Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Práctica A: DIAGNÓSTICO HPLC

Objetivo: Para el equipo HPLC Hitachi Primaide determinar el tiempo de demora (tD), tiempo de mezcla (tmix), funcionamiento
de los gradientes lineal y escalonado, estado de la bomba y mezclador, precisión en los flujos y tiempo de equilibrio.

Actividades a desarrollar.

A. Determinación de flujo del equipo. (Volumen 10,00 mL, balón aforado)

Ensayo 1. Flujo 2 mL/min. Línea A. Repetir 3 veces.
Tiempo estimado: 15 min.

B. Diagnóstico del gradiente lineal.

*Actividad pre-práctica: Dibujar en la figura 1, el programa de gradiente que se espera.

Programa: 5/5/100/100/5/5/0/0% Solvente B en 0/1/11/13/13,1/17/17,1/21 minutos

Línea A: Agua-TFA 0,05%
Línea B: Agua-Acetona 0,4%
Detección 280 nm. Flujo: 2 mL/min.
Determinar el tD y tmix
100

80

60
% solvente B

40

20

0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (minutos)
Figura 1. Gradiente Lineal.

C. Diagnóstico gradiente escalonado.

*Actividad pre-práctica: Dibujar en la figura 2, el programa de gradiente que espera.
Línea A: Agua-TFA 0,05%
Línea B: Agua-Acetona 0,4%
Detección 280 nm. Flujo 2 mL/min

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Programa:

Tiempo (min) %B Tiempo (min) %B Tiempo (min) %B

0,0 0,0 12,1 75,0 24,1 50,0
3,0 0,0 15,0 75,0 27,0 50,0
3,1 5,0 15,1 95,0 27,1 100,0
6,0 5,0 18,0 95,0 30,0 100,0
6,1 25,0 18,1 100,0 30,1 50,0
9,0 25,0 21,0 100,0 33,0 50,0
9,1 50,0 21,1 0,0 33,1 0,0
12,0 50,0 24,0 0,0 36,0 0,0
100

80
% solvente B

60

40

20

0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45
Tiempo (minutos)

Figura 2. Gradiente escalonado.

D. Determinación de proporcionalidad de las Válvulas (GPV).

*Actividad pre-práctica: Dibujar en la figura 3, el programa de gradiente que espera.
Línea A(C): Agua-TFA 0,05%
Línea B (D): Agua-Acetona 0,4%
Detección 280 nm. Flujo: 2 mL/ min.

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Línea Línea Línea Línea

Tiempo
A B C D
(min)
0,0 50 0 50 0
3,0 50 0 50 0
3,1 80 20 0 0
6,0 80 20 0 0
6,1 50 0 50 0
9,0 50 0 50 0
9,1 80 0 0 20
12,0 80 0 0 20
12,1 50 0 50 0
15,0 50 0 50 0
15,1 0 20 80 0
18,0 0 20 80 0
18,1 50 0 50 0
21,0 50 0 50 0
21,1 0 0 80 20
24,0 0 0 80 20
24,1 50 0 50 0
27,0 50 0 50 0

100

80
% solvente B

60

40

20

0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (minutos)
Figura 3. Proporcionalidad de válvulas.

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Tener en cuenta los siguientes Parámetros de verificación (tomado de Snyder, L., et al. Introduction to modern liquid
chromatography. 3rd ed. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc, 2009, p. 136.):

Parámetro /ensayo Especificación típica Criterio de aceptación típico

Linealidad ±1% Linealidad visual 5-95% B
Volumen de residencia (dwell) Varia Como sea medido
Gradiente escalonado (precisión) ±1% ±1%
Proporcionalidad de válvulas - ≤ 2%*
Flujo (colectar 10 mL a 1 mL/min) ±1% ±2% (± 12 segundos)
Reproducibilidad en retención - ±0.05 min
Reproducibilidad en área (10 μL, inyección) ±0.3% ±1%
*diferencia entre la meseta más alta y más baja

PRÁCTICA B: EFICIENCIA DE LAS COLUMNAS. ECUACIÓN DE VAN

DEEMTER.

Objetivo. Evaluar la eficiencia de una columna C18 y determinar su altura de plato teórico mínima y flujo óptimo de trabajo.

Analitos. Preparar una mezcla de 10 mL que contenga: ácido benzoico (0,2 mg/mL), cafeína (0,4 mg/mL) y KNO3 (0,2 mg/mL)
usando como solvente la fase móvil 30% ACN (TFA 0,05%) en agua MilliQ. Filtrar la solución por membrana de 0,45 µm.
Inyección 5 µL, detección 220 nm.

Descripción de la columna a evaluar: (Nombre, dimensiones, tamaño de partícula)

____________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________

Equilibrar la columna con la fase móvil por 5 min a un flujo de 1 mL/min.

1. Determinar el flujo máximo de trabajo que permite la columna seleccionada. Para esta determinación, iniciar con un
flujo de 0,1 mL/min y registrar la presión. Aumentar gradualmente el flujo hasta un valor que no exceda 250 bar.
2. Analizar la mezcla de los analitos al máximo flujo que permite la columna, y que no supere el valor de 2,5 mL/min.
Tabular los datos en la tabla.
3. Realizar la predicción del analito que más se retiene (ac. Benzoico) a los demás flujos, para determinar el tiempo de
análisis de los métodos cromatográficos (llenar la tabla).

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Presión
Flujo(mL/min) t0 (min) tR ac. Benzoico (min)
(bar)
0,10
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
2,00
2,50

A partir de esta tabla, crear los métodos en el equipo y la secuencia para los análisis que permiten obtener la curva de van
Deemter para cada analito.

Con los datos obtenidos experimentalmente, graficar para cada analito frente a la velocidad lineal (u):
a. Presión en cabeza de columna (P)
b. Tiempo de retención (tR)
c. Respuesta del detector (cuentas de área)
d. Factor de retención (k)
e. Factor de separación o selectividad (α)
f. Número de platos teóricos (N)
g. Resolución (Rs) medida con los anchos en 4σ y 2,355σ. Comparar estos resultados con la resolución obtenida
teoricamente usando los datos de N, k y α
h. Porosidad (ε)
i. Altura de plato teórico (H). Medirlo a 4σ y 2,355σ. Para estas gráficas aplicar modelo de Van Deemter. Emplear
SOLVER para obtener los valores de las contantes A, B y C

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

PRÁCTICAS C, D: ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC Y DIAGNÓSTICO CON

COLUMNA

Objetivo. Verificar la reproducibilidad de la inyección, los rangos dinámico y lineal, el carry over y los LOD y LOQ para un
análisis de cafeína por RP-HPLC. Elaborar la curva de calibración que permita cuantificar la cafeína en una muestra problema
de: café, té verde, té negro, té rojo, dolex forte, etc.

Nota: Cada grupo debe seleccionar e informar la muestra problema donde cuantificará la cafeína una semana antes de la
práctica

PROCEDIMIENTO

Condiciones Cromatográficas

Analito: Cafeína
Detección: 273 nm.
Flujo: ______________________________________________________________________________________________
Inyección: 10 µL
Columna: ___________________________________________________________________________________________

1. Preparar la solución Stock de la siguiente manera:

Solución Stock: Pesar 100,0 mg de cafeína y completar a volumen con agua milliQ, en un matraz aforado de 100,0 mL.
Filtrar toda la solución empleando membrana de 0,45 µm.
2. Preparar la muestra problema según la matriz seleccionada y la revisión bibliográfica. Filtrar la muestra con membrana
de 0,45 um.
3. Preparar una dilución de la solución Stock (ej. 3,00 mL en 10,00 mL), usando agua MilliQ.
4. Analizar el stock diluido y la muestra usando el gradiente diagnóstico: 5/5/100/100/5/5 %B (ACN-0,05%TFA) en
0/1/11/14/14,1/17 min.
5. A partir del análisis por gradiente de su muestra, desarrollar y optimizar un método por elución isocrática. Emplear como
criterios de optimización, la resolución y la pureza de pico cromatográfico.
6. Con el método isocrático optimizado, analizar la solución diluida del stock de cafeína y determinar el factor de respuesta.
7. Teniendo en cuenta el factor de respuesta, diseñar la curva de calibración que tenga absorbancias cercanas a las descritas
en la tabla:

Nivel mAU Nivel mAU

1 50
2 200
3 400
4 600
5 800
6 1000
7 1200
8 1700
9 2000
10 >2000

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

8. Preparar las soluciones de los niveles diseñados, empleando la solución Stock filtrada.
9. Programar en el equipo la siguiente secuencia:
10. Evaluar si la muestra preparada presenta una absorbancia cercana a 600 mAU. Ajustar por dilución la muestra si
no cumple con este requerimiento.

TRATAMIENTO DE DATOS

1. Graficar la curva de calibración y determinar: Rango lineal, rango dinámico, puntos sospechosos o atípicos mediante
pruebas estadísticas.
2. Realizar la regresión lineal usando mínimos cuadrados ordinarios y evaluar la curva con criterios estadísticos y
numéricos, según lo aprendido en la primera sesión (correlación, ajuste, pendiente, corte en y, comportamiento de
residuales, homocedasticidad/heterocedasticidad etc.)
3. Determinar LOD y LOQ.
4. Determinar la concentración de cafeína presente en la muestra problema y reportarla en %p/p con su respectiva
incertidumbre. Comparar con el valor reportado en la literatura o por el fabricante.
5. Empleando las réplicas del nivel 7 verificar la reproducibilidad en la inyección.
6. Empleando el blanco 2 y la última réplica del nivel 7 determinar el carryover.

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Prácticas E, F: Análisis Cuantitativo y cualitativo GC

Objetivo. Evaluar los diferentes parámetros cromatográficos en CG-FID y determinar la concentración de un analito (limoneno,
eugenol, Eucaliptol, etc) en un aceite esencial, usando la técnica de patrón interno.

PROCEDIMIENTO

*Antes de encender el equipo GC, preparar las siguientes soluciones, por pesada: (Solvente diclorometano o hexano)

Soluciones Stock

Stock 1: Estándar del analito

Stock 2: Patrón interno (PI)

Stock 3: Aceite esencial (muestra)

Stock 4 (Para análisis cualitativo): Tetradecano (C14H30), pentadecano (C15H32) y hexadecano (C16H34): 10 µL de cada uno
en 10 mL de DCM. PREPARAR POR VOLUMEN.

DATOS

Masa total del stock Concentración en

Nombre Medir 20 uL Solvente (10 mL)
(g) mg/g

Stock 1 Masa: _________ mg Masa: __________ g

Stock 2 Masa: _________ mg Masa: __________ g

Stock 3 Masa: _________ mg Masa: __________ g

Soluciones para inyectar en el equipo:

- Solución A: 50 µL de Stock 1 y 50 µL de stock 2 en 1,0 mL DCM.

- Solución B: 50 µL de Stock 3 y 50 µL de stock 2 en 1,0 mL DCM
- Stock 4: Inyectar sin diluir.

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

DATOS

Completar a
Medir 50 µL Medir 50 µL Medir 50 µL Masa Concentración
Nombre 1 mL con
Stock 1 Stock 2 Stock 3 total (g) analitos
solvente
_________ mg/g
Solución A _________ mg _________mg _________ mg/g
_________ mg/g

_________ mg/g
Solución B _________mg _________mg _________g
_________ mg/g

E. ANÁLISIS CUALITATIVO

Split vs Splitless.
Inyectar 1 µL de la Stock 4 en un análisis isotérmico a 150°C con flujo 2 mL/min de gas de arrastre Helio y en una columna
HP-5. Temperatura de liner y FID 300°C. Variar en el método las condiciones de Split (1:20 y 1:10) y splitless y discutir los
resultados obtenidos.

Análisis isotérmico vs Rampa

Inyectar 1 µL de la Stock 4 en un análisis por rampa según el siguiente método: Rampa: 80 a 280°C, ΔT: 40 °C/min.
Delay: 1 minuto al inicio y final de la rampa. Flujo: 2 mL/min (Helio). Columna: HP-5. temperatura de liner y FID 300°C.
Tipo de inyección: Splitless. Comparar el cromatograma obtenido con los resultados de la sección Split vs. Splitless y
discutir.
Ecuación de Golay
Inyectar 1 µL de la Stock 4 en un análisis isotérmico a 150°C, gas de arrastre Helio en una columna HP-5. Temperatura
de liner y FID 300°C. Split 1:10. Repetir en análisis variando los flujos de acuerdo a la siguiente tabla: (Predecir los tiempos
de análisis necesarios para cada método)

t0 (min) Flujo (mL/min)

3,95 0,5
2,21 1
1,3 2
0,99 3
0,72 5
0,59 7
0,48 10
0,39 15

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

Para el análisis isotérmico determinar:

1. Factores de retención.
2. Factores de selectividad.
3. Resolución del par crítico.
4. TZ (número de separación)
5. Graficar la relación entre número de carbonos y tiempo de retención. (índices de Kovats)
6. Discutir diferencias entre split y splitless.

Para el análisis por rampa de temperatura:

1. Calcular las temperaturas de elución de los analitos.

2. Graficar la relación entre el número de carbonos y tiempo de retención. (índices lineales)
3. Discutir diferencias entre análisis isotérmico y de rampa.

Con los datos de Golay, graficar para cada analito frente a la velocidad lineal (u):

1. Tiempo de retención.
2. Factor de retención.
3. Resolución del par crítico.
4. Número de platos teóricos (N) y altura de plato teórico (H) a 2.355 σ. (Determinar valores de A, B y C)

F. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE UNA MUESTRA PROBLEMA POR PATRÓN INTERNO.

Método cromatográfico: Columna: HP-5. Inyección: 1 µL. Rampa: 80 a 300°C (1min delay al principio y final de la rampa),
ΔT: 40°C. Flujo: 2 mL/min. (Helio). Tipo de inyección: Split 1:5. Temperatura de liner y FID 300°C.

1. Inyectar las soluciones A y B para determinar los factores de respuesta del estándar, del patrón interno y del aceite
esencial.
2. Diseñar la curva de calibración llenando la siguiente tabla:

Solvente
Analito Patrón interno DCM
Nivel
Área Altura Altura
mg/kg Peso (mg) mg/kg Peso (mg) Área (pA.s) Peso (g)
(pA.s) (pA) (pA)
1
2
3
4
5
6
Elaborado por: Diego Insuasty
Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023
 Laboratorio de Análisis Químico Instrumental 2015578 – 2023

3. Determinar la dilución que se debe hacer a la muestra problema (si es necesario) para que quede en la mitad de la
curva de calibración diseñada.
4. Programar una secuencia en el equipo GC, inyectando los niveles de la curva y la muestra por triplicado.

TRATAMIENTO DE DATOS

1. Graficar la curva de calibración y determinar: Rango lineal y puntos sospechosos o atípicos (mediante pruebas
estadísticas.
2. Realizar la regresión lineal usando mínimos cuadrados ordinarios y evaluar la curva con criterios estadísticos y
numéricos, según lo aprendido en la primera sesión (correlación, ajuste, pendiente, corte en y, comportamiento de
residuales, homocedasticidad/heterocedasticidad etc.)
3. Determinar la concentración de analito presente en el aceite esencial y reportarla en %p/p con su respectiva
incertidumbre. Comparar con el valor reportado en la literatura o por el fabricante.

Elaborado por: Diego Insuasty

Revisado por: Diana Sinuco, Zuly Rivera
Febrero 2023