La Susceptibilidad de las Bacterias a los Antibidticos Objetivos Explicar el modo de accién de algunos antibiéticos Determinar la susceptibilidad de las bacterias a los antibidticos seleccionados utilizando la técnica de Kirby-Bauer. * Mencionar los factores que se deben tomar en consideracién al utilizar antibidticos en los seres humanos Introduccién ‘eosmantibidticosssonssustanciasssolubles originalmente producidas por diversos microorganismos como los mohos_y algunas bacterias filamentosas del suelo, en particular del género Streptomyces que pueden ser modificadas or las compaiiias farmacéuticas para producir derivados un poco diferentes a la sustancia en su estado natural. Inclusive, algunos antibidticos muy conocidos son total 0 parcialmente sintéticos, tal y como mencionamos en el ejercicio de las tinciones sobre la sulfa. Todos ellos, no importa su origen, tienen el mismo fin para la humanidad, que es controlar el crecimiento de algun patogeno. El término antibiético se deriva del griego, donde anti significa en contra, y bio ‘vida’. La penicilina es quizas el antibidtico mas conocido. El descubrimiento accidental por parte de Alexander Fleming de Penicillium, el hongo que la produce, y su posterior purificacién y desarrollo como medicamento natural represent6 en aquel momento (la década de los 1940s) el equivalente de una “bala magica”, usando un término asociado con el pionero de la quimioterapia mucho antes de la existencia de los antibidticos, Paul Ehrlich, al que recordamos por sus trabajos sobre las tinciones. El descubrimiento de la penicilina permitié tratar efectivamente muchas enfermedades infecciosas, a pesar de que bastante pronto comenzaron a surgir grandes problemas con su uso, como la resistencia microbiana Al presente contamos con una gran variedad de antibidticos de distintas generaciones, ya que no solamente se introdujeron modificaciones a la molécula de la penicilina, sino que se identificaron y produjeron otras sustancias con efectos similares, aunque no iguales. Sin embargo, desde los 1990s no se introcucen al mercado nuevos antibidticos, lo que presenta grandes limitaciones en el siglo 21. El gran reto de enfrentar la resistencia por parte de patégenos de gran importancia siempre esta presente, y por lo tanto, requiere que tengamos disponibles una variedad de posibles medicamentos. Pero la realidad de las industrias farmacéuticas es que tienen limitaciones serias con respecto a la produccién de antibiticos nuevos, ya que la propagacién del fenémeno de resistencia es mayor que la capacidad de generar agentes quimicos cuya 303efectividad estara limitada en un tiempo corto. Las grandes compafiias prefieren invertir en la produccion de medicamentos utilizados en condiciones crénicas de salud menos cambiantes, como el asma, la diabetes y la hipertensidn, lo que implica que en un futuro no muy lejano habra escasez de antibidticos verdaderamente efectivos. Cuando llegue este momento, dejaremos de contar con las ventajas de las "balas magicas” y tendremos que recurrir a las medidas de higiene como la forma principal de evitar infecciones bacterianas. El origen de los antibidticos como moléculas naturales se puede explicar como el desarrollo evolutivo de mecanismos de supervivencia por parte de algunos microorganismos. La presencia de muchos de ellos en el terreno fomenta unascompetenciascontinuasporsiasobtencion=desnutrientes. Por esta raz6n, algunos microorganisms han desarrollado mecanismos para competir de forma exitosa y lograr perpetuar su especie bajo condiciones normales. La excrecion de productos toxicos capaces de el crecimiento de microorganismos vecinos es un ejemplo de los mecanismos desarrollados para sobrevivir. Estos inhibidores naturales del crecimiento de otros microorganismos son lo que conocemos como antibidticos, y su produccién se observa en microorganismos de los géneros Streptomyces 0 Penicillium, ya mencionados, Bacillus. Diversos microorganismos producen antibidticos en el escenario natural para eliminar a la competencia. Debemos conocer los mecanismosmde=accién=demiosmantibisticos no solamente como cientificos, sino por su relevancia a nuestra vida diaria Aigunos antibiéticos:lesionan:de:forma:selectiva:lamembrana:celular de los microorganismos, mientras que una gran cantidad de ellossinhibenclassintesis= ‘deteparedcetwlar, en particular al péptidoglican. También podemos hablar de los que afectan algun trayecto=metabélicomcomosel=deiicidosfélico. Otros antibidticos afectan al ADN o ARN, a los ribosomas y/o a la sintesis de proteinas bacterianas. En este sentido cabe sefialar los efectos a nivel de la polimerasa de ARN, las unidades=ribosomales=30=0=50Smysei=ARNede transferenciam(tRNA). Los efectos de los antibidticos son mucho mas profundos y complejos que los de los desinfectantes, ya que .¥ por lo tanto, ponen en riesgo su capacidad de multiplicarse y de sobrevivir. Por ejemplo, un antibidtico que afecte el ADN bacteriano puede evitar su replicacion o {FEFISEMPEIOH® procesos que son cruciales para que la bacteria organice su material hereditario antes de dividirse 0 de producir nuevas proteinas. Por otra parte, un antibidtico que afecte la pared celular producira bacterias fragiles que tienen mucha menos probabilidad de sobrevivir. A continuacién damos algunos ejemplos importantes sobre el modo de accién de antibidticos muy conocidos: . afectan la pared celular © Uso frecuente de la penicilina para bacterias Gram+ 304Uso para bactenas Gram + Eritromicina y cloramfenicol nivel de la unidad ribosomal 50S interfieren con la sintesis de proteinas a + Tetraciclinas y estreptomicina = interfieren con la sintesis de proteinas a nivel de la unidad ribosomal 30S, bloquea la incorporacién de amino Acidos © Uso de la tetraciclina para bacterias Gram + y Gram — > Uso de la estreptomicina para micobacterias + Polimixinas = Interrumpen las funciones de transporte de la membrana Dentro de la gran variedad de antibidticos existentes, algunos como la tetracicilina afectan la unidad ribosomal 30S. representada en la figura del centro, mientras que la penicilina afecta la estructura de la pared celular. Debemos recordar que para otfos patégenos como los hongos, protozoarios 0 virus hay los medicamentos correspondientes que son quimicamente distintos a los antibidticos de diversas generaciones que encontramos en el mercado. Ejemplos de estos productos son: + Interferén y andlogos de nucledsidos para los virus * Cicloheximida para los hongos Las infecciones virales no pueden ser combatidas con antibidticos dirigidos hacia las bacterias. El valor terapéutico de los antibisticos reside en la toxi exhiben, 0 sea, que no afecte a los tejidos del paciente. Al momento de juzgar ese valor se toman en consideracién otras propiedades que deberia tener un antibistico ideal: + Exhibir un amplio espectro de accién- ello implica que debe ser efectivo contra organismos de diferentes grupos y especies, afectando a Gram + y Gram -; por ejemplo, vimos que la tetraciclina afecta a ambos. + Ser selectivo en su accién para evitar la alteracién de la flora normal del paciente, 305Ser efectivo a través de cualquier via de inoculacién: © local: sobre la piel, en los ojos 0 en las membranas mucosas © oral: tabletas, Iiquidos y cépsulas que son ingeridas © parenteral: inyecciones + subcutdneas (debajo de la piel) + intramusculares (en un misculo) + intravenosas (por vena) No debe provocar una reaccién alérgica en el paciente. Debe ser un agente bacter infecci6n en el paciente. la mas que bacteriostatic para evitar una re- No debe ser inactivado facilmente por los mecanismos de resistencia del agente infeccioso, ya que esto anula su valor terapéutico. © En este sentido debemos volver a enfatizar que la resistencia es un fenémeno natural, y en cuestion de tiempo todo antibidtico se hace poco efectivo en contra de uno o varios patégenos importantes. Peor atin, para antibidticos que atin no existen comercialmente, ya puede existir en el ambiente natural algin microorganismo capaz de inactivarlo, Pseudomonas es un buen ejemplo de una bacteria con resistencia a diversos antibidticos. EI primer antibiotico hacia el que se comenzé a observar la resistencia fue la penicilina, obviamente por ser el primero que se utilizé. Su uso indiscriminado y excesivo a partir de los 1940s seleccioné a favor de cepas resistentes de Staphylococcus aureus una década mas tarde. Otras bacterias eventualmente ganaron fama por su resistencia, incluyendo a Salmonella y Neisseria gonorrheae © La resistencia puede ser mediada por diversos mecanismos, como la produccién de enzimas que inactivan al antibiético, el desarrollo de rutas alternas metabdlicas 0 el bombeo del producto hacia el exterior de la célula bacteriana. Un ejemplo notable es la existencia de las llamadas B-lactamasas y su efecto sobre la penicilina. El acrénimo SPICE es facil de recordar, y se refiere a bacterias Gram- que tienen genes cromosémicos para la produccién de las B-lactamasas. Las letras se relacionan con: Serratia, Providencia, Indol+ Proteus, Citrobacter y Enterobacter. La resistencia de estas bacterias tal vez no se detecta inicialmente, pero puede aparecer luego de un periodo de exposicidn a antibidticos B-lactamicos. Algunos factores de riesgo para infecciones por SPICE son: hospitalizacion previa o prolongada; hemodialisis, uso de antibiéticos previo 0 prolongado; viajes a areas con una alta tasa de bacterias resistentes. Mycobacterium tuberculosis ocupa un lugar prominente a nivel mundial dada su multiresistencia a los antibidticos mas utilizados, 306© En la actualidad también hay mucha preocupacién a nivel global ante algunas cepas multiresistentes de Klebsiella pneumoniae. Su capacidad inicial de resistir antibidticos le permitia inactivar a la penicilina y las cefalosporinas. Mas recientemente, la produccién de las enzimas llamadas carbapenemasas ha permitido que la bacteria sea_resistente a otros antibidticos adicionales, limitando las posibilidades de terapia en pacientes hospitalizados. © La aparicién reciente de cepas de Escherichia coll resistentes a colistin anticipa el momento en el que ya no haya antibidticos disponibles, ya que en muchas ocasiones es usado como el tltimo recurso. * Debe poder ser excretado en la orina activamente para los casos de infeccién en el tracto genitourinario, En la practica diaria es muy dificil encontrar un antibidtico que retina todas esas propiedades. Siempre se trata de utilizar aquellos que exhiban una toxicidad selectiva, que no provoquen alergias en el paciente, y que reuinan la mayoria de las propiedades del antibidtico ideal. En ocasiones es necesario decidir entre los riesgos que presenta una infeccién y las complicaciones que pueda causar el medicamento, como ocurre en el caso de la toxicidad. Al momento de seleccionar un antibidtico hay que tomar en consideracién una serie de factores importantes que deberian ser conocidos por cada paciente, ya que las infecciones pueden ser muy diversas en su origen, localizacién e intensidad. La edad del paciente y su estado general de salud influyen en el éxito de la terapia con antibiéticos, al igual que e! cumplimiento en su uso. Pseudomonas es una de las bacterias mas resistentes a antibidticos y con peor pronéstico. Algunos de los factores mas importantes son’ ‘+ Tipo de microorganismo causando la infeccién ‘Aunque en muchas ocasiones existe una relacién directa entre la enfermedad y el organismo implicado (ejemplo: Mycobacterium tuberculosis y la tuberculosis), en otros casos la infeccion puede ser causada por mas de un microorganismo, como ocurre con la pulmonia (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y otros). Cada caso requeriré una seleccién apropiada del o los antibidticos de acuerdo al agente causal. © La informacién exacta sobre el tipo de microorganismo causante de una infeccién solamente se logra mediante las técnicas de cultivo puro, o haciendo pruebas serolégicas para detectar anticuerpos 307especificos producidos por la persona. Una vez los organismos son cultivados en forma pura, entonces se puede determinar su patron de ‘susceptibilidad resistencia a una gran variedad de antibidticos. Mientras estos resultados llegan, la persona debera ser tratada con un antibiético de amplio espectro que pueda ser efectivo con diversos tipos de bacterias. Se debe seleccionar un antibiético con la mayor actividad bactericida posible para tratar de controlar el surgimiento de cepas resistentes. © Mientras mas bacterias sobrevivan a un antibidtico, mayor sera la probabilidad de que sus descendientes lleven mutaciones relacionadas con el fenémeno de resistencia. De exponerse de nuevo la persona al mismo antibidtico, las cepas resistentes saldran favorecidas. El conocimiento sobre la existencia en un hospital o en la comunidad general de cepas resistentes a un antibidtico en particular es muy importante. Ya sabemos que muchos microorganismos son resistentes a la penicilina, lo que indica que en términos generales no deberia ser el antibidtico de preferencia. Se debe considerar el potencial téxico del antibiético para evitar dafios innecesarios al paciente: © Vertigo 0 sordera debido al efecto en las células del ofdo. © Paralisis respiratoria por bloqueo neuromuscular. © Nefrotoxicidad relacionada con diversos problemas en los rifiones. © Sangrado al inteferir con la agregacion de plaquetas. © Diversas formas de anemia al afectar la produccién de células en la médula sea o inhibir la sintesis de proteinas. © Hepatitis al afectar al higado. © Convulsiones al estimular regiones nerviosas. © Diarreas, al seleccionar a favor de Clostridium difficile Malabsorcién al dafiar a las vellosidades del intestino delgado Hipotensién al provocar cambios en la permeabilidad celular El costo del antibidtico es un elemento de juicio para su seleccién cuando hay varios disponibles con efectividad similar. © Afortunadamente existen los medicamentos bioequivalentes, con un ‘costo mucho menor que el del producto de marca. La dosis a ser administrada puede ser modificada por varias razones: © Razén con que se excreta la droga, o sea el tiempo que le toma salir de nuestro cuerpo © Razén de inactivacién de la droga * Debemos recordar que los medicamentos son metabolizados y degradados en nuestro sistema, produciendo formas inactivas © Toxicidad potencial 308© Edad del paciente © Presencia de otras enfermedades 0 condiciones en el paciente, algunas de ellas debilitantes o relacionadas con una inmunosupresion pasajera 0 permanente (infeccion con VIH, cancer, trasplantes de ‘érganos, etc.) ‘+ Muchas drogas son absorbidas por el tracto intestinal y otras son destruidas por los Acidos estomacales. Por esta razén es importante saber determinar la via 0 ruta del antibistico. En pacientes con sintomas severos es preferible usar la ruta parenteral, ya que la droga puede llegar con mayor rapidez al foco de infeccién, ademas de que la dosis puede ser mayor que una utilizada por la via oral. Ademas, dependiendo de donde sea la infeccion, se debe seleccionar el antibidtico mas adecuado y que se absorba con rapidez en el caso de infecciones en el tracto intestinal. Por el contrario, para infecciones en el tracto genitourinario se recomienda el uso de antibidticos que se absorban lentamente. ‘+ Eluso de terapia combinada es una practica que se reserva para casos de infecciones severas causadas por mas de un microorganismo. La seleccién de las drogas a ser mezcladas dependera de: ©. La resistencia microbiana alas drogas © Eltipo de interaccién entre las drogas * Indiferencia = una droga no interfiere con la otra, ni mejora su efecto * Adicién = el efecto de la suma de las drogas es igual al efecto de cada una por separado + Sinergismo* = el efecto de la suma de las drogas es mayor al efecto de cada una por separado + Antagonismo* = el efecto de las drogas combinadas es menor ‘que el de cada una por separarado *El sinergismo y el antagonismo son las interacciones mas importantes, por su efecto multiplicador o de anulacién. Pero sobre todos los puntos que hemos mencionado, siempre debe haber una gran prioridad: la decisién de! paciente 0 de la persona a cargo de suministrar un antibidtico de regirse por el protocolo de uso establecido. Este es uno de los grandes retos que tenemos como pacientes, y sin embargo, es uno de los mejores mecanismos para evitar el desarrollo de la resistencia bacteriana a los antibiéticos. En términos practicos, debemos conocer la forma de medir la susceptibilidad de los microorganismos a diferentes antibioticos. El método de Kirby-Bauer es muy util para este propésito, y conlleva el uso de milltiples discos de papel impregnados en distintos antibidticos que son colocados en placas Petri inoculadas con alguna bacteria. En este caso el medio de cultivo es el agar 309Mueller Hinton, que ofrece las condiciones ideales para que el antibiético se difunda alrededor del disco. La evaluacion de los resultados es muy similar a la que hace para ver el efecto de los desinfectantes, ya que luego de 16-18 horas de incubacién se mide la presencia o ausencia de un halo de inhibicién alrededor del disco, indicando la susceptibilidad o resistencia de la bacteria al antibiotico. Los resultados obtenidos experimentalmente 0 en el laboratorio clinico son comparados con resultados previos conocides, utilizando informacién similar a la presentada en la Tabla 1 que se encuentra en el cuadero. Este tipo de prueba puede ser afectada por diversos factores, que deben ser muy cuidadosamente tomados en cuenta en un laboratorio clinico, ya que esta en juego el tratamiento, y por lo tanto, la vida, de un ser humano. Por lo tanto, la técnica debe ser controlada cuidadosamente para que brinde resultados altamente satisfactorios, tal y como se hace en los laboratorios clinicos. Algunos de los factores que afectan la prueba son: + Eltamajio del indculo bacteriano = la cantidad de cultive usado ° la ibucién pareja del inéculo por la placa + La profundidad del agar + Lavelocidad de difusién de cada antibistico * La velocidad de crecimiento de la bacteria 310Materiales y Equipo ‘© Cultivos bacterianos en solucién salina (0.85% NaCl) © Bacterias sugeridas: Escherichia coli Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus ‘+ Placas Petri con agar Mueller Hinton ‘+ Hisopos estériles de algodon ‘* Discos comerciales impregnados en antibisticos © Pinzas ‘+ Alcohol 70% + Vasos pequefios | Mecheros * Reglas divididas en mm. Instrucciones particulares que haya re 3Procedimiento 1, Inocule la placa con una suspensién (muestra diluida) de la bacteria asignada en forma de grama, como ha hecho anteriormente, utilizando un hisopo estéril y cubriendo de forma pareja la superficie del agar 2. Divida su placa en cuatro partes, marcandola por debajo (Figura 1). 3. Desinfecte su pinza con alcohol, paséndola por la llama del mechero. 4, Coloque un antibidtico distinto en cada cuadrante, colocandolo en el centro con la ayuda de las pinzas. a. Los discos vienen rotulados con las iniciales del antibiético, de forma que es muy facil identificarios. 5. Entregue su placa debidamente rotulada y sellada con parafina, para ser incubada a 35°C por 16-18 horas. 6. Evalle sus resultados en el préximo periodo de laboratorio. 7. Anote la presencia o ausencia de un halo de inhibicion alrededor de cada antibiético. 8. Mida cada halo de inhibicién en mm con una regla 9. Cuando no hay zona de inhibicién la medida es de 6mm, o sea, el diametro del disco de papel, pero para propésitos de practica lo puede reportar como cero, de forma que contraste con el tamario de los halos que se hayan formado. 10. Compare sus resultados con los del resto del grupo, llenando una tabla gue los resuma, 11. Utilice la tabla | como referencia para decidir si el efecto se puede considerar como R,,SFigura 1. Forma de colocar los discos con antibidticos Clave antibidticos usados El nombre completo de los antibidticos que us6, y la concentracion en cada disco es: 313Introduccion a la Unidad XI: El Control del Crecimiento Microbiano Los productos quimicos que afectan el crecimiento de microorganismos se conocen como agentes _antimicrobianos. Estos pueden matar a un microorganismo o solamente inhibir su crecimiento, cayendo en la categoria de microbicidas o microbiostaticos, respectivamente. Del mismo modo, podemos clasificar a los agentes quimicos en desinfectantes 0 antibiéticos, que estudiaremos en ejercicios separados. Los desinfectantes pertenecientes a diversos grupos quimicos son _utilizados ampliamente en varias industrias y en todos los hospitales para inhibir o prevenir el crecimiento microbiano. Del mismo modo, todos estamos familiarizados con el uso, y a veces abuso, de estos productos quimicos en nuestro hogar. Los antibidticos representan otro conjunto de potentes agentes quimicos que hemos usado ampliamente, y a veces de forma descuidada, desde su descubrimiento en el siglo 20, y es de vital importancia estudiarlos en el laboratorio para ver su efecto en aquellos organismos que tengan susceptibilidad. La efectividad de los agentes antimicrobianos depende de su efecto particular 0 modo de accién, que es caracteristico de cada tipo de agente quimico, de ahi que en esta unidad hayamos deseado comparar diversos tipos de desinfectantes y antibioticos en contra de bacterias asociadas frecuentemente a problemas de la salud. En la actualidad podemos tomar el cuidado de las ufias postizas 0 extendidas con polimeros organicos como ejemplo de un escenario donde hace falta la desinfeccién continua, utilizando productos de limpieza general en el area de trabajo y agentes como el yodo a manera de antiséptico. Igualmente importantes son los antibisticos para tratar las infecciones generadas por el dafio al esmalte natural y ala cuticula. La persistente bacteria Pseudomonas es una de las. mas favorecidas por el ambiente artificial creado en las ufias, lo que requiere una combinacién adecuada de antibidticos para tratarla, debido a su resistencia natural a la mayoria de los antibioticosLos Efectos de los Desinfectantes como Agentes Quimicos Antimicrobianos Objetivos + Demostrar el efecto de algunos desinfectantes en las actividades microbianas * Explicar algunos factores que afectan el uso efectivo de los agentes quimicos en la desinfeccién + Comparar el efecto de diversos desinfectantes sobre diferentes bacterias, Introduccion Podemos definir a un desinfectante como un agente antimicrobiano utilizado en objetos sin vida o inanimados como instrumentos y superficies estructurales. Es importante reconocer que desinfeccién NO es esterilizacion. La mayoria de los patégenos no muere con el uso de desinfectantes, y algunos microorganismos formadores de endosporas son muy resistentes a ellos. Asi mismo, los virus generalmente no son afectados por los desinfectantes mas comunes, como oourre con la peligrosa situacién de la hepatitis. De otra parte, los desinfectantes no son igualmente efectivos contra bacterias u hongos ambientales, y por lo tanto, debemos tener claro el concepto de que los desinfectantes reducen la carga microbiana, pero no esterilizan un objeto 0 superficie. Cada desinfectante tiene un efecto asociado a la categoria en la que cae, que puede ser alterar los lipidos de la membrana o servir como agente oxidante, entre muchos otros. Del mismo modo, las caracteristicas generales de cada desinfectante determinan su uso, ya que, por ejemplo, no todos pueden entrar en contacto con tejido vivo o ser usados para conservar alimentos. Sin embargo, todos los desinfectantes tienen algo en comin: solamente afectan estructuras microbianas ya existentes, y no interfieren con las funciones del ADN, ARN © la sintesis de proteinas. Los productos quimicos que pueden ser utilizados en tejido vivo se conocen como antisépticos, y podemos mencionar una gran variedad de ellos, como los enjuagues bucales, el yodo que se aplica en la piel antes de una operacién, los tratamientos para el acné y cualquier otro producto con el que podamos lavamos las manos y el cuerpo. En afios recientes se ha popularizado el uso de jabones antibacterianos para uso diario, sin embargo, debemos tener cuidado de no usarlos de forma exagerada o innecesaria, La historia del uso de los desinfectantes comienza en el 1867, cuando Joseph Lister utiizé al Acido carbélico o fenol diluido con el propésito de evitar y tratar algunas infecciones en cirugia. Debemos recordar que en tiempos antiguos no habia conocimiento del origen microbiolégico de las infecciones, y por lo tanto, no se tomaban medidas adecuadas para su control. Todo lo 290Caracteristicas del microorganismo ‘+ Los distintos microorganismos varian en su susceptibilidad o resistencia a los diversos agentes quimicos, © No todos los microorganismos responden de igual manera al entrar en contacto con un desinfectante, como ocurre con las diferencias observadas entre bacterias, virus u hongos. © La presencia de capsulas 0 endosporas hace variar el efecto de! desinfectante, ya que se asocian con proteccién de la bacteria que las produce. + En el caso de un cultivo, su edad influye en el modo de responder, ya que ‘en un cultivo viejo hay mas microorganismos dafiados o moribundos. Carga microbiana + El grado de contaminacién y el ntimero de microorganismos influye en la eficacia de un agente quimico, ya que la carga microbiana puede ser mucho mayor en proporcién a la cantidad del producto quimico utilizado. © A mayor el grado de contaminacién, mayor la necesidad de una cantidad grande del desinfectante, * Un buen ejemplo de esto es la enorme cantidad de cloro que es utiizado en las plantas de tratamiento de aguas usadas, que es mayor que el que se necesita en las piscinas o para tratar al agua de consumo. En el hogar, lo debemos usar diluido. © En el ambiente de hospital podemos encontrar situaciones donde la carga microbiana es mucho mayor que la de nuestras casas, de ahi ‘ue la desinfeccién de centros de salud deba ser mucho mas rigurosa que la rutinaria del hogar. La carga microbiana varia segun el ambiente o la muestra que deseamos desinfectar. Naturaleza del desinfectante ‘+ Los desinfectantes se clasifican seguin su actividad (Tabla #1). © Algunos pueden ser utilizados en tejido vivo = antisépticos © Algunos son muy téxicos o irritantes y por lo tanto tienen uso limitado, como ocurre con las sustancias utilizadas para preservar cadaveres humanos o especimenes de laboratorio. 292Tabla 1. Tipos de agentes antimicrobianos comunes: Tipo de agonto | _Derivados 0 ejemplos ‘Aplicaciones Fenoles [Redo earl, Tetosan, Lysol] Umplezay desinfeccion genoral ‘Acoholes Etanol,sopropanch Uso para poly termémetios | |Helogenos Yodo, for Uso para pelo dente loro (en forma de hipocterto) | __Limpieza genera, piscinas ‘Metaies pesados | Mercurio, niftrato de plata, | En piel y superficies, oj, sulfato de cobre ara dotoner emortag 8, emulsifeadores de | Piel y ropa, desinfectantes etergentes,Cefrén agentes sanitarios Ageries surfacantes| (surtace actve’) | ot ‘Agentes alquiantes | Formaidehide,formalina | Germicda, ador de tei, Inactvador de toxins Heridas, control de afeocones | “Agentos oxdantes locales, elimina’ tide mero ‘cote de pir Tint control del erecimianto de Ranges El uso de un agente quimico como antiséptico esta limitado por su toxicidad 0 efectos adversos, como causar irritacién o alergias. En infantes es frecuente el uso de violeta genciana para tratar infecciones en la boca. Otros antisépticos muy populares son el mercurocromo y el yodo, con un coeficiente de fenol superior a 1; el del alcohol es inferior a 1, lo que indica que no es tan efectivo como el fenol. Por otra parte, recordamos la capacidad que tienen algunas bacterias para romper al agua oxigenada, o peréxido. El efecto de un desinfectante puede ser clasificado como: Bactericida o bacteriostatico = efecto en bacterias * Algunos son efectivos en contra de Gram+ y Gram- * Algunos logran eliminar endosporas bacterianas, © Fungicida o fungistatico = efecto en hongos © Vitucida o virustatico = efecto en virus Los productos comerciales utilizados en el ambiente de hospital deben ser altamente efectivos en contra de diversos tipos de microorganismos, incluyendo virus. Por otra parte, en nuestros hogares usualmente necesitamos productos para la limpieza en general que no son tan efectivos. Estos productos usualmente son antibacterianos, siendo muy populares los agentes cuaternarios de amonio. 293Las grandes diferencias entre las bacterias, hongos y virus dificultan que un producto quimico pueda ser totalmente efectivo en contra de todos ellos. La interaccién entre el desinfectante y el microorganismo * Es afectada por la temperatura, el contacto entre ambos, la presencia de materia organica, el tiempo de accion y el pH. Temperatura: muchos desinfectantes funcionan mejor en temperaturas relativamente altas. * El calor disminuye la tensién superficial y permite que el desinfectante penetre mejor. * El calor aumenta la cisociacién de las sustancias quimicas que llevan a cabo la desinfeccion. Contacto: es importante que un desinfectante entre en contacto directo con el microorganismo. + Se debe evitar la formacién de burbujas de aire que evitan el contacto. * Para desinfectar un objeto, se recomienda que se sumerja en el desinfectante. Materia organica: la_mayoria de los microorganismos se encuentra rodeada de la materia que encontramos en nuestras secreciones, fluidos y desperdicios biolégicos + Incluye pus, sangre, sudor, heces fecales, grasa de la piel, etc. * La materia organica representa un obstaculo para la desinfeccion ya que se forma una cubierta que rodea a los microorganismos, dejandolos_vivos_ e inactivando al desinfectante. Tiempo de accién: la mayor parte de los desinfectantes necesitan un tiempo para actuar. PH: La actividad de un desinfectante se va a afectar segin sea la acidez 0 alcalinidad de la solucion. * Por ejemplo, el fenol es mas eficiente a un pH bajo o Acido, mientras que otros desinfectantes no. Los fluidos biolégicos como Ia sangre o el esputo, y la materia fecal pueden interferir con el proceso de desinfeccién. En el caso de la sangre, que puede estar contaminada con virus como el de hepatitis o la inmunodeficiencia humana, podemos usar una solucién de cloro al 10%. 294‘Al momento de escoger un producto quimico también hay que tener en consideracion las caracteristicas de un desinfectante ideal, que son: * La capacidad de matar a todos los microorganismos patégenos, incluyendo a los mas resistentes + Untiempo de desinfeccién corto. + Efectividad a bajas concentraciones (0 sea, diluido). + Soluble en agua, para poder diluiro. + No tener efectos corrosivos que alteren la calidad del recipiente 0 envase de almacenaje. + No tener efectos toxicos e irritantes en os tejidos humanos. + Tener un buen poder de penetracién, de forma que la materia orgdnica no limite su efectividad. * Precio econémico, + Facilidad de obtencién y preparacion. Otra caracteristica ideal afadida hace relativamente poco tiempo es que no cause dafio al ambiente 0 genere pocos desperdicios, de ahi que haya surgido toda una nueva generacién de productos antimicrobianos que no causan problemas ecolégicos serios, basados en agentes quimicos naturales como aceite de coco o limén en combinacién con alcohol producido a partir de maiz y que también es usado como biocombustible. Dado el auge de la preocupacién por el ambiente y la necesidad imperiosa de detener la contaminacién del aire y del agua, afortunadamente cada vez sera més frecuente el uso de este tipo de “desinfectante verde.” Sin embargo, tenemos que ser realistas y conocer un poco sobre la situacion de estos productos en la actualidad * Los agentes quimicos que usemos para desinfectar la cocina deben tener la calidad esperada, dados los peligros de bacterias como Salmonella. + La EPA lleva a cabo pruebas rigurosas para determinar la efectividad de cualquier producto nuevo. Una vez registrado, la etiqueta debe tener una lista de todos los patégenos que combate. + Ninguna de las compajiias muy conocidas que ofrecen productos “verdes” como “Seventh Generation’ 0 “GreenWorks’ los tiene registrados. Sin embargo, algunas compafias pequefias ya lo han logrado. 295Por lo tanto, los consumidores debemos tomar decisiones sabias a la hora de comprar algun desinfectante, ya que nos enfrentamos con anaqueles llenos de frascos con variados colores y olores, y en ocasiones terminamos comprando el desinfectante incorrecto 0 adquirimos dos productos de distinta marca, pero con el mismo efecto. Lo que debemos conocer es el ingrediente activo de cada desinfectante, segin presentamos en la tabla anterior, ya que el resto del producto contiene ingredientes inertes, incluyendo a los que dan el color o el aroma particular. Por ejemplo, podemos adquirir dos productos para la limpieza general del hogar con colores y olores muy distintos, y sin embargo ambos contienen agentes cuarternarios de amonio, que caen en la categoria de agentes surfactantes 0 jabonosos. Viendo otro ejemplo parecido, podemos comprar dos productos antibacterianos distintos para el cuerpo, y que varian en su fragancia, marca o inclusive precio, y sin embargo, ambos tienen el mismo ingrediente activo (triclosan), que por cierto es muy efectivo y representa el uso moderno de un producto fenélico. Debemos recordar que fue con este tipo de agente quimico que Lister comenzé la desinfeccion en el ambiente de hospital, asi que en realidad con su uso en productos que parecen modernos 0 innovadores como los que contienen triciosan lo que estamos haciendo es una variacién del mismo tema, De igual importancia para los consumidores es poder distinguir entre el nombre de un producto antimicrobiano y alguna marca en particular, como oourre en el caso de productos de cloro versus el Clorox, ya que las diferencias en precio pueden ser notables. En este caso, el ingrediente activo es esencialmente el mismo, 0 sea, hipociorito de sodio, que es un derivado del cloro, cuyo estado original es gaseoso. Otra peculiaridad del siglo 21 es la popularidad de los productos para limpiar las manos en ausencia de agua (los tan usados “sanitizers”), y sin embargo, no son otra cosa que una variante del muy conocido uso del alcohol como agente antimicrobiano. Ya que muchas personas dependen de estos productos para sentirse protegidos en situaciones como la epidemia de influenza, debemos aclarar varios puntos importantes: * Para que el producto pueda tener efecto antimicrobiano debe tener por lo menos 60% de alcohol, aunque ya mencionamos que su coeficiente de fenol es bajo. + Su uso es tipicamente antibacteriano, no hay garantia de que funcione en contra de virus, * Solamente en el caso de aquellos virus que tienen una cubierta soluble en alcohol podemos esperar alguin efecto. 296+ El reclamo de que cualquiera de los “sanitizers” en el mercado es 99.9% efectivo no es cierto, ya que los datos no son obtenidos mediante estudios en manos humanas sino en condiciones controladas de laboratorio donde el producto es probado en objetos inanimados, como sillas 0 mesas. La mano es una superfici vulnerable al crecimiento de bacterias. Tabla 2. Ingredientes activos en productos antimicrobianos comunes Producto Ingrediente activo Paritos (wipes) Derivado de cloruro de amorio™ como agente surfactante \Jabones de mano Triclosan = fendlico antibacterianos Pine-Sol Fendlicos y surfactantes “Sanitizers” al estilo Purell — Noxzema Triclosan pHisoderm Acido salicflico (anti-inflamatorio) Enjuagues bucales Etanol Tilex, Lysol bafio Hipoclorito de sodio Betadine Yodo *Los productos con cloruro de amonio son usados. muy frecuentemente, e incluyen al Lysol, Lestoil, etc El uso de los “sanitizers”, tan de moda en el siglo 21 por su conveniencia, no necesariamente ofrece la proteccion esperada. 297 mucho mas compleja yFinalmente, debemos ser juiciosos a la hora de usar los desinfectantes en nuestro hogar, evitando hacer mezclas peligrosas que pueden afectar las vias respiratorias, especialmente si se usan en sitios cerrados. Del mismo modo, no solamente debemos preocupamos de desinfectar el bafio 0 el piso, sino que es importante que tomemos una serie de medidas de prevencién en la cocina. En este sentido no basta con la desinfeccién quimica, ya que no podemos echarle desinfectantes caseros a los alimentos que preparamos, sino que dependemos de una serie de medidas adicionales relacionadas con el manejo adecuado y el buen juicio para evitar contaminar los alimentos ya cocidos. La muy conocida y peligrosa bacteria Salmonella, que aparece frecuentemente en las noticias, no solamente se encuentra en alimentos como en el pollo o los huevos, pudiendo contaminar alimentos ya preparados, sino que puede ser transmitida por personas portadoras que en algin momento padecieron la infeccién intestinal. En este caso no solamente basta con que la persona tenga buena higiene personal 0 use una variedad de agentes antimicrobianos, sino que sencillamente debe abstenerse de manejar comestibles crudos o de preparar alimentos, como ocurrié con la famosa “Typhoid Mary’ que es mencionada en todos los libros de Microbiologia Diversas industrias utiizan desinfectantes en un intento por reducir la carga microbiana en papel, cuero, plastico, textiles, madera, metales, petrdleo, acondicionadores de aire, plantas eléctricas y nucleares. Relacionado con los sos industriales y con la anécdota sobre Typhoid Mary, otros agentes quimicos de interés por su efecto inhibitorio en el crecimiento microbiano no caen en la categoria de desinfectantes, sino que son preservatives de alimentos, como por ejemplo, los nitritos y sulfitos, el etileno o diversos acidos organicos y su base, como el acido propiénico, sérbico 0 benzoico. Aunque el uso de estos productos se limita a los alimentos y es usualmente comercial, sus efectos sobre diversos microorganismos pueden ser similares a los de los desinfectantes. La presencia de los preservativos en los alimentos ha sido ampliamente objetado por diversos grupos de ciudadanos que no desean consumir productos conteniendo agentes quimicos adicionales, pero es bien sabido que sin su uso aumenta la probabilidad de que un alimento se dafie antes de ser consumido, o inclusive, aumenta también la probabilidad de adquirir una enfermedad gastrointestinal. De ahi que el uso de los preservativos de alimentos siga siendo frecuente, aunque aprobado y regulado por la FDA. Por lo tanto, los consumimos a diario en golosinas, refrescos, frutas secas, panes y bizcochos, algunos quesos, canes curadas, jaleas y muchos otros alimentos que llegan a nuestra mesa. Gran parte de los productos que consumimos tiene algun tipo de preservativo quimico. 298Materiales y Equipo + Cultivos bacterianos en solucién salina (0.85% NaCl) © Bacterias sugeridas: + Escherichia coli + Proteus vulgaris + Klebsiella pneumoniae + Salmonella typhimurium + Pseudomonas aeruginosa + Serratia marcescens + Staphylococcus aureus 0 epidermidis + Desinfectantes de uso general y antisépticos representativos de los diversos tipos, incluyendo alguno de los nuevos de menor impacto ambiental 0 Enel caso de los que productos que vayan a ser usados de forma diluida, las soluciones deben ser frescas, ya que la efectividad de los desinfectantes es afectada por el tiempo de almacenaje. © Los agentes quimicos que vayan a ser usados de forma pura también deben ser frescos. > Se debe evitar el uso de productos expirados, ya que podemos llegar a conclusiones incorrectas sobre su efectividad. + Placas Petri con agar TSA + Hisopos estériles * Discos de papel estériles + Pinzas * Alcohol 70% * Mecheros © Reglas divididas en mm Instrucciones particulares que haya recibi 299Procedimiento 1. Ya que deseamos experimentar con una variedad de bacterias y de desinfectantes, se sugiere que trabaje en pareja con otro estudiante, o si el grupo es muy grande, con otras dos personas. En el caso de que el grupo sea muy pequerio, puede que alguien trabaje de forma individual. 2. Trabajando con una bacteria asignada, inocule dos placas en forma de grama utilizando un hisopo estéril, seguin indica la Figura 4. 3. Marque cuatro secciones por debajo de cada placa como se indica en la Figura 6. 4, Rotule como 1, 2, 3, 4 los desinfectantes que va a utilizar en cada placa, asegurandose de que escribe la clave apropiada que los identifica. a. Se recomienda servir los distintos desinfectantes en vasitos.desechables. i, En este caso, cada vasito debe indicar claramente el nombre del desinfectante, para evitar confusiones. 5. Esteriice una pinza desinfectndola con alcohol 70% y paséndola por la Nama. 6. Utilice la pinza para tomar un disco de papel estéril que tocara un poco en. el desinfectante correspondiente identificado como #1 7. Coléquelo en el medio del area que le corresponde en la primera placa, sobre la superficie del agar, asegurandose de que el disco no se caiga al invertir la placa 0 quede muy cerca del borde. 8. Haga lo mismo con los desinfectantes 2, 3 y 4 de la primera placa. 9. Repita todo el procedimiento con la segunda placa y un grupo distinto de desinfectantes, 10. Entregue sus placas para ser colocadas en la incubadora. 11.Los resultados serén evaluados en el proximo periodo de laboratorio. 12. Para cada desinfectante se estara midiendo el halo de inhibicién (ver el ejemplo de la Figura 6), utilizando una regia dividida en milimetros (mm). 300Forma de sembrar la placa de agar usando un hisopo estéril Cubrir totalmente la superficie del agar 301Alternativa sugerida para colocar los discos con desinfectantes, de forma que no interfieran entre si ( en vez de cuatro por placa se pueden poner solamente dos o tres; del mismo modo, al usar cuatro productos puede rotular ambas placas con nuimeros que vayan del 1-8, para evitar confusiones). Clave primera placa Clave segunda placa ae Posible formacion de halos de inhibicion alrededor de los discos 302Introduccion a la Unidad X: Factores Abidticos que Afectan el Crecimiento Microbiano Debido al tamafio pequefio de los organismos procariotas y a las caracteristicas de sus estructuras, ellos sufren los efectos de los cambios ambientales de manera més directa y rdpida que los organismos multicelulares o mas grandes. Durante millones de afios los microorganismos han sido sometidos a presiones ambientales en ocasiones extremas, y las frecuentes mutaciones al azar en su material genético les han permitido desarrollar mecanismos que favorecen su adaptacién a las condiciones de un ambiente natural dado. En este sentido debemos recalcar que los microorganismos no se adaptan a propésito a un ambiente dado seleccionando unos cambios que sean favorables, sino que, al contrario, los cambios genéticos ocurren al azar, y algunos de ellos favorecen la vida en un tipo de ambiente con unas caracteristicas particulares, como puede ser una temperatura fria o muy caliente, un alto grado de acidez/alcalinidad o una salinidad extremadamente alta. Este es el principio de seleccién natural, un concepto fundamental de la Biologia que todos asociamos con el proceso de evolucion, y que tiene aplicaciones generales a todos los organismos vivientes, independientemente de su tamario o complejidad. En el mundo microbiano el proceso de seleccién natural se multiplica muchisimas veces dada la velocidad de reproduccién que tienen los microorganismos, y la alta frecuencia con la que ocurren las mutaciones. Podemos citar de nuevo a Beijerinck, a quien mencionamos en un ejercicio anterior: los microorganismos pueden estar en todas partes, pero el ambiente selecciona a los que pueden sobrevivir. Es por esta razon que podemos encontrar microorganisms habitando ambientes con un pH muy acide o muy alcalino, en sitios que nos parecen inhéspitos como las salinas y los desiertos, o reproduciéndose a temperaturas cerca de 100°C, a la que el agua hierve. Igualmente importante y variada es la cantidad de oxigeno presente. Mas interesante todavia, algunos microorganismos combinan los factores antes mencionados, como por ejemplo, los que viven en condiciones muy acidas y a la vez necesitan altas temperaturas. Debemos resaltar que algunas de estas extraordinarias capacidades para tolerar ambientes extremos son tipicas de los miembros de! Dominio Arquea mencionado en un 50ejercicio anterior, aunque también existen bacterias verdaderas capaces de sobrevivir en condiciones poco favorables para el resto de los seres vivientes. Pero aun dentro de las bacterias hay una gran variedad en la capacidad para tolerar o crecer de modo ideal en presencia de factores fisicos limitantes, y es lo que demostraremos en los siguientes ejercicios, enfatizando las aplicaciones practicas de cada situacién. Debemos aclarar que en estos ejercicios no estaremos utilizando procariotas clasificados como Arqueas, sino bacterias frecuentemente encontradas en el medio ambiente a nuestro alrededor o tipicas del laboratorio de Microbiologia.EI Efecto de la Deshidratacion Objetivos + Demostrar el efecto de la deshidratacién en las bacterias + Explicar las aplicaciones practicas de este efecto en la preservacién de alimentos y en el cuidado de pacientes Introduccién La disponibilidad de agua libre para reaccionar se puede expresar cuantitativamente como la actividad de agua (au, en inglés). Bajo este criterio el agua pura tiene un valor de 1.00, mientras que los cereales y otros alimentos deshidratados tienen un valor de 0.60 0 menos. Algunos microorganismos pueden sobrevivir en un ambiente seco por largos periodos de tiempo, mientras que otros mueren rapidamente. La mayoria de las bacterias necesitan una actividad de agua de 0.9 0 mayor para poder estar metabdlicamente activas Ciertas bacterias son xerotolerantes, pudiendo crecer en presencia de mucha menos agua. Algunas levaduras pueden crecer en ambientes con actividad de agua de 0.6, y podemos decir que en general esto aplica a muchos hongos. De ahi que los veamos creciendo en superficies bastante secas, como el pan, mientras que las bacterias se encuentran ausentes. La habilidad de sobrevivir a la deshidratacion es de importancia en la transmisién de enfermedades como la tuberculosis, ya que la bacteria correspondiente puede resistir condiciones severas de ausencia de agua y seguir infectiva. Por otra parte, patégenos como Treponema pallidum, causante de la sifiis, es muy sensible a la deshidratacion y se mantiene viable por muy poco tiempo en superficies secas. Las bacterias que viven en el suelo de los desiertos deben tolerar largos periodos de deshidratacién. Inclusive, como ocurre en la Antartica, también deben tolerar temperaturas muy bajas y una intensa radiacién solar. Los llamados organismos xeréfilos viven en ambientes secos, pero por lo general para que las células microbianas estén vivas y se multipliquen necesitan humedad, ya que el agua es un componente indispensable y muy abundante en todo ser viviente. Sin agua algunos microorganismos pueden sobrevivir, pero no crecen o se multiplican. Los microorganismos pueden permanecer viables e inactivos por afios en su estado seco, como ocurre con los que forman esporas © quistes, pero solamente pueden activarse y reproducirse cuando se les suple un ambiente nutriivo con la humedad adecuada. En la ausencia de agua los microorganismos pueden recurrir al uso de solutos compatibles, como lo son ciertas azicares. La capacidad de algunos microorganismos de permanecer inactivos pero Viables durante bastante tiempo tiene diversas aplicaciones practicas, incluyendo las siguientes:Es importante tomar conciencia de que en las facilidades clinicas y en sitios ptiblicos puede haber una diversidad de microorganismos capaces de sobrevivir en un ambiente seco (cortinas, ventanas, muebles, sillas, colchones, etc.) y retener su habilidad para producir enfermedades, activandose una vez encuentran las condiciones ideales. Ya hemos indicado que esto aplica al caso particular de la tuberculosis. En nuestras manos y otras superficies secas del cuerpo también podemos encontrar microorganismos con la capacidad de ser patogenos al encontrar un ambiente himedo y nultitivo, como una herida. La deshidratacién se utiliza comercialmente a nivel del laboratorio clinico © de investigacion, para conservar de forma inactiva a una gran variedad de microorganismos, incluyendo patégenos. Del mismo modo, este el procedimiento utiizado para preparar los medios de cultivo que usamos en el laboratorio. Un método de deshidratacién muy utllizado es Ia liofilizacién, proceso poco destructivo en el que una muestra es congelada y luego se somete al vacio para sacarle toda la humedad. De esta forma se obtiene un polvo que puede contener la etapa latente de un microorganismo, si es que la muestra original proviene de alguin cultivo. Asi se puede conservar a los microorganisms provenientes de muestras clinicas, como excreta, us, esputo y secreciones de las mucosas. Ademas, la lioflizacién se utiliza en laboratorios donde su personal se dedica a almacenar microorganismos para la venta. La capacidad de mantener cultivos microbianos secos por largo tiempo ha tenido consecuencias negativas en décadas recientes, ya que es una forma muy conveniente de preparar armas biolégicas. Esto facilta el bioterrorismo, tal y como ocurrié hace unos afios en Estados Unidos con unas cartas contaminadas con esporas de la bacteria causante del antrax. Del mismo modo, la dispersion de patégenos en forma seca podria ser arte de una guerra a gran escala, La capacidad de algunos microorganismos de permanecer latentes ha sido objeto de estudio en el contexto de la historia de las enfermedades infecciosas ¢ inclusive de la arqueologia, ya que muestras antiguas de tierra 0 tejido como el de algunas momias pueden contener esporas antiquisimas de microorganismos importantes. Igualmente interesante ha sido el estudio de algunas practicas antiguas como el achicamiento de cabezas 0 cadaveres por parte de diversas culturas indigenas, en las que en efecto se practicaba la deshidratacién severa del cuerpo humano con su consecuente preservacion.+ El conocimiento de que el agua es esencial para la multiplicacién de los microorganismos se ha utilizado en procesos comerciales para la preparacion de alimentos, que son deshidratados para conservarlos. En este sentido, es de todos conocidos la larga vida que tienen los alimentos secos en comparacién con su forma original hidratada, como lo podemos confirmar en nuestros hogares con diversos productos, ya sea cereales, sopas, frutas, vegetales, especias, leche u otro. En el caso de los productos lacteos, podemos destacar que a la leche en polvo se le saca un 85% de su contenido de agua original. La practica de deshidratar 0 desecar alimentos es muy antigua, comenzando con el proceso de dejar que los alimentos se secaran al estar expuestos al sol En la actualidad se sigue utilizando el mismo tipo de practica en paises con climas secos y célidos para la conservacién de pasas, higos y ciruelas. La tecnologia asociada a [a liofiizacién produce alimentos de més alta calidad en comparacién con la deshidratacion tradicional pero también es mas costosa. En este sentido podemos resaltar su uso en la preparacion de alimentos de alto valor, como cares 0 café. * En el caso de los alimentos solamente se esté inhibiendo la multiplicacién de los microorganismos y su metabolismo activo. Es importante enfatizar que el concepto de inhibicién no quiere decir que los microorganismos han muerto, ya que pueden permanecer en estado latente por meses o afios. Es por esta razén que los alimentos secos deben ser almacenados en sitios con poca humedad y ventilados, evitando que entren en contacto con agua. * Como dato curioso, muchos alimentos deshidratados no solamente duran més tiempo sin dafiarse, sino que ocupan menos espacio, de ahi que los astronautas lleven en sus viajes un ment variado de productos liofiizados que al ser hidratados logran “parecerse bastante” a la comida original. Tal vez al visitar algtin famoso parque de recreo muchas personas han tenido la oportunidad de probar uno de estos manjares, sin conocer sobre el procedimiento detras de la liofilizacién o la importancia general que tiene la deshidratacién en el control de la actividad microbiana. Del mismo modo, no hay que ser astronauta para consumir alimentos lioflizados, ya que en afios recientes su uso se ha ido popularizando, como ocurre con la preparacién del café en grano y en polvo por diversas compafias comerciales, 254Materiales y Equipo * Cultivos de bacterias con diversa capacidad para resistir condiciones ambientales de deshidratacién © Bacterias sugeridas: © Bacillus subtilis o megaterium © Escherichia coli © Staphylococcus aureus 0 epidermidis © Serratia marcescens © Pseudomonas aeruginosa + Placas Petri vacias y estériles + Cubreobjetos estériles * Alcohol 70% * Pinzas * Mechero + Tubos con 15 ml de TSA derretido (para la segunda semana). * Parafina Instrucciones particulars que haya recibido:Procedimiento Importante: este ejercicio va a tomar tres periodos de laboratorio, contando ‘el momento en que se comience el cultivo como el primero. 1, Coloque un cobreobjetos en el fondo de una placa Petri vacia, utilizando pinzas desinfectadas con alcohol y pasadas por la llama. (De tener una placa dividida en dos partes, puede usar ambas, usando mas de un cubreobjetos). a. No olvide rotular su placa de forma apropiada 2. Contamine el cubreobjetos afiadiendo con un gotero o pipeta Pasteur desechable una 0 dos gotas del cultivo bacteriano asignado. También puede colocar las gotas debajo del cubreojetos. 3. Incube la placa a 35°C por una semana 4, Haga lo siguiente en el proximo periodo de laboratorio: a. Observe su placa y describa las condiciones macroscépicas (0 sea, el aspecto general) del cubreobjetos contaminado con una bacteria. b. Sin mover el cubreobjetos, afiada el contenido de un tubo con agar TSA derretido y tibio. i. Incube a 35°C 0 a temperatura ambiente por una semana adicional, siguiendo las instrucciones dadas 5. Haga lo siguiente en el periodo tercero y final del ejercicio: ‘a. Observe su placa detenidamente. b. Observe las placas de otros compafieros que usaron bacterias distintas a la suya. c, Anote sus observaciones en el espacio correspondiente. d. Descarte todo el material utilizando los envases apropiadas para ser esterilizados. 256Los Efectos de la Temperatura Objetivos Demostrar el efecto de diversas temperaturas en el crecimiento bacteriano Demostrar el efecto letal que pueden tener las temperaturas altas Mencionar la importancia del efecto de las temperaturas bajas en la preservacién de alimentos, medicamentos, sangre y cultivos microbianos Mencionar las diferentes temperaturas a las cuales crecen éptimamente las bacterias Interpretar la curva de los limites de tolerancia determinadas por el efecto de las temperaturas Introduccion Uno de los factores que afectan al crecimiento de los organismos vivos es la temperatura del ambiente en donde habitan. Las temperaturas minimas y maximas en las cuales un microorganismo se puede multiplicar establecen su rango de temperatura de crecimiento. Dentro de este rango hay una temperatura de crecimiento éptimo donde ocurre la velocidad més alta de reproduccién, un limite de tolerancia maximo y un limite de tolerancia 1a. El Conjunto de todas ellas se conoce como temperaturas cardinales. El limite de tolerancia maximo esta determinado por el efecto de las temperaturas altas sobre las proteinas con actividad enzimatica. Dicho efecto puede variar desde una inhibicién total de la enzima, hasta la desnaturalizacién de la proteina como macromolécula. Esto detiene a las reacciones quimicas que hacen posible el metabolismo celular, y que son indispensables para los procesos vitales de un organismo. En este sentido, para que un microorganismo pueda vivir a altas temperaturas debe tener los mecanismos adecuados para preservar intactas sus enzimas, y estas deben funcionar de forma éptima en presencia de calor. El limite de tolerancia minimo esta determinado por el efecto de las temperaturas bajas sobre la actividad catalitica de las enzimas, y por su efecto sobre los lipidos o grasas de la membrana celular. Las temperaturas frias promueven la fusién de los lipidos en la membrana, restandole fluidez y por lo tanto, afectando su capacidad de transporte. Esto convierte a la célula microbiana en un sistema biolégico totalmente aislado de su ambiente externo. La incapacidad para obtener nutrientes y para eliminar desperdicios metabdlicos se suma a la reduccién en la capacidad metabdlica, de forma que se el crecimiento 0 inclusive ocurre la muerte celular.© En este sentido, para que un microorganismo pueda vivir a temperaturas bajas debe tener unas modificaciones en su ‘membrana celular que le permitan contrarrestar el efecto del frio en los lipidos, y esto usualmente se logra teniendo Acidos grasos insaturados que la dan mayor fiuidez. Opuesto a esto, organismos que viven a altas temperaturas tienen acidos grasos saturados, produciendo lipidos menos flexibles en sus membranas. Los microorganismos que viven en ambientes extremos de temperatura, como algunos miembros de las arquea, tienen fitano en sus membranas en vez de acidos grasos convencionales. Dentro de los limites de tolerancia encontramos el area de temperatura 6ptima para el transporte y la actividad metabélica de las células microbianas, y por ende, para su reproduccion. Grafica sobre los limites de tolerancia a diversas temperaturas: el eje de X (temperatura) no tiene valores especificos porque varia con cada bacteria. Grea de crecimiento épiimo 4 de microorgarismos/mni Into de tolerancia minima leite de tolerancia Temperatura (°C) El estudio de los limites de tolerancia para el factor de temperatura en diversos microorganismos ha permitido clasificarlos en tres categorias generales: sicrofilicos, mesofilicos y termofilicos, segun su preferencia por el frio, las temperaturas intermedias 0 el calor, respectivamente (Tabla 1). 258Tabla 1: Clasificacién de microorganismos de acuerdo a su temperatura de crecimiento en °C Tipo de Limite minimo [Temperatura Limite maximo microorganismo | de tolerancia éptima de tolerancia ae | = | [moons | vo | a Temoteos soo Esta clasificacién de los microorganismos se refiere a su temperatura de crecimiento optimo y no a la temperatura a la cual puede sobrevivir. Varios tipos de bacilos, como algunos representantes de los géneros Clostridium y Bacillus son mesofilicos y viven de forma abundante en el suelo, pero tienen la habilidad de producir endosporas que les permiten sobrevivir en estado latente a altas temperaturas (son termotolerantes). Otros bacilos son termofilicos, como Bacillus stearothermophilus, que se utiliza para validar el autoclave y se cultiva en calor moderado. Por otro lado, también hay muchos termofilicos y mesofllicos que sobreviven a temperaturas bajas. Esto tiene mucha importancia en nuestra vida diaria y a nivel comercial, ya que es de todos conocidos que los alimentos en la nevera se pueden deteriorar lentamente por la accién microbiana de organismos ambientales sicrotolerantes como bacterias y hongos de distintos tipos, A finales de la década de los 1960s ocurrié un hallazgo interesante, ya que David D. Brock y colaboradores identificaron al primer extreméfilo en el Parque Nacional de Yellowstone. Hasta entonces se pensaba que el limite de tolerancia era de 73°C, y sin embargo, este nuevo microorganism al que llamaron Thermus aquatics crecia en temperaturas superiores gracias a la presencia de una enzima termoestable (polimerasa llamada Taq). Brock y colaboradores también encontraron otro extreméfilo muy intreresante en un area acida con temperatura de 85-90°C, al que llamaron Sulfobolus acidocaldarius. 259A continuacién mencionamos otros géneros microbianos y su preferencia con respecto a la temperatura: + Flavobacterium = sicrofilico, 13°C © Escherichia = mesofilico, 39°C + Thermococeus = termofilico, 88°C * Pyrodictium = termofilico, 105°C Las temperaturas bajas son esenciales para el crecimiento microbiano cuando queremos reducir la contaminacion o evitar la descomposicion rapida de diversos materiales incluyendo antibisticos y sangre, pero debemos recordar que las temperaturas bajas utilizadas en las neveras caseras 0 comerciales solamente inhiben la actividad enzimatica y el transporte celular de muchos microorganismos, pero no necesariamente los mata. Por el contrario, la mayoria de ellos permanece en un estado latente, siendo capaces de recobrar su actividad metabélica normal una vez la temperatura llega a niveles éptimos. El frio del congelador tiene un efecto inhibidor mayor sobre los microorganismos, pero atin asi no los mata a todos, de ahi que debamos tener mucho cuidado en nuestros hogares a la hora de congelar y descongelar alimentos. Cada vez que descongelamos un producto alimenticio permitimos que los microorganismos presentes se multipliquen, y si lo volvemos a congelar es posible que llegue a tener una carga microbiana no aceptable que favorezca su descomposicion rapida cuando lo volvamos a descongelar. El tiempo de exposicién de un microorganismo a una temperatura en particular es un factor vital para las células microbianas. Existen medidas que comparan la susceptibilidad de los mictoorganismos a temperaturas elevadas, y que son muy importantes en procesos industriales que dependen de la eliminacién de microorganismos mediante el calor, como ocurre en la elaboracién de alimentos enlatados. Para este propésito hay dos métodos que pueden ser utlizados: + Determinar el punto termal de muerte: es la temperatura a la que un organismo puede morir en 10 minutos de exposicién. * Determinar el tiempo termal de muerte: es el tiempo requerido para matar a un microorganismo 0 su endospora a una temperatura dada. Cuando se desea suprimir totalmente la presencia de microorganismos de un area o material, como ocurre con los instrumentos quirtirgicos o los productos inyectables, podemos utilizar diferentes métodos y procesos dependiendo de su susceptibilidad a cambios en la temperatura. Algunos de estos métodos son: 260+ Esterilizacién* por incineracién o calor seco ‘© Ejemplo: quemar el asa 0 aguja de inocular utilizando el mechero © Ejemplo: quema de cadaveres durante plagas historicas para reducir la transmisién de la enfermedad + Esterilizacién* con vapor con o sin presién. © Ejemplo: usar el autoclave *La palabra esterilizacién conlleva la eliminacién de todo tipo de forma microbiana, segiin determinada por métodos de cultivo llevados a cabo con el producto que ha sido sometido a las condiciones adecuadas. En ocasiones se desea eliminar parcialmente la presencia de algunos microorganismos, ya que no se necesita que el producto final quede ester + Ejemplo: pasteurizacion de productos lacteos, jugos y otras bebidas usando calor moderado. © Aunque hoy en dia asociamos el proceso principalmente con los productos lacteos, en un principio Pasteur lo disené para evitar que el alcohol del vino se convierta en acido acético 0 vinagre. © En el caso de la leche, solamente elimina a los patégenos, sobreviviendo otros organismos menos susceptibles al calor que eventualmente la pueden dafiar o cortar, como los lactobacilos, © Un modo de hacerlo: 63-66°C, 30 minutos en un tanque © Es menos efectivo eliminando bacterias que otro procedimiento mas reciente, el llamado “ultra high temperature’o UHT, que produce la leche que compramos en cajas sin refrigerar. + Ejemplo: hervir el agua La efectividad del calor para desinfectar o esterilizar materiales y areas depende de varios factores, igual que la velocidad con la que se logra’ + Tipo de microorganismo que se va a destruir * Factores que afectan la interaccién 0 contacto entre el organismo y el agente © Modo de contacto, directo 0 indirecto © Tiempo de exposicién del microorganismo al calor * Caracteristicas del agente destructor © Temperatura que se logra alcanzar 10 de calor (Tabla 2) 261Tabla 2. Descripcidn de los diferentes tipos de calor Calor Seco — Incineracién + Excelente para eliminar ‘materiales desechables contaminados, ya que lo quema todo + Es el que usa con la aguja de inocular + No se puede usar con ‘material delicado reusable - Horno + Esteriiza materiales erdurables de cristal, metal otela + Temperatura necesaria que debe ser constante: 328°F 0 170°C + Tiempo de contacto ecesario: 90-120 minutos Calor Huimedo — Hervir agua + Temperatura: 100°C + No destruye endosporas 0 virus + No esteriliza, solamente desinfecta + Elimina patégenos que por ser mesofflicos son destruidos en 15 minutos — Vapor de agua + Efecto y temperatura similar al agua hirviendo + De utilidad en el hogar al preparar alimentos ~ Vapor a presion + Es el método del autoclave + Esteriza instrumentos, Cristaleria, medios de cultivo 262Materiales y Equipo Instrucciones particulares que haya reci Cultivos de diversas bacterias: Bacterias sugeridas: Bacillus subtilis, Escherichia coli o cualquier otra bacteria Gram- Staphylococcus Kocuria rhizophila (Micrococcus) Tubos con caldo nutritive estéril Pipetas Pasteur desechables estériles Nevera y bafos a diferentes temperaturas Matraces con agua Pinzas para agarrar tubos de ensayo Planchas de calentar Placas Petri con TSA Asas de inocular Mechero Opcional: Espectrofotémetro adaptado para colocar tubos No lo olvide... el uso de las pinzas evita quemaduras al momento de sacar los tubos del agua hirviendo. 263Procedimiento Efecto de las temperaturas bajas importante: este ejercicio va a tomar tres periodos de laboratorio, contando el momento en que se comience el cultivo como el primero. 1. Trabaje en un grupo asignado con la bacteria indicada, usando el asa para inocular cuatro tubos de caldo nutritive que serén debidamente rotulados para ser entonces colocados en una de distintas temperaturas, de incubacién: 0°C (congelador) 4°C (nevera) 25°C (ambiente) 33°C (incubadora) 2. Luego del periodo de incubacién, anote sus resultados en la tabla provista en la seccién de resultados, fjandose en la turbidez del medio. © Podemos usar cruces (+, ++, +++) para comparar el grado de turbidez: poco crecimiento = poca turbidez, hilachas recimiento regular = algo de turbidez + +++ = crecimiento abundante = mucha turbidez 3. Opcional: De ser posible, utilice el espectrofotémetro a 600 nm para determinar la absorbancia en cada tubo, anotando sus resultados en la tabla correspondiente 4, Coloque todos los tubos en la incubadora por una semana adicional. 5. Luego del segundo periodo de incubacién, anote sus observaciones en la tabla de resultados, fijandose de nuevo en la turbidez o usando de nuevo el espectrofolémetro para medir la absorbancia. Comparta sus resultados para hacer una tabla grupal. 264Efecto de las temperaturas altas: calor himedo 1, Trabajando con el mismo grupo de estudiantes y con la misma bacteria asignada, siga las siguientes instrucciones 2. Ponga a hervir agua en un matraz 0 vaso de andlisis, asegurandose de que tiene abundante ebullicién antes de comenzar el experimento y pueda lograr exponer su bacteria a 100°C. 3. Inocule un primer tubo, que serviré como control, con 5 gotas del cultivo bacteriano original utiizando una pipeta Pasteur desechable. No lo caliente, ya que le servira de evidencia sobre la viabilidad de las bacterias. 4, Inocule otros cuatro tubos con 5 gotas del cultivo bacteriano (puede usar la misma pipeta desechable). 5. Coloque los tubos a la vez en el agua hirviendo, sacando cada uno de ellos con pinzas al tiempo que le corresponda (5, 10, 15 y 30 minutos). Tenga cuidado de no quemarse con el vapor de agua. 6. Enfrie cada tubo rapidamente por fuera a medida que sale del calor usando agua de la pluma. 7. Rotule cada tubo a medida que salga del agua hirviendo, dando importancia al nombre del microorganismo y el tiempo de contacto (si los rotula antes, las etiquetas nadan en el agua hirviendo). 8. Entregue los cinco tubos para ser colocados en la incubadora. 9. Luego del periodo de incubacién observe sus tubos para ver si hubo crecimiento bacteriano, fijandose en la turbidez o utilizando el espectrofotémetro para medir la absorbancia 10.Llene las tablas correspondientes, siguiendo las mismas instrucciones que para el ejercicio de temperaturas bajas. 265Efecto de I 1 ineracién: calor seco Trabajando de forma individual, divida una placa de agar estéril en dos reas, rotulando por debajo para identificar ambas partes. En el lado izquierdo de la placa inocule la bacteria con la que ha estado trabajando, siguiendo las técnicas asépticas ya conocidas sobre el manejo del asa de inocular y haciendo estrias en una sola direccién. Queme el asa, utilizando el mechero, y sin tomar ninguna nueva muestra, inocule el lado derecho de la placa siguiendo el mismo patron. Dibuje sus resultados de “antes y después’ de la incineracién en el dibujo provisto en el area de resultados. 266El Efecto del pH Objetivos + Explicar el efecto del pH en el crecimiento microbiano + Explicar las aplicaciones practicas del pH como factor limitante Introduccion EI pH 0 concentracién de H’ afecta dramaticamente al crecimiento de los organismos procariotas, ya que impacta a la actividad de diversas enzimas, especialmente las que participan en biosintesis y crecimiento. La estructura secundaria de las proteinas es modificada segtin los cambios que ocurren en las cargas de los amino cidos bajo el efecto del pH, y estos cambios a su vez afectan al sitio activo de la enzima. Por lo tanto, las enzimas usualmente estén inactivas a un pH muy dcido o muy basico. Aparte de la temperatura, el pH representa el factor ambiental mas importante que influye en el crecimiento microbiano. Cada microorganismo tolera ciertas variaciones con respecto al pH ideal para sus necesidades fisidlogicas, teniendo sus correspondientes niveles minimos y maximos de tolerancia: + Los acidofilicos o acidéfilos viven mejor entre un pH de 0.0-5.5 + Los neutréfilicos o neutraléfilos entre 5.5-8.0 + Los alcalofilicos 0 alcaléfilos entre 8.5-11.5 En general, los distintos grupos microbianos tienen su pH éptimo caracteristico. La mayoria de las bacterias y los protozoarios prefieren un pH cercano al neutral, los hongos crecen mejor en ambientes ligeramente acidos, con un pH de 4-6. Las algas también pueden crecer en ambientes dcidos Cabe indicar que estos criterios aplican mientras los otros factores ambientales se mantienen constantes. De ocurrir algtin cambio en la composicién del medio, la temperatura de incubacién o la presién osmdtica, también cambiaran los requisitos con respecto al H’ Muchas bacterias producen acidos metabdlicos que pueden bajar el pH del medio de cultivo e inhibir su crecimiento, como ocurre durante el proceso de fermentacién. Por lo tanto, debemos utilizar amortiguadores para neutralizar su efecto. Las peptonas presentes en medios complejos hacen esta funcién, al igual que las sales de fosfato utilizadas en medios definidos. Si cultivamos microorganismos en un medio con un pH muy alto 0 muy bajo para sus limites de tolerancia, lograremos su inhibicién. Este fendmeno permite que utilicemos medios selectivos; por ejemplo, un medio con un pH de 5.5 favorece el crecimiento de hongos, pero no permite el crecimiento de la mayoria de las 267bacterias. Esto puede tener aplicaciones clinicas utiles que nos permiten aislar a cierto tipo de patogeno, y aplicaciones industriales; en este caso, el uso de un medio acidico favorece el crecimiento de levaduras como Saccharomyces, pero inhibe a las bacterias no deseadas. Los organismos acidéfilos que podemos encontrar en aguas cercanas a minas 0 en manantiales naturalmente acidos, son particularmente interesantes, ya que logran mantener el pH de su interior cercano al neutral. O sea, que estos organismos no tienen enzimas capaces de funcionar en un ambiente dcido, sencillamente el ambiente exterior es el que tiene un pH bajo, pero el interior se mantiene cercano a7. Las bacterias acidofilas tienen adaptaciones especiales relacionadas con el bombeo de protones y los cambios en el potencial de su membrana. Por otra parte, los alcalfilos prefieren crecer bajo condiciones muy basicas 0 alcalinas. Ambientes con mucho sodio, como los lagos salados, 0 suelos con muchos carbonatos pueden tener valores de pH entre 9-11. Las bacterias que viven en estos extremos de pH tienen mecanismos para mantener los iones de sodio fuera de la célula. Utilizando mecanismos distintos a los de las bacterias acidéfilas, ellas logran transportar tanto sodio como potasio a través de sus membranas. Por otra parte, no debemos olvidar a un grupo que ya mencionamos en otro ejercicio: el de las bacterias acidéfilas y terméfilas a la vez, descubiertas por Brock y colaboradores en Yellowstone. Los seres humanos hemos sacado mucho provecho de las actividades microbianas que se llevan a cabo bajo condiciones particulares de acidez 0 alcalinidad: * Muchos detergentes caseros utilizan enzimas producidas por organismos alcaléfilos que son muy adecuadas para trabajar en al pH alcalino de los jabones. * Por otra parte, la capacidad de algunas bacterias de producir acidos y tolerar vivir en este ambiente sirvid de base para la confeccién de productos lacteos y vegetales acidificados, al igual que de carnes fermentadas. Su uso es milenario dada la ventaja de preservar alimentos sin refrigeracion, pero en tiempos recientes hemos visto un auge en el consumo de productos ldcteos como el yogurt y otros relacionados (kefir, koumis, crema agria, leche acidificada usada con fines terapéuticos) y podemos tener una idea del tipo de microorganismo que se utliza en su produccién al leer la palabra acidophilus en ia etiqueta En este caso se refiere a una especie de lactobacilo relacionado con otros que se utilizan en la misma industria, como L. bulgaricus. La relacién de estos productos con el proceso de fermentacion se encuentra en el ejercicio relacionado con las caracteristicas fisiolégicas de las bacterias Para los amantes del yogurt y los otros productos lécteos, debemos indicar que las diferencias entre todos ellos dependen de las bacterias utilizadas, ya sean 268solas 0 en combinaciones; el sustrato inicial, ya sea leche o crema; el balance de los productos de fermentacién, como el acido lactico, y la consistencia final Vale la pena mencionar que L. acidophilus tiene otro uso importante, ya que muchas personas lo consumen en forma de capsula para mejorar los procesos digestivos y estimular la inmunidad a nivel de mucosa. El drenaje acido conteniendo H2SO4 que se origina en areas de mineria provee un nicho ecolégico para bacterias aciddfilas; por otra parte, los lactobacilos acidéfilos se usan para preparar alimentos muy nutritivos y como parte de una terapia intestinal. En lagos cdusticos y suelos con muchos carbonatos podemos encontrar a los alcaléfilos. 269Materiales y Equipo + Cultivos bacterianos ias sugeridas: + Escherichia coll + Proteus mirabilis + Serratia marcescens + Staphylococcus aureus + Bacillus subtilis * Cultivo de la levadura Saccharomyces * Caldos de TSB con distintos pH: 3,5,7,8,9,10 * Asa de inocular * Goteros + Opcional: Espectrofotémetro Beckman UV-VIS * Cuvetas desechables para espectrofotémetro (si necesarias) + Medio sin inocular para usar como blanco 270Procedimiento 1 Inocule la serie de tubos de distintos pH con el cultivo asignado utilizando el asa 0 un gotero, seguin las instrucciones particulares que reciba Incube todos los tubos a 35°C (0 a 25°C si utiliza a Serratia). En el proximo periodo de laboratorio, utilice un tubo con caldo sin inocular como blanco para calibrar el espectrofotémetro, De ser posible, tome la absorbancia de cada muestra, anotando los datos en el espacio provisto. De lo contrario, fijese en la turbidez en los tubos, evaluandolos del mismo modo que en el ejercicio de los efectos de la temperatura, De haber medido la absorbancia, prepare una grafica con todos los datos obtenidos por el grupo para los diversos microorganismos utiizados. 2mEl Efecto de la Salinidad y la Presion Osmotica Objetivos + Explicar el efecto de la presién osmética en el crecimiento microbiano + Explicar las aplicaciones practicas de la presién osmetica como factor limitante Introduccion Ya que los microorganismos se encuentran separados de su ambiente fisico solamente por una membrana selectivamente permeable, pueden verse afectados por los cambios en la presion osmética. Debemos recordar que la presién osmotica es la fuerza que se genera cuando dos soluciones con distintas concentraciones de soluto se encuentran separadas por una membrana que es permeable solamente con respecto al solvente (agua, en este caso). Las condiciones hipoténicas con mucha agua y poco soluito no afectan tanto a las bacterias, ya que su pared celular es rigida y ayuda a mantener la forma e integridad de la célula. Por otra parte, las bacterias se deshidratan cuando son colocadas en una solucién hiperténica conteniendo una alta concentracién de soluto y una baja cantidad de solvente, ya que el agua sale de la célula. Bajo estas condiciones las células dejan de crecer. Los microorganismos que pueden crecer en una alta concentracién de soluto se conocen como osmotolerantes. Estos organismos pueden resistir presiones osméticas altas y crecer en una baja actividad de agua. Otros microorganismos son osméfilos, necesitando una concentracién alta de soluto para crecer. En este sentido las cantidades de azticar en un medio de cultivo pueden ser importantes para mantener la integridad de cierto tipo de células. Ya que muchos hongos necesitan menos actividad de agua que las bacterias, no debe sorprendemos que los encontremos creciendo en alimentos con un alto contenido de azicar, como mermeladas y jaleas. La salinidad tiene un efecto importante en la presién osmética. Unas pocas bacterias, llamadas haléfilas, pueden tolerar condiciones _hiperténicas relacionadas con una concentracién de sal mas alta de lo normal: * Las que viven en ambientes como las salinas son llamadas haléfilas extremas (15-30% NaCl). + Las que viven en agua de mar son haléfilas moderadas (6-15% NaCl). + Una tercera categoria incluye a las hal6filas leves (1-6% NaCl) * Las bacterias que pueden tolerar y resistir cierto desbalance de agua, ero de rutina viven en concentraciones menores de sal se conocen como halotolerantes. 22Podemos comparar diversas bacterias para comprender mejor la importancia de la presién osmética en el crecimiento y las actividades microbianas: * Bacterias como Halobacterium necesitan una alta concentracién de sal para estar activas y mantener su integridad celular = haléfilas extremas. Estas bacterias: © Viven en las salinas cerca del mar y en lagos salados © Se asocian con dafio al pescado conservado en sal y a las pieles o-cuero © Pueden vivir en barriles con vegetales preservados en sal © La bicapa purpura de su membrana plasmatica es diferente de la de las bacterias tipicas y contiene bacteriorodopsina © Su pared celular carece de peptidoglican y los iones de sodio le dan estabilidad © Tienen muchas enzimas poco convencionales que solamente pueden estar activas en altas concentraciones de sal © Tienen una alta concentracién de KCI en su interior © Sus ribosomas requieren alias cantidades de potasio para mantener su estabilidad © Al cultivarlas en diversas concentraciones de sal, mantienen su forma hasta 5.2 M NaCl (actividad de agua = 0.75); en concentraciones menores las células se deforman e inclusive pierden su pared. © En muy bajas concentraciones de sal ocurre lisis 0 rompimiento, ya que estas bacterias necesitan sodio, cloruro y magnesio para mantener su estructura y rigidez. * Bacterias como algunas cepas de Staphylococcus aureus pueden tolerar concentraciones de sal de hasta 15%, equivalente a 2.5M NaCl (actividad de agua = 0.86) © Estas bacterias se asocian con nuestro cuerpo, aunque las concentraciones de sal nunca llegan a ser tan altas. Por esta raz6n las podemos encontrar viviendo en la piell, donde hay mayor cantidad de sal debido al sudor y la evaporacion + Bacterias como Escherichia coli son muy sensibles a las altas concentraciones de sal, ya que carecen de tolerancia osmotica © Estas bacterias son parte de nuestra flora normal intestinal, en donde la sal no juega un papel importante. > Este tipo de bacteria no puede crecer en una actividad de agua ‘menor a 0.95. 223Materiales y Equipo Cultivo de bacterias haléfilas Cultivos en caldo de bacterias con diversas tolerancias a la sal, como por ejemplo: > Staphylococcus aureus 0 epidermidis © Escherichia coli © Pseudomonas aeruginosa © Serratia marcescens © Bacillus subtilis Placas de agar TSA con diversas concentraciones de NaCl: 0.5%, 5.0%, 10%, 15% Placas sin sal (0%) Hisopos estériles 274Procedimiento 1 La bacteria asignada debera ser inoculada en una serie completa de placas que varian en la concentracién de sal Utilice un hisopo esteril para estriar cada placa. Una vez selladas con parafina, entregue sus placas para ser colocadas en la incubadora a. No olvide que en el caso de estar trabajando con Serratia, debe incubarla a 25°C para que pueda producir el pigmento rojo b. En el caso de haber trabajado con una bacteria haldfila, debera esperar alrededor de una semana para observar algun crecimiento Luego del periodo de incubacién, evalde la serie de placas usando el criterio de ++++, +++, +4, + 0 0 para adjudicar valor al grado de crecimiento. Cada serie de placas debe ser comparada solamente entre si, ya que el crecimiento varia de un organismo a otro. Anote sus resultados particulares en el érea indicada, y proceda a llenar la tabla general para los resultados obtenidos con los distintos organismos. 275El Efecto de la Luz Ultravioleta Objetivos + Explicar el efecto de la luz ultravioleta en el crecimiento microbiano + Explicar las aplicaciones practicas de la luz ultravioleta como factor limitante Introduccion Con la excepcién de las bacterias que son fotosintéticas, la mayoria de ellas son susceptibles a los dafios producidos por la luz ultravioleta (UV). Este tipo de radiacion incluye ondas electromagnéticas con un largo de onda entre 4-400 nm (40-4000 angstroms). Por lo tanto, la luz UV no es una entidad sola, sino una banda amplia de largos de onda. Sus efectos germicidas estan limitados a ciertas regiones del espectro ultravioleta, fenémeno que ha sido aprovechado en el disefio de lamparas de mercurio con uso bactericida. Este tipo de lampara es de gran utilidad en salas de operaciones, frigorificos, bancos de sangre, laboratorios de investigacion y donde quiera que se necesite mantener un control estricto sobre el crecimiento microbiano. Las facilidades que usan luz UV por lo general lo hacen de dos formas, ya sea mediante gabinetes biolégicos (‘hoods’) con lamparas que emiten luz UV mientras no hay nadie trabajando en ellos, 0 mediante lamparas que iluminan todo el espacio una vez los trabajadores se han retirado 0 localizadas en areas de acceso controlado. En este sentido debemos recalcar las reglas de seguridad con respecto a la exposicin de las personas a la luz UV, ya que puede causar quemaduras 0 ceguera, y tiene efectos carcinégenos. La luz UV no tiene un gran poder de penetracién y solamente puede afectar a los mictoorganismos en una superficie o cerca de ella, en el caso de un medio liquido. En el caso de microorganismos dentro de un recipiente de cristal © en una placa cubierta por su tapa, la luz UV no puede penetrar. La luz ultravioleta es letal para los microorganismos mediante diversos mecanismos. EI principal y mas conocido es el que ocurre a 260 nm, lo que coincide con la absorcién maxima del ADN. La luz UV causa mutaciones que pueden ser letales, ya que induce la formacién de dimeros de timina. Sin embargo, la exposicion a luz UV a 340 nm tambien tiene un efecto potente sobre los microorganismos, aunqu este largo de onda no es absorbido fuertemente por el ADN. Esto sugiere la existencia de otros mecanismos mediante los cuales la luz UV ejerce su letalidad 276Los experimentos en que se utiliza la luz UV usualmente estan dirigidos a determinar el tiempo minimo que toma matar a 100% de un cultivo en placa. En este sentido debemos resaltar la diferencia entre diversos microorganismos, como ocurre con Bacillus, un formador de endosporas, versus bacterias al estilo de Staphylococcus que carecen de mecanismos para sobrevivir ante condiciones ambientales adversas. En términos de los escenarios naturales, debemos poder comprender la diferencia relativa entre la capacidad de sobrevivir que tienen las formas vegetativas en comparacién con estructuras como las_endosporas. En el caso de los hongos, recordamos que tienen una capacidad natural para tolerar niveles altos de radiacién, por lo que pueden crecer en estaciones espaciales expuestas a intensas emisiones solares. 27Materiales y Equipo Cultivos en caldo de bacterias con diferentes grados de susceptibilidad a la luz UV © Bacterias sugeridas: + Escherichia coli + Serratia marcescens + Staphylococcus aureus + Bacillus subtilis o megaterium Levadura Saccharomyces en solucién salina Cultivos en placa de hongos negros, como Rhizopus Agar TSA en placas Petri regulares ‘Agar Sabouraud en placas regulares y en mitades Hisopos estériles Pinzas y escalpelos, Papel de aluminio Gabinete biolégico con luz ultravioleta Parafina 278Procedimiento 1. Utilice un hisopo estéril para inocular tres placas de agar TSA en forma de grama con la bacteria indicada. 2. En el caso de estar trabajando con la levadura, siga el mismo procedimiento, pero inoculando en agar Sabouraud. 3. Sile ha sido asignado un hongo, coloque una muestra pequefia tomada con pinza 0 escalpelo en el medio de cada una de las mitades de una placa con agar Sabouraud 4. Lleve las placas tapadas hacia el area donde se encuentra el gabinete con luz ultravioleta, asegurandose de seguir las instrucciones sobre la forma de prender y apagar la lampara; al comienzo del experimento la lampara deberd estar apagada, 5. Una vez tenga las placas dentro del gabinete, remueva las tapas con mucho cuidado; en cada una de ella deberé dejar una mitad expuesta, cubriendo la otra mitad con papel de aluminio. 6. Prenda la lampara de luz UV, dejando sus placas expuestas por 1, 10 0 30 minutos. 7. Asegurese de tapar de nuevo las placas antes de sacarlas del gabinete. 8. Asegurese igualmente de que las placas estén correctamente identificadas y selladas antes de colocarias en la incubadora a 34°C (bacterias ) 0 en el gabinete a 25°C (hongos), 9. Ala hora de observar los resultados, compare el crecimiento en ambos lados de cada placa usando el criterio de +#4+, +44, +4, +, 0. 10. Ya que el crecimiento de los hongos filamentosos es mas lento que el de las bacterias, los incubaremos por una semana antes de evaluar los resultados, Aunque muchas personas estan acostumbradas a exponerse a luz UV durante actividades recreativas o cosméticas, debemos recordar que puede causar dajio serio permanente. Por lo tanto, en el laboratorio debemos seguir las reglas de seguridad correspondientes para evitar la exposicién inadecuada 0 prolongada a la luz ultravioleta. 279