Universidad de Colima

Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias Licenciatura en Biologa

Extraccin y caracterizacin enzimtica de amilasas de Aspergillus sp. Aislado de masa de maz.

Integrantes
Eduardo Chvez Sahagn. Eduardo Duarte lvarez. Blanca I. Mendoza Macias. Adriana M. Montes Picaso. Joel F. Morfn Mndez. Mara Daniela Muiz Anguiano.

Tecomn, colima a 19 de junio del 2007

I. INTRODUCCIN

Las enzimas son protenas con propiedades catalticas, es decir que aceleran reacciones qumicas, entre cuyas propiedades se encuentran su gran especificidad y la presencia de uno o ms sitios activos. Las enzimas no solo se encuentran en todos los seres vivos, sino que adems son absolutamente necesarias para la vida. Las enzimas al ser protenas estn formadas por aminocidos, sin embargo algunas requieren de iones inorgnicos (cofactores) y/o de molculas orgnicas derivadas de vitaminas (coenzimas) para poder cumplir con su funcin de catalizadoras. As mismo factores ambientales tales como el pH y la temperatura alteran la funcin de las enzimas, pudiendo llegar a desnaturalizarse o degradase particulares a cada enzima. (Nelson y Cox, 2004). El almidn es un polisacrido constituido principalmente por largas cadenas de glucosa, en su forma nativa esta constituido por -amilasa y amilopectina. Es el principal polisacrido de reserva de origen vegetal, es ms abundantemente en semillas de cereales y tubrculos. (Vargas y Silver, 2002). Las amilasas son enzimas que hidrolizan el almidn, cortando cadenas de azucares en cadenas mas cortas, actan sobre los enlaces -(1-4) y/o (1-6). La actividad ptima de las amilasas se lleva acabo a un pH de 4.8 a 6.5. Si bien las amilasas no cuentan con coenzimas, si cuentan con un in de calcio unido covalentemente a cada una de sus molculas, dicho in es necesario para llevar acabo la catlisis. (Vargas A y Silver L, 2002). Las amilasas pueden ser producidas por una gran variedad de seres vivos que incluyen a animales, plantas, bacterias y hongos; estos ltimos son los organismos ms importantes en su produccin a nivel industrial. (Castro, et al). Una de las caractersticas fundamentales de los hongos es su alimentacin misma que realizan por absorcin: primero secretan hacia el medio exterior enzimas digestivas (exoenzimas) que degradan molculas grandes tales como protenas, polisacridos y lpidos en molculas mas pequeas fciles de absorber a travs de su pared celular y su membrana plasmtica. (Alexopoulos, Mims y Blackwell ,1996) El gnero Aspergillus es uno de los grupos de hongos con mayor distribucin y con mayor variedad de formas de alimentacin que hay, con un gran arsenal enzimtico, y con gran cantidad de especies saprobias, algunas parsitas de vegetales, animales y humanos; algunas son de importancia industrial. (Mier y Toriello 2002) perdiendo as su funcin en condiciones extremas o a catalizar mas eficientemente en ciertas condiciones optimas

II.OBJETIVO
Extraer y caracterizar enzimticamente las amilasas aisladas de Aspergillus sp. aisladas de masa de maz.

III. MATERIALES Y MTODOS

a) Materiales
1) Material de laboratorio 28 Vasos de precipitado de 40 mL. 4 2 2 2 1 2 5 2 Vasos de precipitado de 500 mL. Cubas Agitadores Agitadores magnticos Incubadora Bolsas para esterilizar Porta y cubre objetos Embudos

15 Cajas de Petri

1 Pliego de papel filtro 2 Platos calientes 1 Termmetro Parafilm 2 Matraces de 500 mL. 3 Esptulas 2 Probetas de 100 y 10 mL. Papel filtro 1 Balanza analtica 1 Balanza granataria. 1 Cmara de flujo laminar. 1 Mechero de Bunsen 2 asas bacteriolgicas 2 agujas de diseccin Algodn Gasas

Cinta Autoclave Papel extraza 1potenciometro 1 piceta

2) Reactivos
Extracto de levadura (BECTON DICKNSON DE MXICO S.A. DE C.V) Agar nutritivo (BECTON DICKISON DE MXICO S.A. DE C.V) Peptona de casena (BECTON DICKISON DE MXICO S.A. DE C.V) Cloruro de sodio (QUMICA DINMICA S.A DE C.V MONTERREY N.L) Dextrosa Monohidratada (J.T BARRER S.A DE C.V XALOSTOC, MXICO) Fcula de maz (UNILEVER DE MEXICO, S DE R.L. DE C.V) cido clorhdrico (ANAL Y TAKA DE MXICO S.A DE C.V. PM 36.46 g/mol) Acetato de sodio (FERMONT, PM: 136.08 g/mol) Glicerina (HYCEL DE MXICO SA. DE C.V, PM: 92.09 g/mol, 99.5%) Alcohol al 70% Agua Tween 80

3) Material Biolgico
Masa de maz Almidn soluble Salvado de trigo

b) Mtodos
1) Preparacin de soluciones -Agua con glicerina al 10% v/v %v/v = v soluto/ v solucin * 100 v soluto = 10 mL *100/ 100 v soluto = 10 mL.

En un matraz Erlenmeyer se colocaron 10 mL. de glicerina y 90 mL. de agua, lo cual se agito en un plato caliente. -Medio YPD Extracto de levadura 15% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (1.5%) (250 mL.)/100 Masa de extracto de levadura =3.75 g -Peptna de Casena al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100 Masa de peptna = 5 g -Dextrosa al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100 Masa de dextrosa = 5 g -NaCl al 5% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (5%) (250 mL.)/100 Masa de NaCl = 12.5 g -Agar-agar al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100 Masa de Agar - agar = 5 g En un matraz Erlenmeyer se agregaron 250 mL de agua junto con 3.75 g de extracto de levadura, 5 g de peptona de casena, 5 g de dextrosa 5 g de agar agar y 12.5 g de NaCl, se mezcl con un agitador magntico, posteriormente se esteriliz en la autoclave y se verti en 10 cajas de Petri. -NaCl al 1% p/v % p/v = masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (1%) (600 mL.)/100

Masa de NaCl =6 g En un vaso de precipitado se agregaron 600 ml de agua junto con 6 g de NaCl, se disolvi usando un agitador magntico -Fcula de Maz Se agregaron 60 g de fcula de maz (maizena) en 500 mL de agua, de mezcl utilizando un agitador magntico. -Tween 80 al 0.1% v/v % v/v= volumen de soluto / v solucin * 100 Volumen soluto= (0.1%) (500 mL.)/100 Volumen de Tween 80 = 0.5 mL En un matraz Erlenmeyer se mezclaron 0.5 mL de Tween 80 con 500 mL de de agua. Posteriormente se esteriliz en la autoclave. -Solucin de almidn tamponada: Almidn 0.05% p/v % P/V= masa del soluto/v solucin * 100 Masa del soluto= (0.05%) (250 mL.)/100 Masa de almidn =0.125 g -Acetato de sodio (CH3COONa) 0.1M n= (M) ((Lslon) n = (0.1 M) (.25 L) n= 0.025 moles m= (PM) (n) m= (0.025 moles) (82 g/mol) m = 2.05 g de CH3COONa

-NaCl (0.15M) n= (M) (Lslon) n = (0.15M)(.25L) n= 0.0375 moles

m= (PM) (n) m= (0.0375moles) (58.453 g/mol) m = 2.19g de NaCl En un matraz Erlenmeyer se coloc 250 mL de agua estril, 2.19 g NaCl, 2.05 de CH3COONa y 0.125 g de almidn, se disolvieron y mezclaron usando agitador magntico. 2) Aislamiento del hongo Se aisl el hongo apartir de masa de maz mediante los siguientes mtodos:

a) Cmara hmeda
El mtodo de cmara hmeda se lleva acabo con la colocacin de un caballete (sobre un triangulo de cristal se coloca un porta objetos, fijndolo con cinta adhesiva) dentro de una caja de Petri a la cual se agreg 20 mL. de agua con glicerina al 10% v/v, los cuales ya haban sido previamente esterilizados durante 15 min. a 15 libras de presin, por ultimo se coloco una pequea muestra de masa de maz. La preparacin antes descrita se incub durante 5 das a 28 C. b) Medio de cultivo YPD A cinco cajas de Petri esterilizadas se les agrego 20mL de YPD, una vez gelificado este, se coloco una pequea muestra de masa de maz a cada caja de petri, este proceso se realiz en una cmara de flujo laminar .Se incubaron durante 7 das a 28 C (Castro, Navas, Caro, Pieros). 3) Identificacin del hongo Se realiz por medio de un cultivo monosprico (la finalidad de este fue para que el crecimiento del hongo fuera en las paredes del cubre y portaobjetos para una fcil observacin en el microscopio), el cual consisti en poner un trozo de YPD portaobjetos que esta fijado al caballete y encima sobre el se coloc un cubreobjetos. Una vez

realizado lo anteriormente descrito, con una aguja de diseccin estril se tomo un muestra de nuestro hongo y fue inoculado por los cuatro lados del trozo de YPD, cada vez que se tomaba

muestra del hongo se esterilizaba la aguja de diseccin, dichas preparaciones se incubaron a 28 C durante 3 das. Una vez obtenido el crecimiento del hongo fue observado en el microscopio, para ello tuvimos que separar el cubre y el portaobjetos, a los cuales se les aadi unas gotas de hidrxido de sodio para el aclaracin de las estructuras morfolgicas, despus fueron observadas en el microscopio y se hicieron las comparaciones con imgenes y caractersticas del Aspergillus sp. descritas en manuales, libros y artculos. Una vez identificado en hongo, se resembr en 5 cajas de YPD, para mayor obtencin de esporas, as mismos se sembraron otras 5 cajas con esporas de otra sepa de Aspergillus aislada por otro equipo. Despus del crecimiento las esporas obtenidas de cada sepa fueron suspendidas por separado en tween 80 al 0.1%. (Castro, Navas, Caro, Pieros).

4) Expresin de las amilasas Se esterilizaron dos bolsas con 395 g salvado de trigo en la autoclave por 15 min. a 121C, una vez enfriado el salvado, cada una de las bolsas fue inoculada con las esporas de ambas sepas respectivamente e incubadas por 7 das a 28C (Castro, Navas, Caro, Pieros).

5) Extraccin de la enzima Las enzimas fueron extradas del salvado de trigo mediante la utilizacin de una solucin de cloruro de sodio. Se tomaron 100g del salvado de trigo y se colocaron en un vaso de precipitado con 295 militros de solucin de cloruro de sodio, posteriormente la mezcla fue agitada durante 24 hrs. a 8 C. Luego se filtro la mezcla utilizando un embudo y papel filtro, se tomaron 70 mL. Del filtrado y se reparti en 14 fracciones de 5 mL, el proceso se repiti por separado para ambas sepas aisladas, obteniendo as un total de 28 fracciones de extracto enzimtico (14 de cada cepa) (Castro, Navas, Caro, Pieros).

6) Actividad enzimtica:

Cada uno de los grupos de extractos enzimticos fueron divididos en dos grupos de siete fracciones (cada fraccin contena 5 mL), a cada uno de los cuales se les aplicaron 10 mL de solucin taponada de almidn (almidn 0.5% p/v, pH 5) y 10 mL de fcula de maz comercial respectivamente (as que tenemos siete fracciones de cada cepa con solucin taponada y otras siete con solucin de fcula de maz comercial). Posteriormente fueron incubadas a 37 C durante: 1,5 10,30,60, 90 y 120 minutos, extrayendo al termino de cada periodo una fraccin incubada con almidn y otra con fcula de cada cepa respectivamente, aplicando entonces a las muestras extradas lugol y comparando la coloracin obtenida con muestras de solucin de fcula y de almidn sin extracto enzimtico y coloreadas con lugol.

IV RESULTADOS Y DISCUSIN

Se tio una muestra de solucin de fcula de maz y una muestra con solucin de almidn tamponada con lugol, en la muestra de solucin de fcula de maz se observ una coloracin prpura obscura y en la solucin tamponada una coloracin caf claro, sin embargo a las muestras a las que si se les aplico el extracto enzimtico se observo que conforme pasaba el tiempo las muestras incubadas adquiran una coloracin mas clara progresivamente, debido a la accin de las amilasas. En primer lugar se sabe que la amilosa, componente del almidn en solucin acuosa adquiere una estructura en forma de espiral, al aplicar lugol el yodo contenido en este interacta con la parte interna del espiral de la amilosa provocando una coloracin prpura oscura. (Xiaochun , Houtman Y Atalla Almidn soluble , 1996). Al interactuar la amilasa con el almidn, corta las cadenas del mismo en segmentos ms cortos, como consecuencia hay menos lugol interactuando con la parte interna del espiral que forme cada cadena, causando que sea apreciable una coloracin ms tenue. Observado el proceso anteriormente mencionado significa que hay actividad amilolitica con el almidn, as mismo al observarse la disminucin de la coloracin, sabemos que sigue actuando continuamente la amilasa.

V CONCLUSIN

Los hongos del genero Aspergillus son capaces de producir amilasas, mismas que pueden ser extradas y observada su actividad in-vitro.

VI BIBLIOGRAFA - Stryer B. T (2002) Bioqumica. Editorial Reverte. SA. 5 ta edicin, Barcelona pp.196222. - Roskosk R. (2001) Bioqumica. Editorial MCGraw-Hill interamericana, Mxico, pp.100, 101. - Alexopoulos C.J., Mims C.W., Blackwell M., (1996). Editorial John Wiley y Sons, INC. 4a edition, Canad. pp. 28 -Nelson D.L. y M.M. Cox (2004) Lehninger principios de bioqumica. Editorial omega. 4 edicin, Espaa. pp. 190-215. -Mier T, Toriello C, Ulloa M, (2002) Hongos microscpicos saprobios y parsitos: mtodos de laboratorio. Editorial UAM-Xochimilco, 1era edicin, Mxico, pp. 29 - Castro C, Navas C, Caro O, Pieros Y. Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp. aislado en semillas de lentejas. Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano, Bogot, Colombia. - Apaza V, Silver L, (2002) Seleccin y evaluacin del genero Bacillus productoras de amilasa en cultivo sumergido, Universidad Nacional de San Marcos, Per. - Xiaochun Y, Houtman C, Atalla R. H. (1996) The complex of amylase and iodine; Chemical Engineering Department, University of Wisconsin, Forest Products Laboratory, One Gifford Pinchot Dr., Madison. http://es.scribd.com/doc/36099740/Extraccion-y-caracterizacion-enzimatica-deamilasas-de-Aspergillus-sp-Aislado-de-masa-de-maiz