滅菌及消毒

組別：2-1
組員：林子欽、曾柏勳、蔡秉宏、邱宣凱、鄭棣中
一、 目的
吾人可使用物理或化學的方法達到滅菌或消毒之目的。例如：
加熱、紫外線照射、過濾、氧化乙烯（ethylene oxide gas）
處理、消毒劑處理等。
二、 原理
轉型作用(transformation)是細菌自外在環境獲得一段 DNA
的過程；此段外來 DNA，有機會造成細菌遺傳基因的改變，甚
至改變細菌原有的特性，例如：改變營養物質種類的攝取或增
強抗藥性。
抗生素事由真菌或細菌所分泌的化學物質，可破壞其他微生
物之構造或干擾代謝，以便維護自己的生活。在器皿中證明一
些常用抗生素可以抑制細菌生長的現象，類似試驗常用於檢驗
病原菌的藥物(含合成藥物)感受性，以便選擇治療用抗生素之
參考。在體內顯然還有其他因素影響抗生素的抗菌作用，而這
些往往不能在試管中呈現。但是除了一些例外，在試管中所得
結果大致符合抗生素的療效。
三、 材料：
甲、 Transformation:
Escherichia coli 勝任細胞，帶有或沒有抗藥性基因的質體
(plasmids)、冰桶、2 支 1.5 ml 離心管、營養肉湯
(nutrient broth)、2 片營養瓊脂平板(agar plates，韓
50µl/ml Ampicillin)。
乙、 Antibiotic susceptibility test:
1. 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌
(Escherichia coli)的營養肉湯培養
2. Mueller Hinton media 製備的 15cm 瓊枝平板 2 個
3. 無菌棉棒 2 個、打火機、酒精燈、鑷子
4. 下列抗生素紙錠(paper discs)各 2 片
Tetracycl Gentamyc Erythromy Penicill Chlorampheni Streptomy
ine in cin in G col cin
TE-30 GM-10 E-15 P-10 C-30 S-10
30µg/mL 10µg/mL 15µg/mL 10µg/mL 30µg/mL 10µg/mL
四、 實驗過程
甲、 Transformation
1. 將被誘導為勝任細胞的 E.coli 搓熱溶解，並在離心數秒
後插在冰上備用。
2. 將帶有抗藥性基因 DNA 的 R 管與帶有無抗藥性基因 DNA
各加入 100 μL 的勝任細胞，以 pipet 輕輕混合，冰浴靜
置 30 分鐘。
3. 置入 42∘C 水浴槽，進行熱休克 90 秒後插回冰上。
4. 冰浴 5 分鐘後，加入 1mL 營養肉湯在 37∘C 水浴槽培養
1 小時。
5. 離心(8000rpm, 5min)過後，以微量吸管吸掉上層液體留
下 0.2mL 的菌液。
6. 將 V 管的菌液打散後加到含 50 μg/mL Ampicillin 的 agar
plate 上，再以滅過菌的 L 型玻棒塗抹均勻。R 管的處理
同上。
乙、 Antibiotic susceptibility test
1. 用棉棒沾取 S. a.菌液，接著在 Mueller Hinton media
製備的 15cm 瓊脂平板上密集塗抹，確保培養基上布滿菌
液。
2. 使用滅過菌的鑷子夾取不同的待測紙錠（中心為無藥劑
的對照組），均勻分布在 agar plate 上，如下圖所示。

3. 在培養 24 小時後，測量紙錠邊緣的抑制帶直徑，並對照
表格，推測不同紙錠對於細菌的抑制程度。
五、 實驗結果
甲、 Transformation 的實驗結果
V 管（帶有無抗藥性基因
R 管（帶有抗藥性基因 DNA）
DNA）

實驗結論：
就 R 管的 Agar Plate 上可以長出菌落，我們可以得知抗藥性
在我們的遭挫下可以讓抗藥性的質體轉行成功，且實驗步驟上
應無其他問題。就 V 管與 R 管 Agar Plate 的比較，我可以了解到
抗藥性的基因可以幫助細菌對抗抗生素。
 乙、 Antibiotic susceptibilitytest 的實驗結果

實驗結果：
抗生素 抑制帶（inhibition 細菌對抗生素的反應
zone）的直徑
對照組 0 cm
Te-30 2.8 cm susceptible
GM-10 2.3 cm susceptible
E-15 1.2 cm resistant
P-10 1.1 cm susceptible
C-30 2.8 cm susceptible
S-10 1.0 cm resistant

六、 問題：
甲、 請說明細菌 transformation 實驗中，Ca2+扮演的角色。
ChatGPT
 在細菌轉化（bacterial transformation）的實驗中，Ca2+
（鈣離子）扮演了關鍵的角色。細菌轉化是指將外源性 DNA 導入
細菌細胞內，使其進行基因重組的過程。而 Ca2+在細菌轉化過
程中起到了以下作用：
1. 改善細胞膜的通透性：細胞膜是細菌細胞與外部環境之
間的屏障，而 Ca2+可以通過相互作用和穿過細胞膜來幫
助 DNA 進入細胞內。
2. 中和 DNA 的磷酸基團的負電荷：DNA 帶有大量的負電荷，
而 Ca2+可以與 DNA 上的磷酸基團結合，中和這些負電荷，
從而降低 DNA 的親水性，增加其與細胞膜的相互作用。
3. 促進 DNA 的吸附：Ca2+可以與細胞膜上的陰離子結合，
形成陰離子區域，這些區域能夠吸附帶有正電荷的
DNA，促進 DNA 進入細胞內部。
總之，Ca2+對於細菌轉化過程至關重要，能夠幫助 DNA 進入細胞
內部，並且增加 DNA 與細胞膜的相互作用，促進 DNA 轉化的成功率。
精進答案
主要是使用 Calcium chloride transformation，由於 DNA 本身帶有
負電且親水，故不容易穿過帶有負電且不親水的磷脂雙層膜，因此
帶正電的鈣離子可以去中和兩者上的負電荷，並幫助 DNA 通過磷脂
雙層膜來進到細胞內。

(來源：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5681917/)
https://www.mybiosource.com/learn/testing-procedures/cacl2-transformation-
technique/)
 乙、 說明這六種抗生素抑制細菌生長的機制作用。
ChatGPT
Tetracycline：
Tetracycline 是一種廣效抗生素，可用於治療多種細菌感染。
它的抗菌作用是通過抑制細菌的蛋白質合成實現的。
具體來說，tetracycline 可與細菌核糖體上的 30S 次單位的 A 位和
P 位相結合，從而阻止胺酸-轉移核糖體在蛋白質合成過程中進行正
確的配對，使得多肽鏈不能正常延伸。此外，tetracycline 還可以
阻止 tRNA 進入 A 位和 P 位，並抑制一些胞外蛋白質的合成。這些機
制共同作用，最終導致細菌的蛋白質合成受阻，細菌不能正常生長
和繁殖，從而達到治療感染的目的。
需要注意的是，由於 tetracycline 的廣效性，它不僅可以殺滅病原
菌，也會同時殺滅正常的腸道細菌，因此在使用時需要謹慎，以免
產生抗藥性或導致其他副作用。
Gentamycin：
Gentamicin 是一種氨基糖苷類抗生素，主要用於治療由革蘭氏
陰性菌引起的感染，例如泌尿道感染、呼吸道感染、骨髓炎等。它
的抗菌作用主要通過以下機制：
1. 干擾細菌蛋白質合成：Gentamicin 能夠結合到細菌核糖體上
的 30S 次單元，阻止細菌合成蛋白質，尤其是引起蛋白質合
成錯誤的蛋白質，從而抑制細菌的生長和增殖。
2. 破壞細胞膜結構：Gentamicin 在高劑量下能夠穿過細胞膜進
入細胞內，與細胞質內的磷脂結合，干擾細胞膜的結構和功
能，增加細胞內外物質交換，導致離子平衡和代謝功能紊亂，
從而抑制細菌的生長和增殖。
3. 促進細胞自我消化：Gentamicin 能夠誘導細菌發生自我消化，
導致細胞質溢出，細胞壞死和死亡。
總之，Gentamicin 主要通過干擾細菌蛋白質合成、破壞細胞膜
結構和促進細胞自我消化等多個方面，抑制細菌的生長和增殖，從
而達到治療感染的目的。值得注意的是，Gentamicin 對人體的耳毒
性和腎毒性較強，使用時應遵循醫師建議，避免使用過量或長期使
用。
Erythromycin：
Erythromycin 是一種馬來酸鹽型的巨環類抗生素，廣泛用於治
療由革蘭氏陽性菌引起的感染，如肺炎鏈球菌、鏈球菌、金黃色葡
萄球菌等。它的抗菌作用主要通過以下機制：
 1. 干擾細菌蛋白質合成：Erythromycin 能夠結合到細菌核糖體
上的 50S 次單元，阻止細菌合成蛋白質，尤其是引起蛋白質
合成錯誤的蛋白質，從而抑制細菌的生長和增殖。
2. 阻斷細菌的蛋白質轉位：Erythromycin 能夠干擾細菌的蛋白
質轉位，即阻止蛋白質在細胞內的運輸和定位，從而抑制細
菌的生長和增殖。
3. 抑制細胞自我保護機制：Erythromycin 能夠抑制細菌內源性
的核醣體鍵合蛋白質（RP）產生，進而抑制細胞自我保護機
制，使細菌更易受到外界環境的影響，從而增加抗生素的抑
菌效果。
總之，Erythromycin 主要通過干擾細菌蛋白質合成、阻斷細菌
的蛋白質轉位和抑制細胞自我保護機制等多個方面，抑制細菌的生
長和增殖，從而達到治療感染的目的。值得注意的是，
Erythromycin 可引起一系列副作用，如胃腸道不適、過敏等，使用
時應遵循醫師建議，避免使用過量或長期使用。
Penicillin G：
Penicillin G 是一種 β-內酰胺類抗生素，廣泛用於治療由革蘭
氏陽性菌引起的感染，如溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌等。
它的抗菌作用主要通過以下機制：
1. 干擾細菌細胞壁合成：Penicillin G 能夠干擾細菌的細胞壁
合成，具體來說，它能夠結合到細菌細胞壁的 D-葡萄糖-N-
醛酸-乙酰葡萄糖胺聚合物（PG）的酶活性位點（轉酰胺
酶），阻止 PG 的合成，從而破壞細菌的細胞壁，使細菌在
生長和分裂過程中無法維持細胞完整性而死亡。
2. 促進細胞壁水解酶的活性：Penicillin G 可以誘導細菌分泌
出水解酶，這種水解酶能夠分解細菌細胞壁，加速細胞壁的
破壞和細菌的死亡。
總之，Penicillin G 主要通過干擾細菌細胞壁合成和促進細胞
壁水解酶的活性，導致細菌細胞壁的破壞和死亡，從而達到抑制細
菌生長和增殖的目的。值得注意的是，Penicillin G 可引起一些副
作用，如過敏反應、腸道菌群失調等，使用時應遵循醫師建議，避
免使用過量或長期使用。
Chloramphenicol：
Chloramphenicol 是一種廣泛使用的抗生素，主要用於治療革蘭
氏陰性菌和革蘭氏陽性菌引起的感染，如肺炎、敗血症、腸炎等。
它的抗菌作用主要通過以下機制：
 1. 抑制細菌的蛋白質合成：Chloramphenicol 能夠結合到細菌
核糖體的 50S 亞基上，阻止氨基酸載體的結合和肽鍵的形成，
抑制細菌蛋白質合成，從而阻止細菌的生長和增殖。
2. 抑制細菌中的糖原合成：Chloramphenicol 還能夠抑制細菌
中糖原的合成，因為細菌在生長過程中需要糖原作為能量的
儲存，所以這種作用也能夠干擾細菌的生長和增殖。
總之，Chloramphenicol 主要通過抑制細菌的蛋白質合成和糖原
的合成，從而達到抑制細菌生長和增殖的目的。Chloramphenicol
常常被用作治療嚴重的感染，但它也有一些副作用，如骨髓抑制、
貧血、腸道菌群失調等，因此應該嚴格遵循醫生的建議使用。
Streptomycin：
Streptomycin 是一種氨基糖苷類抗生素，主要用於治療由革蘭
氏陰性菌引起的感染，如結核病、肺炎等。Streptomycin 的抗菌作
用主要通過以下機制：
1. 抑制細菌的蛋白質合成：Streptomycin 能夠結合到細菌核糖體
的 30S 亞基上，阻止細菌的蛋白質合成，從而阻止細菌的生長和
增殖。
2. 增加細胞膜的通透性：Streptomycin 能夠破壞細菌的細胞膜，
使得細胞內外物質的交換增加，從而增加了抗生素和其他毒素
進入細胞的速度，也增加了細胞死亡的可能性。
總之，Streptomycin 主要通過抑制細菌的蛋白質合成和增加細
胞膜的通透性，從而達到抑制細菌生長和增殖的目的。但是，
Streptomycin 也有一些副作用，如耳毒性、腎毒性、神經毒性等，
因此應該嚴格遵循醫生的建議使用。
精進答案
Tetracycline：
四環黴素為具有下圖共同構造的廣效抗生素

其藥理作用為抑制蛋白質合成，在經由被動擴散或主動運輸進細菌
內後，會可逆的結合在核醣體 30S subunit(下圖紅框)，以阻止
Charged tRNA 結合在 acceptor site，並抑制多肽鏈的延長。

Gentamycin：
對 Gram-positive 和 Gram-negative 都有效(但對厭氧菌無效)，共
通結構如下圖
其藥理作用為不可逆的抑制蛋白質合成，在越過 porin channels 後，
接下來會由需氧的過程運送進細胞內(故厭氧菌無效)，並結合至核
醣體的 30S-subunit，並透過三個機制干擾合成：

1. 干擾 initiation complex
2. 造成 mRNA misreading
3. 將聚合的核醣體分解為無功用的單體

Erythromycin：
下圖為紅黴素的構造
紅黴素可以阻止蛋白質合成，在高濃度下具有殺菌的作用，其原理
為結合在核醣體的 50S-subunit，由於其位置鄰近於
peptidyltransferase，故會阻止多肽鏈的 transpeptidation，同
時也可以阻止核醣體兩單位的結合。並對下列細菌有效

Penicillin G：
下圖為其構造，具有 β-lactamases 的細菌對其有抗藥性
其藥理作用為阻止細胞壁合成步驟中的 transpeptidation
reaction，並造成細菌死亡。

Chloramphenicol：
下圖為氯黴素的構造

其藥理作用會可逆的結合在核醣體上面的 50S-subunit 上(紅框處)，

以阻止肽鍵的形成。
Streptomycin：
下圖為其構造

其藥理作用和 Gentamycin 相似，主要差別為 enterococcienzyme 具

有改變 Gentamycin 的功能，但卻對 Streptomycin 無效，故具有
gentamicin-resistant enterococci 還是可以用 Streptomycin。
(來源：Katzung、Lippiincott)
 丙、 為什麼要先做 V，再做 R?
ChatGPT
進行 R 管和 V 管的實驗時，如果先將 R 管轉化到菌落中，可能會存
在以下問題：
1. 抗藥性基因會傳播：如果先將 R 管轉化到菌落中，其中的抗藥性
基因可能會傳播到菌落中的其他細菌中，使得整個菌落都具有
抗藥性，這會影響後續的實驗結果。
2. V 管的轉化效率較低：V 管中含有無抗藥性基因的 DNA，轉化後
的菌落是無法在抗生素培養基上存活的，因此 V 管轉化的效率相
對較低，如果將 R 管轉化到菌落中後再進行 V 管的轉化，可能會
影響 V 管轉化的結果。
因此，為了避免上述問題，一般情況下會先將 V 管轉化到菌落中，
然後再將 R 管轉化到已經含有無抗藥性基因的菌落中，這樣可以保
證轉化效率，也可以防止抗藥性基因的傳播。
精進答案
避免被汙染，要是先做 R 的話有機會讓裡面具有抗藥性的 DNA 藉由 L
形玻棒跑到 V 裡面，造成 V 也獲得抗藥性。
 丁、 比較 μg/mL 與 unit/mL 差異
ChatGPT
抗生素的 μg/mL 和 unit/mL 都是用來表示抗生素濃度的單位，但它
們所代表的含義有所不同：
1. μg/mL：μg/mL 表示每毫升液體中含有的抗生素質量。這是一
個質量單位，常用於測量抗生素的濃度，可以用來計算在特定容積
的液體中所含有的抗生素總量。
2. unit/mL：unit/mL 則是根據特定抗生素的生物活性來定義的單
位，用於測量抗生素的生物活性。它是一個相對的單位，用於表示
一定體積抗生素溶液中所含有的生物活性物質的量，因此在不同抗
生素之間是不可比較的。
總的來說，μg/mL 主要用於測量抗生素的濃度，而 unit/mL 則用於
測量抗生素的生物活性，兩者所代表的含義不同，不能直接進行比
較。在臨床實踐中，常常使用 μg/mL 來表示抗生素的濃度，而在細
菌培養實驗中，則常常使用 unit/mL 來測量抗生素的生物活性。
精進答案
盤尼西林會特別用 unit 來計量，其中 1 unit = 0.6 mcg; 1
million units of penicillin = 0.6 g，而 Crystalline sodium
penicillin G 每毫克含有 1600 units，人工合成的盤尼西林則會用
回原本的重量來計算。
(來源：Katzung)