; EHPABA 148, 165, 277 m/z; B[a]A (ES) 114,

226, 228m/z; y OCT 204, 249, 360 m/z. Todos los datos se adquirieron utilizando el software

Mass Hunter Workstation de la versión de Agilent Technologies

 32

B.07.00. Para fines cuantitativos, se empleó el área del pico del ion cuantificador.Tabla

S2delInformación suplementariamuestra los tiempos de retención para cada analito.

2.3. Microextracción en fase sólida (SPME)

Para la optimización del método SPME, los analitos se agregaron en agua a 100 ng mL—1. Los

siguientes parámetros fueron evaluados usando un

enfoque de un factor a la vez: tipo de fibra (PA, CAR/PDMS, DVB/CAR/PDMS, PDMS/DVB y

PEG), solvente orgánico (2, 5, 9 % ACN, v/v) , fuerza iónica (0, 10, 18 % NaCl, p/v),

temperatura (25, 35, 45,

55 ◦C), tiempo de extracción (15, 30, 45, 60 min), y desorción del inyector

temperatura (250 y 270 ◦C). Se fijaron otros parámetros, incluido el uso del modo de inmersión

directa, el volumen de muestra diluida (15 ml) y la velocidad de agitación (1000 rpm). Se

seleccionó el modo de inmersión directa porque la mayoría de los analitos eran de volatilidad

baja a media y polaridad alta a media (Tabla S1). Todos los experimentos fueron realizados por

triplicado.

2.4. Dispersión de matriz en fase sólida (MSPD)

Para optimizar el método MSPD, se usaron muestras de pescado enriquecidas con 500 µg g—1 y

los extractos se analizaron con las condiciones óptimas del método SPME-GC-MS, a menos que

se especifique lo contrario. Los siguientes parámetros se evaluaron usando un enfoque de un

factor a la vez: tipo de sorbente dispersante (Discovery® DSC C18 y Bondesil PPL), relación

muestra-sorbente (1:2, 1:4, 1:6 , 1:8, 1:10), limpieza (EMR-lípido, EMR-lípido EMR lípido

pulido, EMR-lípido como co-columna), disolvente de elución (ACN, ACN-agua 80:20, 85:15 y

proporciones 90:10 (v/v)) y volumen de elución (1,

 33

2, 3, 4 y 5 ml). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

2.5. Condiciones óptimas

Las condiciones óptimas para MSPD fueron las siguientes: 25 mg de músculo liofilizado y 150

mg de adsorbente Bondesil PPL se mezclaron en un mortero de ágata hasta obtener una mezcla

homogénea. Luego, la mezcla se colocó en un cartucho de polipropileno de 6 ml que contenía

300 mg de Bond Elut EMR-lipid como co-columna y sorbente de limpieza.

Los analitos se eluyeron del cartucho con 3 ml de acetonitrilo-agua

90:10 (v/v).

Las condiciones óptimas para SPME fueron las siguientes: 1 mL de MSPD

2.6. validación del método

Una vez que se optimizó el método MSPD-SPME-GC-MS, se evaluaron los parámetros

analíticos, incluidos los efectos de matriz, la exactitud, la precisión (repetibilidad), la linealidad,

el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) para la tilapia y el salmón. Los

efectos de la matriz fueron evaluados por

comparar las proporciones de área promedio de los estándares que contienen todos los analitos

enel solvente puro a 56 ng mL—1 y los estándares emparejados con la matriz a 56 ng

ml—1 (equivalente a 100mgramo g-1) para el dos muestras, con cada estándarpreparándose por

triplicado. La exactitud y la precisión fueron evaluadas por

 34

analizando muestras en blanco enriquecidas en cuatro niveles de concentración de 5, 10, 100 y

300 μg g—1. Para cada concentración se realizaron tres repeticiones y

se calcularon las recuperaciones y las desviaciones estándar relativas (RSD)

para cada nivel. El LOD y el LOQ se determinaron con una relación señal/ruido (S/N) de 3 y 10,

respectivamente, usando estándares emparejados por matriz

(tilapia y salmón) preparados por duplicado de 0,05 a 150 ng mL—1. La linealidad del método

se evaluó con estándares emparejados por matriz

(tilapia y salmón) a cinco niveles de concentración para MP (150, 200, 300, 400 y 500 μg g—1)

y siete niveles de concentración (10, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 μg g—1 ) para los analitos

restantes. Para cada con nivel de concentración, se hicieron tres repeticiones. Se calcularon el

coeficiente de determinación (R2), la pendiente y la intercepción Y de las curvas de calibración.

3. Resultados y discusión

3.1. Optimización del procedimiento SPME

Para la optimización del método SPME, que se utilizó para analizar laExtractos MSPD (Figura

1), se estudiaron los siguientes parámetros más influyentes: tipo de fibra, contenido de solvente

orgánico, fuerza iónica, temperatura de extracción, tiempo de extracción y temperatura de

desorción. Se fijaron otros parámetros, incluidos el volumen de muestra y la velocidad de

agitación. El volumen de la muestra se fijó en 15 ml para garantizar una preconcentración

adecuada por parte de la fibra SPME. Además, se empleó el modo de inmersión directa con una

alta velocidad de agitación (1000 rpm). La transferencia de masa de los analitos de la muestra a
 35

la fase de extracción está limitada por la difusión de los analitos a través de la capa estática que

rodea la fibra, denominada límite de Prandtl. El espesor de la capa límite depende en gran

medida del grado de agitación; por lo tanto, las altas velocidades de agitación acortan el tiempo

de equilibrio (Pawliszyn, 2012).

El principal desafío del método SPME fue extraer los once PCP simultáneamente a pesar de sus

diferentes estructuras químicas y su amplia gama de propiedades fisicoquímicas (Tabla S1). Por

este motivo, se realizó el cribado de las fibras SPME comerciales con varios revestimientos

absorbentes y polaridades, incluidos PA, CAR/PDMS, DVB/CAR/PDMS, PDMS/DVB y PEG.

La fibra PDMS es generalmente preferible para analitos hidrofóbicos, mientras que las fibras PA

y PEG son para compuestos más polares (Kataoka et al., 2000).Figura S1muestra la extracción

Figura 2. Perfiles de tiempo de extracción obtenidos por el método SPME-GC-MS utilizando

una fibra PDMS/DVB(n3). Condiciones experimentales: 15 mL de agua conteniendo los

 36

analitos a 100 ng mL—1, ACN 5 % (v/v), NaCl 10 % (p/v), temperatura de extracción 35◦C, tasa

de agitación 1000 rpm.

3.2. Optimización del procedimiento MSPD

Entre los principales inconvenientes de la determinación cromatográfica de contaminantes

orgánicos en el pescado se encuentra que los lípidos se extraen comúnmente junto con los

analitos y pueden contaminar el sistema GC-MS. Se sabe que los lípidos empeoran la forma de

los picos cromatográficos, acortan la vida útil de las columnas capilares y contaminan la fuente

de iones MS. Los métodos informados en la literatura generalmente se desarrollan para un tipo

específico de matriz debido a la variabilidad en el contenido de lípidos del pescado. Por esta

razón, el método MSPD presentado en este estudio para la extracción de analitos del músculo de

pescado (Figura 1) fue optimizado considerando su aplicación a una amplia gama de matrices de

peces. Se seleccionaron tilapia y salmón porque su contenido lipídico era de aproximadamente 4

% y 40 % (p/p), respectivamente (Tabla S3). Las condiciones de MSPD se optimizaron

utilizando acetonitrilo como disolvente de elución debido a su baja afinidad por los lípidos

(Negreira et al., 2013). Se estudiaron los siguientes cuatro parámetros en la extracción MSPD:

tipo de sorbente dispersante, relación muestra-sorbente, limpieza y volumen de elución.

La selección del sorbente es de suma importancia ya que es una de las variables que controlan la

selectividad del proceso MSPD. Se espera que la composición química y las características del

sorbente sólido y la fase ligada afecten la retención y elución de los analitos. La fase ligada actúa

como un solvente que disuelve y dispersa los componentes de la muestra sobre la superficie del

sorbente en función de sus polaridades relativas, logrando así la disrupción completa de la

muestra. Como ejemplo del sorbente C18, los componentes de la matriz hidrofóbica se dispersan
 37

dentro de la fase unida orgánica no polar, con moléculas polares capaces de formar enlaces de

hidrógeno (como el agua) que se asocian con los silanoles libres de la partícula de sílice y la

distribución de moléculas más grandes a través la superficie de la estructura multifásica (Barker,

2000; Barker, 2007). La mayoría de las aplicaciones de MSPD emplean sorbentes a base de

sílice, como C18 y sorbentes inorgánicos (sílice, florisil y alúmina), pero los sorbentes

poliméricos se han estudiado poco (Capriotti et al., 2010). Por esta razón, en este trabajo se

probaron el sorbente a base de sílice Discovery® DSC C18 y el sorbente polimérico Bondesil

PPL. Para seleccionar el sorbente óptimo, se dispersaron 50 mg de muestra de tilapia con 200 mg

de sorbente (Discovery® DSC C18 o Bondesil PPL) y se eluyeron con 5 mL de acetonitrilo. Se

inyectó un microlitro del extracto en el sistema GC-MS. Los cromatogramas obtenidos en modo

de barrido para los extractos de MSPD usando los sorbentes C18 y Bondesil PPL se muestran

enFigura S6. Se detectaron picos de tres compuestos de matriz desconocidos en ambos extractos.

Sin embargo, la altura de los picos fue dos veces mayor (indicando una mayor concentración) en

el extracto C18 que en el Bondesil PPL. Además, de 18 min a 18,5 min, se detectaron dos picos

adicionales de componentes de matriz desconocidos solo en el cromatograma del extracto C18.

Sobre la base de los resultados, se seleccionó el adsorbente polimérico Bondesil PPL para

estudios de optimización posteriores, ya que se coextrajeron menos componentes de la matriz

con los analitos. Esto puede deberse a la composición química del sorbente Bondesil PPL, que

consta de un polímero de estireno divinilbenceno funcionalizado patentado que, a diferencia del

sorbente C18 a base de sílice, proporciona selectividad química para compuestos hidrofóbicos

aromáticos y ciertos compuestos polares como los fenoles (Li et al., 2016).

La proporción de muestra a sorbente es importante porque expone la superficie de la muestra al

solvente durante el paso de elución (Figura 1). Para la mayoría de los estudios, las proporciones
 38

de muestra a sorbente varían de 1: 1 a 1: 4, pero también se han aplicado proporciones más altas

según la aplicación (Capriotti et al., 2010). Se probaron varias proporciones de muestra a

sorbente para tilapia y salmón (Tabla S4). Como se muestra enFigura S7, la dilución de extractos

de tilapia con agua obtenida para proporciones de 1:2 y 1:4 resultó en una solución no

homogénea, mientras que la proporción de 1:6 proporcionó una solución transparente. Por otro

lado, la dilución de los extractos de salmón con todas las proporciones estudiadas resultó en una

solución no homogénea con presencia de un sólido blanco, como se muestra enFigura S8. Se

seleccionó la relación 1:6 para experimentos posteriores porque no se observó ninguna mejora

adicional cuando se aumentó la relación.

Un paso de limpieza con un sorbente apropiado para eliminar

analito linealidada Precisió n (% de recuperació n) Precisió n (repetibilidad, RSD %)

¡ Concentració n(mgramo
Concentració n(mgramogramo
¡
1, seco peso)C gramo 1, seco peso)C

Pendiente SEb Intersecci SEb R2 5 10 100 300 5 10 100 300

ón Y
DEE 6.77⋅10-6 5.78⋅10-7 3.57⋅10-4 1.92⋅10-4 0.984 – – 108.63 99.91 – – 5.20 8.71
T MP 1.12⋅10-4 3.36⋅10-6 1.81⋅10-3 9.45⋅10-4 0.993 – 98.36 85.79 86.54 – 9.31 10.02 10.92

PÁGINAS 1.84⋅10-4 3.90⋅10-6 —5.61⋅10- 1.10⋅10-3 0.999 – 99.74 88.09 93.90 – 4.67 5.77 9.65
GAL 1.49⋅10-3 4.50⋅10-5 4 1.27⋅10-2 98.22 9.81
1.41⋅10-3 3.96⋅10-5 1.11⋅10- 0.988 98.94 87.08 80.44 10.20 5.76 3.25
ÓN 4.07⋅10-2 2 0.987 95.86 98.22 89.61 80.31 11.82 4.36 5.89 2.69
DE 3.92⋅10-2
TON
ELA
DA
PC 3.27⋅10- 7.83⋅10-5 2.48⋅10-2 2.20⋅10-2 0.996 96.54 96.91 88.95 83.39 8.02 2.49 2.83 7.85
3
OXY 4.90⋅10- 2.00⋅10-4 7.44⋅10-2 5.63⋅10-2 0.991 92.47 92.59 91.17 85.24 10.06 7.14 3.17 5.44
3
4-MBC 1.53⋅10- 5.29⋅10-5 4.03⋅10-2 1.49⋅10-2 0.985 93.69 94.81 92.22 81.26 9.45 3.21 3.30 4.96
3
TCS 1.71⋅10 7.44⋅10-5 3.61⋅10-2 2.09⋅10-2 0.980 97.43 92.19 92.70 84.49 7.38 5.22 6.42 5.39
-3
EHPABA 1.08⋅10- 3.77⋅10-4 1.82⋅10-1 1.06⋅10-1 0.987 94.29 93.87 85.98 80.11 8.55 6.67 8.60 2.59
2
OCT 4.38⋅10- 2.03⋅10-5 8.39⋅10-3 5.70⋅10-3 0.972 – 98.55 87.59 89.17 – 10.56 12.04 6.36
4

Tabla 2
 39

Resultados de validación del método MSPD-SPME-GC-MS para muestras de salmón (n = 3).

compuestos de matrizera necesario obtener un extracto diluido transparente apto para DI-SPME.

Por lo general, la limpieza del extracto de MSPD se realiza con extracción en fase sólida (SPE)

(Capriotti et al., 2010). Para evaluar el paso de limpieza, se seleccionó el adsorbente de lípidos

EMR porque se demostró previamente que elimina los lípidos de manera selectiva y eficiente en

la extracción QuEChERS de hidrocarburos aromáticos policíclicos (Urban & Lesueur, 2017) y

compuestos fenólicos (Yin et al., 2022) del salmón. Los tres enfoques siguientes se probaron

como limpieza:

(1) SPE dispersivo (d-SPE) con 200 mg de absorbente de lípidos EMR, (2) d-SPE con 200 mg de

absorbente de lípidos EMR seguido de d-SPE con 200 mg de pulidor de lípidos EMR (un post

paso de d-SPE que mejora la eliminación de agua y residuos sólidos del extracto de la muestra),

y (3) 300 mg de absorbente de lípidos EMR como una co-columna empaquetada en el fondo del

mismo cartucho que el material MSPD. Se seleccionó el uso de sorbente de lípidos EMR como

co-columna ya que se encontró que produce extractos diluidos transparentes para las matrices de

tilapia y salmón. Sin embargo, el cromatograma de barrido obtenido para tilapia después de

SPME reveló que los lípidos aún se extraían conjuntamente (Figura S9). Para abordar esto, se

realizaron dos modificaciones del método en experimentos posteriores. En primer lugar, se

redujo la cantidad de muestra manteniendo una proporción de muestra a sorbente de 1:6 (25 mg

de muestra por 150 mg de sorbente PPL). En segundo lugar, se redujo la fuerza del disolvente de

elución para mejorar el rendimiento del absorbente de lípidos EMR,

ya que es muy recomendable realizar la extracción con disolvente orgánico-agua 80:20 (v/v) para

una eliminación óptima de la matriz (Agilenttecnología- nologías, 2017).

 40

Capítulo III

13. Caracterización del Perfil de Ciguatoxina en Muestras de Pescado del Oriente

14. Océano Atlántico usando cromatografía líquida capilar de alta resolución

15. espectrometría de masas

16.

La intoxicación por ciguatera es un riesgo emergente en el Océano Atlántico oriental. A pesar de

los esfuerzos de caracterización, aún se desconoce el perfil completo de las especies químicas de

ciguatoxina en estas aguas. Estos esfuerzos se han visto complicados por la falta de materiales de

referencia y la escasez de pescado contaminado con altos niveles de ciguatoxinas. El desarrollo y

la aplicación de métodos analíticos con selectividad y sensibilidad mejoradas son esenciales para

la caracterización de la ciguatoxina. Aquí, desarrollamos un enfoque de caracterización analítica

utilizando cromatografía líquida capilar acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

aplicada a materiales de referencia obtenidos de pescado contaminado con ciguatoxina. La

espectrometría de masas acoplada por LC capilar dio como resultado una mayor sensibilidad que

condujo a la confirmación de C-CTX1 como la principal ciguatoxina presente en estas muestras.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales de referencia de normas

El estándar C-CTX1 puro (20 ng), caracterizado por RMN, fue proporcionado amablemente por

el Dr. Robert W. Dickey (anteriormente FDA de EE. UU.) (Crouch et al., 1995).
 41

Los materiales de referencia purificados (RM) de C-CTX1 utilizados en este trabajo para la

caracterización completa fueron preparados previamente porCastro et al. (2022) bajo el proyecto

EuroCigua (GP/EFSA/AFSCO/2015/03). Cada RM purificado constaba de cuatro fracciones que

presentaban actividad similar a la CTX en el ensayo de citotoxicidad de la célula de

neuroblastoma 2a (N2a) y se obtuvieron a partir del fraccionamiento por HPLC de un extracto de

pescado tóxico. RM1 se obtuvo de unmedregal (Seriola sp.) de Tenerife (Islas Canarias, España).

RM2 se obtuvo de un pargo cubera (Lutjanus cyanopterus) de Fuerteventura (Islas Canarias,

España). RM3 se obtuvo de un pez boba barrado (Bodianus scrofa) de las islas Selvagen

(archipiélago de Madeira, Portugal). RM4 se obtuvo de un mero oscuro (Epinephelus

marginatus) de Lanzarote (Islas Canarias, España).

2.2. Muestras

Las muestras de pescado (n = 5) consistieron en una porción cruda de carne de pescado y se

mantuvieron

–20◦C hasta extracción y purificación(Mesa S1). Pez muestras eran

capturadas en Canarias (España) y obtenidas a través del proyecto EuroCigua

(GP/EFSA/AFSCO/2015/03). La caracterización inicial de estas muestras se realizó en el marco

del proyecto Euro-Cigua mediante LC-MS/MS detectando C-CTX1 y sospechando el

presencia de análogos adicionales (Gago-Martínez et al., 2021). Pez

las especies incluyeron serviola (Seriola sp.) (S1, S2, S3 y S3́), y mero oscuro (Epinephelus

marginatus) (E1 y E2). Muestra de pescado (S3) un

El medregal (Seriola sp.) capturado en las Islas Canarias (España) estuvo involucrado en un caso

de PC en 2019. Se cocinó una muestra S3 para evaluar la

 42

la estabilidad de los CTX y la muestra cocinada se denominó S3́.

2.3. preparación de la muestra

El pretratamiento de la muestra se realizó como se describe enEstévez et al. (2019a), con

modificaciones. Brevemente, la carne de pescado (10 g) se extrajo con acetona (2 x 30 mL)

usando un Ultra-Turrax® (Ika) durante 2 min a 9000 rpm. Los extractos de acetona se

combinaron y evaporaron hasta un residuo acuoso. El residuo acuoso se extrajo con éter dietílico

(2x 10 ml). La capa orgánica se evaporó hasta obtener un residuo sólido, que se disolvió en

metanol al 80 % (10 ml) y se desengrasó con n-hexano (2x 10 ml). La capa acuosa de metanol se

evaporó hasta obtener un residuo sólido bajo una corriente ligera de gas nitrógeno y la

purificación se realizó utilizando un Florisil SPE siguiendo las condiciones descritas en

K.Murata y Yasu- moto, (2019). El residuo sólido de la extracción se disolvió en hexano/acetona

(4:1, v/v) (2 mL) y se cargó en un cartucho Florisil SPE (500 mg, J. Baker) previamente

acondicionado con hexano/acetona (4:1 , v/v) (3 ml). El cartucho se lavó con hexano/acetona

(4:1, v/v) (3 ml) y los CTX se eluyeron con acetona/metanol (9:1, v/v) (3 ml). La fracción que

contenía las CTX se evaporó a sequedad, se reconstituyó en metanol (1 mL) y se filtró a través

de un filtro de PVDF de 0,22 μm.

(Jeringuilla Conductor filtrar Unidad, Millex®-CV 0.22mmetro, 13 mm, Milliporo) previo

al análisis cLC-HRMS (1 ml equivale a 10 g de carne de pescado).

La estabilidad térmica de los C-CTX se evaluó cocinando la muestra S3

(10 g a 100 ◦C, 20 min). El S3 cocido se denominó S3́ y se extrajo y purificó como se describe

anteriormente.
 43

2.4. Análisis cLC-HRMS

Los análisis de cLC-HRMS se realizaron con un nano Acquity Ultra Performance LC (Waters)

acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Q Exactive Plus equipado con una fuente de

ionización por aspersión fácil (Thermo Scientific, EE. UU.). La separación cromatográfica se

realizó mediante una columna PepMap RSLC C18 (3 μm, 100 Å, 75 μm x 15 cm, Thermo

Scientific, Lituania) fijado en 45 ◦C. La fase móvil consistía en agua (A)

y acetonitrilo (B), ambos con un 0,1 % de ácido fórmico. El gradiente utilizado fue: 50 % B

durante 18 min, aumentando a 95 % B a los 42 min, manteniendo durante 6 min y volviendo a 50

% B a los 51 min equilibrando la columna durante 4 min antes de la siguiente inyección. El

caudal fue de 0,6 μL/min y el volumen de inyección de 2 μL.

El espectrómetro de masas funcionó en modo de adquisición dependiente de datos de MS

completo (Full MS-ddMS2) para identificación y cuantificación de compuestos, y modo de

monitoreo de reacción en paralelo (PRM) para análisis estructural.

aclaración y confirmación. Los parámetros completos de MS en el modo Full MS-ddMS2

fueron: resolución de masa de 140 000 (a m/z 200), ion objetivo

cuente el control automático de ganancia (AGC) de 3 x 106, tiempo máximo de inyección de

iones

(IT) 100 ms, voltaje de lente s de 90 V, voltaje ESI de 4,0 kV, temperatura capilartemperatura de

340 ◦C, y el rango de masas se estableció de m/z 1000 a 1200. Los parámetros de ddMS2 en Full

MS-ddMS2 fueron: resolución de masa de 17 500 (a m/z 200), AGC de 5 x 104, ion máximo TI

120 ms, aislamiento

 44

ventana de m/z 4, primera masa fija de m/z 50, energía de colisión normalizada (NCE) de 20 y

40, objetivo de AGC mínimo 2 x 103 y umbral de intensidad 1,7 x 104. La lista de exclusión se

desactivó y los análisis

se llevaron a cabo sin bloqueo de masa. El modo PRM operó con una resolución de masa de 35

000 (a m/z 200), un AGC de 2 x 105, un máximo de iones IT de 200 ms, una ventana de

aislamiento de m/z 4, una primera masa fija de m/z 50 y

Se utilizaron diferentes NCE con fines de elucidación estructural 10, 15, 20 y 40. El límite de

detección LOD (S/N 3) y la cuantificación LOQ (S/N 10) se determinaron con el método de

datos de regresión de mínimos cuadrados ordinarios (Sanagi et al., 2009; Frasco y Jardy, 1999).

El LOD y LOQ se calcularon como tres y diez veces la desviación estándar de la y-

intersecciones sobre la pendiente de la curva de calibración y fueron 0,2 y 0,6 ng/mL,

respectivamente.

2.5. Metoxilación de C-CTX

La metoxilación de C-CTX se evaluó según lo descrito porEstévez et al. (2020a). Brevemente,

las soluciones metanólicas (100 µL) que contenían el C-CTX de interés se acidificaron con un

exceso de ácido fórmico (10 µL), se agitaron (30 s) y se analizaron mediante cLC-HRMS/MS

para evaluar la posible transformación en su derivados metoxilados y para confirmar la

estructura de su anillo-N.

3. Resultados

3.1. Caracterización de C-CTX1 por cLC-HRMS

 45

El estándar puro de C-CTX1 (20 ng/mL) se analizó mediante el método cLC-HRMS en MS

scan-ddMS2 completo, así como en el modo PRM. Se detectó un pico correspondiente a C-

CTX1 eluyendo en la columna capilar en

RT=25,8 min con un patrón de iones MS1 característico de los compuestos de poliéter cíclicos

(Cifra 1A). A prominente primero pérdida de agua [M+H–H2O]+, más dos pérdidas de agua

adicionales ([M+H–2H2O]+, y [M+H–3H2O]+), con

la detección de la molécula protonada de C-CTX1 [M+H]+ y amonio

Los iones de aducto [M NH4]+, sodio [M Na]+ y potasio [MK]+ confirmaron la detección de C-

CTX1 (Figura 1A.1).

Se obtuvo una gran cantidad de fragmentos después de los experimentos PRM, y la

nomenclatura propuesta porKriuchkov et al. (2020)se siguió para identificar los iones del

fragmento CTX (Figura 2). Las letras (p, q y s) indican el enlace que está roto, el número se

refiere al número de anillos contenidos en el fragmento (anillos parciales o intactos), y

el símbolo primo ()́ se usa para indicar el final de la molécula (fragmento

iones hacia el anillo N). Se utilizaron letras adicionales (r y f) para representar fragmentaciones

que no están incluidas en la nomenclatura anterior. La fragmentación de las CTX a menudo

implica la escisión de un enlace CC y uno o dos enlaces CO; estos iones de producto a menudo

experimentan pérdidas de agua y también iones 2H debido al cambio de hidrógeno. La

observación de iones 2H a partir del desplazamiento de hidrógeno en el análisis de C-CTX se

detectó por primera vez medianteKriuchkov et al. (2020)Sin embargo, la fragmentación

mecanismo sigue siendo desconocido.

 46

C-CTX1 se caracterizó estructuralmente seleccionando su ion prominente m/ z 1123.6200 [MH–

H2O]+ como ion precursor y realizando experimentos PRM a diferentes energías de colisión

(CE) (Figura 2). PRM de C-

CTX1 enCE bajo (CE15) mostró hasta seis pérdidas de agua [MH–nH2O]+, y fragmentos de

iones que van desde m/z 700 a 1000 la mayoría de ellos.

Figura 1. A) Estándar de C-CTX1 (20 ng/ml) detectado en un tiempo de retención de 25,76 min

y trazas de 56-metoxi-C-CTX1 detectadas en un tiempo de retención de 28,53 min. A.1)

Espectros de masas que muestran los iones moleculares y pseudomoleculares de C-CTX1 y sus

respectivos Δppm. B) 17-hidroxi-C-CTX1 (supuesto C-CTX-1157) detectado en RM1 en un

tiempo de retención de 23,50 min y trazas de 17-hidroxi-56-metoxi-C-CTX1 detectadas en un

tiempo de retención de 25,72 min B .1) Espectros de masas que muestran los iones moleculares

y pseudomoleculares de 17-hidroxi-C-CTX1 y sus respectivos Δppm. C) C-CTX3/4 (supuesto C-

 47

CTX-1143a/b) detectado en RM3 en un tiempo de retención de 23,21 min y 23,51 min,

respectivamente. C.1) Espectros de masas que muestran los iones moleculares y

pseudomoleculares de C-CTX3/4 y sus respectivos Δppm.

Figura 2. Vías de fragmentación propuestas para C-CTX1 y asignación basada en los fragmentos

detectados después de los experimentos de PRM seleccionando C-CTX1 m/z 1123,6200 [M+H–H2O]+

comoión precursor. Las regiones de masa m/z 50-440 ym/z 440-980 se expanden aproximadamente 2 y 6

veces en el eje vertical, respectivamente. El

La nomenclatura utilizada para la identificación de los iones MS/MS fue propuesta por (Kriuchkov et al.,

2020), y se resume en la parte superior derecha de la figura. La letra (p, q y s) indica el enlace que está
 48

roto, el número es el número de anillos contenidos en el fragmento (ya sea un fragmento de anillo o el

anillo intacto) y el primo

El símbolo ()́ se utiliza para indicar el final de la molécula. Se utilizaron letras adicionales (r y f) para

representar fragmentaciones no incluidas en la nomenclatura anterior.

Capítulo IV

Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos: un enfoque

integrado combinado con la determinación de contaminantes elementales

Se propone un método para la determinación del contenido de microplásticos (MP) en pescados

y mariscos basado en la digestión selectiva de pescados y mariscos sin la degradación de MP. Se

desarrolló un enfoque simple utilizando ácido diluido con digestión húmeda asistida por

microondas. Se evaluaron los siguientes parámetros: concentración de ácido nítrico (0.5 a

14,4 mol L−1), temperatura de digestión (180 a 220 °C), tiempo de mantenimiento del programa

de irradiación (10 a 30 min), tamaño de partícula MP (0,3 a 5 mm) y la masa del marisco (0,5 a 2

g) . Desarrollar un método confiable para la determinación decantidad de MP, se añadieron hasta

2 g de una muestra de marisco in natura con una cantidad conocida de MP (100 mg de MP

mixto). Las condiciones adecuadas se obtuvieron utilizando 1 mol L-1 HNO3 a 200 °C (tiempo

de mantenimiento de 10 min). Los digestos se filtraron y el contenido de plástico se determinó

gravimétricamente. El programa de calentamiento fue de 20 min, lo que representa una

reducción significativa en el tiempo normalmente reportado en la literatura para el análisis de

MP (desde pocas horas hasta 3 días). El método propuesto permitió la determinación

gravimétrica de ocho tipos de plásticos (tereftalato de polietileno, poliestireno, poliestireno

 49

expandido, polipropileno, polietileno de alta y baja densidad, policarbonato y policloruro de

vinilo) con tamaño de partícula ≥0,3 mm. Se digirieron eficientemente hasta 2 g de una muestra

de marisco in natura (especies de tiburón, pez débil acoupa, atún, trahira y gamba rosada), lo que

abrió la posibilidad de utilizar el método de digestión propuesto para la determinación de

contaminantes elementales (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, La, Mg, Mn, Mo, Ni, Pb y Zn).

Así, como principal característica del método de digestión propuesto está la posibilidad de

determinar MP y contaminantes elementales utilizando el mismo protocolo de digestión, ahorra

tiempo y reactivos y proporciona información precisa y exacta sobre las diferentes clases de

contaminantes marinos (MP y contaminantes elementales).

2. Materiales y métodos

2.1. Muestras, reactivos y materiales

Para evaluar la degradación de MP al someterse a digestión ácida se utilizaron nueve muestras

plásticas: tereftalato de polietileno (PET), poliestireno (PS), poliestireno expandido (EPS),

polipropileno (PP), polietileno de alta densidad (HDPE), polietileno de baja densidad polietileno

(LDPE), policarbonato (PC), cloruro de polivinilo (PVC) y poliuretano (PU). Todos los plásticos

utilizados como MP se obtuvieron como productos nuevos en el mercado local. Las muestras de

plástico se cortaron manualmente para obtener un tamaño de partícula inferior a 5 mm.

Posteriormente, las MP se tamizaron en un tamizador (número de serie 8708, Bertel, Brasil) para

separar el tamaño de partícula entre 0,3 y

0,8 mm, 0,81 a 1,69 mm y 1,7 a 5 mm. Todas las optimizaciones de la digestión.y la separación

MP del músculo de pescado se realizaron con una especie de tiburón Prionace glauca
 50

seleccionada como muestra modelo para el desarrollo del método. El método optimizado se

aplicó para la determinación de PM en camarón rosado (Panaeus brasiliensis), corvina acoupa

(Cynoscion acoupa), atún (Thunnus spp.) y trahira (Hoplias malabaricus). Todos los músculos de

pescado y los camarones se compraron en un mercado local. Para todos los experimentos se

utilizó la muestra in natura (tejido fresco). Para evaluar la precisión del método de determinación

de contaminantes elementales, se utilizó un material de referencia certificado (CRM) de músculo

de mielga (DORM-2). El agua se purificó en un sistema Milli-Q (Merck Millipore Corp.,

Bedford, EE. UU., 18,2 MΩ·cm) y se utilizó para la limpieza de materiales y para la preparación

de todos los estándares, soluciones y diluciones. Para la digestión de la muestra, Se utilizó ácido

nítrico (65%, Merck, Darmstadt, Alemania). Cuando se realizó la cuantificación de

contaminantes elementales, el ácido nítrico se destiló utilizando un sistema de sub-ebullición

(DuoPur, Milestone, Sorisole, Italia). Se utilizó hidróxido de potasio (Merck, Darmstadt,

Alemania) para la digestión alcalina, que se utilizó como método comparativo. Para la

preparación de los estándares analíticos en HNO3 al 5% se utilizó una solución madre de

referencia multielemento (solución de calibración PlasmaCal, 10 mg L−1, SCP33MS, SCP

Science, Quebec, Canadá). Para la determinación de Hg por generación química de vapor

(CVG), se utilizó ácido clorhídrico (37%, Merck, Darmstadt, Alemania) destilado en un sistema

de sub-ebullición y tetrahidroborato de sodio (NaBH4, Vetec). Los estándares analíticos para Hg

se prepararon a partir de una solución madre de 1000 mg L−1 (Merck, Darmstadt, Alemania).

Las soluciones de referencia de carbono utilizadas para la determinación de carbono disuelto se

prepararon mediante disolución de ácido cítrico (Merck) en agua (25 a 500 mg L−1 de C). Se

utilizó itrio (1,0 mg L−1, Spex CertPrep, Metuchen, Nueva Jersey, EE. UU.) como estándar

interno en todas las muestras, blancos y soluciones de referencia para el carbono disuelto.
 51

determinación.

Para la filtración se utilizó un papel de filtro con un tamaño de poro inferior a 2 μm (Whatman

No. 589/3 Florham Park, MI). Antes de cualquier filtración, el papel filtro se lavó con agua para

eliminar cualquier partícula retenida y se secó a 105 °C durante 1 h en estufa (Nova Ética,

Vargem Grande Paulista, Brasil).

La evaluación estadística se realizó mediante una prueba t (Statistica StatSoft Inc., versión 10)

con un nivel de confianza del 95% para todas las comparaciones. Para el desarrollo del método,

se utilizó una cantidad conocida de MP en cada evaluación. Luego, se realizaron comparaciones

estadísticas entre la recuperación de cada experimento y la cantidad añadida (t-test) y entre las

recuperaciones (ANOVA) para todas las condiciones en un rango optimizado.

2.2 Instrumentación

Todos los procedimientos de digestión se realizaron en un sistema de cámara de reacción única

asistido por microondas (Ultrawave™, Milestone, Sorisole, Italia). Se colocó una gradilla de

quince recipientes (recipientes de vidrio desechables, 15 ml) en un revestimiento de

politetrafluoroetileno. La tapa se colocó en una cavidad de microondas (1 L), que se selló y

presurizó con 40 bar de Ar (99,996%, White Martins, São Paulo, Brasil) antes de la irradiación

con microondas. El sistema fue configurado para operar a una potencia máxima de 1500 W, con

una temperatura y presión máximas de funcionamiento de 270 °C y 160 bar, respectivamente.

Se utilizaron un espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (Spectro

Cirus CCD, Spectro Analytical Instruments, Kleve, Alemania) y un espectrómetro de masas de

 52

plasma acoplado inductivamente (NexION 300×, Perkin Elmer, Thornhil, EE. UU.) para la

determinación de contaminantes elementales. Los parámetros operativos para mediciones

mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) y

espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) se muestran entabla 1. El

carbono disuelto se determinó a través de ICP-OES al monitorear la longitud de onda de 193,030

nm (el itrio fue el estándar interno a 371,029 nm). El mercurio se determinó mediante la

generación de vapor químico junto con ICP-MS (CVG-ICP-MS). Para ello se utilizó un sistema

de inyección de flujo (FI) casero, compuesto por una bomba peristáltica (Ismatech, Zurich,

Suiza), una válvula de inyección equipada con un loop de muestra de 100 μL y un separador gas-

líquido tipo U para gases. Se utilizaron soluciones de NaBH4 al 0,05 % m/v y HCl 1 mol L−1.

2.3. Protocolo de resistencia de MPs al ácido

Se evaluó la degradación de MPs sometidos al protocolo ácido paraconcentraciones de ácido

nítrico de 0,5 a 14,4 mol L−1 HNO3. Para ello, 100 mg de cada MP (sin tejido de pescado) se

sometieron a un procedimiento de digestión con 6 mL de solución de digestión. El recipiente de

digestión con MP y HNO3 se colocó en el sistema SRC (revestido con TFM, que contenía 130

mL de agua y 5 mL de HNO3) con la ayuda de una gradilla. A continuación, el sistema se selló y

presurizó con 40 bar de Ar. La temperatura de digestión se evaluó de 180 a 220 °C, con una

presión y potencia máxima de 160 bar y 1500 W, respectivamente. También se evaluó el tiempo

de calentamiento, variando de 10 a 30 min (tiempo de rampa de 10 min hasta temperatura

máxima).
 53

Después de la digestión, las soluciones obtenidas se enfriarona temperatura ambiente y luego se

transfirió a matraces de polipropileno pasando por un papel de filtro para la retención y

separación de las MP. En este paso, se utilizó un sistema de vacío para aumentar la velocidad del

proceso de filtración. Después de la filtración y retención de MP en el papel de filtro, el papel de

filtro se secó a 120 °C durante 1 h en un horno. El papel de filtro seco que contenía las MP se

pesó con una balanza analítica (modelo AY 220, 0,1 mg de resolución, Shimadzu, Kyoto, Japón).

Se obtuvo una muestra en blanco filtrando únicamente ácido nítrico en todas las concentraciones

evaluadas para comprobar una posible degradación del papel de filtro. El papel de filtro seco se

pesó antes y después de la filtración. La recuperación de MP en todos los experimentos se

calculó utilizando la ecuación.(1).

Recuperaciónd%Þ ¼ Wa−Wb ×100 ð1Þ

donde “Wa” es el peso del papel de filtro seco después de la filtración, “Wb” es el peso del papel

de filtro seco antes de la filtración y “Wi” es el peso inicialpeso de los diputados.

2.4. digestión de mariscos

Evaluar la eficiencia del método propuesto para la degradación dedel material biológico, la

muestra de marisco se digirió selectivamente utilizando el método previamente optimizado para

el ahorro de MP (condición de mínima degradación de MP). Para ello, se añadieron de 0,5 a 2 g

de músculo de tiburón in natura (sin MPs) a cada recipiente de digestión, el cual se llenó con 6

mL de 1 mol L−1 HNO3. Después del programa de calentamiento (rampa de 10 min hasta 200

°C y 10 min de tiempo de mantenimiento a 200 °C), los productos de la digestión se transfirieron

a matraces volumétricos y se diluyeron con agua ultrapura hasta 25 ml para una determinación
 54

adicional del carbono disuelto por ICP-OES, que se utilizó para evaluar la eficiencia de la

digestión.

2.5. Determinación del contenido de microplásticos en pescados y mariscos

Se mezcló una cantidad conocida de MP con una muestra de tiburón in natura (llamada muestra

enriquecida) y se digirió usando HNO3 diluido. Para ello, a 2 g de una muestra in natura se les

añadió 100 mg de una mezcla de ocho MP (PET, PS, EPS, PP, HDPE, LDPE, PC y PVC). Este

enfoque se realizó para evaluar la eficiencia del protocolo de separación (digestión de tejido de

mariscos seguida de filtración para separación MP). La muestra enriquecida se transfirió a un

recipiente de digestión con 6 mL de 1 mol L−1 HNO3 y siguió el mismo protocolo previamente

optimizado para ahorrar MP (rampa de 10 min hasta 200 °C y 10 min de tiempo de espera a 200

°C). ). Los extractos se transfirieron a matraces volumétricos y se filtraron usando un sistema de

vacío. Las MP retenidas en el papel filtro se pesaron para calcular la recuperación de MP (según

la Ec.(1)).

Para evaluar la aplicabilidad del método propuesto, se sometieron a un protocolo de digestión

optimizado tres especies de peces más (coupa, atún y trahira) y camarones. La eficiencia de la

digestión ácida se evaluó mediante la determinación de carbono disuelto en digestos a través de

ICP-OES. Además, todas las muestras de mariscos se enriquecieron con una mezcla de 100 mg

de MP y se sometieron al mismo protocolo optimizado. Después del programa de digestión, la

solución final se filtró al vacío para retener las MP y evaluar la eficiencia del protocolo

propuesto. Para la comparación de los resultados obtenidos por el método de digestión ácida

propuesto, un método de digestión alcalina, adaptado deKarami et al. (2017), también se llevó a
 55

cabo. Para ello, se enriquecieron 5 g de músculo de tiburón in natura con una mezcla de 0,5 g de

MP (HDPE, LDPE, PET, PVC, PS y PP) y se transfirieron a un recipiente de polipropileno.

Como solución de digestión se utilizaron 60 mL de KOH al 10%, que estuvo en contacto con la

muestra de pescado enriquecida con MP a 40 °C durante 48 h. Después de la digestión, las

partículas de PM se filtraron al vacío y se secaron a 50 °C durante 5 h. El filtro seco

Se pesó el papel y se calculó la recuperación de MP utilizando la ecuación.1.

2.6. Determinación de los contaminantes elementales por ICP-OES e ICP-MS

Teniendo en cuenta la ingestión de pescados y mariscos, que representaríauna fuente de

elementos tóxicos para los humanos (de los mariscos y los elementos adsorbidos en MP), las

soluciones digeridas obtenidas después de la

protocolo propuesto fueron evaluados para la determinación de con-contaminantes Por lo tanto,

los productos de digestión obtenidos de muestras de tiburones antes de la filtración se recogieron

en matraces volumétricos y se diluyeron hasta 25 ml con agua para una mayor determinación de

contaminantes elementales mediante ICP-OES e ICP-MS (Hg mediante CVG-ICP-MS).

Para evaluar la posibilidad de contaminantes elementales simultáneamente con la determinación

de MPs, se llevaron a cabo los siguientes procedimientos de preparación de muestras con el uso

de 6 mL de 1 mol L−1 HNO3 como solución de digestión:

i). digestión de músculo de tiburón in natura (sin MPs) utilizando 2 g de muestra y

ii). digestión de músculo de tiburón in natura (2 g) enriquecido con 100 mg de la mezcla de

MPs.
 56

Estos pasos combinados (i y ii) permitieron determinar la cantidad de contaminantes elementales

presentes en la muestra de tiburón (paso “i”). Además, en el paso “ii”, fue posible estimar los

elementos de lixiviado de MP al aumentar la contaminación de la muestra de tiburón. Para

evaluar la precisión del procedimiento propuesto para la determinación de contaminantes

elementales, se utilizó un MRC de músculo de mielga (DORM-2).

2.7. Seguro de calidad

La robustez del protocolo de preparación de muestras se evaluó tomandoen cuenta las

variaciones en los siguientes parámetros: relación MP/masa de pescados y mariscos (en %), masa

de la muestra, tiempo de retención de la irradiación, temperatura de digestión y concentración de

la solución ácida. La precisión intradía (repetibilidad) y la precisión interdía (precisión

intermedia) se estimaron con base en la desviación estándar relativa (RSD) analizando la

aplicación del protocolo propuesto a cada muestra de mariscos en tres días diferentes y con tres

análisis replicados. por día. La precisión del método propuesto se evaluó comparando el

protocolo propuesto con un método basado en digestión alcalina realizada de acuerdo con la

literatura previa, así como utilizando CRM de músculo de mielga (DORM-2).

3. Resultadosy discusión

Debido a la preocupación mundial por los riesgos que los MP pueden traer para la salud

ambiental y humana, se requiere el desarrollo de protocolos para determinar el contenido de MP

 57

en el músculo de pescado. Aunque ya se han desarrollado varios métodos, la mayoría no son

factibles para la rutina del laboratorio porque, dado que suelen requerir largos tiempos de

pretratamiento, el uso de reactivos concentrados (normalmente HNO3 o HCl) para la

degradación total de la materia orgánica, o reactivos específicos y específicos. equipo costoso,

como SEM y Py-GC-MS (Schwaferts et al., 2019). Además, estos métodos pueden resultar en la

solubilización o degradación de MP, lo que lleva a resultados finales subestimados (Avio et al.,

2015).

3.1. Evaluación del comportamiento de MP expuestas al protocolo de digestión ácida

Para cada MP, se evaluó el efecto del tratamiento con ácido (concentración de ácido,

temperatura, tiempo de calentamiento y tamaño de partícula de MP) sobre la recuperación de

MP. En este paso, cada MP se evaluó solo y fue posible seleccionar la condición más adecuada

para proporcionar una condición de digestión mínima o cualquier degradación de MP. Los

parámetros evaluados se describen en las siguientes secciones.

3.1.1. concentración de HNO3

Cabe mencionar que el papel filtro utilizado para la filtraciónno sufrió ninguna degradación

apreciable de la solución ácida. Se evaluó usando la solución ácida a temperatura ambiente, y el

proceso de filtración ocurre bastante rápido (menos de 5 s). Usando esta condición,

independientemente de la concentración de la solución ácida, no se observó un cambio

significativo en la masa del papel de filtro al pesarlo antes y después del contacto con la solución

ácida. Se supuso que este procedimiento no interfería en

 58

determinación de la cantidad de MP. Además, la degradación de MP se evaluó utilizando

diferentes concentraciones de HNO3. Como se observa en elFigura 1a, al utilizar HNO3

concentrado (14,4 mol L−1) todos los MP evaluados se disolvieron casi por completo (superiores

al 80%). La única excepción fue el PVC, que presentó una recuperación cercana al 60%. El PET

se disolvió completamente usando 7 mol L−1 y HNO3 concentrado y permaneció como un

precipitado blanco después del programa de calentamiento. Este precipitado blanco condujo a

una evaluación sobreestimada de la resistencia del PET al tratamiento con ácido, y estas dos

concentraciones de ácido no se consideraron para el PET. PU, por ejemplo, era muy propenso al

ataque ácido. Se obtuvieron recuperaciones de todas las concentraciones de HNO3 por debajo

del 20% (masa del PU no disuelto), y este tipo de plástico no se utilizó para experimentos

posteriores. A pesar de PU, al considerar soluciones de HNO3 más diluidas.

 59

Fig. 1. Evaluación de los parámetros de mínima degradación de MPs por tratamiento MAWD-SRC y

determinación gravimétrica del contenido de MPs. A) Concentración de ácido nítrico; B) temperatura de

digestión; C) Tiempo de mantenimiento a temperatura máxima. Condiciones: A) 180 °C como

temperatura de digestión y tiempo de mantenimiento de 10 min;

B) 1 mol L−1 HNO3 como solución de digestión y tiempo de mantenimiento de 10 min; C) 1 mol L−1

HNO3 como solución de digestión y digestióntemperatura de 200 °C. La línea punteada representa la

recuperación del 100%. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). Las letras sobre

las columnas representan marcas de significancia, donde las condiciones con la misma letra no tienen

una diferencia significativa (ANOVA, 95% del nivel de confianza ).

Evaluación de la temperatura máxima del programa de calefacción

Como se reporta en la literatura, cuando la temperatura de digestión es más alta, la oxidación de

la materia orgánica es más eficiente (Bizzi et al., 2017b). Por el contrario, considerando que las

MP deben recuperarse cuantitativamente, la temperatura utilizada en el protocolo propuesto debe

ser lo suficientemente baja para evitar cualquier posible degradación. Por lo tanto, al buscar un

protocolo para MP y determinar los contaminantes elementales en el tejido de pescado, se debe

encontrar una condición de compromiso de temperatura máxima para una mejor eficiencia de la

digestión sin degradación de MP.

En este sentido, se evaluaron 180, 200 y 220 °C (Figura 1b). PC y PVC no se degradaron incluso

cuando se sometieron a la temperatura más alta evaluada (220 °C). Para los demás MP, cuando el

programa de calentamiento se fijó a 200 °C, se obtuvieron recuperaciones cercanas al 100 %. La

 60

excepción a este comportamiento fue el LDPE, que presentó baja resistencia a temperaturas más

altas. Para este PM, la recuperación se reduce gradualmente de 90, 70 y 50%, mientras que la

temperatura aumenta de 180, 200 y 220 °C, respectivamente. A pesar de la baja recuperación

obtenida para LDPE, aún ajustando la temperatura a 220 °C la recuperación de PET, PS, EPS,

PP y HDPE fue cercana al 90%. Entre los ocho MP evaluados, es posible suponer que solo el

LDPE presentó un comportamiento que podría requerir el uso de temperaturas más bajas.

3.1.3. El tiempo de mantenimiento a la temperatura máxima de digestión.

El tiempo de calentamiento es un parámetro crucial para lograr una mayor eficiencia de

digestión.deficiencia de materia orgánica. Un tiempo de calentamiento prolongado conduce a un

contacto más efectivo entre el agente oxidante y la materia orgánica (giancarlo et al., 2017). Sin

embargo, mientras que la eficiencia de la digestión del tejido de pescado es mejor con un tiempo

de irradiación prolongado, este enfoque podría aumentar la degradación de MP. Con el fin de

evaluar cómo se comportan los MP al aumentar el tiempo de calentamiento, los MP se

sometieron a tiempos de espera que aumentaron de 10 a 30 min (temperatura máxima establecida

en 200 °C, con un tiempo de rampa de 10 min).

Como se muestraenFigura 1c, PS, EPS, PP, HDPE, PC y PVC presentaron un comportamiento

similar que es resistente para todos los tiempos de permanencia evaluados, conrecuperaciones

superiores al 90%. El PET, por ejemplo, presentó una reducción significativa en su recuperación

cuando se expuso a un mayor tiempo de calentamiento (del 85 al 67% cuando el tiempo de

mantenimiento aumenta de 15 a 30 min, respectivamente). El LDPE, como era de esperar,

presentó recuperaciones que oscilaron entre el 70 y el 20 % cuando se incrementó el tiempo de

espera de 10 a 30 min, respectivamente.

 61

Aunque un tiempo de espera de 30 min puede contribuir a una mejor eficiencia para la digestión

de los tejidos, se obtuvo una condición de compromiso para ahorrar MP con 10 min de tiempo de

espera a 200 °C usando 1 mol L−1 HNO3 (recuperacionesestaban cerca del 100%, excepto para

LDPE). Esta condición representa una reducción drástica en el tiempo mencionado en la

literatura para la determinación de MP, el cual debería ser de hasta 72 h (Karami yal., 2017).

Ante la posibilidad de determinar el mayor número de MPs, con recuperaciones cercanas al

100% (excepto PEBD), se seleccionó el tiempo de espera de 10 min.

3.1.4. Efecto del tamaño de los MP presentados a latratamiento ácido

Dado que la definición MP considera una amplia gama de tamaños (partículas plásticas menores

a 5 mm), lo cual fue propuesto por la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica en 2008

(Arturo et al., 2009), se vuelve esencial evaluar cómo se comportarían partículas de diferentes

tamaños bajo tratamiento ácido a temperaturas relativamente más altas.

En este sentido, cada MP se separó en tres rangos de tamaño (0,3 a 0,8, 0,81 a 1,69 y 1,7 a 5

mm). Cada rango de tamaño se sometió al programa de calentamiento optimizado (rampa de 10

min hasta 200 °C, seguido de 10 min de mantenimiento a 200 °C) utilizando 1 mol L−1 HNO3.

Como es posible observar enFigura 2, todos los MP evaluados no sufrieron influencia del

tratamiento ácido propuesto, independientemente del rango de tamaño de MP (de 90 a 100 %

para PET, PS, EPS, PP, HDPE, PC y PVC, así como 70 % para PEBD). En base a este resultado,
 62

el enfoque propuesto demostró ser factible para MP con un rango de tamaño tan bajo como 0,3

mm.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la evaluación sobre el comportamiento de cada

MP cuando se somete a condiciones de digestión de la muestra, es posible suponer que las

recuperaciones cuantitativas son posibles. La digestión ácida propuesta se optimizó utilizando 1

mol L−1 HNO3 como solución de digestión, temperatura máxima de digestión de 200 °C, con un

tiempo de espera de 10 min (20 min de programa de calentamiento total), que es capaz de

obtener recuperaciones de aproximadamente 70% para LDPE y superior al 90% para PET, PS,

EPS, PP, HDPE, PC y PVC.

16.1. Eficiencia de la digestión de pescados y mariscos utilizando un programa de

calentamiento optimizado para la determinación de la cantidad de PM

16.2.

Después de optimizar lacondiciones relacionadas con la digestión ácida (concentración de

HNO3, temperatura máxima y tiempo de retención, y tamaño de partícula de MP), así como

cómo afectan la recuperación de MP, se llevó a cabo la evaluación de la eficiencia del protocolo

optimizado. Aunque la mayoría de los protocolos para la digestión de mariscos tienden a utilizar

HNO3 concentrado (Duarte et al., 2009;Schmidt et al., 2013), con el fin de mantener la

integridad de los MP, se hace necesario el uso de ácido diluido para el desarrollo de este método.

El uso de HNO3 diluido se ha informado para digerir materia orgánica en varios informes

dedicados a la preparación de muestras para espectrometría atómica. La eficiencia del HNO3

diluido se puede mejorar utilizando oxígeno o peróxido de hidrógeno como reactivos auxiliares
 63

(Bizzi et al., 2014, 2017a;González et al., 2009;Yopuka et al., 2017). A pesar de esto, el uso de

auxiliares no fue evaluado en el presente trabajo porque contribuiría a la degradación de MP.

Al mirar la literatura previa centrada en el aislamiento de MP con ni-

ácido trico,Naidoo et al. (2017)investigó su eficiencia para la digestión de peces juveniles y la

extracción de MP. La digestión completa se obtuvo usando 10 mL de HNO3 al 55% (aprox. 12

mol L-1) para 1 g de pescado entero bajo incubación durante la noche a temperatura ambiente (o

3 g a 80 °C, en 30 min). Se informó que el nailon estaba totalmente degradado mientras que el

HDPE, PS, poliéster y PVC eran resistentes. Además, la evaluación de la degradación del tejido

de pescado para el aislamiento de MP usando HNO3 al 5 % (aprox. 0,7 mol L−1) y concentrado,

o HCl concentrado al 5 % (aprox. 0,7 mol L−1) a temperatura ambiente por 96 h fue realizado

porKarami et al. (2017).

Fig. 2. Evaluación del tamaño de partícula de las MP sometidas al pretratamiento MAWD-SRC y

determinación del contenido de MP por gravimetría. Condiciones: 1 mol L−1 HNO3 como solución de

digestión, temperatura de digestión de 200 °C y tiempo de mantenimiento de 10 min. La línea punteada

representa una recuperación del 100%. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3).
 64

Las letras sobre las columnas representan marcas de significancia, donde las condiciones con la misma

letra no tienen una diferencia significativa (ANOVA, 95% del nivel de confianza).

3.3. Evaluación del método de preparación de muestras propuesto para la determinación de

contaminantes elementales

Los PM y los contaminantes elementales se clasifican comúnmente como dos clases diferentes

de contaminantes en el agua de mar. Debido a la gran área superficial de las MP, pueden

adsorber varios elementos (incluso elementos tóxicos, como As, Cd, Cr, Hg y Pb) y luego

liberarlos en organismos marinos, como los peces (es decir, bajo un pH apropiado). condición).

Por lo tanto, los peces pueden ser una fuente de contaminantes, contaminantes elementales y PM

para los humanos (Brennecke et al., 2016;Cole et al., 2011). Los residuos industriales y las

acciones antropogénicas (pinturas antiincrustantes, combustión de combustibles, etc.) son las

principales fuentes de contaminantes elementales en el medio marino (Deheyn y Latz, 2006). Ya

se ha demostrado que algunos elementos, como Al, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb y Zn,

pueden estar presentes o adsorbidos del medio acuático en PET, HDPE, LDPE, PP , PS y PVC

(Brennecke et al., 2016;Karbalaei et al., 2020;Rochman et al., 2014). También está bien

documentado que los peces pueden acumular especies tóxicas de As y Hg (Olmedo et al., 2013).

En vista de los riesgos de los contaminantes elementales para los organismos marinos y los seres

humanos, el método propuesto, optimizado para la determinación de MP, también se exploró

 65

para la determinación elemental. Tal posibilidad solo se consideró porque los PM se

determinaron con precisión y la digestión del músculo de pescado fue eficiente.

La muestra de tiburón se digirió usando las condiciones optimizadas para

La determinación de MP y los contaminantes elementales (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, La,

Mg, Mn, Mo, Ni, Pb y Zn) se determinaron directamente mediante ICP-OES o ICP-MS, mientras

que el Hg se determinó por CVG-ICP-MS. Para evaluar el efecto promovido por la presencia de

MPs, se evaluaron dos condiciones: i) digestión de muestra de tiburón in natura (libre de MPs);

y, ii) digestión de una muestra de tiburón in natura enriquecida con una mezcla de MP. Ambos

resultados se presentan enTabla 2.

Los niveles máximos de Cd, Pb y Hg en el músculo de pescado han sido establecidos por la

Unión Europea, de acuerdo con la CE No 1881/2006. Aunque los límites se establecieron según

la especie de pescado, el Cd, el Pb y el Hg son tolerados en concentraciones de hasta 0,05, 0,3 y

1,0 μg g−1, respectivamente. A pesar de los conocidos efectos nocivos del As, la Unión Europea

no ha establecido ningún límite. En Brasil,

1,0 μg g−1 es el nivel máximo considerado para el As (RDC n° 42, publicada por la Agencia

Nacional de Vigilancia Sanitaria - ANVISA), mientras que el Cd, el Pb y el Hg tienen los

mismos límites establecidos por la CE 1881/2006.

Teniendo en cuenta la muestra de pescadodigerido sin MP (Tabla 2), los resultados obtenidos

para Cd, Pb y Hg estaban por debajo de los niveles máximos establecidos (CE nº 1881/2006 y

RDC nº 42). Sin embargo, el valor obtenido para As es aproximadamente 10 veces mayor que el
 66

Tabla 2 Resultados obtenidos para contaminantes elementales en tiburón y en tiburón mezclado

con 100 mg de una mezcla de MP (5 % p/p) después de la descomposición por MAWD-SRC y

posterior determinación por ICP-OES o ICP-MS. La digestión se realizó usando 2 g de músculo

de pescado, 1 mol L-1 HNO3 como solución de digestión y 10 min de tiempo de mantenimiento

a 200 °C (resultados en μg g-1, media ± desviación estándar, n = 3).

17. CONCLUCIONES

En conclusión, las técnicas químicas utilizadas para analizar la composición de los alimentos

marinos son herramientas fundamentales en la investigación y control de calidad de estos

productos. Estas técnicas permiten determinar la presencia y concentración de diversos

componentes, como proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, minerales, compuestos volátiles

y contaminantes.

La cromatografía, la espectroscopia y la espectrometría de masas son técnicas ampliamente

utilizadas en el análisis de alimentos marinos. La cromatografía proporciona información sobre

 67

la separación y cuantificación de los componentes de una muestra, mientras que la

espectroscopia y la espectrometría de masas permiten la identificación y cuantificación de

compuestos específicos presentes en los alimentos.

Estas técnicas químicas brindan información precisa y detallada sobre la composición química de

los alimentos marinos, lo cual es crucial para evaluar su calidad nutricional, su autenticidad, su

frescura y su seguridad alimentaria. Además, estas técnicas también se utilizan en la

investigación y desarrollo de nuevos productos, la optimización de procesos de producción y la

detección de posibles contaminantes.

En definitiva, las técnicas químicas aplicadas al análisis de los alimentos marinos desempeñan un

papel fundamental en la evaluación de la calidad y seguridad alimentaria, así como en la

investigación y desarrollo de la industria pesquera y acuícola. Su aplicación proporciona

información valiosa para garantizar la producción de alimentos marinos de alta calidad y

contribuye a la protección de la salud del consumidor.

18. REFERENCIAS

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