INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Departamento de Bioquímica

LABORATORIO DE MÉTODOS DE
ANÁLISIS

Reporte de la práctica No.6 “ Efecto de

algunos factores que afectan la intensidad de
fluorescencia de la Riboflavina”

5QV2

Profesora: Olguín Ruiz Gabriela Edith

Alumna: Rosas Nápoles Mariel
Ciudad de México Octubre
2021

OBJETIVOS:
a. Conocerá el manejo de un fluorómetro de filtros.
b. Determinará el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia.
c. Determinará el efecto de la concentración sobre la intensidad de fluorescencia
d. Determinará el efecto de la luz visible sobre la intensidad de fluorescencia.
e. Determinar efecto tiene la temperatura sobre la emisión de fluorescencia de un
compuesto

RESULTADOS:
14

12
Intensidad de fluorescencia (RFU)

10

0
0 10 20 30 40 50 60

Riboflavina (ppm)

Intensidad de la fluorescencia en H2O

Intensidad en la fluorescencia en HCL 0.1M
Intensidad en la fluorescencia enCH3COO 0.9M
Intensidad en la fluorescencia en NaOH 0.1M

Figura 1. Curva de calibración de riboflavina en diferentes métodos (1-50 ppm)

 5
4.5
4 f(x) = 0.816 x + 0.263999999999999
R² = 0.999261647067298
3.5
Intensidad de flurescencia (RFU)

3 f(x) = 0.632 x + 0.036

R² = 0.975899611031841
2.5
2
1.5
1
0.5
f(x) = 0.104 x + 0.023999999999999
R² = 0.998522895125554 0
y = 0.104x + 0.024 1 f(x) =1.5
0.00699999999999984
2 2.5 x +30.00299999999999997
3.5 0.5
4 4.5 5 5.5
Figura
R² = 0.9985 2. Curva deR²calibración de riboflavina en diferentes métodos (1-5 ppm)
= 0.942307692307693
Riboflavina (ppm)

Intensidad de la fluorescencia en H2O

Linear (Intensidad de la fluorescencia en H2O)
Intensidad de la fluorescencia en HCl 0.1M
Linear (Intensidad de la fluorescencia en HCl 0.1M)
Intensidad de la fluorescencia en CH3COOH 0.9 M
Linear (Intensidad de la fluorescencia en CH3COOH 0.9 M)
Intensidad de la fluorescencia en NaOH 0.1M
Linear (Intensidad de la fluorescencia en NaOH 0.1M)

Figura 2. Curva de calibración de riboflavina en diferentes métodos (1-5 ppm)

14

12

10
Intensidad de flurescencia (RFU)

0
0 10 20 30 40 50 60
Riboflavina (ppm)

Intensidad de fluorescencia en H2O

Intensidad de fluorescencia en H2O expuesta a luz visible

Figura 3. Curva de calibración de Riboflavina bajo efecto de la luz visible

¿Cuál es la concentración en ppm de riboflavina para una muestra en la que se obtuvo un valor de 3
RFU (el disolvente usado fue agua)?

R= 2.0945 ppm

PREGUNTA EXTRA:
Un ejemplo en donde se observe o use la fluorescencia (redactar en un solo párrafo) y el motivo
personal para escoger ese ejemplo

En la Laguna de Manialtepec, en las inmediaciones de Puerto Escondido en el estado de Oaxaca, se

observa un fenómeno bioluminiscente el cual es consecuencia de la actividad biológica de una
especie de protistas dinoflagelados.

En razón del por qué elegí este ejemplo del fenómeno de bioluminiscencia es porque al ser un
fenómeno llamativo, despierta en mi la curiosidad por estudiar este tipo de microorganismos y el
cómo y porqué de su desarrollo.

¿Cuánto cuesta un espectro flourometro?

No encontré datos exactos con un proveedor, porque piden datos extras, soloencontré fichas
técnicas.

https://www.agsanalitica.com/archivos/productos/197/FLS1000-Brochure.pdf

DISCUSIÓN:
EFECTO DE LA CONCENTRCIÓN.

En el primer experimento, se analizó el efecto de la concentración de Riboflavina a partir de la

emisión de fluorescencia. En la figura 1 se observa un intervalo de concentración de 10 a 50 ppm
que presenta una desviación a la tendencia lineal, se observa un punto de inflexión que marca la
desviación a esta ley y se puede comprobar mediante el análisis del coeficiente de correlación y las
pendientes de cada uno de los intervalos de concentración de la curva mediante regresión lineal.
Como ya se mencionó anteriormente, en la gráfica se observa un punto de inflexión que se
encuentra a las 10 ppm, esto indica que disminuye la sensibilidad del método y por lo tanto la
emisión de fluorescencia se ve comprometida por este aumento en la concentración. Dicha
desviación a la ley general de la fotometría se atribuye dos factores responsables de las
desviaciones negativas de la linealidad a elevadas concentraciones: el fenómeno de autoabsorción y
el fenómeno de autoatenuación; primero se describirá el fenómeno de autoabsorción, al
aumentar la concentración, el espacio entre las moléculas del analito es menor, por lo que se
aumenta la probabilidad de que haya más colisiones entre moléculas del analito, posteriormente la
luz seleccionada va a llegar a las moléculas y va a excitar a los electrones, ocasionando que estos
pasen a un nivel energético más alto e inmediatamente después de que absorben regresen al
estado fundamental, posteriormente emitirán fluorescencia pero las moléculas vecinas van a
utilizar esa fluorescencia como luz, para exitar a sus electrones sin importar que no sea la máxima
longitud de absorción, es por eso que el detector ya no detecta cantidades tan altas. El segundo
fenómeno responsable de esta inflexión es la autoatenuación ya que como ya se mencionó
anteriormente se tienen concentraciones más altas y por lo tanto se tienen más colisiones, debido a
esto existirán perdidas de energía que debían expresarse como fluorescencia, ahora se expresan en
forma de calor.

En la figura 2 se observa la que se cumple con la linealidad, y puede comprobarse mediante la

ecuación de la recta y el coeficiente de correlación, solamente en el caso del HCl se tiene un punto
que tiene una ligera desviación.

EFECTO DEL pH

En la figura 1 se observan 4 curvas en un intervalo de 1 a 50 ppm, ninguna de estas curvas

presenta una tendencia lineal, todas presentan desviaciones a la ley general de la fotometría
debido al efecto de altas concentraciones, la emisión de fluorescencia es disminuida si la
Riboflavina es disuelta en valores de pH extremos, tanto ácidos como alcalinos, si los valores
de pH están muy cercanos del valor de neutralidad, la emisión de fluorescencia se ve favorecida
y el valor de la pendiente aumenta.

En la figura 2 se tiene un intervalo menor de concentración (1 a 5 ppm) y se observa mediante

el coeficiente de correlación que la tendencia del agua bidestilada, el HCl y NaOH es lineal, por
lo que no presenta desviaciones a la ley general de la fotometría además de que hubo una
mayor emisión de fluorescencia, mientras que la tendencia de la curva de CH3COOH presenta
una ligera desviación a la ley general de la fotometría.

La Riboflavina es una vitamina que en disolución acuosa es estable a valores de pH de entre 5 y

7, es decir que en soluciones como ácidos débiles, bases débiles y soluciones neutras la
Riboflavina no se degrada, pero por el contrario si la Riboflavina es disuelta en un medio muy
acido o muy alcalino, esta comienza a degradarse, dando origen a productos
derivados carentes de poder emitir fluorescencia, es por esto que los cambios en la
emisión de fluorescencia de compuestos como la Riboflavina provienen del número de
especies resonantes diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas delas
moléculas. Estas formas resonantes adicionales proporcionan una mayor estabilidad
al primer estado excitado, y la consecuencia es una emisión fluorescente a mayor longitud de
onda.

Los derivados de la riboflavina que son biológicamente activos son el flavin mononucleótido
(FMN) y el flavín adenina dinucleótido (FAD), que son las forma en la

que actúa como coenzima. Ambos pueden interconvertirse reversiblemente en sus formas

oxidadas o reducidas:

EFECTO DE LA LUZ VISBLE

Para este último punto las diferentes soluciones de Riboflavina se expusieron durante 1 hora a
la radiación de luz visible. La Riboflavina es una vitamina fotosensible a la luz visible, luz
ultravioleta y a ciertos tratamientos, como la pasteurización, proceso que hace perder el 20% de
su contenido, por lo que la degradación de esta molécula conduce a la generación de productos
derivados de esta vitamina que pueden emitir o no emitir fluorescencia, sin embargo, a pesar
de la generación de productos derivados, las moléculas de Riboflavina que no fueron
degradadas son las encargadas de emitir fluorescencia en este experimento. Al ser sometidas
las soluciones de Riboflavina a la luz visible se puede observar que la emisión de fluorescencia
se ve disminuida de forma considerable, debido a la degradación de la Riboflavina y está
representado en la figura 3, ya que no presentan una tendencia lineal lo que significa que
presentan desviaciones a la ley general de la fotometría.

CONCLUSIONES:
 A niveles relativamente bajos de concentración (1 – 5 ppm) la emisión de fluorescencia
cumple con la ley general de la fotometría, por el contrario a niveles altos de
concentración (10 – 50 ppm) la emisión de fluorescencia se ve comprometida y se
presentan desviaciones a la ley general de la fotometría .
 Presencia de disolventes con valores de pH demasiado altos o bajos, producen hidrolisis en
las moléculas de Riboflavina y disminuyen la emisión de fluorescencia, pero la presencia de
disolventes con valores de entre 5 y 7, no producen hidrolisis del analito, por lo que la
emisión de las moléculas de Riboflavina no se ve comprometida.
  La exposición a luz visible de las moléculas de Riboflavina, produce la degradación de las
moléculas, dando origen a derivados con escasa emisión de fluorescencia.
 Al aumentar la temperatura disminuye la intensidad de la fluorescencia, debido al aumento
en el número de choques moleculares, por lo que la desactivación tiende a efectuarse a
través de procesos no radiactivos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia.

REFERENCIAS:

 Mario, F. Semanate. (2016). Determinación de Vitamina B2 (Riboflavina) por

Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC). Ecuador: Universidad Técnica de Ambato
 Skoog. D, A; J.J. Leary. (1994). Análisis instrumental. McGraw-Hill.
 Diana, P. Peñaloza. (2013). Análisis comparativo de diferentes modalidades de curva de
adición en la determinación de Riboflavina en multivitamínicos infantiles por Fluorometría.
México: UNAM
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