Professional Documents
Culture Documents
Penggunaan Teknologi Dna Typing Untuk Menganalisis Sifat Molekuler Tanaman Kelapa Sawit Komersial (Elaeis Guineensis Jacq.)
Penggunaan Teknologi Dna Typing Untuk Menganalisis Sifat Molekuler Tanaman Kelapa Sawit Komersial (Elaeis Guineensis Jacq.)
ABSTRAK
Tanaman kelapa sawit merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi
oleh sebab itu proses perakitan untuk menemukan varietas unggul terus dilakukan.
Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi benih off type, DNA typing dan nilai
keragaman molekuler pada marka RAPD dan SSR. Metode penelitian dilakukan
dengan mengamati pola pita yang terbentuk, pengamatan terhadap peubah genetik
dan analisis Principal Coordinat (PCOA). Analisis data dilakukan dengan
menggunakan softwer Power Marker 3.25, Gen Alex Versi 6.501 dan DARwin 6.0.
Kesimpulan pada menunjukkan bahwa marka RAPD dan SSR telah dapat
mengidentifikasi benih off type sebanyak 1 sampel dari 30 sampel yang diuji,
selanjutnya bahwa FR-304 merupakan DNA typing pada varietas komersial yang
diuji dan nilai keragaman molekuler pada marka RAPD sebesar 60.29% sedangkan
lokus SSR sebesar 75.39%.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelapa sawit merupakan tanaman penghasil minyak sawit dan inti sawit
sebagai salah satu primadona tanaman perkebunan yang menjadi sumber penghasil
devisa non migas bagi Indonesia. Produksi kelapa sawit ASEAN dikuasai oleh dua
negara, yaitu Indonesia dan Malaysia. Berdasarkan data FAO, selama tahun 2009-
2012 Indonesia berada di posisi pertama sebagai negara penghasil kelapa sawit
terbesar di ASEAN dengan rata-rata kontribusi produksi sebesar 50,99% dari total
produksi kelapa sawit ASEAN, sedangkan Malaysia berada di peringkat kedua
dengan kontribusi mencapai 45,10% (Kementerian Pertanian, 2014).
Proses pemuliaan tanaman kelapa sawit terus dilakukan untuk mendapatkan
tanaman kelapa sawit yang memliki karakter unggul. Penanaman kelapa sawit
dengan benih unggul akan dapat meningkatkan produksi dan produktifitas kelapa
sawit nasional. Proses benih unggul tersebut telah diolah sebaik mungkin, namun
demikian kemunculan benih off type tidak dapat dihindarkan yang menyebabkan
menurunnya kemurnian benih. Kualitas benih dapat menurun karena persentase
kemurnian benih yang rendah sehingga berakibat kemunculan benih tipe simpang
(off type), umur panen yang tidak sama serta munculnya variasi pada karakter
morfologi tanaman. Ahadiyat dan Darjanto (2010) benih bermutu adalah benih yang
memiliki tingkat kemurnian 100%, mempunyai kelebihan tertentu, sesuai dengan
jumlah yang dibutuhkan, sesuai untuk daerah pengembangan, harga yang
terjangkau dan daya hasil tinggi
Tanaman tipe simpang (Off Type) adalah tanaman atau benih yang
menyimpang dari sifat-sifat suatu varietas diluar batas kisaran yang telah ditetapkan
(Permentan, 2014), (Deptan, 2014). Selanjutnya, Tim Penyusun (2014) menjelaskan
bahwa proses produksi dengan menjaga kemurnian genetik benih hibrida penting
dilakukan untuk melindungi petani dari penyimpangan yang berakibat pada tidak
berhasilnya peningkatan produk pertanian.
Oleh sebab itu, kemurniaan genetik suatu benih perlu untuk ditingkatkan.
kemurnian genetik dinyatakan sebagai persentase jumlah tanaman yang murni
3
secara genetik sesuai dengan deskripsi varietas yang dimaksud. Kontaminasi genetik
sering ditemukan dalam uji kemurnian genetik yang dapat terdiri dari tipe simpang
(off-type), tetua betina yang tidak terhibridisasi atau campuran varietas lain.
Kegiatan pengawasan terhadap kemurniaan benih biasanya dilakukan dengan
pengamatan terhadap tampilan visual tanaman, analisis fisiologi dan biokimia atau
dikenal dengan istilah Grow Out Test (GOT). Pengamatan GOT sangat dipengaruhi
oleh faktor lingkungan sehingga hasilnya kurang akurat. Untuk meningkatkan
keakuratan hasil test GOT tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan teknik
DNA Typing dengan pemanfaatan teknologi molekuler. Hal ini juga dijelaskan oleh
Dualembang, et al. (2010) yang menyatakan bahwa identifikasi menggunakan
marka molekuler dapat memberikan hasil yang lebih cepat, efektif, dan akurat
dibandingkan dengan karakterisasi berdasarkan ciri-ciri morfologi. Karakterisasi
menggunakan marka molekuler dapat dilakukan pada stadium awal, bahkan dapat
dilakukan pada benih.
Pada lokus terdapat alel yang memuat DNA dalam jumlah yang beragam, hal
ini menyebabkan terjadinya perbedaan antara satu individu dengan individu lainnya.
Hal ini dikenal dengan sebutan DNA polimorpisme yang dapat dideteksi dengan
menggunakan metode PCR. Untuk mendeteksi DNA polymorisme tersebut dikenal
dengang sebutan DNA typing (Bathusha, 2013).
Pengamatan terhadap DNA polimorpisme dapat dilakukan dengan
menggunakan marka molekuler seperti RAPD dan SSR. Kedua marka ini memiliki
tingkat sensifitas yang tinggi untuk mengamati tingkat keragaman genetik pada
tanaman yang memiliki kerabat dekat. Penanda genetik hanya berguna apabila
polimorfik dan terpaut dengan sifat yang akan diamati atau dengan penanda genetik
lain. Syarat polimorfik diperlukan karena penanda genetik harus bisa membedakan
individu-individu dalam populasi yang diteliti. Syarat terpaut dengan penanda, gen
atau sifat lain diperlukan karena fungsi penanda genetik adalah sebagai tanda
pengenal yang harus melekat pada sifat yang diteliti (Sharma et al. 2008). Kegiatan
identifikasi pita spesifik akan sangat bermanfaat dalam identifikasi karakter tertentu
yang terdapat pada tanaman yang diuji (Istino, et al. 2012).
4
Oleh sebab itu, penggunaan teknik DNA typing perlu dilakukan untuk
mendapatkan hasil dengann tingkat presisi data yang lebih akurat sehingga akan
dapat meningkatkan tingkat kemurniaan suatu benih yang pada akhirnya akan
memberikan manfaat kepada para petani tradisonal kelapa sawit dan juga dapat
meningkatkan akurasi data pada proses pemuliaan tanaman.
Tujuan Penulisan
1. Untuk mendeteksi keberadaan benih off type pada benih kelapa sawit komersial
dengan menggunakan marka RAPD dan SSR.
2. Untuk mengidentifikasi marka molekuler yang dapat dijadikan sebaga DNA
Typing pada tanaman kelapa sawit komersial.
3. Untuk mengetahui nilai keragaman molekuler pada marka RAPD dan SSR pada
tanaman kelapa sawit komersial.
Kegunaan Penulisan
1. Sebagai salah satu penerapan teknologi marka molekuler untuk mendeteksi
keberadaan benih off type pada tanaman kelapa sawit komersial.
2. Bahan informasi terkait dengan DNA typing sebagai marker untuk kelapa sawit
komersial.
3. Sebagai salah satu bahan informasi bagi pihak-pihak yang membutuhkan.
5
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan terhadap daun benih kelapa sawit yang masih muda (3
MST). Prosedur isolasi DNA diadaptasi dari metode CTAB oleh Orozco-Castilo (1994).
dengan beberapa modifikasi.
6
Analisis Data
Analisis data dilakukan pada kedua marka molekuler baik itu pada marka
RAPD dan SSR. Dokumentasi hasil elktroforesis akan diubah kedalam data biner,
dimana pita yang tampak di ubah kedalam kode 1 sedangkan pita yang tidak
tampak diubah kedalam kode 0. Nilai PIC untuk dominan marker seperti RAPD
memiliki nilai maksimum yaitu 0.5 untuk fi = 0.5 (Ma et al. 2013). Perhitungan PIC
pada RAPD dihitung dengan menggunakan Excel 2007. Polymorphic Information
Content (PIC) untuk beberapa marker dihitung dengan menggunakan rumus:
PICi = 2fi (1-fi)
Dimana:
PICi = Polymorphic Information Content (PIC) pada marker
fi = frekuensi dari pita primer yang muncul
(1-fi) = frekuensi dari pita yang tidak muncul
Persentase pita polimorfik menggunakan rumus berikut :
% Pita Polimorfik=
∑ lokus yang polimorfik x 100
∑ lokus semuanya
Nilai polymorphic information content (PIC) marka SSR dihitung dengan
menggunakan software Power Marker 3.25 (Liu, 2005). Botsein et al. (1980)
mengklasifikasikan nilai PIC menjadi 3 kelas yaitu : PIC > 0.5:sangat informatif ;
0.25 > PIC < 0.5: sedang PIC < 0.25: rendah. Untuk menghitung jumlah alel efektif
per lokus (Na), observed heterozigosity (Ho) dan expected heterozigosity (He)
digunakan GenAlex ver. 6.501 (Peakall dan Smouse, 2012). Principal Coordinates
Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk
8
1 Well 1
Well 2
2
Gambar 1. Visualisasi 3D Hasil Uji Kualitas Hasil Isolasi DNA Tanaman Kelapa Sawit Komersial
Keterangan : Lingkaran 1 : menunjukkan hasil ketidakadaan DNA hasil ekstraksi
Lingkaran 2 : menunjukkan smear, well 1 dan well 2 menunjukkan material
genetik isolasi DNA
menghilangkan klorofil dan pigmen yang terbawa pada proses isolasi. Dengan
demikian, penggunaan ethanol absulte pada saat proses purifikasi dapat
meningkatkan hasil kemurniaan DNA.
Profil Uji Kuantitas DNA Komersial Tanaman Kelapa Sawit
Uji kuantitas DNA merupakan langkah yang dilakukan untuk melihat tingkat
kemurniaan DNA yang diukur secara kuantitatif. Hasil ini akan memperkuat dan
memperjelas hasil uji kualitas. Hasil uji kuanitas dilakukan dengan menggunakan
prinsip panjang gelombang yang dapat diserap oleh senyawa tersebut, karena setiap
senyawa kimia seperti senyawa metabolit sekunder, polisakarida dan senyawa-
senyawa aromatik lainnya memiliki penyerapan terhadap panjang gelombang yang
berbeda-beda, seperti senyawa flavonoid menyerap pada panjang gelombang 250-
450 nm (Neldawanti, et al. 2013), senyawa aromatik (1630-1450 cm-1) dan fenol
(1300-1000 cm-1) (Tim Penyusun, 2007), dan senyawa albumin (380-780 nm)
(Serlawaty, et al. 2015), sedangkan DNA sendiri diserap dengan baik pada 260/280
yaitu 1.8-2.0 (Sambrook, et al. 1989).
Rataan panjang serapan yang dapat diserap oleh DNA sebesar 1.33 dengan
panjang gelombang berkisar antara 0.64 sampai dengan 2.09. Panjang gelombang
yang dapat diserap oleh DNA adalah sekitar 1.80 sampai dengan 2.00. Berdasarkan
hasil penelitian dapat diketahui ada tiga individu yang memiliki nilai absorbansi 1.80
sampai 2.00. Sedangkan individu yang menunjukkan nilai absorbansi di bawah 1.80
menunjukkan bahwa sampel tersebut diduga lebih banyak mengandung protein.
lemak, metabolit sekunder dan lipid akan tetapi jika nilai absorbansi yang
ditunjukkan lebih dari 2.00 maka sampel tersebut mengandung RNA.
Selain dipengaruhi oleh nilai absorbansi, kejelasan pita hasil elektroforesis
juga dapat dipengaruhi oleh konsentrasi DNA yang dihasilkan oleh hasil ekstrasi
selama proses isolasi DNA. Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh rataan
konsentrasi DNA adalah sebesar 421.89 µg/µl. Jika dibandingkan dengan penelitian
yang dilakukan oleh Syahputra (2016) menunjukkkan nilai rataan konsetrasi DNA
sebesar 61.05. Hal ini berarti bahwa rataan nilai konsentrasi DNA yang dihasilkan
pada penelitian ini lebih tinggi. Tinggi rendahnya konsentrasi DNA juga akan dapat
11
Pola Pita DNA Hasil Elektroforesis Pada Marka RAPD (Random Amplified
Polymorpism DNA)
Analisis selanjutnya akan diperoleh bagaimana gambaran pola pita hasil
elektroforesis dengan menggunakan marka RAPD. Marka RAPD merupakan salah
satu marka berbasis DNA molekuler yang dapat menunjukkan tingkat keragaman
genetik pada suatu spesies. Adapun hasil pola pita DNA pada tanaman kelapa sawit
komersial berdasarkan marka RAPD disajikan pada Gambar 2.
L 5 18 23 21 15 20 29 27 8 16 11 44 26 38 35 31 36 9 40 2 47 6 42 45 3 48 30 37 24 12
1kb 1
3000 bp
1000 bp
250 bp
2
1kb
3000 bp
1000 bp
250 bp
1kb 3
3000 bp
1000 bp
250 bp
1kb 4
3000 bp
1000 bp
250 bp
12
Gambar 2. Pola Pita DNA Hasil Elektroforesis dengan Menggunakan Marka RAPD
Keterangan : L = Marker Ladder 1 kb; persegi kuning menunjukkan
ketidakmunculan pita, 1 : Primer OPH-6, 2 : Primer SB-19, 3 : Primer OPD-3,
4 : Primer OPD-20
untuk mengkonfirmasi hasil dari analisis RAPD ini diantaranya adalah penggunaan
marka SSR.
L 5 18 23 21 15 20 29 27 8 16 11 44 26 38 35 31 36 9 40 2 47 6 42 45 3 48 30 37 24 12
1
2072 bp
600 bp
100 bp
2
2072 bp
600 bp
100 bp
2072 bp 3
600 bp
100 bp
4
2072 bp
600 bp
100 bp
Gambar 3. Pola Pita DNA Hasil Elektroforesis dengan Menggunakan Lokus SSR
14
Berdasarkan Ma et al. (2013) bahwa nilai PIC maksimum yang ditunjukkan oleh
marka RAPD adalah 0.5. Tingkat PIC menunjukkan kemampuan primer untuk
membedakan antara satu individu dengan individu lainnya.
Primer yang menunjukkan tingkat PIC tertinggi terdapat pada OPH-6 (0.480)
sedangkan terendah terdapat pada SB-19. Semakin tinggi nilai PIC maka akan
semakin tinggi tingkat kemampuan primer tersebut untuk menunjukkan adanya
perbedaan secara genetik. Selanjutnya Ma et al. (2013) menjelaskan semakin besar
nilai PIC maka pprimer tersebut semakin baik untuk dijadikan sebagai penanda
molekuler. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa primer yang telah digunakan
telah mampu menunjukkan adanya perbedaan genetik. Analisis selanjutnya
dilakukan untuk melihat bagaimana tingkat polimorfisme pada tanaman yang diuji
berdasarkan primer SSR. Adapun profil kuantitatif elektroforesisnya disajikan pada
Tabel 2.
Tabel 2. Profil kuantiatif elektorforesis kelapa sawit dengan menggunakan SSR
No. Primer Ukuran Alel (bp) N Na Ne Ho He PIC
1 SSR I 190,215,252 30 3.000 2.476 0.933 0.596 0.509
2 FR-391 278, 308 29 2.000 1.979 0.000 0.495 0.372
3 FR-304 120 30 1.000 1.000 0.000 0.000 0.000
4 FR-10219 256,270,387 27 4.000 3.673 1.000 0.728 0.678
Rataan 29 2.333 2.031 0.514 0.391 0.329
Berdasarkan hasil analisis kuantitatif dapat diketahui nilai PIC berkisar antara
0.000 sampai dengan 0.678. Berdasarkan studi literatur dapat diketahui ada
beberapa acuan yang dpat dijadikan sebagai standar penggunaan marka SSR yaitu
berdasarkan Yu et al. (2009) yang menyebutkan standar marka SSR yang dapat
digunakan untuk menganalisis keragaman genetik adalah pada marka yang memiliki
lebih dari 4 alel dan PIC 0.7. Standar selanjutnya berdasarkan Billotte et al. (2001)
yang menyebutkan bahwa nilai PIC diatas 60% dan jumlah alel perlokus sebanyak 5.
Berdasarkan kedua standar ini marka yang paling mendekati adalah marka FR-10219
dengan nilai PIC 0.678 dan jumlah alel perlokus sebanyak 3.
Nilai PIC sebesar 0.000 menunjukkan bahwa marka yang digunakan bersifat
homozigot atau jumlah pita yang ditunjukkan memperlihatkan pola yang
menunjukkan profil yang sama. Berdasarkan Gambar 3 pita yang ditunjukkan
sebanyak 1 pada 120 bp. Berdasarkan hasil ini maka lokus FR-304 merupakan
16
marka SSR yang dpat dijadikan sebagai penanda spesifik atau DNA typing (DNA
fingerprinting) pada tanaman kelapa sawit komersial yang dijadikan sebagai objek
penelitian ini. Selanjutnya lokus FR-304 dapat digunakan untuk mendeteksi
kemurniaan benih kelapa sawit komersial spesifik. Hal ini sesuai dengan Mulsanti et
al. (2013) yang menjelaskan bahwa identifikasi kebenaran suatu genotipe tanaman
menggunakan marka SSR monomorfik merupakan salah satu metode yang dapat
digunakan untuk menguji kemurnian benih hibrida.
Aksis II : 34.36%
Aksis II : 17.94%
Hewan Provinsi Sumatera Utara, Medan atas izin dalam pemakaian nitrogen cair.
Tidak lupa, kami juga mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang terlibat
dalam penulisan karya ilmiah ini.
DAFTAR PUSTAKA
Ahadiyat, Y.R. dan Darjanto. 2010. Upaya pemurnian varietas kedeleai dengan
seleksi massa berdasarkan karakter morfologi dan analisis isoenzim.
Agrosains. 12 (1) : 14-18.
Ardiana, D.W. 2009. Teknik isolasi dna genom tanaman pepaya dan jeruk dengan
menggunakan modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian. 14 (1) :
1-5.
Azizah, N.N., Muthia, N.M., Dwi, L., dan Dahlia. 2014. Optimalisasi isolasi dan
purifikasi DNA Petunia hybrida seri rose picotedengan kit isolasi geneaid.
Prosiding Seminar Nasional XI Pendidikan Biologi UNS. 07 Juni 2014 :
273-278.
Batusha, S., 2013. The Application of IRAP Markers in The Breeding of Papaya.
[Dissertation]. Institute of Biological Science. Faculty of Science.
University of Malaya. Kuala Lumpur.
Billotte, N., Risterucci, A.M., Barcelos, E., Noyer, J.L., Amblard, P., and Baurens,
F.C., 2001. Develpomen characterisation and across-taxa utility of oil
palm (Elais guineensis Jacq.) Microsatellite Markers. Genome, 44 (33),
413-425.
Botstein D, White RL, Skolnick M, and Davis RW, 1980. Construction of a genetic
linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.
Am. J. Hum. Genet. 32:314–331.
Emad, O.H.A., and Soon, G.T. 2014. Using monomorphic microsatellite markes in oil
palm (Elaeis guineensis Jacq.). Journal of Botanical Science. 3 (4) : 1-6.
19
Faatih, M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan
Teknologi. 10 (1) : 61-67.
Hack, S.M., Huckket, B.I., dan Butterfield, M.K., 2002. Application of microsatellite
analysis to the screening of putative parents of sugarcane cross AA40.
Proc S Afr Sug Technol Ass. 76 :232-234.
Istino, F., Jamsari, Suliansyah,I. dan Gustian. 2012. Studi hubungan karakter
morfologi, anatomi, dan molekuler terkait potensi kadar katekin pada
tanaman gambir (Uncaria gambir (Hunter) Roxb.). Artikel Disetasi
Universitas Andalas. 5-25.
Kementerian Pertanian, 2014. Outlook Komoditi Kelapa Sawit. Pusat Data dan
Sistem Informasi Pertanian. Sekretariat Jenderal Kementerian Pertanian.
Liu, K., Muse, SV. 2005. Power Marker : An integrated analysis environment for
genetic marker analysis. Bioinformatics, 21 : 2128-2129.
Ma. X., X.Y. Gu, T.T. Chen, S.Y. Chen, L.K. Huang and X.Q. Zhang. 2013. Genetic
relationships between Lolium (Poaceae) species revealed by RAPD
markers. Genet. Mol. Res. 12 (3): 3246-3255.
Maftuchah dan A. Zainuddin. 2013. Studi pendahuluan variasi genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) lokal berdasarkan Random Amplified Polymorphic
DNA. Pusat Pengembangan Bioteknologi Universitas Muhammadiyah
Malang : 123-131.
Raisawati, T., 2010. Monitoring keragaan bibit kelapa sawit di pembibitan utama.
Jurnal Akta Agrosia. 2 (13) : 29-34.
Sahu, S.K., Thangaraj, M., Kathiresan, K. 2012. DNA Extraction Protocol for Plants
with Levels of Secondary Metabolites and Polysaccarides without Using
Liquid Nitrogen and Phenol. International Scholarly Research Network.
2012 : 1-6.
Sayaka, B., Kariyasa, I.K., Waluyo, Marisa, Y., dan Nurasa. 2006. Laporan Akhir
Penelitian TA 2006. Analisis Sistem Perbenihan Komoditas Pangan
Perkebunan Utama. Pusat Sosial Ekonomi Kebijakan Pertanian . Badan
Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Departemen Pertanian.
Jakarta.
Serlawaty, D., Syarmalina dan Novita, S. 2015. Analisis kandungan lemak dan
protein terhadap kualitas soyghurt dengan penambahan susu kim . Jurnal
Berkala Ilmiah Farmasi. 4 (2) :35-40.
Suariasih, K. 2015. Pemotongan dan menyambung DNA dalam Kloning gen, studi
kloning gen prolidase dari bakteri asam laktat. Media Ilmiah Teknologi
Pangan. 2 (2) : 1-11.
Syahputra, I. 2016. Validasi Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik PT. Socfindo
Berdasarkan Marka SSR. [Tesis]. Universitas Sumatera Utara. Medan.
YU, Q., J. LUO, X. HAN, Y.Z. ZHU, C. CHEN, J.X. LIU and H. SHENG. 2009. Genetic
diversity and relationships of 10 Chinese goat breeds in the Middle and
Western China. Small Ruminant Research. 2 (3) 15-20.