CHUYÊN ĐỀ DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

LÂN THƯ XII – NĂM 2019

- - -  - - -

CHUYÊN ĐỀ
ƯNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC TẠO GIỐNG
BẰNG CÔNG NGHỆ GEN

* * *

tháng 8 năm 2019

1
 MỤC LỤC

A. PHÂN MỞ ĐÂU...............................................................................................5

1. Lý do chọn đề tài................................................................................................ 5

2. Mục đích của đề tài.............................................................................................5

3. Nội dung của đề tài............................................................................................. 5

4. Đối tượng áp dụng.............................................................................................. 6

5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 6

B . PHÂN NỘI DUNG......................................................................................... 7

I. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ GEN........................................................... 7

1. Công nghệ gen là gì?....................................................................................... 7

2. Một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen......................................................8

2.1. Gen cần tách dòng......................................................................................8

2.2. Enzym giới hạn.......................................................................................... 8

2.2.1. Khái niệm enzyme giới hạn...................................................................8

2.2.2. Cách gọi tên enzyme giới hạn................................................................ 8

2.3. Các loại enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật gen..............................10

2.3.1. Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA................................................. 10

2.3.2. Enzyme DNA ligase............................................................................. 10

2.3.3. Các loại enzyme phân cắt acid nucleic.................................................11

2.4. Vector tách dòng...................................................................................... 11

2.4.1. Khái niệm..............................................................................................11

2.4.2. Các loại vector tách dòng..................................................................... 11

2
 2.5. Vector biểu hiện gen................................................................................ 16

2.5.1. Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện gen............................................... 16

2.5.2. Các loại promoter thường sử dụng trong vector biểu hiện gen........... 16

2.6. Các hệ thống biểu hiện gen......................................................................17

3. Các thao tác cơ bản trong kỹ thuật chuyển gen.............................................17

3.1. Tách acid nucleic từ tế bào......................................................................... 17

3.1.1. Tách chiết DNA từ tế bào hoặc tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA... 17

3.1.1.1. Tách chiết DNA từ tế bào..................................................................17

3.1.1.2. Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA.................................................. 18

3.1.2. Tách chiết acid nucleic để làm vector tách dòng................................. 19

3.1.4. Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA........................................................19

3.1.4.1. Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trên gel.................. 19

3.1.4.2. Kiểm tra độ tinh sạch của DNA, RNA bằng quang phổ kế.............. 21

3.2. Tạo vector tái tổ hợp...................................................................................21

3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.................................................. 22

3.4. Sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp................................ 23

3.4.1. Chọn lọc tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh.............................. 23

3.4.2. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu.........................25

3.4.3. Chọn lọc dòng tế bào bằng phương pháp lai phân tử...........................25

3.5. Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm............................................... 25

II. ƯNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ GEN......................................................26

2.1. Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen.................................. 26

2.1.1. Tách dòng gen..........................................................................................26

2.1.1.1. Xây dựng thư viện hệ gen..................................................................27

3
 2.1.1.2. Xây dựng thư viện cDNA..................................................................28

2.1.2. PCR và ứng dụng của PCR..................................................................... 30

2.2. Ứng dụng công nghệ gen trong y học, dược học.......................................... 35

2.2.1. Liệu pháp gene......................................................................................35

2.2.2. Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học........ 36

2.3. Ứng dụng công nghệ gen tạo các sinh vật biến đổi gen............................... 40

2.3.1. Các phương pháp chuyển gen...............................................................40

2.3.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp....................................................40

2.3.1.3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.................................................... 42

* Chuyển gen bằng súng bắn gen................................................................... 42

* Chuyển gen nhờ siêu âm..............................................................................42

* Chuyển gen trực tiếp bằng cách lắc với silicon carbide..............................42

* Chuyển gen bằng kỹ thuật điện xung.......................................................... 43

* Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm............................................................... 43

2.3.2. Chuyển gen ở thực vật.......................................................................... 43

2.3.3. Chuyển gen ở động vật......................................................................... 45

III. MỘT SỐ CÂU HỎI, BÀI TẬP VỀ CÔNG NGHỆ GEN....................... 48

C -ƯNG DỤNG THỰC TIỄN CỦA CHUYÊN ĐỀ........................................ 70

D. PHÂN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................71

1. KẾT LUẬN......................................................................................................71

2. ĐỀ NGHỊ......................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................72

4
 CHUYÊN ĐỀ

ƯNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ GEN

Tác giả: Đỗ Thị Loan

Trường Trung học phổ Chuyên Hưng Yên

A. PHÂN MỞ ĐÂU
1. Lý do chọn đề tài
Những hiểu biết sâu sắc về di truyền học có vai trò cách mạng hóa đối với sự
phát triển của loài người. Di truyền học đã cung cấp cơ sở khoa học cho những
ứng dụng trong thực tiễn sản xuất chọn giống vi sinh vật, vật nuôi và cây trồng.
Đặc biệt, sự ra đời của kỹ thuật di truyền đã cung cấp cho con người công cụ
vượt giới hạn trong cuộc cách mạng công nghệ sinh học tạo sự chuyển biến lớn
trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y dược học và nhiều lĩnh vực khác.
Hiện nay, trong thời đại công nghệ sinh học phát triển, chương trình Sinh
học trung học phổ thông tổng thể cũng đổi mới, cập nhật những ứng dụng
nguyên lí, quy trình công nghệ sinh học trong giảng dạy. Và những kiến thức
này cũng là một chuyên đề quan trọng trong thi THPT Quốc gia và thi học sinh
giỏi quốc gia môn Sinh học. Vì vậy, tôi chọn chuyên đề “Ứng dụng di truyền
học tạo giống bằng công nghệ gen” giúp hệ thống lại kiến thức lý thuyết và các
câu hỏi, bài tập củng cố cho học sinh ôn tập trong thi THPT Quốc gia và thi Học
sinh giỏi quốc gia môn Sinh học.
2. Mục đích của đề tài
- Hệ thống hóa kiến thức về công nghệ gen, một số ứng dụng của công nghệ
gen.
- Hệ thống một số câu hỏi, bài tập phần ứng dụng di truyền học tạo giống
bằng công nghệ gen.
3. Nội dung của đề tài
- Lý thuyết
+ Khái quát về công nghệ gen
+ Các ứng dụng của công nghệ gen

5
- Một số câu hỏi, bài tập về công nghệ gen.
4. Đối tượng áp dụng
- Học sinh ôn thi trung học phổ thông Quốc gia.
- Học sinh ôn thi học sinh giỏi các cấp.
- Các giáo viên Sinh học.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu thập tài liệu.

6
 B . PHÂN NỘI DUNG
Công nghệ gen được ứng dụng trong nghiên cứu hệ gen, phân tích các sản
phẩm của gen, trong y học, dược học và trong nông nghiệp tạo ra các sản phẩm
chuyển gen cho năng suất, chất lượng cao giúp đem lại lợi ích kinh tế to lớn cho
con người.
I. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ GEN
1. Công nghệ gen là gì?
Gen là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa cho một sản phẩm
xác định (một chuỗi pôlinucleotit hoặc RNA).
Công nghệ gen hay kỹ thuật di truyền (genetics engineering) là các kỹ thuật
hiện đại được thực hiện trên acid nucleic nhằm nghiên cứu cấu trúc gen, điều
chỉnh và biến đổi gen, tách, tổng hợp và chuyển các gen mới vào tế bào để tạo ra
cơ thể sinh vật mới mang những đặc tính mới, cũng như tạo ra sản phẩm mới.
Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách
DNA từ cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy,
người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc
hiệu theo chủ ý lựa chọn. Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên
ngoài cơ thể sống trong các ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo
dựng sau các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban
đầu được tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này
được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thành
công chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và
chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử
DNA tái tổ hợp.
Ba lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của công nghệ gen là:
- Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen
- Sản xuất các chế phẩm sinh học
- Tạo các sinh vật biến đổi gen.

7
 2. Một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen
2.1. Gen cần tách dòng
- Gen cần tách dòng thường là những gen mã hoá các protein, enzym hoặc
gen mã hoá các đặc điểm quý (năng suất cao, khả năng chống bệnh…) cần thiết
cho con người trong thực tiễn sản xuất hoặc trong nghiên cứu. Gen này có thể
được tách chiết từ bộ gen vi sinh vật, động thực vật và con người hoặc tổng hợp
nhân tạo từ mRNA theo con đường sao mã ngược.
2.2. Enzym giới hạn
2.2.1. Khái niệm enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme - RE) là enzyme có khả năng nhận
biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên phân tử DNA và cắt đặc hiệu phân tử
DNA tại những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn.
Căn cứ vào khả năng nhận biết vị trí và cắt đặc hiệu của enzyme mà người ta
có thể thành các nhóm enzyme giới hạn thành ba nhóm:
- Nhóm thứ nhất: Chúng nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu sau đó cắt
DNA tại vị trí cách vị trí đó khoảng 1000 - 5000 nucleotide về phía trước.
- Nhóm thứ hai: Chúng nhận biết đoạn đặc hiệu và cắt ngay tại vị trí đặc
hiệu đó. Loại này có vai trò quan trong trong kỹ thuật gen.
- Nhóm thứ ba: nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu sau đó cắt DNA tại vị
trí cách vị trí đó khoảng 20 nucleotide về phía trước.
Đặc điểm enzyme giới hạn: Mỗi enzyme giới hạn có đặc tính cao trong dung
dịch đệm phù hợp và ở những điều kiện nhất định về nhiệt độ, pH…Enzyme
giới hạn không mang tính đặc hiệu loài. Vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu trên
phân tử DNA của mỗi enzyme giới hạn là khác nhau, gọi là vị trí giới hạn.
2.2.2. Cách gọi tên enzyme giới hạn
Cách gọi tên enzyme giới hạn được thống nhất ký hiệu bằng 3- 5 chữ cái
kèm theo các số La Mã.
Chữ cái đầu tiên viết hoa, chỉ tên chi của vi khuẩn (sinh vật) đã tách được
enzyme giới hạn.
Hai chữ cái tiếp theo viết thường, chỉ loài hoặc giống vi sinh vật đã tách
được enzyme giới hạn.
Chữ cái tiếp theo viết hoa chỉ tên chủng của vi khuẩn đã tách được enzyme
giới hạn.
8
 Chữ số La Mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn hoặc sinh vật mà enzyme giới hạn
được phát hiện.

Ví dụ: Enzyme EcoR I: E là tên chi vi khuẩn Escherichia

co là tên giống coli
R là tên chủng Ry13
I là thứ tự dòng vi khuẩn.

2.2.3. Các kiểu cắt của enzyme giới hạn:

Enzyme giới hạn có hai kiểu cắt.
Cắt thẳng tạo ra các đầu bằng, enzyme giới hạn cắt cả hai mạch của phân tử
DNA cùng một điểm tạo các đoạn cắt có đầu bằng (hay đầu tù) (blunt ends).
Các đoạn DNA tạo ra có đầu bằng nên không có khả năng tự dính lại với nhau.
Do vậy để nối các đoạn DNA có đầu bằng phải sử dụng enzyme nối (DNA
ligase) hoặc các adaptor (bộ chuyển đổi) chuyên dụng cho mỗi loại enzyme.

Cắt lệch (cắt sole): Các enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các
vị trí khác nhau giữa hai mạch đơn DNA tạo nên các đoạn cắt có đầu sole (hay
đầu dính – sticky ends). Có 2 loại là đầu dính 5’ và đầu dính 3’. Các đầu so le có
thể tự nối lại với nhau mà không cần có mặt của enzyme nối, do đó các enzyme
cắt tạo đầu so le hay được sử dụng trong công nghệ gen.
Ví dụ: enzyme EcoR I nhận biết đoạn có 6 nucleotid và cắt tạo đầu so le.

9
 Tên và kiểu cắt của một số enzyme giới hạn:

2.3. Các loại enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật gen

2.3.1. Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA
Nhóm enzyme xúc tác tổng hợp DNA gọi chung là DNA polymerase, gồm
rất nhiều loại khác nhau có vai trò xúc tác gắn các nucleotid mới vào chuỗi
mạch đơn DNA đang tổng hợp. Một số loại enzyme DNA polymerase điển hình
là: Taq DNA polymerase, Stoffel DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Vent
DNA DNAmerase, T4 DNA polymerase, enzyme phiên mã ngược, enzyme xúc
tác tổng hợp RNA,…
2.3.2. Enzyme DNA ligase
Enzyme DNA ligase là loại enzyme xúc tác hình thành các liên kết
phosphoeste nối các đoạn DNA với nhau. Mỗi loại enzyme DNA ligase có các
tính chất đặc trưng riêng, có khả năng nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu so
le.
VD: Enzyme E.coli DNA ligase chỉ nối các đoạn DNA có đầu so le, còn T4
DNA ligase là enzyme được tách chiết từ thực khuẩn thể T4, có khả năng nối
các đoạn DNA cắt đầu bằng hoặc đoạn DNA cắt so le được sử dụng rộng rãi
trong kỹ thuật gen. Trong kỹ thuật gen còn chứa một số loại enzyme khác tham
gia vào phản ứng nối DNA như T4 polynucleotide kinase, Alkaline
phosphatase…

10
 2.3.3. Các loại enzyme phân cắt acid nucleic
Các enzyme phân cắt phân tử DNA (DNase) hoặc cắt phân tử RNA (RNase)
có vai trò quan trọng trong các kỹ thuật tinh sạch DNA, RNA, trong phản ứng
phiên mã ngược tạo cDNA. Enzyme cắt phân tử DNA gồm nhiều loại khác nhau:
DNase I, Nuclease S1, Exonuclease… Các loại enzyme cắt RNA chủ yếu gồm
RNase A, RNase H…
2.4. Vector tách dòng
2.4.1. Khái niệm
Vector tách dòng (cloning vector) còn gọi là phương tiện chuyển gen. Vector
tách dòng là thường là các phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài các
đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của
tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen
của tế bào vật chủ.
Vector tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiệu duy nhất cho các loại
enzyme giới hạn khác nhau, đồng thời mang các gen “tín hiệu” (gen chỉ thị màu
hoặc chỉ thị kháng sinh) để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp.
Đặc điểm cần thiết của các vector tách dòng:
- Kích thước vector càng nhỏ càng tốt để có thể cài DNA có kích thước tối
đa. Kích thước vector nhỏ càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép
càng nhanh.
- Vector phải có điểm khởi đầu tái bản (ori), tức là có khả năng để tái bản.
- Vector có khả năng xâm nhập vào tế bào.
- Vector phải có đặc điểm cho phép dễ nhận biết chúng trong tế bào chủ.
Chúng thường chứa các gen kháng chất kháng sinh hoặc gene tổng hợp chất
màu, dễ dàng phát hiện trong môi trường thạch.
Vector tách dòng được sử dụng để chuyển gen nhằm tạo số lượng lớn các
bản sao của một gen hoặc một trình tự DNA trong các tế bào chủ. Vector tách
dòng có vai trò quan trọng trong tách dòng gen, giải trình tự gen hoặc xây dựng
các bản đồ gen…
2.4.2. Các loại vector tách dòng
2.4.2.1. Vector tách dòng là plasmid
Plasmid là các phân tử DNA xoắn kép dạng vòng, có kích thước nhỏ, trong
tế bào chất của tế bào vi khuẩn hoặc tế bào nấm men. Kích thước trung bình của

11
plasmid từ 1 – 5 kb, plasmid có khả năng tự tái bản độc lập với sự phân chia tế
bào. Plasmid cho cài gắn các đoạn DNA lạ, không gây ảnh hưởng tới chức năng
và hoạt động của tế bào. Plasmid ở vi khuẩn mang một số ít gen như các gen xác
định giới tính, gen kháng chất kháng sinh, gen sinh độc tố… Mỗi loài vi khuẩn
có các loại plasmid đặc trưng riêng.
VD: Vi khuẩn E.coli có nhiều loại plasmid khác nhau: plasmid giới tính F,
plasmid Col E1 mang gen sinh độc tố colicin ức chế sinh trưởng và tiêu diệt các
loại vi khuẩn khác…
Qui ước: viết tên một plasmid gồm chữ p viết thường (viết tắt của chữ
plasmid) đầu tiên, sau đó là một hoặc hai, ba chữ tiếp theo viết hoa chỉ chữ đầu
tên tác giả tạo nên plasmid hoặc tên vi khuẩn phát hiện plasmid và chữ số chỉ
thứ tự chủng vi khuẩn có plasmid đó.
VD: pBR322: B – Bolivar, R – Rodriguez là tên hai tác giả tạo nên plasmid
này, 322 chỉ số thứ tự.

Vector tách dòng pBR322

Plasmid được sử dụng làm vector tách dòng phải có các vị trí cắt đặc hiệu
của các enzyme giới hạn và các gen chỉ thị dễ nhận biết.
2.4.2.2. Vector tách dòng là phage
Phage (Bacteriophage) bao gồm nhiều loại thực khuẩn thể có bộ gen DNA
mạch đơn hoặc mạch kép được sử dụng làm vector tách dòng.
VD: phage M13 gắn thêm lacZ và các vị trí cắt đặc hiệu của các loại enzyme
giới hạn tạo thành nhiều loại vector tách dòng khác nhau: phage M13mp1,
M13mp7, M13mp18…
Vector tách dòng phage có một số ưu điểm hơn so với plasmid như vector
phage cho cài gắn đoạn DNA kích thước lớn hơn plasmid, phage có hệ thống
gen giúp xâm nhiễm và tạo nên số bản sao rất cao trong tế bào vi khuẩn. Vector

12
tách dòng là phage được sử dụng làm vector tách dòng hiêu quả ở cả tế bào chủ
là Prokaryote và Eukaryote.

Cấu trúc vector phage M13mp18

2.4.2.3. Vector tách dòng là phagemid
Phagemid cấu tạo gồm một số gen của plasmid (các gen chỉ thị, đoạn ori…)
và một phần gen của phage (đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói).

2.4.2.4. Vector tách dòng là cosmid

Vector cosmid được thiết kế từ một đoạn của plasmid và đoạn cos của phage
λ. Trình tự cos điều khiển đóng gói DNA của phage vào phần đầu của phage.
Vector tách dòng là cosmid cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước lớn 40 -
50 kb.

13
 VD: Vector SuperCos kích thước 7,9kb có cấu trúc gồm 2 đoạn cos của bộ
gen phage, 2 gen chỉ thị kháng sinh (ampicilin và neomycin), đoạn ori của virus
SV40 và đoạn đa cắt nối (MCS). Vector cosmid cho cài gắn DNA có kích thước
lớn tới 50kb.

2.4.2.5. Vector tách dòng là các NST nhân tạo

Bộ gen của sinh vật bậc cao có kích thước rất lớn. Do đó, khi thiết lập các
ngân hàng bộ gen, ngân hàng cDNA sử dụng các loại vector plasmid, phage,
phagemid, cosmid… tạo nên số lượng dòng rất lớn, gây khó khăn trong tách
dòng. Các NST nhân tạo được thiết kế làm vector tách dòng, cho phép cài gắn
các đoạn DNA có kích thước rất lớn từ 100kb – hàng nghìn kb, tạo thuận lợi
trong tách dòng và lập ngân hàng gen.
Vector tách dòng là NST nhân tạo vi khuẩn BAC (Bacteria Artificial
Chromosomes): Cấu trúc vector BAC gồm các đoạn ori, các gen chỉ thị đặc hiệu,
đoạn đa cắt nối (MCS – many cloning site) và promoter đặc hiệu.
Vector BAC cho phép cài gắn đoạn DNA kích thước từ 100kb – 300kb.
Vector BAC được ứng dụng nhiều trong lập ngân hàng bộ gen và giải trình tự bộ
gen của sinh vật Prokaryote và Eukaryote.
Vector tách dòng là NST nhân tạo nấm men (YAC – Yeast Artificial
Chromosomes) có thể cho cài gắn đoạn DNA lớn tới 2000kb. Vector YAC được
thiết kế từ một số trình tự đặc hiệu của bộ gen nấm men, trong đó có 3 trình tự
quan trọng là trình tự tái bản ARS (Autonomous Replicating Sequences), tâm
động CEN (centromer) và trình tự TEL (telomer).
Ngoài các trình tự chủ yếu ARS, CEN, TEL… vector YAC còn được gắn
thêm các gen chỉ thị đặc hiệu với tế bào nấm men trpI (auxotrophs), ura3
14
(uracin), leu2 (leucin), his3 (histidin)… các gen chỉ thị kháng sinh và các đoạn
ori của vi khuẩn hoặc đoạn đa cắt nối (MCS)…
2.4.2.6. Vector tách dòng là Ti plasmid
Ti plasmid là plasmid có kích thước lớn tới 200kb trong tế bào vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien. Ti plasmid có một đoạn T – DNA kích thước
khoảng 10 – 20 kb mang các gen tổng hợp opin, auxin… gây nên các khối u ở
thực vật hai lá mầm. Do khả năng xâm nhiễm tự nhiên vào cây hai lá mầm thông
qua các vết xước rễ cây, nên Ti plasmid được cải biến cấu trúc làm vector tách
dòng và vector chuyển gen có hiệu quả ở thực vật.

2.4.2.7. Vector tách dòng ở tế bào sinh vật Eukaryote

Nhiều loại vector tách dòng plasmid, cosmid… hoạt động kém ở các tế bào
thực vật và động vật bậc cao. Do vậy, trong tách dòng gen và chuyển gen ở động
vật có vú và nhiều loài sinh vật bậc cao khác, người ta thường sử dụng vector
tách dòng là các loại virus được cải tiến bộ gen, cắt bỏ các gen độc lực và cài
gắn thêm các gen chỉ thị đặc hiệu.
Các loại virus SV40 (Simian virus), adenovirus, retrovirus, baculovirus và
virus herpes…cải biến bộ gen (loại bỏ các gen độc, thêm các gen chỉ thị và các
đoạn MCS…) được sử dụng làm vector tách dòng, vector chuyển gen ở sinh vật
bậc cao.

15
 2.5. Vector biểu hiện gen
2.5.1. Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện gen
Vector biểu hiện là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho
phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protein lai.
Để tạo ra vector biểu hiện, thường người ta sử dụng ngay chính các vector
nhân dòng, rồi bổ sung thêm một promoter (trình tự tín hiệu khởi đầu phiên mã)
và có thể thêm cả trình tự tín hiệu kết thúc phiên mã phù hợp với loại tế bào chủ
mà gen nhân dòng được biểu hiện. Vậy một vector biểu hiện gen gồm các thành
phần chủ yếu: promoter mạnh, trình tự khởi đầu sao chép (ori), vị trí khởi đầu
phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc quá trình dịch mã, các trình
tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ thị.
Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm: có khả năng tạo số
lượng lớn bản sao trong tế bào chủ; promoter hoạt động mạnh, dịch mã tạo
nhiều protein lai; đoạn trình tự MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loại
enzym giới hạn; vector vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng kích
thước lớn; hoạt động của vector không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ;
gen chỉ thị dễ dàng nhận biết…

2.5.2. Các loại promoter thường sử dụng trong vector biểu hiện gen
Các loại vector biểu hiện gen trong tế bào prokaryote thường sử dụng các
promoter mạnh của thực khuẩn thể (T7 promoter; T3 promoter,…) hoặc một số
promoter mạnh của vi khuẩn (Lac promoter, Trp promoter, Lac UV5
promoter…)

16
 Biểu hiện trong tế bào eurokaryote thường sử dụng các vector biểu hiện gen
có các promoter mạnh của virus CMV promoter, SV40 promoter…hoặc các
promoter mạnh gen nấm men như PGK promoter, ADH I promoter, GAL
promoter, AOX I promoter…
2.6. Các hệ thống biểu hiện gen
Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết
định sự thành bại của kỹ thuật gen. Hệ thống các tế bào chủ thường được sử
dụng trong biểu hiện gen bao gồm: tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào
trứng động vật có vú và baculovirus,…
Mỗi loại hệ thống biểu hiện gen có đặc điểm đặc trưng riêng, cùng với các
thuận lợi và hạn chế nhất định. Cần căn cứ vào đặc điểm của gen biểu hiện, bản
chất của protein tách dòng và protein lai, cũng như điều kiện cụ thể của từng
phòng thí nghiệm để lựa chọn hệ thống biểu hiện gen thích hợp.
3. Các thao tác cơ bản trong kỹ thuật chuyển gen
Trọng tâm của công nghệ gen là kỹ thuật chuyển gen tạo DNA tái tổ hợp
nhằm chuyển gen từ tế bào này sang tế bào khác. Kỹ thuật chuyển gen có thể
chia thành 5 bước sau: 1) tách acid nucleic khỏi tế bào, 2) tạo vector tái tổ hợp, 3)
biến nạp vector tổ hợp vào tế bào chủ, 4) sàng lọc các dòng tế bào mang vector
tái tổ hợp, 4) sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp, 5) nuôi cấy tế
bào tái tổ hợp để thu sản phẩm.
3.1. Tách acid nucleic từ tế bào
- Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ
bộ gen vi sinh vật, động thực vật và con người hoặc tổng hợp nhân tạo các
oligonucleotid từ mRNA. Trong thực tế, các gen mang các đặc điểm quý hiếm,
cần thiết cho con người chủ yếu được tách chiết từ bộ gen vi sinh vật hoặc từ bộ
gen sinh vật bậc cao.
Đồng thời, cũng cần tách các vector tách dòng như plasmid ra khỏi tế bào vi
khuẩn hay bộ gen của phage để chuẩn bị tạo vector tái tổ hợp.
3.1.1. Tách chiết DNA từ tế bào hoặc tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA
3.1.1.1. Tách chiết DNA từ tế bào
Nguyên tắc chung tách chiết DNA:
Chuẩn bị mẫu  Phá vỡ tế bào Hòa tan DNA Loại bỏ tạp chất (Protein,
polysaccharide,…) Tủa DNA – Rửa DNA Làm khô Kiểm tra chất lượng
DNA
17
 - Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường
người ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) và
proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân,
giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
- Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là
các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform,
dung dịch phenol : chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời
không hòa tan axit nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong
pha nước có chứa axit nucleic và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa
pha nước và pha phenol : chloroform. Pha nước có chứa axit nucleic được thu
nhận lại.
- Bước 3: Tủa axit nucleic. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận lại axit
nuclêic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các
enzyme, mặt khác để có thể hòa tan lại trong dung dịch theo nồng độ mong
muốn. Có 2 cách tủa thông dụng là tủa trong ethanol và tủa trong isopropanol.
Lớp dịch
lỏng chứa
DNA
Thêm cồn tuyệt đối lạnh Li tâm, hút bỏ
Lớp protein và dung dịch muối dịch lỏng
kết tủa

Lớp dung dịch

phenol
Lớp dịch lỏng chứa DNA Axit nucleic dạng cô đặc

3.1.1.2. Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA

- Tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với
DNA.
- Tách chiết mRNA: 90 – 99% RNA tổng số là rRNA, tRNA. Các loại RNA
này có kích thước và trình tự xác định và có thể tách riêng một cách dễ dàng
bằng điện li và li tâm. Riêng mRNA chiếm 1-5% có kích thước và trình tự đa
dạng, song chúng có 1 đặc điểm chung là có đuôi polyA nên người ta có thể tách
riêng ra bằng sắc kí cột oligo dT – cellulose.
- Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA: Từ mRNA dưới sự xúc tác của
enzyme phiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) và sự tham gia của các đoạn

18
mồi oligo dT ngắn (12-18 nucleotide) và các nguyên liệu dNTP (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP) sẽ tổng hợp mạch DNA mạch kép.
3.1.2. Tách chiết acid nucleic để làm vector tách dòng
- Vector tách dòng có thể là plasmid của vi khuẩn hoặc bộ gen của phage,
NST nấm men,vector nhân tạo…nên tùy kích thước gen cần chuyển và tế bào
chủ mà chọn vector nào và cần tách chúng ra khỏi tế bào để sử dụng làm vector
tách dòng.
- Ví dụ chọn plasmid là vector tách dòng thì cần tách plasmid ra khỏi tế bào
vi khuẩn:
+ Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp.
+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút qua
đêm, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5-6 phút thu sinh khối.
+ Phá vỡ tế bào bằng hoá chất hoặc siêu âm. Sau đó xử lý natri acetat
(pH=4,3) và ly tâm 12000 vòng trong 10 phút. Sau ly tâm bộ gen và protein của
vi khuẩn kết tủa ở đáy, lớp dịch nổi phía trên chứa DNA plasmid. Thu lớp dịch
nổi, thêm ethanol hay làm lạnh để kết tủa DNA plasmid.
3.1.4. Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA
DNA hay RNA được tách chiết ở bước trên có thể bị lẫn tạp với protein hay
polysaccharide,… Vì vậy, trước khi sử dụng cần kiểm tra độ tinh sạch của chúng.
Có 2 phương pháp là kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trên gel và
bằng quang phổ kế.
3.1.4.1. Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trên gel
Kỹ thuật điện di sử dụng một loại gel là các hợp chất polyme như
polysaccharide. Gel hoạt động như một chiếc “rây” cho phép phân tách các phẩn
tử acid nucleic, protein ra khỏi nhau dựa trên kích thước, độ tích điện, cấu trúc
và một số tính chất vật lý khác.
- Điện di trên gel agarose (agarose gel electrophoresis)dùng để tách các đoạn
DNA có kích thước từ 100 bp đến 50 kb.Tại pH > 7, DNA tích điện âm, dưới tác
dụng của điện trường thì DNA sẽ chạy từ (-) về phía (+).
Tốc độ di chuyển của DNA trên gel phụ thuộc vào kích thước DNA, cấu trúc
DNA (DNA siêu xoắn chạy nhanh nhất, dạng vòng chạy nhanh hoen dạng thẳng
khi có cùng khối lượng phân tử), nồng độ agarose, cường độ dòng điện, đệm
điện di, nhiệt độ,…

19
 Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trong
mẫu đảm bảo cho nghiên cứu. Nếu các vạch kéo dài hoặc phân tách không rõ
cần xử lý lại từ khâu xử lý proteinase K, để đảm bảo độ tinh sạch cuả mẫu
nghiên cứu.

20
 3.1.4.2. Kiểm tra độ tinh sạch của DNA, RNA bằng quang phổ kế
Trên cơ sở mức độ hấp thụ ánh sáng khác nhau của các bazơ nitơ trong các
mạch đơn DNA, DNA mạch kép và RNA có thể xác định hàm lượng của DNA,
RNA trong dịch chiết bằng chỉ số hấp phụ quang phổ.
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dịch chiết dựa vào tỷ lệ A260/
A280. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu DNA cho phép
xác định nồng độ DNA trong dung dịch.
Giá trị OD260 nm tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch DNA sợi
đôi.
CDNA (ng/ml) = OD260nm * 50 * độ pha loãng.
Protein có mức hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở
bước sóng 260 nm, do vậy tỷ lệ A260/ A280 biểu thị mức độ protein còn sót lại
trong dịch chiết. DNA( RNA) được coi là tinh sạch khi tỷ số A260/ A280 = 1,8-
2,0.
3.2. Tạo vector tái tổ hợp
Dựa vào đặc điểm của gen cần tách dòng để lựa chọn loại vector tách dòng
và các enzym giới hạn phù hợp, nhằm thực hiện phản ứng ghép nối giữa các gen
cần chuyển với vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp.
Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA cần chuyển và tế bào chủ mà chọn
vector tách dòng có thể là plasmid vi khuẩn, phage, phagemid, cosmid hay các
NST nhân tạo,…
Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên
phân tử DNA và cắt đặc hiệu phân tử DNA tại những vị trí nhất định thành
những đoạn ngắn.
Cắt cả DNA cần chuyển và DNA vector bằng cùng 1 enzyme giới hạn để
tách đoạn DNA mục tiêu và mở vòng plasmid. Mục đích cắt cả DNA cần
chuyển và DNA vector bằng cùng 1 enzyme giới hạn để tạo ra đầu dính bổ sung
để có thể gắn chúng với nhau. Tùy loại enzyme cắt giới hạn có thể tạo ra đầu
dính bằng hoặc đầu dính so le nhau. Sau đó chúng được gắn với nhau bằng
enzyme lygase để tạo DNA tái tổ hợp.

21
 Enzyme nối lygase

3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

Sử dụng các cách khác nhau (sốc nhiệt, xung điện, bắn gen...) để đưa các
vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tạo điều kiện môi trường thích hợp để vector
tái tổ hợp tồn tại và được nhân lên cùng tế bào chủ.
Tế bào chủ có thể là tế bào vi khuẩn, nấm men, thực vật hay động vật, nhưng
thường dùng là tế bào vi khuẩn E.coli. Một trong những phương pháp biến nạp
đòi hỏi tế bào chủ phải được xử lý trước CaCl2 ở 4oC để lỗ màng tế bào chủ mở
rộng ra cho DNA tái tổ hợp chui vào.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật
khác nhau: bắn gen, vi tiêm, xung điện, sốc nhiệt, sử dụng PEG (polyethylene
glycols)…
Hiệu quả biến nạp phụ thuộc vào loại tế bào chủ, kích thước vector tái tổ
hợp và kỹ thuật biến nạp thích hợp. Để hiệu quả biến nạp cao, cần lựa chọn kỹ
thuật biến nạp thích hợp với mỗi loại tế bào chủ. Thực tế, tỉ lệ biến nạp rất thấp
< 1/1000. Vì sau biến nạp, đa số tế bào không giành được plasmid mới. Hơn nữa,
một số tế bào đã được các plasmid tái khép vòng do thoát khỏi khử phosphat
bằng phosphatase kiềm. Một số giành được DNA ngoại lai không có plasmid
(DNA này sẽ tự hủy). Chỉ có một số ít tế bào được biến nạp DNA tái tổ hợp. Vì
vậy, sau bước biến nạp cần phải biết được và tách được tế bào có DNA tái tổ
hợp.

22
 3.4. Sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp
Sàng lọc (screening) dòng tái tổ hợp là quá trình kiểm tra, chọn lọc và tách
riêng các dòng tái tổ hợp có hoạt tính.
Dòng tế bào tái tổ hợp (còn gọi là thể tái tổ hợp) là dòng các tế bào mang
vector tái tổ hợp, được nuôi ở môi trường thích hợp thành các khuẩn lạc. Tùy
theo đặc điểm của gen chỉ thị có trong vector tái tổ hợp, có thể lựa chọn các tế
bào tái tổ hợp theo nhiều phương pháp khác nhau. Phương pháp chọn lọc tế bào
tái tổ hợp có thể sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau: sử dụng chỉ thị kháng sinh,
sử dụng chỉ thị màu hoặc lai phân tử với mẫu dò đánh dấu phóng xạ, huỳnh
quang…
3.4.1. Chọn lọc tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh
Là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng.
Dựa vào gen kháng chất kháng sinh trong vector tái tổ hợp, chuẩn bị môi
trường dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh tương ứng để nuôi cấy tế bào sau
biến nạp. Trong môi trường có chất kháng sinh tế bào chứa vector tái tổ hợp có
gen kháng chất kháng sinh tồn tại và phát triển được.
Ví dụ sàng lọc DNA tái tổ hợp với vector tách dòng là pBR322. pBR322
chứa gen kháng ampicillin (AmpR) và gen kháng tetracycline (TetR). Tại vị trí
gen TetR có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn như: HindIII, BamHI,…
23
 Trong pBR322, DNA đích được xen vào vị trí BamHI nằm ở gen TetR. Sau
bước biến nạp, có 3 loại tế bào: tế bào không chứa plasmid, tế bào chứa plasmid
khép vòng nguyên vẹn và tế bào chứa DNA tái tổ hợp. Ta cần biết và tách ra
được những tế bào có nhận DNA tái tổ hợp.
Những tế bào không chứa plasmid sẽ không thể sống được trong môi trường
có ampicillin và tetracycline. Những tế bào chứa plasmid nguyên vẹn sẽ sống
được trong môi trường có ampicillin và tetracycline. Những tế bào chứa DNA
tái tổ hợp sẽ sống được trong môi trường có ampicillin nhưng mẫn cảm với
tetracycline (gen kháng tetracycline bị gãy do enzyme giới hạn cắt và chèn AND
cài vào).
- Nuôi cấy hỗn hợp các tế bào trong môi trường chứa ampicillin. Chỉ các tế
bào chứa plasmid khép vòng nguyên vẹn và tế bào chứa DNA tái tổ hợp mới
sống được và hình thành các khuẩn lạc.
- Nuôi cấy in dấu các tế bào mọc được ở môi trường chứa ampicillin sang
môi trường có tetracycline. Những tế bào chứa plasmid nguyên vẹn sẽ sống
được còn tế bào chứa DNA tái tổ hợp không sống được trên môi trường có
tetracycline. Ta chọn các khuẩn lạc tương ứng trên đĩa chứa ampicillin và nuôi
cấy chúng tiếp tục.

24
 3.4.2. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu
Sử dụng gen chỉ thị mầu với gen chỉ thị kháng sinh là phương pháp chọn lọc
dòng tế bào tái tổ hợp có hiệu quả cao. Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở
tế bào vi khuẩn, gen LacZ kết hợp với ITPG và X-gal làm gen chỉ thị màu tương
đối phổ biến.
3.4.3. Chọn lọc dòng tế bào bằng phương pháp lai phân tử
Là phương pháp chọn lọc dòng tế bào tổ hợp có độ chính xác cao. Tuy nhiên,
kỹ thuật thực hiện tương đối phức tạp, tốn kếm về hóa chất và đòi hỏi các thiết
bị chuyên dùng. Tùy theo điều kiện nghiên cứu, có thể sử dụng phương pháp lai
acid nucleic (DNA, RNA) với mẫu dò đánh dấu phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh
quang. Các bước thực hiện chủ yếu gồm:
- Sau khi biến nạp, các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men được nuôi cấy ở hộp
Petri để mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Đặt một màng lai
(nitrocellulose) lên trên hộp Petri, để các khuẩn lạc in dấu lên màng lai ở các vị
trí tương ứng.
- Lấy màng lai đã in dấu các khuẩn lạc vi khuẩn sau biên nạp đem lai phân ử
với mẫu thăm dò đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang, mẫu do phải có trình tự
tương ứng với đoạn đặc hiệu của gen tái tổ hợp.
- Ủ ở nhiệt độ thích hợp để tạo phản ứng lai. Rửa màng lai để loại bỏ các
thăm dò không được lai và thực hiện phóng xạ tự ghi.
Kết quả hiện hình phóng xạ cho thấy ở những vị trí có phản ứng lai sẽ có các
chấm đen trên phim nhạy phóng xạ, hoặc các vết màu khi hiện hình huỳnh
quang. Lựa chọn các khuẩn lạc ở các vị trí tương ứng trong hộp Petri thu được
các dòng tái tổ hợp.
3.5. Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm
Tế bào tái tổ hợp được nuôi trong các bình lên men, với điều kiện thích hợp
về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ pH,... để các tế bào tăng sinh khối nhanh, tạo các
sản phẩm protein tái tổ hợp ở mức cao nhất. Thực hiện công nghệ tách chiết
protein tái tổ hợp, tinh sạch thu chế phẩm.

25
 II. ƯNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ GEN
2.1. Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen.
2.1.1. Tách dòng gen
Hệ gen động vật, thực vật, vi sinh vật thường quá lớn để phân tích bằng điện
di trên gel và lập bản đồ giới hạn nên tách dòng gen được thực hiện với mục
đích xác định một phân đoạn DNA đặc thù trong hệ gen, tinh sạch đoạn gen đó
với các phân đoạn khác, khuếch đại, tạo nhiều bản sao các phân đoạn gen, sau
đó, có thể phân tích phân đoạn gen đã tách dòng bằng lập bản đồ giới hạn và giải
trình tự DNA.
Tách dòng gen (gene cloning) là gắn một gen, 1 trình tự DNA cần thiết vào
vector tách dòng, tạo vector tái tổ hợp và đưa vào tế bào nhận (tế bào chủ) nhằm
thu được một số lượng lớn các bản sao của gen hoặc trình tự DNA cần thiết.
Tách dòng gen in vitro gồm tách dòng gen đã biết và tách dòng gen chưa
biết.
* Tách dòng gen đã biết
- Tạo đoạn DNA cài (DNA insert): tách chiết DNA cần tách dòng từ các
mẫu nghiên cứu  khuếch đại DNA bằng PCR cắt đoạn gen cài bằng enzim
giới hạn thích hợp. Sử dụng cùng enzim giới hạn đó cắt vector tách dòng.

26
 - Tạo vector tái tổ hợp: trộn vector tách dòng và các đoạn cài DNA chung
với nhau với tỷ lệ nhất định, có sự tham gia của enzyme T4 DNA lygase.
Enzyme T4 DNA lygase xúc tác gắn đoạn DNA cài và vector tách dòng tạo
vector tái tổ hợp.
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: vector tái tổ hợp sẽ được nhân
lên với số lượng lớn bản sao. Tế bào chủ thường là tế bào vi khuẩn vì chúng sinh
sản nhanh, thao tác dễ, ít tốn kém.
- Chọn và sàng lọc các thể tái tổ hợp: Nuôi cấy vi khuẩn có vector tái tổ hợp
trong môi trường thích hợp, sử dụng các gen chỉ thị là gen mã hóa khả năng
kháng kháng sinh, X – gal,… để chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
* Tách dòng gen chưa biết
Tách dòng gen chưa biết là kỹ thuật từ mRNA tạo nên các gen tương ứng.
Dự đoán cấu trúc của protein do gen chỉ huy tổng hợp, kết hợp phân tích thành
phần và trình tự sắp xếp của các acid amin trong phân tử protein do gen mã hóa
để xác định gen cần nghiên cứu.
Tách chiết RNA tổng số  sử dụng enzyme sao mã ngược RT (Reverse
transcriptase) và DNA polymerase tạo DNA bổ sung (cDNA – complementary
DNA)  tách dòng gen cDNA.
Sau khi tách dòng gen, người ta xây dựng các thư viện DNA – là tập hợp các
phân đoạn DNA của cùng hệ gen. Có 2 loại thư viện DNA chính là thư viện hệ
gen và thư viện cDNA.
2.1.1.1. Xây dựng thư viện hệ gen
Thư viện hệ gen là tập hợp các dòng phân đoạn DNA của hệ gen đã được
tách dòng của một cơ thể nào đó. Thư viện hệ gen có tính đặc trưng loài. Thư
viện hệ gen chứa toàn bộ trình tự nucleotide trong vật chất di truyền của một cơ
thể, bất kể trình tự nucleotide có được biểu hiện hay không. Như vậy, thư viện
hệ gen chứa tất cả các trình tự: các trình tự exon và intron, các vùng khởi đầu
phiên mã, kết thúc phiên mã, các trình tự điều hòa và liên gen.
Hệ gen được cắt bằng các enzyme giới hạn tạo các đoạn DNA khác nhau 
mỗi đoạn được gắn vào một vector tách dòng và nhân dòng trong một dòng vi
khuẩn khác nhau. Mỗi dòng vi khuẩn mang một đoạn DNA bộ gen, tập hợp tất
cả các dòng vi khuẩn gọi là thư viện hệ gen.
Đương lượng hệ gen (Genomic equivalent) f – số dòng trong một thư viện
hoàn chỉnh = độ dài của hệ gen/ kích thước trung bình của đoạn DNA chèn vào
vector tách dòng.
27
 Ví dụ: Hệ gen của E.coli có kích thước là 4,6 Mb tạo ra các phân đoạn DNA
có kích thước trung bình 5kb  Số dòng trong thư viện gen của E.coli là:
f = 4600000/5000 = 920.
Tập hợp tất cả các dòng vi khuẩn và phage tái tổ hợp được tạo nên thư viện
sơ cấp. Các dòng tái tổ hợp được phân lập từ môi trường nuôi cấy rồi được
chuyển vào các ống nghiệm phù hợp. Thư viện sơ cấp thường có mật độ thấp,
kém ổn định nên tập hợp các dòng vi khuẩn, phage tái tổ hợp lại trải ra trên môi
trường nuôi cấy lần nữa. Kết quả, tập hợp thế hệ con thu được hình thành nên
thư viện thứ cấp. Thư viện thứ cấp có lượng lớn hơn thư viện sơ cấp và thường
được sàng lọc nhiều lần.

2.1.1.2. Xây dựng thư viện cDNA

Bộ gen của sinh vật nhân chuẩn có kích thước lớn gồm DNA mã hóa các
protein, enzym, một phần lớn DNA rất lớn không mã hóa thông tin di truyền và
một số gen chưa rõ chức năng. Trong mỗi tế bào cơ thể chứa tất cả các gen trong
bộ gen. Các tế bào, các mô có các gen hoạt động ở từng giai đoạn khác nhau. Vì
vậy, tập hợp của các phân tử mRNA thu nhận được từ 1 tế bào phản ánh tập hợp
các gen đang được biểu hiện (ở mức phiên mã) trong tế bào ở 1 thời điểm nhất
định. Tuy nhiên, mRNA thường kém bền nên khó thao tác cũng như duy trì các
vector tách dòng. Vì vậy, người ta đã xây dựng một thư viện phản ánh được
trình tự DNA được phiên mã ngược từ các phân tử mRNA. Phân tử DNA này
được gọi là cDNA (DNA bổ sung– complementary DNA).
Thư viện cDNA không giống với thư viện hệ gen, thư viện cDNA phải được
xác lập từ 1 loại tế bào xác định, trong đó, các gen quan tâm phải được biểu hiện
thành mRNA. Thiết lập thư viện cDNA cũng tương tự như thư viện hệ gen
nhưng có một số khác biệt:
- Trước tiên, mRNA trong tế bào phải được tách ra bằng cách cho hỗn hợp
RNA thu được từ 1 loại mô qua cột sắc kí có chứa oligodeoxytimin để mRNA
có đuôi polyA được giữ lại còn tRNA, rRNA sẽ chảy xuống dưới. mRNA được
rút ra khỏi cột nhờ dung dịch muối loãng.
- Bổ sung các đoạn mồi oligo dT ngắn (12-18 nucleotide) với hỗn hợp
mRNA đã tinh sạch để đoạn mồi này liên kết với đuôi polyA – 3’ của mRNA.
- Bổ sung enzyme phiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) và các
nguyên liệu dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)  tổng hợp mạch DNA đơn bổ
sung với mạch RNA tạo RNA / DNAss (DNA mạch đơn).

28
 - Nhờ hoạt tính của RNAseH hoặc dung dịch thủy phân kiềm sẽ loại bỏ
mạch RNA, để lại phân tử DNAss.
- Nhờ hoạt tính của DNA polymerase tổng hợp mạch DNA đơn thứ 2 bổ
sung bổ sung với mạch DNA đơn thứ nhất tạo DNA mạch kép có cấu trúc kẹp
tóc. Sau đó, cấu trúc kẹp tóc được cắt bởi nuclease N1.

Sau khi tạo được cDNA, thư viện cDNA được tạo ra như sau:
- Chọn vector: vector tách dòng thường được dùng là plasmid. Plasmid được
cắt bởi 1 enzyme giới hạn và được xử lý với photphatase kiềm để tránh bị khép
vòng tự động.
- Tạo các đầu dính cho cDNA rồi tổ hợp với plasmid tạo vector tái tổ hợp.

29
 - Biến nạp vào vi khuẩn chủ và nhân lên tạo thư viện cDNA.
- Sàng lọc thư viện hệ gen hay thư viện cDNA để tìm ra các dòng gen mong
muốn. Việc xác định gen này có thể sử dụng phương pháp lai acid nucleic. Mẫu
dò acid nucleic là 1đoạn DNA hoặc RNA ngắn sẽ liên kết với trình tự gen cần
tìm, được đánh dấu phóng xạ, sau đó chúng ta theo dõi và phát hiện. Khi xác
định được dòng gen mong muốn, chúng ta có thể nuôi cấy nhân các tế bào tạo
nhiều bản sao của gene hay có thể tạo ra các sản phẩm protein do gen đó mã hóa
tùy theo mục đích nghiên cứu.

2.1.2. PCR và ứng dụng của PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullis
phát minh năm 1985, là phương pháp nhân bản nhanh (khuếch đại) một đoạn
DNA nào đó trong ống nghiệm nhờ việc sử dụng enzyme polymerase và các yếu
tố cần thiết khác.
Với kỹ thuật PCR trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp tạo ra một bước tiến cách
mạng đối với di truyền học phân tử cho phép nghiên cứu sâu về chức năng của
gen và được ứng dụng trong sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ở
người, phân tích pháp y,…
2.1.2.1. Nguyên tắc của PCR
Sử dụng các cặp mồi oligonucleotide được thiết kế dựa trên trình tự của gen
nghiên cứu
Dưới tác động của nhiệt độ được điều chỉnh thích hợp, phân tử DNA sẽ
được tách mạch, gắn với mồi và được tái bản dưới sự xúc tác của DNA
polymerase theo chu kì.
Sau n chu kì phản ứng, ta sẽ có 2n bản sao của đoạn gen cần nhân lên.

30
 2.1.2.2. Thành phần phản ứng
- DNA làm khuôn chứa gen cần khuếch đại.
- DNA polymerase (Tag polymerase) từ vi khuẩn Themus aquaticus.
- Cặp mồi: mồi xuôi và mồi ngược.
+ Mồi xuôi là trình tự bổ sung với sợi khuôn (3’  5’), là trình tự trên sợi có
nghĩa.
+ Mồi ngược là trình tự bổ sung với sợi mang mã (sợi 5’  3’).
- 4 loại deoxyribonucleotide (dNTP)
- Ion Mg2+, thường dùng MgCl2 hoặc MgSO4.

2.1.2.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR:

- Gây biến tính DNA: Dùng nhiệt tách sợi đôi thành sợi đơn, nhiệt độ được
dùng là 940C.
- Gắn mồi: Các mồi nhận biết và gắn vào DNA ở chiều 3’ theo nguyên tắc bổ
sung. Nhiệt độ thích hợp 54oC.

31
 - Kéo dài chuỗi: DNA mới được tổng hợp nhờ Taq polymerase (extension),
nhiệt độ được dùng là 720C.

Mỗi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 DNA ban đầu có
thể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ.

2.1.2.4. Các ứng dụng của PCR

Ưu thế nổi trội của PCR là chỉ cần một lượng nhỏ DNA để chẩn đoán. Các
tế bào máu, niêm mạc là những vật liệu thích hợp để chẩn đoán ở cá thể sau sinh,
với bào thai chỉ cần một lượng nhỏ lông tơ màng đệm. PCR được sử dụng để
phát hiện nhanh các gene đặc hiệu, gene kháng nguyên của nhiều loại virus gây

32
ung thư, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân ung thư. Ngoài ra, PCR được sử dụng
để phát hiện các đột biến xen/ mất đoạn, đột biến điểm.
PCR chẩn đoán bệnh ung thư: Ung thư vòm họng phần lớn do virus EBV
gây nên. Virus này thuộc họ virus Herpes có bộ gen DNA mạch kép. Bằng kỹ
thuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu khác nhau nhân các đoạn gen đặc trưng của
virus EBV có thể chẩn đoán ung thư vòm họng chính xác trên 90%.
Áp dụng kỹ thuật PCR và các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán sớm các
bệnh truyền nhiễm như bệnh sốt rét, bệnh lao,..
Phát hiện đột biến xen/ mất đoạn: Hội chứng Waardenburg là bệnh di
truyền trội trên NST thường, đặc trưng bởi tật điếc và hình thành sắc tố không
bình thường gây mắt trắng, mi trắng. Một số dạng hội chứng này do đột biến ở
gen PAX – 3 – gen quy định 1 nhân tố phiên mã tham gia điều hòa sự phát triển
của phôi. Đột biến này là mất đoạn 18 bp ở vùng mã hóa nơi gắn kết của nhân tố
phiên mã. PCR đoạn DNA bình thường cho sản phẩm là đoạn DNA156 bp còn
trình tự đột biến gen sinh ra đoạn DNA ngắn hơn là 138 bp.
Ứng dụng xác định vân tay DNA (DNA fingerprinting)
Năm 1984, Sir Alec Jeffreys - nhà di truyền học người Anh, đã phát triển
một kỹ thuật gọi là dấu vân tay DNA, phân tích các mẫu DNA để xác định các
cá thể.
Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định danh tính một
người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu
thu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của
người tình nghi. Từ lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc… 
DNA được tách chiết từ mẫu vừa thu nhân lên bằng PCR  phân tích nhờ kỹ
thuật điện di và thấm tách southern. Hệ gen người có nhiều trình tự DNA ngắn
được lặp lại với số lượng biến động trên NST khác nhau. Các đoạn lặp lại nối
tiếp với số lượng biến động này được gọi là VNTR (variable number of tandem
repeats) là một trong những loại dấu vân tay quan trọng.

33
 Kỹ thuật xác định vân tay DNA còn được dùng để xác định huyết thống
quan hệ cha mẹ con cái. Mẫu DNA được lấy từ người mẹ hoặc người cha cần
xác định và phân tích những chỉ thị DNA. Khi phân tích chỉ thị DNA của người
con thì tất cả các băng DNA của con phải được tìm thấy trong tổ hợp các băng
của DNA của bố, mẹ.Trong cặp NST tương đồng thì con thì con nhận 1 NST từ
cha và 1 NST từ mẹ nên có khoảng 1 nửa số băng của con sẽ được thừa hưởng
trình tự DNA từ mẹ và nửa còn lại từ cha.

34
 Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định các mối
quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.

2.2. Ưng dụng công nghệ gen trong y học, dược học
2.2.1. Liệu pháp gene
Liệu pháp gene là kỹ thuật đưa gene vào trong một cơ thể mắc bệnh vì mục
đích trị liệu. Người bệnh mang gen đột biến sẽ được chuyển một bản sao của
gen bình thường, nhờ vậy mà protein bình thường được tạo ra và triệu chứng của
bệnh bị loại bỏ. Để gene ổn định trong tế bào soma, các tế bào tiếp nhận gene
bình thường phải là các tế bào có khả năng phân chia suốt đời cá thể như các tế
bào tủy xương.

35
 Ở một số nước phát triển, liệu pháp gen đã có những thành tựu nhất định.
Bệnh “suy giảm miễn dịch kết hợp nghiêm trọng” (X-SCID) do gene lặn trên
NST X gây nên. Gen kiểu dại γc mã hóa chuỗi γ của thụ thể interleukin – 2. Đột
biến gen này làm tế bào lympho T và tế bào T độc không phát triển bình thường.
Khi mắc bệnh trẻ thường chết trong vòng 1 năm tuổi. Để chữa trị bằng liệu pháp
gene, các tế bào gốc được tách ra từ tủy xương người bệnh và được nuôi cấy với
retrovirus mang gen γc kiểu dại. Tế bào gốc mang gene bình thường được cấy
trở lại người bệnh, chúng có khả năng tạo miễn dịch bình thường.
Tuy nhiên, liệu pháp gene cũng đặt ra một số các câu hỏi khác về mặt kỹ
thuật: làm thế nào để điều khiển hoạt động của gene thay thế để tế bào có thể
tổng hợp được một lượng sản phẩm vừa đủ đúng thời điểm và đúng vị trí?, làm
sao khẳng định được việc cài gene thay thế vào hệ gene không gây hại đến chức
năng khác của tế bào?,…
Phương pháp chuyển gene liệu pháp có định hướng và tiếp tục nghiên cứu
phát triển với một số bệnh di truyền như bệnh máu khó đông, ung thư, HIV,…
2.2.2. Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học
Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học: tạo các
chủng vi sinh vật biến đổi gen nhằm phục vụ các mục đích khác nhau của con
người. Điển hình là công nghệ gen đã tạo các chủng vi sinh vật mới có khả năng
sản suất nhiều loại sản phẩm sinh học có giá trị như acid amin, protein, vitamin,
enzyme, hormone, kháng sinh ... trên quy mô công nghiệp với số lượng lớn
và giá thành rẻ.
Thành tựu đã đạt được như tạo chủng vi khuẩn E. coli sản xuất
hormone insulin để chữa tiểu đường ở người, tạo chủng vi khuẩn E.coli sản suất

36
hormone Somatostatin, chuyển gen tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn (sinh sản
chậm) vào các chủng vi khuẩn (sinh sản nhanh) nhằm mục đích hạ giá thành
thuốc kháng sinh, tạo chủng vi khuẩn chuyển gen có khả năng phân hủy nhanh
rác thải …
2.2.2.1. Sản xuất insulin của người
- Insulin là hormone của tuyến tụy có chức năng điều hòa glucose trong máu.
Trường hợp insulin do cơ thể sản xuất không đủ hoặc mất chức năng sẽ gây
bệnh tiểu đường do glucose bị thải ra qua nước tiểu. Bệnh tiểu đường hay còn
được gọi một cái tên khác là bệnh đái tháo đường. Đây là một bệnh rối loạn
chuyển hóa, cacbonhydrat, mỡ và protein. Khi mắc bệnh này tức là tuyến tụy
của cơ thể bạn đã mất đi khả năng sử dụng hoặc sản xuất ra hoocmone insulin,
việc này khiến cho lượng đường trong máu lúc nào cũng ở mức cao.
- Insulin là hormone do tuyến tụy tiết ra có cấu tạo là 2 chuỗi polypeptide:

Trước đây, insulin được tạo ra bằng cách tách chiết từ tuyến tụy của động
vật như lợn và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần
acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B)
và insulin lợn (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không
mong muốn khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ lợn hay bò. Ngoài ra, quá trình
sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Và phải cần
4000 – 5000 tụy bò mới sản xuất được 100 g insulin. Sau đó, các phương pháp
bán tổng hợp insulin người từ insulin lợn và bò đã được phát triển bằng các sử
dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin.
Với sự phát triển của công nghệ gen, từ cuối năm 1970, người ta đã ứng
dụng chuyển gen tổng hợp insulin được tách từ cơ thể người và chuyển vào vi

37
khuẩn E.coli bằng plasmid. Sau đó, nuôi cấy vi khuẩn để sản xuất insulin trên
qui mô công nghiệp đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho con người.

Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt
Phương pháp sản xuất thứ nhất là tổng hợp chuỗi A và chuỗi B riêng biệt
bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với
nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp.
Do đó, họ phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này tạo
proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo
cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng
trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin.

Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn

38
 Một phương pháp khác của tập đoàn Novo Nordisk là tổng hợp
miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin,
được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin
tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được
hình thành trong quá trình tổng hợp và miniproinsulin, và miniproinsulin này
được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy.
Với quy trình sản xuất insulin bằng công nghệ gen này đã tạo ra một lượng
insulin rất lớn đảm bảo cung cấp cho các bệnh nhân tiểu đường với giá thành
thấp.
2.2.2.2. Sản xuất hormone tăng trưởng (Human Growth Hormone)
Hormone tăng trưởng ở người (HGH) là một phân tử protein gồm 191 acid
amin được sản xuất ở tuyến yên. HGH kích thích sinh trưởng bằng cách tăng
cường khai thông giữa các acid amin của các tế bào và kích thích tổng hợp
protein. Khi tuyến yên tổng hợp HGH không đủ ở trẻ em thì sinh trưởng bị chậm
lại, đứa trẻ có tỉ lệ cơ thể bất thường, thừa mỡ, lùn mặc dù trí tuệ bình thường.
Bệnh lùn có thể điều trị sớm khi sự sinh trưởng của bộ xương vẫn diễn ra bằng
cách tiêm HGH. Trước đây, HGH được tách chiết từ tuyến yên người chết. Cần
tuyến yên của 80 xác chết mới đủ lượng HGH điều trị cho 1 bệnh nhân trong 1
năm, mà phải điều trị trong 8 -10 năm. Mặt khác, người bệnh còn có nguy cơ
mắc bệnh khác do mô não của người chết đã bị nhiễm trùng.
Hiện nay, các nhà khoa học có thể sản xuất được HGH bằng công nghệ gen.
Gen tổng hợp HGH được tái tổ hợp vào plasmid vi khuẩn và đưa vào vi khuẩn.
Phân tử HGH tự nhiên có 191 acid amin. Trong quá trình sản xuất HGH tự
nhiên có một phân tử tín hiệu trung gian có thêm 26 axid amin làm peptide tín
hiệu. Chuỗi acid amin này sẽ bị cắt bỏ trong quá trình tiết hormone.
Để tổng hợp HGH, mRNA mã hóa HGH được sử dụng làm khuôn để tổng
hợp phân tử DNA. Khi cDNA được xen vào E.coli thì vi khuẩn phản ứng lại
một cách thất thường vì nó không hiểu được ý nghĩa của peptide tín hiệu và
không tách peptide tín hiệu ra khỏi HGH. Giải quyết vấn đề này: các nhà công
nghệ DNA khi vận hành phân tử DNA đã sử dụng enzyme giới hạn EcoRI tách
đoạn peptide tín hiệu (26 acid amin) và đoạn 24 acid amin tiếp theo. Sau đó,
trình tự 24 acid amin được tổng hợp và thế vào phân tử cDNA để tạo ra gen
HGH hoàn chỉnh. Gen này được xen vào E.coli để sản xuất HGH. Năm 1985,
HGH được sản xuất như vậy, thử nghiệm điều trị trên người. Để đạt chiều cao
bình thường, trẻ mắc bệnh phải được tiêm thuốc trong nhiều năm.

39
 2.3. Ưng dụng công nghệ gen tạo các sinh vật biến đổi gen
Sinh vật biến đổi gen (GMO – Genetically Modified Organism) là sinh vật
(động vật, thực vật, vi sinh vật) mà hệ gen của nó đã được con người làm biến
đổi cho phù hợp với lợi ích của mình.
Các cách làm biến đổi gen của 1 sinh vật:
- Đưa thêm 1 gen lạ của 1 loài khác vào hệ gen (gọi là sinh vật chuyển gen).
- Làm biến đổi 1 gen đã có sẵn trong hệ gen
- Loại bỏ hoặc làm bất hoạt 1 gen nào đó trong hệ gen.
Sinh vật biến đổi gen còn là vấn đề nhạy cảm, gây tranh cãi về mặt tích cực,
tiêu cực của nó. Tuy nhiên, cây trồng, vật nuôi biến đổi gen góp phần tăng năng
suất, chất lượng bảo đảm an ninh lương thực, giải quyết đói nghèo cho nhiều
nước trên thế giới.
2.3.1. Các phương pháp chuyển gen
Chuyển gen vào tế bào, mô thực vật có thể bằng phương pháp chuyển gen
trực tiếp hoặc gián tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua các sinh vật
trung gian thường là các vi sinh vật hoặc virus. Phương pháp chuyển gen trực
tiếp qua các thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không nhờ các sinh vật trung
gian.
2.3.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
* Chuyển gen nhờ vi sinh vật đất Agrobacterium
Chi Agrobacterium là các vi khuẩn đất gram âm. Trong chi vi khuẩn này loài
A. tumefaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. Loài A.
tumefaciens gây bệnh cho thực vật, có chứa 1 plasmid lớn 200 kb gọi là Ti –
40
plasmid. Khi cây bị nhiễm vi khuẩn này, vi khuẩn sẽ truyền 1 đoạn gen của Ti-
plasmid để sát nhập vào DNA của cây, hình thành 1 khối u ngay tại vị trí bị
nhiễm.

Ti – plasmid có kích thước từ 12- 14 kb, chứa các gen sinh tổng hợp auxin,
xitokinin, opin (chất dinh dưỡng nuôi vi khuẩn) và các gen gây khối u gọi là
virulence (vùng vir).
Ti – plasmid là vector tách dòng khá hiệu quả nhưng có một số nhược điểm
như:
- Việc tạo ra các phytohormone bởi các tế bào được chuyển gen sẽ cản trở sự
phát triển của cây thành thục. Do đó, cần cắt bỏ các gen này.
- Gen mã hóa tổng hợp opin là bất lợi cho cây chuyển gen và sản phẩm từ
cây sẽ thấp vì chệnh hướng người cung cấp chất dinh dưỡng. Do đó, gen này
cũng cần cắt bỏ.
- Ti – plasmid có kích thước quá lớn nên cần cắt bớt các đoạn không cần
thiết.
- Ti – plasmid không tái bản được trong E. Coli nên cần bổ sung điểm khởi
đầu tái bản của E.coli vào để tách dòng phân tử trên đối tượng E.coli.
Dựa vào các đặc điểm trên, người ta đã thiết kế được vector liên hợp là kết
quả liên hợp 2 plasmid: Ti – plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u, gen tạo
phytohormone và opin; thay vào những gen bị cắt bỏ là một đoạn trên plasmid
thứ hai từ vi khuẩn E.coli chứa điểm khởi đầu tái bản, gen chỉ thị phục vụ cho
việc chọn lọc DNA tái tổ hợp.

41
 Vector liên hợp được gắn thêm DNA mang đặc điểm mong muốn  đưa
vào tế bào thực vật trong nuôi cấy  tái sinh cây  Cây sẽ mang những đặc
điểm mong muốn.

2.3.1.3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp

* Chuyển gen bằng súng bắn gen
Chuyển gen vào tế bào, mô bằng cách sử dụng các viên đạn có kích thước
hiển vi có tỉ trọng cao để đạt gia tốc lớn nhằm xuyên qua vỏ và màng tế bào đưa
lớp DNA tái tổ hợp (mang gen cần chuyển) bọc ngoài tiếp cận, xen vào bộ máy
di truyền của tế bào thực vật.

* Chuyển gen nhờ siêu âm

Sau khi tách, tế bào trần được xử lý nhẹ bằng siêu âm có sự hiện diện của
DNA ngoại lai và sóng siêu âm giúp DNA ngoại lai đi vào tế bào và xen vào
DNA của tế bào.
* Chuyển gen trực tiếp bằng cách lắc với silicon carbide
Nguyên tắc: tinh thể silicon carbide có độ cứng cao, khi lắc với tế bào thì nó
như 1 cây kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào tế bào và xen vào genom
của tế bào thực vật.
42
 Khi chuyển gen xong, những tế bào chuyển gen được nuôi thành cây, ra hoa,
kết hạt. Sau đó, kiểm tra những cây nào được chuyển gen bằng cách tách DNA
từ cây và kiểm tra hoặc xác định sự biểu hiện của gen qua các sản phẩm protein
bằng điện di hoặc qua các đặc tính chống sâu bệnh hay năng suất cao,…
* Chuyển gen bằng kỹ thuật điện xung
kỹ thuật điện xung là một trong các kỹ thuật biến nạp có hiệu quả cao.Tạo
các tế bào trần và sử dụng thiết bị điện xung với điện thế cao khoảng 500V/cm
trong thời gian 4-5 phần nghìn giây tạo nên lỗ trên màng tế bào trần, làm cho
DNA lạ bên ngoài có thể xâm nhập vào trong bộ gen tế bào.
* Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm
Sử dụng thiết bị vi tiêm đưa gencần chuyển vào trong tế bào chủ ở các vị trí
cần thiết. Tạo điều kiện tái tổ hợp của gen cần chuyển với bộ gen tế bào.

2.3.2. Chuyển gen ở thực vật

Chuyển gen vào thực vật nhằm tạo ra giống cây trồng mới có năng suất cao
hơn, có sức kháng cao với sâu bệnh, virus, chất diệt cỏ, stress của môi trường
(chịu mặn, chịu nóng, chịu lạnh,…) hay tạo ra các giống có đặc tính
quý,…Những loài đã được chuyển gen như cải dầu, bông, ngô, đậu tương, dưa,
khoai tây, cà chua, cây lanh, cẩm chướng, lúa nước, bí, củ cải đường, cà rốt,…
Giống lúa vàng – golden rice là giống lúa chuyển gen có hàm lượng tiền
vitamin A (β – caroten) góp phần giải quyết tình trạng thiếu vitamin A ở trẻ em
trên toàn cầu. Công nghệ tạo giống lúa vàng này gồm các bước cơ bản như sau:
Bước 1: Tách chiết các gen mã hóa sự tạo thành β – caroten từ cây Thủy tiên
hoa vàng (daffodil) và từ vi khuẩn Enwinia uredorava.
Bước 2: tạo vector tái tổ hợp với các plasmid thích hợp và biến nạp vào vi
khuẩn Agrobacterium tumefacien.
Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp mang các gen mã hóa β – caroten vào các
tế bào phôi lúa.
43
 Bước 4: Sàng lọc các tế bào phôi được chuyển gen, nuôi cấy mô để tạo dòng
lúa có khả năng tạo β – caroten trong hạt gạo.

Một số giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu được sâu đục
thân, sâu cuốn lá và các loại bệnh khác có hiệu quả cao đã được đưa vào thương
mại hóa ở nhiều quốc gia. Trong số đó có giống cây (ngô, bông, bắp cải,…)
được chuyển gen mã hóa protein tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus thurigensis
(Bt).

44
 2.3.3. Chuyển gen ở động vật
Năm 1980, Viện Roslin đã chuyển gen mã hóa protein của người vào cừu
làm cho sữa cừu Tracy có protein giúp hạn chế sự phát triển bệnh xơ nang ở
người.
Chuyển gen ở động vật nhằm:
- Tạo nên giống mới có năng suất và chất lượng cao hơn
- sinh vật biến đổi gen có thể được tạo ra dùng trong ngành công nghiệp
dược phẩm (như nhà máy sinh học sản suất thuốc cho con người).
* Phương pháp tạo động vật chuyển gen
- Tách lấy trứng ra khỏi cơ thể sinh vật rồi cho thụ tinh trong ống nghiệm
(hoặc lấy trứng đã thụ tinh).
- Tiêm gen cần chuyển vào hợp tử.
- Cấy hợp tử đã được chuyển gen vào tử cung của con vật để nó mang thai
và sinh đẻ bình thường.
- Nếu gen được chuyển gắn thành công vào hệ gen của hợp tử và phôi phát
triển bình thường thì sẽ cho ra đời 1 sinh vật biến đổi gen (chuyển gen).

Ví dụ về quy trình chuyển gen tạo ra cá mang gen hormone sinh trưởng
của người:

45
 Bước 1: Chọn đối tượng chuyển gen và gen cần chuyển.
Đối tượng cần chuyển gen là các bố mẹ thuần chủng do các trung tâm giống
cá cung cấp.
Gen cần chuyển vào cá là gen mã hóa hormone sinh trưởng người đã được
tách dòng trong các vector tái tổ hợp.
Bước 2: Thu nhận phôi cá
Thụ tinh nhân tạo và thu trứng đã thụ tinh, khử màng dính của trứng bằng
các dung dịch thích hợp.
Bước 3. Chuyển gen
Gen hormone sinh trưởng người (pMThGH) được chuyển vào phôi cá bằng
kỹ thuật vi tiêm. Trứng sau khi vi tiêm được ấp nở trong dung dịch Holfreter.
Phôi được ấp trong dung dịch này có sục khí, thay nước liên tục.
Bước 4: Kiểm tra kết quả chuyển gen
Cá sau khi được chuyển gen được 3 – 7 ngày tuổi, lấy mẫu vây cá tách chiết
DNA và kiểm tra kết quả chuyển gen. Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng
PCR để nhân gen là 5’ AAGCGTCACCACGACT 3’ và 5’
AAAAGCCAGGAGCAG 3’. Sản phẩm nhân gen hormone sinh trưởng người
bằng PCR được điện di trên gel garose 1% với thang DNA chuẩn để xác định
kích thước của gen. Sử dụng phép lai phân tử đánh dấu huỳnh quang (FISH) để
kiểm tra vị trí gắn của gen có chính xác không.
Bước 5: Theo dõi kết quả chuyển gen
Nhóm cá con sau khi được chuyển gen được nuôi trong cùng điều kiện với
nhóm cá đối chứng, theo dõi tốc độ sinh trưởng của 2 nhóm để xác định kết quả
chuyển gen. Sau đó thực hiện thụ tinh chéo giống cá chuyển gen với giống
không chuyển gen, kết hợp chọn lọc nhiều lần để ổn định di truyền giống cá
chuyển gen.

46
Kết quả: a) cá không được chuyển gen. b) cá chuyển gen

47
 III. MỘT SỐ CÂU HỎI, BÀI TẬP VỀ CÔNG NGHỆ GEN
Câu 1. Vector tách dòng cần có những tiêu chuẩn gì?
Hướng dẫn trả lời
Vector tách dòng cần có những tiêu chuẩn:
- Kích thước vector càng nhỏ càng tốt để có thể cài DNA có kích thước tối
đa. Kích thước vector nhỏ càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép
càng nhanh.
- Vector có khả năng xâm nhập vào tế bào.
- Vector phải có điểm khởi đầu tái bản (ori), tức là có khả năng để tái bản.
- Vector phải có điểm cắt của enzym giới hạn.
- Vector phải có đặc điểm cho phép dễ nhận biết chúng trong tế bào chủ.
Chúng thường chứa các gen kháng chất kháng sinh hoặc gene tổng hợp chất
màu, dễ dàng phát hiện trong môi trường thạch.

Câu 2. Một phát hiện quan trọng giúp phát triển công nghệ DNA tái tổ
hợp là gì?
Hướng dẫn trả lời
Một phát hiện quan trọng giúp phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp là việc
xác định và phân lập ra các enzyme giới hạn cho phép cắt DNA. Trước khi phát
hiện ra enzyme này không có cách nào cắt được phân đoạn DNA.

Câu 4. Khi cắt DNA plasmid pBR322 bằng HindIII tạo ra 8 đoạn DNA.
Khi cắt DNA đó bằng SalI chỉ tạo ra 2 đoạn. Có bao nhiêu điểm giới hạn
của mỗi loại enzym?
Hướng dẫn trả lời
DNA plasmid là mạch vòng nên với n điểm giới hạn của 1 enzyme nào đó sẽ
tạo ra n đoạn khi cắt DNA bằng enzyme đó.
Vậy khi cắt DNA plasmid pBR322 bằng HindIII tạo ra 8 đoạn DNA  có 8
điểm giới hạn của HindIII.
Khi cắt DNA plasmid pBR322 bằng SalI chỉ tạo ra 2 đoạn có 2 điểm giới
hạn của SalI.

48
 Câu 5. Một phân tử DNA thẳng được cắt bằng BamHI tạo ra các đoạn
2kb, 3,5 kb và 4,3 kb. Hãy xác định bản đồ giới hạn của phân tử DNA đó.
Hướng dẫn trả lời
Phân tử DNA thẳng với n điểm giới hạn của 1 enzyme nào đó sẽ tạo ra (n+1)
đoạn khi cắt DNA bằng enzyme đó.
Vậy nên phân tử DNA thẳng được cắt bằng enzyme giới hạn tạo 3 đoạn nên
phải có 2 điểm cắt giới hạn. Các điểm đó có thể phân bố như sau:

Câu 6. Khi xử lý một gen bằng BamHI tạo ra các đoạn 2,4 kb, 3,5 kb và
3 kb. Khi xử lý đoạn DNA tách ra từ 1 thể đột biến không tổng hợp được
enzyme của gen này bằng BamHI, người ta chỉ thấy 2 đoạn 2,4 kb và 6,5 kb.
Giải thích.
Hướng dẫn trả lời
Khi xử lý một gen bằng BamHI tạo ra các đoạn 2,4 kb, 3,5 kb và 3 kb vậy là
có 2 điểm cắt giới hạn.
Đột biến đã làm thay đổi một hay một số bazơ tại điểm nhận biết của
enzyme BamHI. Xử lý đoạn DNA tách ra từ 1 thể đột biến không tổng hợp được
enzyme của gen này bằng BamHI, người ta chỉ thấy 2 đoạn 2,4 kb và 6,5 kb 
chỉ có 1 điểm cắt. Đoạn mới 6,5 kb bằng tổng của 2 đoạn 3,5 và 3 kb, cho thấy 2
đoạn này nằm kề nhau trên phân tử DNA bình thường. Và đột biến đã là mất 1
điểm cắt giới hạn trên DNA gốc.

Câu 7. Khi xử lý một gen bằng BamHI tạo ra các đoạn 2,4 kb, 3,5 kb và
3 kb. Khi xử lý đoạn DNA tách ra từ 1 thể đột biến không tổng hợp được
enzyme của gen này bằng BamHI, người ta chỉ thấy 4 đoạn 2,4 kb 3 kb, 2
kb và 1,5 kb. Giải thích.
49
 Hướng dẫn trả lời
Khi xử lý một gen bằng BamHI tạo ra các đoạn 2,4 kb, 3,5 kb và 3 kb vậy là
có 2 điểm cắt giới hạn.
Đột biến đã làm thay đổi một hay một số bazơ tại điểm nhận biết của
enzyme BamHI. Xử lý đoạn DNA tách ra từ 1 thể đột biến không tổng hợp được
enzyme của gen này bằng BamHI, người ta chỉ thấy 4 đoạn 2,4 kb 3 kb, 2 kb và
1,5 kb  chỉ có 3 điểm cắt. 2 đoạn 2 kb và 1,5 kb bằng đoạn 3,5 kb. Vậy đột
biến đã tạo ra 1 vị trí cắt giới hạn mới trên DNA gốc.

Câu 8. Một phân tử ADN mạch thẳng được xử lý bằng các enzym dưới
đây và kết quả như sau:
EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2 kb.
HaeI: 1,0; 1,4; 4,6 kb.
Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1 kb.
Những đoạn giới hạn nào của EcoRI không chứa các điểm giới hạn của
HaeI và ngược lại?
Hướng dẫn trả lời
Đoạn 2,1 của EcoRI cũng xuất hiện trong hỗn hợp, tức là cắt bằng cả 2 loại
enzyme thì đoạn 2,1 cũng không bị cắt nhỏ hơn, vậy, nó không có điểm giới hạn
của HaeI. Các đoạn khác của EcoRI mất đi khi xử lý bằng cả hai enzym, nên
chúng phải chứa các điểm giới hạn của HaeI. Tương tự, các đoạn 1,0 và 1,4 của
HaeI đều không chứa các điểm giới hạn của HaeI.
Câu 9. Trình bày 3 phương pháp thu nhận gene để thực hiện kĩ thuật
DNA tái tổ hợp?
Hướng dẫn trả lời
Cách 1: Tách các đoạn DNA từ hệ gene: dùng enzyme restriction cắt toàn bộ
DNA thành các đoạn nhỏ rồi gắn vào vector mang gene tạo plasmid tái tổ hợp.
Cách 2: Hóa tổng hợp nhân tạo gene. Ví dụ: Tạo vi khuẩn sản xuất insulin
bằng phương pháp hóa tổng hợp gene như sau: dùng ligase nối các đoạn
oligonucleotide đã tổng hợp thành polynucleotide. Polynucleotide được gắn vào
plasmid. Biến nạp plasmid mang gene insulin vào tế bào  Tế bào sẽ sản xuất
ra proinsulin, qua xử lí hóa học sẽ thu được insulin.

50
 Cách 3: Sinh tổng hợp gene từ mRNA tương ứng: tổng hợp cDNA mạch
đơn từ mRNA trưởng thành nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase),
sau đó dùng DNA polymerase tổng hợp cDNA mạch kép từ cDNA mạch đơn.
Gắn cDNA mạch kép vào plasmid và biến nạp vào tế bào vi khuẩn.

Câu 10. Trong công nghệ gen, người ta đã tạo được các nhiễm sắc thể
nhân tạo. Cần bổ sung các trình tự nucleotit nào để tạo nên một nhiễm sắc
thể nhân tạo dạng thẳng, sao cho nó có thể hoạt động như nhiễm sắc thể
bình thường trong tế bào nhân thực?
Hướng dẫn trả lời
- NST nhân tạo này phải có ít nhất một trình tự Ori – điểm khởi đầu sao
chép (khởi đầu tái bản) – trình tự giúp enzim nhận biết và khởi đầu quá trình tự
nhân đôi DNA.
- Có trình tự nucleotide làm nhiệm vụ của tâm động (liên kết với thoi vô
sắc trong quá trình phân bào).
- Có trình tự đầu mút ở 2 đầu nhiễm sắc thể để duy trì sự ổn định của
nhiễm sắc thể nhân tạo, để các nhiễm sắc thể không dính vào nhau.

Câu 11. Đề HSG Quốc gia 2016. Đa số vi khuẩn không chuyển hóa được
xylitol để tạo năng lượng. Người ta tiến hành thí nghiệm chuyển một gen
mã hóa enzyme phân giải xylitol vào E.coli. Một dòng plasmid làm thể
truyền được biến đổi để có một gen kháng Amp và một gen mã hóa β-
galactosidase có chứa trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn EcoRI (β-
galactosidase có khả năng phân giải X-gal từ không màu thành sản phẩm
màu xanh dương).
Sau khi đoạn ADN chứa gen mã hóa enzyme phân giải xylitol và thể
truyền được xử lí riêng rẽ với EcoRI, chúng được trộn với nhau để tái tổ hợp
ngẫu nhiên.
Hỗn hợp ADN này tiếp tục được cho biến nạp vào một chủng E.coli đã bị
đột biến bất hoạt gen Z trong operon Lac. Sau đó đem cấy trải trên môi trường
thạch tối thiểu thu được 3 dòng A, B và C. Tiếp tục nuôi cấy riêng rẽ 3 dòng A,
B và C trên môi trường thạch tối thiểu có bổ sung thêm Amp và X-gal thu được
kết quả như sau:
Dòng A: xuất hiện khuẩn lạc và không thay đổi màu.

51
 Dòng B: Xuất hiện khuẩn lạc và vùng xung quanh khuẩn lạc chuyển sang
màu xanh dương
Dòng C: Không xuất hiện khuẩn lạc
a) Giải thích kết quả thí nghiệm
b) Nếu nuôi cấy riêng rẽ 3 dòng A, B và C trong môi trường chỉ chứa xylitol
làm nguồn carbon duy nhất thì khả năng phát triển của mỗi dòng sẽ như thế nào?
Giải thích.
Hướng dẫn trả lời
Dòng nào không sống được trên môi trường có Amp (không có khuẩn lạc)
 dòng đó không có chứa plasmid
Dòng nào sống được trên môi trường có Amp (có khuẩn lạc) và có khả năng
phân giải X-gal từ không màu thành sản phẩm màu xanh dương  dòng đó có
chứa plasmid và plasmid nguyên vẹn (ko bị cắt bởi EcoRI)
Dòng nào sống được trên môi trường có Amp và không có khả năng phân
giải X-gal (không đổi màu)  dòng đó có plasmid và plasmid bị enzym EcoRI
cắt gen mã hóa β-galactosidase  dòng này chứa plasmid tái tổ hợp.
Dòng A: xuất hiện khuẩn lạc và không thay đổi màu  dòng A chứa
plasmid tái tổ hợp Dòng B: Xuất hiện khuẩn lạc và vùng xung quanh khuẩn lạc
chuyển sang màu xanh dương  dòng B có chứa plasmid nguyên vẹn.
Dòng C: Không xuất hiện khuẩn lạc  dòng C không có chứa plasmid
b. Nếu nuôi cấy riêng rẽ 3 dòng A, B và C trong môi trường chỉ chứa xylitol
làm nguồn carbon duy nhất thì khả năng phát triển của mỗi dòng:
Dòng B, C không chứa gen mã hóa enzyme phân giải xylitol  không có
khả năng phân giải xylitol nên không có khả năng phát triển trên môi trường có
nguồn carbon duy nhất là xylitol. Dòng A chứa plasmid tái tổ hợp có gen mã
hóa enzyme phân giải xylitol  có khả năng phân giải xylitol nên có khả năng
phát triển trên môi trường xylitol.

Câu 12. Trong công nghệ gen, người ta có thể sản xuất được các prôtêin
đơn giản của động vật có vú nhờ vi khuẩn, chẳng hạn như E. coli. Trên cơ
sở các đặc điểm khác nhau về cấu trúc gen ở sinh vật nhân sơ và nhân thực,
hãy nêu những cải biến cần được thực hiện ở gen được cấy, để tế bào vi
khuẩn có thể sản xuất được prôtêin của động vật có vú.

52
 Hướng dẫn trả lời
Cấu trúc gen của sinh vật nhân thực khác của sinh vật nhân sơ ở chỗ :
- Có chứa các intron.
- Trình tự ADN khởi đầu phiên mã.
- Trình tự kết thúc phiên mã.
- Trình tự tín hiệu khởi đầu dịch mã.
Để tế bào vi khuẩn có thể sản xuất được protein của động vật có vú, gen
động vật có vú trước khi được cấy vào E. coli thường :
- Được dùng ở dạng cADN (không chứa intron).
- Cải tiến phần trình tự khởi đầu phiên mã.
- Cải tiến phần trình tự kết thúc phiên mã.
- Cải tiến phần trình tự khởi đầu dịch mã.
Câu 13. Để tổng hợp một loại prôtêin đơn giản của người nhờ vi
khuẩn qua sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp, người ta có hai cách:
1) Cách thứ nhất: Tách gen mã hóa prôtêin trực tiếp từ hệ gen trong
nhân tế bào, rồi cài đoạn gen đó vào plasmit của vi khuẩn nhờ enzim ligaza;
2) Cách thứ hai: Tách mARN trưởng thành của gen mã hóa prôtêin
đó, sau đó dùng enzim phiên mã ngược tổng hợp lại gen (cADN), rồi cài
đoạn cADN này vào plasmit nhờ enzim ligaza.
Trong thực tế, người ta thường chọn cách nào? Tại sao?
Hướng dẫn trả lời
Trong thực tế, người ta chọn cách thứ hai. Bởi vì:
- ADN (gen) tách trực tiếp từ hệ gen người thường mang intron, còn cADN
(được tổng hợp từ mARN trong tế bào chất) không mang intron.
- Các tế bào vi khuẩn không có khả năng cắt bỏ các intron của các gen
eucaryote, nên đoạn ADN cài tách trực tiếp từ nhân không tạo ra được prôtêin
bình thường.
- Đoạn ADN phiên mã ngược (cADN) chính là bản sao tương ứng của
mARN dùng để dịch mã prôtêin, có kích thước ngắn hơn nên dễ tách dòng và
biểu hiện gen trong điều kiện in-vitro.

53
 Câu 14. Đề HSG Quốc gia 2016. X là protein có tác dụng ngăn ngừa sự
tăng cân ở người. Protein này bất hoạt ở những người béo phì. Các phân tử
mARN trưởng thành của X phân lập được từ một số người béo phì của
cùng một gia đình cho thấy, chúng thiếu một đoạn trình tự dài 173 nucleotit
so với các phân tử mARN trưởng thành phân lập được từ những người
bình thường. Khi so sánh trình tự gen mã hóa cho protein X của người bình
thường và người béo phì, người ta phát hiện ra rằng không có nucleoti nào
bị mất mà chỉ có 1 nucleotit bị thay đổi. Sự thay đổi này xảy ra ở vùng
intron của gen.
a) Tại sao việc thay đổi 1 nucleotit lại có thể làm cho mARN trưởng
thành của gen đột biến bị mất một đoạn dài 173 nucleotit. Giải thích và
minh họa bằng hình vẽ.
b) Giải thích hiện tượng bất hoạt của protein X ở người béo phì.
c) Để xản xuất protein này, người ta sử dụng kỹ thuật di truyền tạo
plasmid tái tổ hợp giữa thể truyền với gen mã hóa protein X của người bình
thường, sau đó chuyển vào vi khuẩn E. coli để sản xuất sinh khối. Sản phẩm
protein tạo ra có bị bất hoạt không? Giải thích.
Hướng dẫn trả lời
a. Đột biến thay thế nucleotit này bằng nucleotit khác xảy ra trong vùng
intron của gen nhưng lại làm cho phân tử mARN trưởng thành tổng hợp từ gen
đột biến ngắn hơn phân tử mARN trưởng thành của gen bình thường 173
nucleotit, chứng tỏ đột biến trên đã xảy ra ở vùng nhận biết và cắt intron làm cho
quá trình cắt intron bị biến đổi
Thay vì chỉ cắt các trình tự intron thì tế bào đã cắt một trình tự gồm 1 đoạn
exon xen kẽ 2 đoạn intron và đoạn exon này dài 173 nucleotit nên phân tử
mARN trưởng thành của gen đột biến kém phân tử mARN trưởng thành của gen
bình thường 173 nucleotit.
b. Đoạn exon bị mất dài 173 nucleotit. Đây là một số không chia hết cho 3,
có nghĩa là exon này có nucleotit kết hợp với nucleotit của exon khác để tạo
thành một bộ ba hoàn chỉnh. Khi đoạn exon này bị mất sẽ gây ra hiện tượng dịch
khung đọc đối với toàn bộ trình tự nucleotit phía sau exon này, nên phân tử
protein tổng hợp từ gen đột biến sẽ mất đoạn axit amin do 173 nucleotit mã hóa
đồng thời bị thay đổi toàn bộ trình tự axit amin ở đoạn peptide phía sau, làm cho
protein bị mất chức năng (bất hoạt)
c. Sản phẩm protein tạo ra vẫn bị bất hoạt vì plasmid tái tổ hợp tạo ra từ gen
mã hóa protein X từ người bình thường mang cả đoạn intron. Đoạn trình tự này
54
vẫn được phiên mã và giải mã bình thường trong cơ thể vi khuẩn. Vì thế, phân
tử protein tạo ra có trình tự dài hơn hoặc ngắn hơn trình tự axit amin của protein
X. Mặt khác, trình tự axit amin của sẩn phẩm protein tạo ra sẽ khác với trình tự
các axit aminh của protein X.

Câu 15. Trước kia người ta hay chuyển gen của người vào tế bào vi
khuẩn để sản sinh ra những protein nhất định của người với số lượng lớn.
Tuy nhiên, hiện nay các nhà sinh học phân tử lại ưa dùng tế bào nấm men
làm tế bào để chuyển gen của người vào hơn là dùng tế bào vi khuẩn. Tại
sao?
Hướng dẫn trả lời
Vì tế bào nấm men là tế bào nhân chuẩn nên có enzym để loại bỏ intron
khỏi ARN trong quá trình tinh chế để tạo mARN, còn tế bào nhân sơ như vi
khuẩn do chúng không có gen phân mảnh nên không có enzim cắt intron.

Câu 16. Hồ sơ DNA của mẹ và cha và những đứa trẻ nghi ngờ là con của
bố, mẹ. Cho biết những đứa trẻ này có quan hệ huyết thống gì với bố, mẹ?
Giải thích.

55
 Khi 1 đứa trẻ sinh ra, ở mỗi locus gen, chúng sẽ nhận 1 alen từ bố hoặc 1
alen từ mẹ. Nếu con nhận được alen từ bố/mẹ  sẽ có băng kích thước với
bố/mẹ ở locus gen đó.
Xét bảng điện di ở trên, ta thấy:
Đứa trẻ thứ 1 nhận alen của bố và alen của mẹ  con của cả bố và mẹ.
Đứa trẻ thứ 3 nhận alen của bố và alen của mẹ  con của cả bố và mẹ.
Đứa trẻ thứ 2 nhận alen của mẹ nhưng không nhận được alen của bố con
của mẹ, không là con của bố.
Đứa trẻ thứ 4 không nhận alen của mẹ và không nhận được alen của bố
không phải là con của mẹ cũng không là con của bố.

Câu 17. Đề HSG Quốc gia 2015. Trong công nghệ tạo động vật chuyển
gen, gen chuyển được gắn vào một vị trí (locut) trên nhiễm sắc thể của tế
bào động vật. Bằng phương pháp nào có thể tạo ra động vật có kiểu gen
đồng hợp về gen chuyển ?
Hướng dẫn trả lời
Trong tế bào lưỡng bội ở động vật, nhiễm sắc thể tồn tại dưới dạng cặp
nhiễm sắc thể tương đồng, do đó các gen tồn tại thành từng cặp alen, có thể
giống hoặc khác nhau. Trong công nghệ tạo động vật chuyển gen, gen chuyển
được gắn vào 1 vị trí (locut) trên nhiễm sắc thể động vật. Khi đó gen chuyển chỉ
tồn tại dưới dạng 1 alen. Gen chuyển được gắn vào 1 vị trí (locut) trên nhiễm
sắc thể của động vật mang gen chuyển, khi đó để tạo ra động vật có kiểu gen
đồng hợp về gen chuyển thì cần phải có phương pháp lai giống sử dụng động vật
mang gen chuyển là con đầu lòng (hay P) cho lai cận huyết hoặc lai nghịch …

Căn cứ vào kết quả của phép lai để xác định sự di truyền của tính trạng do
gen chuyển biểu hiện; sau đó tiến hành tiếp tục theo dõi sự di truyền của tính
trạng do gen chuyển quy định qua các thế hệ lai cho đến khi tạo ra được kiểu
gen đồng hợp về gen chuyển thông qua sự biểu hiện của tính trạng, nghĩa là khi
cho các cá thể mang tính trạng do gen chuyển quy định giao phối với nhau đều
cho kết quả đồng tính về tính trạng do gen chuyển quy định.

Câu 18. Đề HSG Quốc gia 2018. Ở vi khuẩn E.coli kiểu dại, sự biểu hiện của
gen lacZ thuộc operon Lac mã hóa b-galactosidase phụ thuộc vào sự có mặt
56
của glucose và lactose trong môi trường. Khi môi trường có cả glucose và
lactose, enzim này biểu hiện ở mức thấp; khi môi trường chỉ có lactose,
enzim được biểu hiện ở mức tăng cường trong các tế bào vi khuẩn kiểu dại.
Bằng kỹ thuật gây đột biến và chuyển ADN plasmid mang các trình tự gen
có nguồn gốc từ NST E.coli này vào các tế bào E.coli khác, người ta đã tạo
được 5 chủng vi khuẩn đột biến có kiểu gen lưỡng bội về các gen và trình tự
điều hòa tham gia phân giải lactose (chủng 1 đến chủng 5) như ở bảng dưới
đây.

Chủng đột biến 1 2 3 4 5

IsP+O-Z+ I-P+O+Z+ I+P+O-Z- I+P+O+Z+ IsP+O-Z+

Kiểu gen
I-P+O+Z- I+P+O-Z- I-P+O+Z+ I-P+O-Z+ I-P+O+Z+

Trong đó, I+ , P+ , O+, Z+ tương ứng là các trình tự kiểu dại của gen mã hóa
protein ức chế (I), vùng khởi động (P), vùng vận hành (O) và gen lacZ;
I- là đột biện làm protein ức chế mất khả năng gắn vùng vận hành;
IS là đột biện làm protein ức chế mất khả năng gắn vào đồng phân của
lactose;
P- , O-, Z- là các trình tự đột biến mất chức năng so với trình tự kiểu dại tương
ứng.
Hãy xác định mức biểu hiện của enzim b-galactosidase của 5 chủng đột biến
này trong các điều kiện:
a) Môi trường không có cả glucose và lactose
b) Môi trường chỉ có glucose
c) Môi trường chỉ có lactose
d) Môi trường có cả lactose và glucose

57
Hướng dẫn trả lời

Mức biểu hiện

MÔI
TRƯỜNG 1 2 3 4 5

a)Không có Mức tăng Không biểu Không biểu Mức tăng Không biểu
cả glucose cường hiện hiện cường hiện
và lactose

b)Chỉ có Mức thấp Không biểu Không biểu Mức thấp Không biểu
glucose hiện hiện hiện

c)chỉ có Mức tăng Không biểu Mức tăng Mức tăng Không biểu
lactose cường hiện cường cường hiện

d)có cả Mức thấp Không biểu Mức thấp Mức thấp Không biểu
glucose và hiện hiện
lactose

Câu 19. Đề HSG Quốc gia 2019. Troponin T là một protein liên quan
đến hoạt động của cơ. Để thu được protein của người trong tế bào vi sinh
vật, người ta tiến hành 2 thí nghiệm sau:
Thí nghiệm 1: Tách gen mã hóa troponin T từ DNA hệ gen người và
chuyển sang vector biểu hiện ở nấm men tạo plasmid tái tổ hợp A1; chuyển
vector biểu hiện ở vi khuẩn tạo plasmid tái tổ hợp A2.
Thí nghiệm 2: Tổng hợp phân tử cDNA bằng cách phiên mã ngược
phân tử mRNA trưởng thành mã hóa proponin T. Sau đó, chuyển phân tử
cDNA này vào cùng loại vector biểu hiện ở nấm men tạo plasmid tái tổ hợp
B1; chuyển vào cùng loại vector biểu hiện ở vi khuẩn tạo plasmid tái tổ hợp
B2.
a. Hãy so sánh kích thước của hai plasmid A1 và B1.
b. Khi biến nạp và biểu hiện hai plasmid A2 và B2 trong tế bào nấm men
trong cùng điều kiện thí nghiệm, họ thu được 2 loại protein có kích thước
khác nhau từ plasmid A1 và 1 loại protein từ plasmid B1. Hãy giải thích kết
quả.
58
 c. Khi biến nạp và biểu hiện hai plasmid A2 và B2 vào vi khuẩn E. coli
trong cùng điều kiện thí nghiệm, protein thu được từ plasmid A2 không có
chức năng, còn protein B2 có chức năng bình thường. Hãy giải thích kết quả.
Hướng dẫn trả lời
a. So sánh kích thước của hai plasmid A1 và B1:
Trường hợp 1: Nếu gen mã hóa troponin là gen phân đoạn (gồm exon và
intron) thì plasmid A1 mang gen chứa cả các đoạn intron còn plasmid B1 không
chứa intron nên kích thước plasmid A1 lớn hơn plasmid B1.
Trường hợp 2: Nếu gen mã hóa troponin là gen không phân đoạn thì kích
thước plasmid A1 bằng plasmid B1 vì đều mang gen không chứa các đoạn intron.
b. Khi biến nạp và biểu hiện hai plasmid A2 và B2 trong tế bào nấm men
trong cùng điều kiện thí nghiệm, họ thu được 2 loại protein có kích thước khác
nhau từ plasmid A1 và 1 loại protein từ plasmid B1.
Plasmid A1 phiên mã tạo phân tử tiền mRNA  trải qua quá trình cắt intron
và nối các exon  các phân tử mRNA trưởng thành khác nhau về số lượng các
exon  dịch mã tạo các phân tử protein khác nhau.
Plasmid B1 chỉ có các exon nên không trải qua quá trình cắt nối thay thế và
chỉ tạo ra một loại protein.
c. Khi biến nạp và biểu hiện hai plasmid A2 và B2 vào vi khuẩn E. coli trong
cùng điều kiện thí nghiệm, protein thu được từ plasmid A2 không có chức năng,
còn protein B2 có chức năng bình thường:
Hệ thống biểu hiện gen ở vi khuẩn không có bộ máy cắt intron và nối exon
như ở nấm men.
mRNA tạo ra từ plasmid A2 vẫn còn intron nên tạo thành protein không có
chức năng. Còn mRNA từ plasmid B2 chỉ có các trình tự exon nên tạo protein có
chức năng.

Câu 20. Một plasmid chứa các gen kháng ampicillin và tetracycline.
Plasmid đó chứa một điểm giới hạn nằm trong gen tetracycline. Plasmid đó
được xử lý vơi enzyme giới hạn trộn với DNA ngoại lai, rồi đem ủ với E.coli.
Bằng cách nào bạn sàng lọc được các tế bào có plasmid lai?
Hướng dẫn trả lời

59
 Cấy các tế bào trên môi trường ampicillin  tế bào nào sinh trưởng được
(có khuẩn lạc) là những tế bào chứa plasmid nguyên vẹn và plasmid chứa DNA
ngoại lai. Tế bào nào không sống được (không có khuẩn lạc).
Chọn các tế bào sống được tiếp tục nuôi cấy in dấu trong môi trường có
tetracycline. Những tế bào có plasmid của DNA ngoại lai sẽ không sinh trưởng
được (vì enzyme giới hạn cắt qua gen kháng tetracycline). Trở lại lấy các tế bào
đó trong môi trường có ampicillin. Đó chính là các tế bào chứa vector tái tổ hợp.

Câu 21. Tại sao Ti – plasmid được sử dụng phổ biến trong chuyển gen ở
thực vật? Ti – plasmid cần biến đổi gì trước khi được sử dụng làm vector
tách dòng?
Hướng dẫn trả lời
Loài A. tumefaciens gây bệnh cho thực vật, có chứa 1 plasmid lớn 200 kb
gọi là Ti – plasmid. Ti – plasmid có kích thước từ 12- 14 kb, chứa các gen sinh
tổng hợp auxin, xitokinin, opin (chất dinh dưỡng nuôi vi khuẩn) và các gen gây
khối u gọi là virulence (vùng vir).
Ti – plasmid là vector tách dòng khá hiệu quả nhưng có một số nhược điểm
như:
- Việc tạo ra các phytohormone bởi các tế bào được chuyển gen sẽ cản trở sự
phát triển của cây thành thục. Do đó, cần cắt bỏ các gen này.
- Gen mã hóa tổng hợp opin là bất lợi cho cây chuyển gen và sản phẩm từ
cây sẽ thấp vì chệnh hướng người cung cấp chất dinh dưỡng. Do đó, gen này
cũng cần cắt bỏ.
- Ti – plasmid có kích thước quá lớn nên cần cắt bớt các đoạn không cần
thiết.
- Ti – plasmid không tái bản được trong E. Coli nên cần bổ sung điểm khởi
đầu tái bản của E.coli vào để tách dòng phân tử trên đối tượng E.coli.
Dựa vào các đặc điểm trên, người ta đã thiết kế được vector liên hợp là kết
quả liên hợp 2 plasmid: Ti – plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u, gen tạo
phytohormone và opin; thay vào những gen bị cắt bỏ là một đoạn trên plasmid
thứ hai từ vi khuẩn E.coli chứa điểm khởi đầu tái bản, gen chỉ thị phục vụ cho
việc chọn lọc DNA tái tổ hợp.

60
 Câu 22. Phương pháp phân tích các đoạn DNA bằng thẩm tách
Southern thực hiện như thế nào?
Hướng dẫn trả lời
Bước 1- Mỗi mẫu DNA được xử lý với cùng một enzyme giới hạn.
Bước 2 – Các đoạn được điện di tạo thành kiểu hình điện di đặc thù của mỗi
mẫu.
Bước 3 – Thẩm tách DNA bằng một dòng mao dẫn  DNA bị biến tính và
gắn lên màng đúng với vị trí tương ứng của gel.
Bước 4 – Lai DNA với đoạn mẫu dò oligonucleotide được đánh dấu phóng
xạ.
Bước 5 – Phát hiện mẫu dò bằng phin chụp tự động.

Câu 23. Phương pháp phân tích các đoạn DNA bằng thẩm tách
Northern thực hiện như thế nào?
Hướng dẫn trả lời
RNA được dò tìm với mẫu dò DNA hoặc RNA đánh dấu.
Bước 1- Chuẩn bị mẫu RNA: xử lý tạo ra các sợi đơn hoàn toàn.
Bước 2 – Điện di trên gel Agrose hoặc polyacrylamide.
Bước 3 – Chuyển lên giá thể rắn màng ntro cellulose
Bước 4 - Lai RNA với đoạn mẫu dò được đánh dấu huỳnh quang.
Bước 5 – Quan sát mẫu dò bằng phin chụp tự động.

Câu 24. Dữ liệu dưới đây cho thấy kết quả điện di của các đoạn PCR
được khuếch đại bằng cách sử dụng các đầu dò cho vị trí đã được chứng
minh là bị thay đổi trong bệnh Huntington. Người cha bị bệnh Huntington
khi ông 40 tuổi, được hiển thị bởi hộp đen. Con của ông ta bao gồm 6 đứa
(3,5,7,8,10,11) bị bệnh Huntington và độ tuổi mà các triệu chứng bắt đầu
được thể hiện qua con số trên dải từ đoạn PCR.

61
 a. Dự đoán những đứa trẻ bình thường 4, 6 và 9 có khả năng bị bệnh không?
Giải thích.
b. Kết luận nào sau đây là hợp lí.

1. Không có mối quan hệ giữa tuổi khởi phát bệnh và tỷ lệ di chuyển của các
đoạn PCR.

2. Một đoạn PCR ngắn hơn dự đoán khởi phát sớm bệnh Huntington.

3. Chiều dài của đoạn PCR được khuếch đại dự đoán khởi phát sớm bệnh
Huntington.

4. Bệnh Huntington phải truyền nhiễm vì nhiều trẻ em mắc bệnh.

5. Không có cái nào ở trên.

Hướng dẫn trả lời

a. Trong quá trình điện di, các đoạn DNA di chuyển qua một gel với các
mảnh lớn hơn di chuyển chậm hơn. Trong bệnh Huntington, PCR khuếch đại
một vùng nhiễm sắc thể có số lần lặp lại các chuỗi CAG. Các cá nhân bình
thường có thể có tới 30 bản sao của trình tự nhưng các cá nhân với Huntington
có từ 37 đến hơn một trăm.
Trong gel cho thấy kết quả thí nghiệm PCR cho một gia đình có cha mắc
bệnh Huntington, trẻ em 4 và 9 chỉ hiển thị kích thước bình thường cho khu vực
này, cho thấy họ sẽ không mắc bệnh.
Cá thể 6 bình thường có các chuỗi khuếch đại tương tự như người cha bị
bệnh, cho thấy anh ta cũng sẽ mắc bệnh Huntington. Kích thước của mảnh CAG
tương quan với tuổi khởi phát. Vì người cha mắc bệnh ở tuổi 40 và đứa trẻ 6
62
tuổi có băng cùng kích thước. Dự đoán rằng người con 6 có khả năng mắc bệnh
Huntington trong khoảng 40 tuổi.
b. 1 Sai. Vùng khuếch đại PCR cho thấy mối tương quan giữa kích thước
của băng, số lần CAG được lặp lại và tuổi khởi phát. Người nào phát bệnh càng
sớm thì mức độ lặp càng nhiều. Khi mức độ lặp là 38 thì sẽ phát bệnh.
2 Sai. Một đoạn PCR ngắn hơn dự đoán khởi phát muộn bệnh Huntington.
3. Đúng. Mối quan hệ tỉ lệ nghịch: số lần lặp CAG càng nhiều  băng chạy
chậm  phát bệnh càng sớm  Chiều dài của đoạn PCR được khuếch đại dự
đoán khởi phát sớm bệnh Huntington.
4. Sai. Bệnh Huntington không phải truyền nhiễm.
5. Sai.

Câu 25. Vùng lặp lại trinucleotide của locus bệnh Hungtington của sáu
cá thể được khuếch đại bằng PCR và được điện di trên gel như hình dưới
đây. Các con số bên phải chỉ ra kích thước của các sản phẩm PCR. Mỗi
người có DNA phân tích đều có bố hoặc mẹ bị bệnh.
a. Người nào mắc bệnh sớm nhất?
b. Người nào ít có khả năng bị ảnh hưởng nhất?

Hướng dẫn trả lời

Bệnh Hungtington được xác định là bệnh di truyền khởi phát muộn, gây chết
các tế bào não và gây tử vong. Cá thể nào có số lần lặp CAG càng nhiều  băng
chạy chậm  phát bệnh càng sớm.
Người B có băng chạy chậm nhất nên sẽ mắc bệnh sớm nhất.
63
 Người F có 2 băng chạy chậm nhất ít có khả năng bị ảnh hưởng nhất.

Câu 26. V2-2013. Một nhà nghiên cứu thu thập lá cây từ một quần thể
lớn của loài cây Mimulus guttatus. Mỗi lá được lấy từ một cây, sau đó được
nghiền riêng để thu enzym X. Enzym này sau đó được phân tích bằng điện
di SDS-PAGE. Điện di đồ của enzym X từ lá của 6 cây khác nhau (kí hiệu 1
- 6) thu được như hình dưới.
Chó thÝch 1 2 3 4 5 6
GiÕng tra mÉu enzym 
B¶n gel ®iÖn di
B¨ng ®iÖn di



a) Nếu chỉ có một gen mã hóa enzym X, thì sự đa hình của enzym X như
trên bản gel điện di được giải thích như thế nào?
b) Hãy thiết kế một thí nghiệm nhằm kiểm định giải thuyết đưa ra ở phần
(a).
c) Phân tích phản ứng enzym cho biết enzym X của cả 6 cây thí nghiệm
đều có hoạt tính như nhau. Nếu alen qui định enzym X ở vị trí số 1 trên bản gel
là alen kiểu dại, còn các alen khác là các dạng đột biến, thì kiểu đột biến nhiều
khả năng nhất làm xuất hiện các alen ở mẫu số 2 và số 3 là gì? Giải thích.
Hướng dẫn trả lời
a. Xét vị trí của các băng trên bản điện di ta thấy chỉ có 3 vị trí (vị trí số 1 nằm
gần điểm xuất phát, vị trí 2 nằm giữa và vị trí 3 nằm xa điểm xuất phát nhất).
Mỗi cây chỉ có một hoặc hai trong ba vị trí, từ đó có thể đưa ra giả thuyết là
enzym X được cấu tạo từ một loại chuỗi polypeptit giống nhau (đồng phức kép).
Trong quần thể tồn tại 3 alen khác nhau của cùng một gen. Alen qui định chuỗi
polypeptit có kích thước lớn nhất cho băng ở gần điểm xuất phát có thể ký hiệu
là A1, alen qui định alen có băng điện di ở vị trí trung gian là A2, tương tự alen
qui định protein có băng ở vị trí xa nhất là A3. Những cây có hai băng điện di là
những cây dị hợp tử.
64
b. Để kiểm tra giả thuyết ta cho các cây dị hợp tử tự thụ phấn, sau đó tách
1
enzyme X từ lá của các cây con và đem điện di. Nếu đời con có tỉ lệ phân li:
4
số cây con có 1 băng điện di kiểu gen đồng hợp A1A1: ½ số cây có 2 băng điện
di kiểu dị hợp A1A2: ¼ số cây có 1 băng điện di kiểu gen đồng hợp A2A2 (tỉ lệ
1:2:1) thì giả thuyết đưa ra là phù hợp.
c. Các enzym được tạo ra ở các cây có kiểu gen hoang dại và kiểu gen đột biến
đều có hoạt tính như nhau chứng tỏ đột biến không làm thay đổi cấu hình không
gian ba chiều trong đó có vùng trung tâm hoạt tính của enzym. Như vậy, đột
biến chỉ có thể xảy ra ở vùng ngoài trung tâm hoạt tính của enzym. Ngoài ra các
protein do các enzym đột biến qui định có tốc độ di chuyển nhanh hơn so với
protein do gen kiểu dại qui định. Điều đó chứng tỏ đột biến đã làm xuất hiện bộ
ba kết thúc sớm ở vùng cuối của gen dẫn đến mất đi một vài axit amin làm cho
chuỗi polypeptit ngắn đi nên di chuyển nhanh hơn.

Câu 27. Phenylketon niệu là một bệnh hiếm gặp ở người do đột biến gen
lặn mã hóa phenylalanine hydroxylase.
Phenylketon niệu ảnh hưởng đến một gia đình như thể hiện trong phả
hệ và sơ đồ của một số kết quả của kỹ thuật Southern dưới đây và phát hiện
một đa hình gồm 2 băng ứng với 2 alen có kích thước: 8 kb và 4 kb.
a. Cá thể II-3 bị bệnh. Dự kiến kiểu hình phân tử gồm các những băng
nào?
b. Cá thể II-4 bị bệnh. Dự kiến kiểu hình phân tử gồm các những băng
nào?
c. Cá thể II-2 kết hôn với người vợ bị bệnh. Xác suất để con họ bình
thường là bao nhiêu?

65
 Hướng dẫn trả lời
a. Nhận xét: cá thể I-1 và I-2 dị hợp tử nên mang 2 băng ở 8kb và 4 kb 
không bị bệnh. Cá thể II-1 đồng hợp tử trội mang 2 băng ở 8 kb  không bị
bệnh.
Cá thể II-3 bị bệnh sẽ mang 1 băng tần ở 4 kb.
b. Cá thể II-4 không bệnh nên có thể sẽ mang 1 băng tần ở 4 kb và 1 băng
tần ở 8kb (dị hợp tử) hoặc mang 2 băng tần ở 8 kb (đồng hợp tử trội).
c. Cá thể II-2 dị hợp tử kết hôn với người vợ bị bệnh đồng hợp tử lặn  xác
suất để con họ bình thường là 50%.

Câu 28. Bệnh Phenylketon niệu là đột biến gen gây ra. Sử dụng kỹ thuật
Southern blot của 1 gia đình gồm bố (1), mẹ (2) và các con (3), (4), (5), (6).
Trong đó đã biết đứa con (3) không bị bệnh. Hỏi đứa con còn lại có bị bệnh
không? Giải thích.

66
 Hướng dẫn trả lời
Bố (1), mẹ (2) đều dị hợp tử nên có 2 băng ở 5kb và 3 kb.
Đứa con (3) không bị bệnh đồng hợp trội mang 1 băng tần 5 kb.
Đứa con (4) dị hợp tử mang 1 băng ở 5 kb và 3 kb.
Đứa con (5) bị bệnh đồng hợp lặn mang 1 băng ở 3 kb.
Đứa con (6) không bị bệnh đồng hợp trội.

Câu 29. Trong các nghiên cứu pháp y, đa hình VNTR được phân tích
bằng PCR (3 locus, 2 alen trên mỗi locus). DNA được tìm thấy trên nạn
nhân (làn F) được so sánh với 3 nghi phạm (A, B và C). Mối tương quan
giữa số lượng locus VNTR đang được điều tra và mức độ chắc chắn với
danh tính nào có thể được thiết lập?

67
 Hướng dẫn trả lời
Mối tương quan giữa số lượng locus VNTR đang được điều tra và mức độ
chắc chắn với danh tính thủ phạm có thể là B vì DNA trên người nạn nhân F
chứa các đoạn lặp có trong DNA của B, tức là DNA của B được tìm thấy trên
người nạn nhân.

Câu 30. IBO 2010. Hình dưới mô tả quá trình tạo cây chuyển gen được
biến nạp gen X bằng sử dụng plasmit Ti của vi khuẩn Agrobacterium.

a) Các phát biểu nào dưới đây về quá trình này là đúng hay sai?

68
 I. Các enzym giới hạn và ligaza được dùng để tạo các phân tử ADN tái tổ
hợp.
II. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật được dùng để kích thích mô lá tái sinh
cây.
III. Toàn bộ plasmid Ti cùng với gen X tái tổ hợp sẽ kết hợp vào hệ gen của
thực vật
IV. Có thể dùng kỹ thuật PCR hoặc phân tích Southern để khẳng định cây
chuyển gen đã được biến nạp gen X thành công.
V. Có thể sử dụng các kỹ thuật RT (phiên mã ngược)-PCR, phân tích
Northern hoặc Western để kiểm tra sự biểu hiện của gen X ở cây chuyển gen
Hướng dẫn trả lời
Phát biểu đúng: I, IV, V.
Phát biểu sai: II, III.

b) Các phát biểu dưới đây khi nói về các véctơ biểu hiện gen ở thực vật nói
chung là đúng hay sai?
I. Nó thường phải mang gen đánh dấu hay chỉ thị chọn lọc để nhận ra các tế
bào đã được chuyển gen thành công.
II. Nó thường phải mang một promoter giúp gen biến nạp có thể biểu hiện
được trong tế bào thực vật.
III. Nó thường phải chứa một vị trí đa nhân dòng để có thể cài được gen
ngoại lai vào thể truyền
IV. Nó phải chứa trình tự nucleotit giống hệt một phần đặc hiệu của hệ gen
thực vật vì gen đích luôn được cài vào hệ gen tế bào chủ bởi cơ chế tái tổ hợp
tương đồng.
V. Nó thường phải chứa một vị trí khởi đầu tái bản để có thể được nhân lên
thành nhiều bản sao trong quá trình tạo vectơ tái tổ hợp.
Hướng dẫn trả lời
Phát biểu đúng: I, II, III, V.
Phát biểu sai: IV.

69
C -ƯNG DỤNG THỰC TIỄN CỦA CHUYÊN ĐỀ

Chuyên đề «Ứng dụng di truyền học tạo giống bằng công nghệ gen» đã
được sử dụng trong giảng dạy cho học sinh thi THPT Quốc gia và học sinh thi
chọn Học sinh giỏi Quốc gia tại trường THPT Chuyên Hưng Yên cho thấy được
hiệu quả cũng như tính thuyết phục của chuyên đề. Với nội dung chuyên đề
được xây dựng như trên đã cung cấp cho giáo viên cũng như học sinh nguồn tư
liệu về lý thuyết và bài tập về phần Công nghệ gen một cách hệ thống, logic từ
cơ bản đến chuyên sâu. Chúng tôi khuyến khích nên giao cho học sinh nghiên
cứu trước chuyên đề bằng hệ thống câu hỏi trước khi vào học chuyên đề nhằm
giúp học sinh tự tìm tòi nghiên cứu, phát triển tư duy và giúp học sinh chủ động
trong quá trình học. Trong quá trình dạy học chuyên đề, giáo viên lồng ghép
những kiến thức lý thuyết cùng với các bài tập thực tế, những ứng dụng công
nghệ sinh học hiện đại sẽ gây hứng thú cho học sinh, phát huy năng lực của học
sinh.

Nội dung công nghệ gen nói riêng, công nghệ sinh học nói chung rất được
chú trọng trong dự thảo chương trình giáo dục phổ thông tổng thể môn Sinh học.
Giảng dạy phần công nghệ gen trong chương trình Sinh học phổ thông còn giúp
định hướng cho học sinh lựa chọn ngành nghề trong bối cảnh phát triển công
nghệ sinh học và cuộc cách mạng công nghiệp lần thứ tư.

70
 D. PHÂN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. KẾT LUẬN
Chuyên đề đã xây dựng hệ thống các kiến thức cơ bản và chuyên sâu về
công nghệ gen và những ứng dụng của công nghệ gen trong nghiên cứu di
truyền học cũng như ứng dụng trong thực tế các ngành y, dược học và sản xuất.
Trong mỗi nội dung, tôi đã lồng ghép các kiến thức chuyên sâu, các vấn đề
thường được đề cập trong các đề thi chọn học sinh giỏi quốc gia, quốc tế môn
Sinh học.
Phần cuối của nội dung chuyên đề, chúng tôi đã xây dựng được một số các
câu hỏi, bài tập củng cố, vận dụng cao những kiến thức về công nghệ gen và
những ứng dụng của nó giúp học sinh có thể nghiên cứu, tìm tòi hay ôn tập kiến
thức.
Hy vọng chuyên đề sẽ là nguồn tư liệu tốt phục vụ việc dạy học chuyên đề
ứng dụng di truyền học- nội dung về công nghệ gen của các thầy cô và học sinh
chuyên Sinh.
2. ĐỀ NGHỊ
Dù rất tâm huyết và dành nhiều thời gian viết chuyên đề nhưng cũng không
tránh khỏi những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô và của các em học sinh.
Để hoàn thiện hơn, chuyên đề có thể mở rộng hơn và cần bổ sung thêm
nhiều câu hỏi, bài tập nâng cao hơn nữa. Rất mong được sự đóng góp của quý
thầy cô đồng nghiệp.
Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn.

71
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Trần Bình, Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, NXB
Nông nghiệp.
2. Campbell Reece, Sinh học, NXB Giáo dục.
3. Trịnh Đình Đạt, Công nghệ sinh học - công nghệ di truyền, NXB Giáo dục.
4. Phạm Thành Hổ, Nhập môn công nghệ sinh học, NXB Giáo dục
5. Đỗ Lê Thăng, Hoàng Thị Hòa, Nguyễn Thị Hồng Vân, Chọn lọc và hướng
dẫn giải bài tập di truyền học, NXB Giáo dục.
6. Võ Thị Thương Lan, Giáo trình Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng,
NXB Giáo dục.
7. Lê Đình Lương, Nguyên lí kĩ thuật di truyền, NXB Khoa học Kĩ thuật.
8. Khuất Hữu Thanh, Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, NXB Khoa
học và kỹ thuật Hà Nội.
9. Khuất Hữu Thanh, Kỹ thuật gen nguyên lí và ứng dụng, NXB Khoa học
và kỹ thuật Hà Nội.
10. Internet: https://voer.edu.vn/m/cong-nghe-chuyen-gen-dong-vatthuc-vat-mo-
dau/f1418bd6

72