Universitatea „Transilvania” din Braşov

Facultatea de Medicină
Program de studiu: Laborator clinic

Referat
CHIMIE ANALITICĂ

Determinarea creatininei
serice și urinare

AUTOR:
CAMELIA-MIHAELA BODOR (ROTARU)

COORDONATOR:
Prof.dr. BADEA MIHAELA

Braşov
2021

1
CUPRINS
I. INTRODUCERE ....................................................................................... 3

II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII .................................................. 4

III. MATERIALE NECESARE – ECHIPAMENTE, CONSUMABILE ȘI

REACTIVII NECESARI ................................................................................. 4

IV. METODE DE ANALIZĂ – PRINCIPIUL ȘI MODUL DE LUCRU ....... 6

V. APLICAȚII POSIBILE ............................................................................. 9

VI. REZULTATE ȘI DISCUȚII .................................................................. 10

VII. BIBLIOGRAFIE .................................................................................. 11

2
 I. INTRODUCERE

Boala renală cronică (BRC) este o afecțiune larg răspândită și gravă care
provoacă o creștere semnificativă a morbidității, mortalității și reprezintă povară
financiară semnificativă asupra sistemelor de sănătate din întreaga lume (Zhybak, et
al., 2016; Jha, et al., 2013; Nassar & Ayus, 2001). Ratele de prevalență ale BRC au fost
raportate a fi între 11% și 13% la nivel global (Hill, et al., 2016; Tayebi-Khosroshahi, et
al., 2016). Rinichii joacă un rol crucial în eliminarea reziduurilor azotate din sânge, în
special creatinina și ureea. În cazurile de insuficiență renală, aceste deșeuri se pot
acumula în organism, în funcție de severitatea bolii (Wahlefeld, et al., 1974; Deminice,
et al., 2011; Barcelos, et al., 2016; Brosnan, et al., 2011).
Creatinina, o substanță netoxică, este produsul final al metabolismului creatinei în
mușchi, aproximativ 2% fiind convertit zilnic în creatinină într-un ritm constant (Iseki, et
al., 1997; Fitch & Shields, 1966).Această conversie este ireversibilă, iar creatinina este
în cele din urmă excretată din organism prin urină (Stead, et al., 2006). Creatinina nu
are un rol semnificativ în biometabolism, iar concentrația sa în organism este controlată
de excreția renală (Gao, et al., 2010; Lakshmi, et al., 2006). Cantitatea de creatinină
prezentă în ser și urină este legată de masa musculară și eliminarea renală și este
relativ stabilă în ser (Zinchenko, et al., 2012). Filtrarea creatininei are loc în rinichi fără
reabsorbție, iar toată creatinina produsă prin contracția musculară este eliminată din
organism prin tractul urinar (Narayanan & HD., 1980; Krishnegowda, et al., 2017; Allen,
2012).
Nivelului creatininei serice este un biomarker esențial pentru detectarea
insuficienței renale, evaluarea ratei de filtrare glomerulară și monitorizarea distrofiei
musculare (Gao, et al., 2010).
Reacția lui Jaffe este metoda cea mai frecvent utilizată pentru măsurarea
nivelului de creatinine în ser și urină, în care creatinina reacționează cu acidul picric într-
un mediu alcalin, rezultând un compus de culoare portocalie. Cu toate acestea, au fost
propuse câteva alte tehnici, inclusiv reacții enzimatice, teste de colorimetrie,
chemiluminiscență și cromatografie (Duong & J., 2017; Heinegård & Tiderström, 1973;
Sununta, et al., 2018; Du, et al., 2015; Hanif, et al., 2016; Zhao, 2015). Aceste tehnici
3
sunt aplicate în mod obișnuit pe probele de sânge, urină (Pundir & Narwal, 2018).

II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Scopul principal al măsurării nivelului creatininei din organism este de a evalua

funcția renală și de a detecta leziuni sau boli ale rinichilor. Măsurarea nivelurilor de
creatinine din sânge și urină oferă o măsură indirectă a funcției renale. În mod specific,
măsurarea nivelurilor de creatinine serice este un biomarker important pentru detectarea
insuficienței renale și evaluarea ratei de filtrare glomerulară. În plus, aceasta poate ajuta
la diagnosticarea distrofiei musculare.
Scopul acestei lucrări este evaluarea metodelor de dozare a valorilor creatininei
urinare și serice.
Obiectivele acestei lucrări reprezintă identificarea metodelor de lucru și a
materialelor și reactivilor necesari.
Cele două metode de dozare a creatininei evaluate în cadrul acestei lucrări sunt
reprezentate de:
• Reacția Jaffe
• Cromatografia

III. MATERIALE NECESARE – ECHIPAMENTE,

CONSUMABILE ȘI REACTIVII NECESARI

Echipamentele necesare pentru reacția lui Jaffe pentru a măsura nivelul creatininei
includ:
• Spectrofotometru:
• Pipete și baloane volumetrice:
• Soluție de acid picric: Acidul picric este utilizat ca reactiv pentru a reacționa cu
creatinina în condiții alcaline pentru a produce un cromofor portocaliu-roșu.
• Soluție de bază tare: cum ar fi hidroxidul de sodiu sau hidroxidul de potasiu,
este utilizată pentru alcalinizarea probei și inițierea reacției lui Jaffe.

4
 • Baie de apă sau bloc de încălzire: utilizate pentru a menține o temperatură
constantă în timpul reacției, necesară pentru măsurători precise.
• Recipiente pentru mostre
• Cuve sau eprubete

Echipamentele necesare pentru metodele bazate pe cromatografie pentru

măsurarea nivelului de creatinine includ:
• Sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC): HPLC este un
tip de cromatografie care utilizează o fază mobilă lichidă pentru a separa și
cuantifica componentele dintr-o probă. Un sistem HPLC constă dintr-o pompă,
injector, coloană, detector și sistem de achiziție de date. HPLC este utilizat în
mod obișnuit pentru măsurarea creatininei în laboratoarele clinice.
• Sistem cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS): LC-MS este o
tehnică analitică sensibilă și selectivă care combină puterea de separare a
cromatografiei lichide cu puterea de detecție a spectrometriei de masă. LC-
MS este utilizat pentru cuantificarea precisă a creatininei în medii clinice și de
cercetare.
• Coloana de cromatografie: O coloană de cromatografie este utilizată pentru a
separa și purifica componentele probei pe baza proprietăților lor chimice și
fizice. Coloana este umplută cu o fază staționară, cum ar fi silicagel sau
material cu fază inversă, care interacționează diferit cu componentele probei,
ducând la separarea acestora.
• Faza mobilă: Faza mobilă este solventul utilizat pentru eluarea componentelor
probei din coloana de cromatografie. Compoziția fazei mobile poate fi variată
pentru a optimiza separarea creatininei de alte componente din probă.
• Standarde de calibrare: Standardele de calibrare sunt utilizate pentru a
genera o curbă de calibrare care relaționează semnalul măsurat de la
detector de concentrația de creatinină din probă.
• Echipament de pregătire a probei, cum ar fi centrifugele, dispozitivele de
filtrare și cartușele de extracție, sunt utilizate pentru a pregăti proba pentru
analiză, pentru a elimina substanțele interferente și pentru a concentra
5
 creatinina.
• Software de analiză a datelor: Software-ul de analiză a datelor este utilizat
pentru a procesa și interpreta datele cromatografice, pentru a calcula
concentrația de creatinine și pentru a genera rapoarte.

Metodele bazate pe cromatografie sunt mai precise și mai specifice decât reacția lui
Jaffe, dar necesită echipament și expertiză specializate pentru a funcționa.

IV. METODE DE ANALIZĂ – PRINCIPIUL ȘI MODUL DE

LUCRU

Reacția Jaffe

Reacția lui Jaffe este o metodă colorimetrică pentru măsurarea creatininei în

probe biologice, cum ar fi ser, urină și alte fluide corporale. Se bazează pe reacția
creatininei cu acidul picric într-un mediu alcalin, care produce o culoare galben-
portocalie care poate fi măsurată cu ajutorul unui spectrofotometru.

Principiul reacției lui Jaffe este că creatinina reacționează cu acidul picric într-un
mediu alcalin pentru a forma un complex brun-roșcat numit picrat de creatinine.
Formarea acestui complex este proporțională cu cantitatea de creatinină prezentă în
probă, iar intensitatea culorii poate fi măsurată la o anumită lungime de undă folosind un
spectrofotometru. Lungimea de undă utilizată este de obicei 500-600 nm.

Modelul de lucru al reacției lui Jaffe implică mai mulți pași:

1. Prepararea reactivului: Reactivul Jaffe este preparat prin dizolvarea acidului picric
într-o soluție alcalină puternică, cum ar fi hidroxid de sodiu sau hidroxid de

6
 potasiu. pH-ul reactivului este critic și este de obicei ajustat la un pH de 12,0-
12,5.
2. Amestecarea probei cu reactivul: O cantitate mică de probă biologică, cum ar fi
ser sau urină, este amestecată cu un volum egal de reactiv Jaffe. Amestecul
este apoi lăsat să stea câteva minute pentru a permite reacţiei să continue.
3. Măsurarea intensității culorii: Intensitatea culorii produsă de complexul picrat al
creatininei este măsurată cu ajutorul unui spectrofotometru. Absorbanța este
citită la o lungime de undă de 500-600 nm, iar concentrația de creatinina din
probă este calculată folosind o curbă de calibrare.

4. Precizia reacției lui Jaffe este afectată de mai mulți factori, inclusiv stabilitatea
reactivului, interferența cu alte substanțe din probă și variația condițiilor
alcaline. În ciuda limitărilor sale, reacția lui Jaffe rămâne o metodă utilizată pe
scară largă pentru măsurarea creatininei în medii clinice și de cercetare
datorită simplității și costului redus.

Figura 1. Reacția Jaffe de determinare a creatininei prin producerea complexului

Janovsky (galben-portocalie)
(Fu, et al., 2018)

7
Cromatografia

Metodele bazate pe cromatografie pentru măsurarea creatininei în probele

biologice se bazează pe separarea creatininei de alte substanțe din probă folosind o
fază staționară și o fază mobilă. Principiul din spatele cromatografiei este că diferitele
substanțe dintr-un amestec au afinități diferite pentru fazele staționare și mobile,
permițându-le să fie separate pe baza proprietăților lor fizice și chimice.
Modelul de lucru al metodelor bazate pe cromatografie pentru măsurarea
creatininei implică mai multe etape:
1. Pregătirea probei: Proba biologică, cum ar fi serul sau urina, este mai întâi
pregătită prin îndepărtarea oricăror substanțe interferente și concentrarea
creatininei folosind metode precum ultrafiltrarea, extracția în fază solidă
sau derivatizarea.
2. Separarea cromatografică: Proba pregătită este apoi injectată pe o
coloană cromatografică, care conține o fază staționară care reține selectiv
creatinina și alți analiți. Faza mobilă este apoi trecută prin coloană,
transportând analiții prin faza staționară la viteze diferite, permițând
separarea acestora.
3. Detectare și cuantificare: analiții separați sunt apoi detectați și cuantificați
folosind un detector, cum ar fi un spectrofotometru UV/Vis, un
spectrometru de masă sau un detector electrochimic. Concentrația
creatininei din probă este apoi calculată folosind o curbă de calibrare.
4. Tipul de cromatografie utilizat pentru măsurarea creatininei poate varia, cu
metode comune, inclusiv cromatografia lichidă de înaltă performanță
(HPLC), cromatografia gazoasă (GC) și cromatografia în strat subțire
(TLC). Alegerea metodei depinde de mai mulți factori, inclusiv
sensibilitatea și selectivitatea necesare, tipul de probă analizată și
echipamentul disponibil.
5. Metodele bazate pe cromatografie pentru măsurarea creatininei oferă mai
multe avantaje față de alte metode, inclusiv sensibilitate ridicată,
selectivitate și acuratețe, precum și capacitatea de a analiza mai mulți
8
 analiți simultan. Cu toate acestea, ele necesită, de asemenea,
echipamente și expertiză mai specializate în comparație cu alte metode
precum reacția lui Jaffe.

Tabel 1 Valori de referință în determinarea creatininei urinare și serice

Bărbați Femei Unitate de măsură
Ser 0.7-1.3 0.6-1.1 mg/dL
61.9-114.9 53-97.2 µmol/L
Urină 14-26 11-20 mg/kg/24h
123.8-229.8 97.2-176.8 µmol/kg/24h

Tabel 2 Semnificația valorilor creatininei

Creștere Scădere
Patologii renale Masă musculară scăzută
Deshidratare Malnutriție
Rabdomioliză Sarcină
Obstrucții la nivel renal Patologii hepatice
Regim hiperproteic Înaintarea în vârstă
Antrenament intens
Administrarea anumitor medicamente
(AINS, antibiotice)

V. APLICAȚII POSIBILE

Determinările creatininei au mai multe aplicații în medicină, printre care:

1. Diagnosticul și monitorizarea funcției renale: Nivelurile creatininei din sânge și
urină sunt indicatori importanți ai funcției renale. Niveluri mai mari decât cele
normale pot indica leziuni sau boli renale.
2. Monitorizarea tratamentului bolilor de rinichi: Nivelurile de creatinina sunt utilizate
9
 pentru a monitoriza eficacitatea tratamentului pentru boli de rinichi, cum ar fi
dializa sau medicamente.
3. Detectarea tulburărilor musculare: nivelurile de creatinine din sânge pot fi utilizate
pentru a detecta tulburări musculare, cum ar fi distrofia musculară sau
miopatia.
4. Dozarea medicamentelor: Nivelurile creatininei pot fi utilizate pentru a determina
doza adecvată a anumitor medicamente, cum ar fi antibioticele sau
medicamentele pentru chimioterapie, care sunt eliminate din organism de
către rinichi.
5. Evaluarea stării nutriționale: Nivelurile scăzute ale creatininei în sânge pot indica
malnutriție, în timp ce nivelurile ridicate pot indica o creștere a masei
musculare datorită unei nutriții îmbunătățite.

VI. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Măsurarea creatininei este esențială pentru evaluarea funcției renale, a bolilor

musculare și a dozării medicamentelor. Cele mai comune metode de măsurare a
nivelului de creatinine în ser și urină sunt reacția Jaffe și tehnicile bazate pe
cromatografie. Reacția Jaffe este utilizată pe scară largă datorită simplității, costului
scăzut și reproductibilității ridicate. Cu toate acestea, reacția Jaffe poate fi afectată de
substanțe interferente, ceea ce duce la rezultate fals crescute sau scăzute. Metodele
bazate pe cromatografie, pe de altă parte, oferă specificitate și sensibilitate mai ridicate,
dar sunt mai complexe și mai costisitoare.

Mai multe studii au comparat reacția Jaffe cu metode bazate pe cromatografie pentru
măsurarea nivelului de creatinine din ser și urină. Un studiu realizat de Sánchez-
Ramírez et. al,. a comparat patru metode de măsurare a creatininei în ser, inclusiv
reacția Jaffe, testul enzimatic și două metode de cromatografie lichidă-spectrometrie de
masă (LC-MS) (Sánchez-Ramírez, et al., 2016). Studiul a constatat că analiza
enzimatică și metodele LC-MS au avut o acuratețe și o precizie mai bune decât reacția

10
Jaffe, cu interferențe mai mici și fără nevoie de diluare.
Un alt studiu al lui Li et al. a comparat reacția Jaffe cu cromatografia lichidă de înaltă
performanță (HPLC) pentru măsurarea nivelului de creatinine în urină. Studiul a
constatat că HPLC a avut sensibilitate și specificitate mai mare decât reacția Jaffe, cu o
interferență mai mică de la alte substanțe din urină, cum ar fi proteinele și glucoza (Li,
et al., 2018).
În ciuda avantajelor metodelor bazate pe cromatografie, costul și complexitatea lor
ridicate limitează utilizarea lor de rutină în laboratoarele clinice. Reacția Jaffe rămâne
metoda cea mai frecvent utilizată pentru măsurarea nivelului de creatinine din ser și
urină datorită costului redus și simplității sale. Cu toate acestea, laboratoarele trebuie să
fie conștiente de limitările reacției Jaffe și de potențialul de interferență a substanțelor.
În concluzie, alegerea metodei de măsurare a nivelurilor de creatinine depinde de
contextul clinic, resurse și acuratețea necesară. În timp ce reacția Jaffe rămâne metoda
cea mai frecvent utilizată, metodele bazate pe cromatografie oferă specificitate și
sensibilitate mai ridicate, în special în prezența substanțelor interferente.

VII. BIBLIOGRAFIE

1. Allen, P., 2012. Creatine metabolism and psychiatric disorders: does creatine
supplementation have therapeutic value.. Neurosci Biobehav Rev., 36(5), pp.
1442-1462.

2. Barcelos, R. și alții, 2016. Creatine and the liver: metabolism and possible
interactions.. Mini Rev Med Chem., 16(1), pp. 12-18.

3. Brosnan, J., Da Silva, R. & Brosnan, M., 2011. The metabolic burden of creatine
synthesis. Amino Acids., 40(5), pp. 1325-1331.

4. Deminice, R., Da Silva, R., Lamarre, S. & al., e., 2011. Creatine supplementation
prevents the accumulation of fat in the livers of rats fed a high-fat diet,. J Nutr.
2011, 141(10), pp. 1799-1804.

11
5. Du, J., Zhu, B., Leow, W. & al., e., 2015. Colorimetric detection of creatinine
based on plasmonic nanoparticles via synergistic coordination chemistry.. Small.,
11(33), pp. 4104-4110.

6. Duong, H. & J., R., 2017. Development of ratiometric fluorescent biosensors for
the determination of creatine and creatinine in urine.. Sensors. , 17(11), p. 2570.

7. Fitch, C. & Shields, R., 1966. Creatine metabolism in skeletal muscle I. Creatine
movement across muscle membranes.. J Biol Chem., 241(15), pp. 3611-3614.

8. Fu, L.-M., Tseng, C.-C., Ju, W.-J. & Yang, R.-J., 2018. Rapid Paper-Based
System for Human Serum Creatinine Detection".. Inventions, 3(2), p. 34.

9. Gao, B., Li, Y. & Zhang, Z., 2010. Preparation and recognition performance of
creatinine-imprinted material prepared with novel surface-imprinting technique.. J
Chromatogr B., 878(23), pp. 2077-2086.

10. Hanif, S. și alții, 2016. Chemiluminescence of creatinine/H2O2/Co2+ and its

application for selective creatinine detection.. Biosens Bioelectron., Volumul 75,
pp. 347-351.

11. Heinegård, D. & Tiderström, G., 1973. Determination of serum creatinine by a

direct colorimetric method.. Clin Chim Acta., 43(3), pp. 305-310.

12. Hill, N., Fatoba, S., Oke, J. & al., e., 2016. Global prevalence of chronic kidney
disease—a systematic review and meta-analysis.. PLoS One, 11(7), p.
e0158765.

13. Iseki, K., Ikemiya, Y. & Fukiyama, K., 1997. Risk factors of end-stage renal
disease and serum creatinine in a community-based mass screening.. Kidney
Int., 51(3), pp. 850-854.

14. Jha, V., Garcia-Garcia, G., Iseki, K. & al., e., 2013. Chronic kidney disease:
global dimension and perspectives.. Lancet North Am Ed, 382(9888), pp. 260-
272.

12
15. Krishnegowda, A., Padmarajaiah, N., Anantharaman, S. & Honnur, K., 2017.
Spectrophotometric assay of creatinine in human serum sample.. Arabian J
Chem. , Volumul 10, pp. S2018-S2024.

16. Lakshmi, D., Prasad, B. & Sharma, P., 2006. Creatinine sensor based on a
molecularly imprinted polymer-modified hanging mercury drop electrode..
Talanta., 70(2), pp. 272-280.

17. Li, Y. și alții, 2018. Comparison of the Jaffé method and high-performance liquid
chromatography for measuring creatinine in urine.. Ann Clin Biochem., 55(3), pp.
350-355.

18. Narayanan, S. & HD., A., 1980. Creatinine: a review.. Clin Chem. , 26(8), pp.
1119-1126.

19. Nassar, G. & Ayus, J., 2001. Infectious complications of the hemodialysis
access.. Kidney Int, 60(1), pp. 1-13.

20. Pundir, C. & Narwal, V., 2018. . Biosensing methods for determination of
creatinine: a review.. Biosens Bioelectron., Volumul 100, pp. 241-227.

21. Sánchez-Ramírez, G., Cervantes-Sánchez, A., Gómez-Oliván, L. & García-

Montalvo, E., 2016. . Comparison of methods for creatinine measurement in
human serum: enzymatic assay, Jaffé method and two liquid chromatography-
mass spectrometry methods.. J Anal Methods Chem. .

22. Stead, L. și alții, 2006. Is it time to reevaluate methyl balance in humans?. Am J

Clin Nutr., 83(1), pp. 5-10.

23. Sununta, S., Rattanarat, P., Chailapakul, O. & Praphairaksit, N., 2018.
Microfluidic paper-based analytical devices for determination of creatinine in urine
samples.. Anal Sci. , 34(1), pp. 109-113.

24. Tayebi-Khosroshahi, H., Habibzadeh, A., Niknafs, B. & al., e., 2016. The effect of
lactulose supplementation on fecal microflora of patients with chronic kidney
disease; a randomized clinical trial.. J Renal Inj Prev. , 5(3), p. 162.
13
25. Wahlefeld, A., Holz, G. & Bergmeyer, H., 1974. Creatinine.. Elsevier, pp. 1786-
1790.

26. Zhao, J., 2015. Simultaneous determination of plasma creatinine, uric acid,
kynurenine and tryptophan by high-performance liquid chromatography: method
validation and in application to the assessment of renal function.. Biomed
Chromatogr. , 29(3), pp. 410-415.

27. Zhybak, M. și alții, 2016. Creatinine and urea biosensors based on a novel
ammonium ion-selective copper-polyaniline nano-composite.. Biosens
Bioelectron. 2016; 77: 505- 511, Volumul 77, pp. 505-511.

28. Zinchenko, O., Marchenko, S., Sergeyeva, T. & al., e., 2012. Application of
creatinine-sensitive biosensor for hemodialysis control.. Biosens Bioelectron.,
35(1), pp. 466-469.

14