5.

MICROARRAYS

 Introducción
ₒ Un array es una cuadrícula formada por puntos (“pequeños pocillos”),cada uno de los
cuales contiene una sonda distinta (fragmento de ADN).
ₒ El soporte sólido al que se unen la colección de sondas puede ser : vidrio,plástico o silicio.
ₒ Cada soporte puede dividirse en 1,2, 4 u 8 arrays
ₒ Como un array contiene una colección completa de sondas,se puede analizar tantas
muestras distintas como arrays contenga el chips.

• Ver fig. 5.9 Libro de texto

• Fig. 6

• Fig.7

1
 Concepto de microarrays
• Son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) ,distintos , fijados a una
superficie sólida : vidrio,plástico o silicio.
• Los microarrays también se conocen como biochips.

 Características
• Partiendo de una única muestra y realizando un proceso de hibridación, un microarrays
detecta simultáneamente miles de secuencias distintas,cualitativa y cuantitativamente.
• La inmensa cantidad de información que aportan los convierte en una gran herramienta
para estudios genómicos y de expresión genética.
• Las sondas son monocatenarias y no está marcadas.
• Se marca la muestra a estudiar con fluorocromos
• La lectura del resultado tras la hibridación ,es a través de un escaner de lectura de tipo
laser y un sofware de análisis (programa informático)

 Fabricación
Dos formas:
a) Depositar las sondas una a una en posiciones determinadas del soporte sólido
mediante un brazo automatizado
El resultado final es una matriz de puntos sobre el soporte
Esta tecnología permite fabricar microarrays con decenas de miles de puntos (sondas)
microscópicos.

b) Sintetizar las sondas sobre la propia superficie sólida .

 Protocolo de trabajo genérico con microarrays

1º. Marcaje de la muestra con un flourocromo
a) Para estudios de expresión génica : purificar el ARNm y sintetizar ADN copia con
nucleótidos marcados (ADNcopia ADN obtenido in vitro, no existe como tal en la
naturaleza).

b) Estudios genómicos; purificar el ADN y marcar por Nick tranlation o random priming.

2º Hibridación y lavados poshibridación. Según instrucciones del fabricante.

3º. Lectura del microarray .Se realiza por un escáner que dispone de un laser, éste excita
cada punto de la matriz, con la longitud de onda adecuada al fluorocromo utilizado , y un
detector mide la intensidad de la fluorescencia emitida por cada punto de la matriz.
4º. Análisis e interpretación de los resultados
Se realiza mediante un software específico.

2
 Aplicaciones de los microarrays
Se han descrito múltiples aplicaciones , pero las dos más importantes son :
1. La hibridación genómica comparada
1. Los estudios de expresión génica

A) La hibridación genómica comparada en arrays ( a C G H )

>>> Permite detectar deleciones o ganancias de material genético comparando muestras
con ADN de referencia.
>>> El método consiste :
1. Marcar el ADN de la muestra a analizar y el ADN de referencia con fluorocromos
distintos. Normalmente:
- ADN de la muestra en verde
- ADN de referencia en rojo
2. Mezclar en la misma proporción y utilizar para hibridar un arrays
fabricado con fragmentos de ADN (copia ,clonado u oligonucleótidos)
Se añaden en igual proporción para que compitan por hibridar, hibridará el más
específico.
3. En cada punto de la matriz,ambos ADN compiten por hibridar con la sonda, de forma
que el color de fluorescencia final va a depender de la proporción de ambos :
– Los puntos rojos indican --- > deleciones en el ADN problema
– Los puntos amarillos indican genes inalterados
– Y los puntos verdosos indican duplicaciones en el ADN problema.

Explicación:
• Deleciones: anomalía estructural consistente en la pérdida de un fragmento del cromosoma.
• Duplicaciones: anomalía cromosómica consistente en la repetición o duplicación de un fragmento del
cromosoma.

– PUNTOS AMARILLOS .La mezcla de color rojo y verde da color amarillo , luego
hibridan en igual proporción el ADN de referencia y el ADN problema. Por
tanto no hay anomalía genética.
– PUNTOS ROJOS. Hibrida más el ADN de referencia, porque hay pérdida de una
parte del ADN problema --- > Delección
– PUNTOS VERDES .Hibrida más el ADN problema, hay repetición o duplicación
en el ADN problema.

>>> Este tipo de hibridación es útil :

• Para realizar estudios genómicos de células tumorales.
• En diagnóstico de enfermedades genéticas
• Y en diagnóstico prenatal.

>>> LIMITACIÓN : No detecta alteraciones cromosómicas estructurales como

traslocaciones e inversiones, ya que las secuencias diana están presentes en cantidades
normales aunque situadas en lugares anómalos del cromosoma.
• Traslocación : Consiste en un intercambio de uno o dos fragmentos cromosómicos entre dos cromosomas no
homólogos
• Inversión : consiste en que un segmento cromosómico cambia su orientación y se sitúa en posición invertida
respecto de un cromosoma normal

3
B) Estudios de expresión génica
• La hibridación en microarrays permite analizar la expresión génica de poblaciones
celulares,al estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes.
• Pueden ser:
o En términos absolutos
Se puede saber, en una población celular determinada :
- Qué genes se expresan y con qué intensidad (viendo la intensidad de
fluorescencia en cada punto).
- Y qué genes están reprimidos (ausencia de fluorescencia)

o En términos comparativos
Se realiza con una mezcla de ADNc muestra y ADNc de referencia marcados con
distintos fluorocromos.
Permite comparar la población celular en distintos momentos.

Es muy útil para estudiar los efectos de los medicamentos,etc…

C) Otras aplicaciones de los microarrays (*) (LEER)

• Estudio a gran escala de polimorfismos y mutaciones.

Polimorfismos son variantes del genoma que aparecen por mutaciones en algunos individuos. Se
transmiten a la descendencia etc.
El análisis de los polimorfismos genéticos permiten identificar genes que confieren susceptibilidad
a presentar enfermedades

• Detección de microorganismos contaminantes en alimentos

 EJERCICIO DEL LIBRO Nº 6 (página 132 )

 VER VIDEO “ MICROARREGLOS”. Diego Galvis (2015 )

4
6. TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO
- Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados por
anticuerpos específicos.

- Esta técnica se desarrolló inicialmente para el virus del papiloma humano en muestras
cervicales del útero, aunque actualmente permite detectar múltiples agentes infecciosos.

Procedimiento
- Es en medio líquido la hibridación.
- Si la secuencia diana es ADN la sonda es ARN
- Si la secuencia diana es ARN la sonda es ADN
- Formado el híbrido ADN/ARN éste se transpasa a una placa microtiter que sus pocillos
están recubiertos con anticuerpos específicos del híbrido.
- El híbrido se une al anticuerpo (captura) quedando retenido en el pocillo.
- Se añaden al pocillo anticuerpos anti-híbrido marcado con la enzima fosfatasa alcalina
que se unen al híbrido del pocillo.

- Revelado : se añade al pocillo un sustrato quimioluminiscente que por acción de la

fosfatasa produce luminiscencia , ésta se detecta por un luminómetro o lector de placas
(placa microtiter).

 TRABAJO : TECNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU

HASTA AQUÍ EXÁMEN DEL RA 6 : HIBRIDACIÓN Y TECNICAS DE HIBRIDACIÓN

5
TRABAJO DE LA UT 8 : TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN NOTA …………….............

NOMBRE Y APELLIDOS …………………………………………………………………………………………….

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU ( ISH) .TIPOS DE MUESTRAS

1. ¿Qué significa la expresión in situ?.

Que la secuencia diana se va a localizar en el sitio en que se encuentra fisiológicamente:
a) En el caso del ADN sería ….
b) En el caso del ARN sería ……
2. ¿ Para realizar esta técnica dónde se colocan las estructuras celulares o tisulares?
3. La ISH se puede realizar sobre (4)
4. Nombra 6 características de la técnica de técnica de hibridación in situ.
5. ¿Qué es la ISH fluorescente? ¿Cuáles son sus siglas más conocidas?.
6. Leer protocolo y enumerar cada fase explicando brevemente cada una de ellas.
7. ¿Cómo se visualizan las preparaciones tras realizar un FISH?
8. ¿En qué colores emiten los fluorocromos utilizados en el FISH?
9. Respecto a la FISH interfásica.
a) ¿En que consiste?
b) ¿Cuáles son las sondas más utilizadas para estudios citogenéticos humanos?
c) Las sondas centroméricas hibridan con ……
y detectan principalmente alteraciones ¿ numéricas o estructurales?
d) Las sondas específicas de locus hibridan en ……..
y detectan principalmente alteraciones ¿ numéricas o estructurales?
10. Respecto a la FISH metafísica:
a) ¿En qué consiste?
b) Las sondas teloméricas hibridan con ….
Se utilizan principalmente para estudios de …..
11. Explica brevemente el FISH para pintado de cromosomas enteros.
12. Explica brevemente el FISH multicolor
13. Explica brevemente el cariotipo espectral.
14. Explica brevemente la hibridación genómica comparada convencional. (CGH).
15. ¿Qué es la ISH cromogénica (CISH)?.
16. Las sondas utilizadas en CISH se marcan con ¿ isótopos radiactivos o con haptenos?.
17. ¿Por qué hay que realizar una contratinción en la técnica del CISH?.
18. ¿Por qué es importante realizar controles en la técnica del CISH?.