UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR

INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES BIOTECHNOLOGIE

APPLIQUEES DE TUNIS

3éme année biotechnologie :CEM

**RECHERCHE ET EXPLOITATION DES

MICROORGANISMES **

Par 
Hammami Rihab & Gharbi Sirine
Plan :
Manipulation 1 : dénombrement par filtration.
Manipulation 2 : dénombrement sur milieu solide .
Manipulation 3 : dénombrement sur milieu liquide :
Technique NPP.
 Manipulation n° 1 :
Dénombrement par filtration
Introduction :

L’eau est une substance chimique incolore, insipide, inodore constituée de

molécules H2O. C’est une ressource vitale et responsable à la survie des êtres
vivants. Il est sensible aux germes donc pour le consommer on fait recours aux
analyses bactériologiques pour vérifier son pureté comme technique on cite :
la technique de filtration sur membrane.

Objectif :

Recherche des bactéries : coliformes totaux et fécaux, dans un échantillon

d’eau.

Principe :

L’échantillon d’eau à analyser est filtré à travers une membrane qui

retient les micro-organismes. La membrane est ensuite placée sur un
milieu gélosé. Durant l’incubation, des colonies se forment à la surface
de la membrane.

Les bactéries présentent dans l’eau :

1. Les coliformes totaux :

Correspondent à des bacilles Gram négatif, non

sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie
facultatifs, capables de se multiplier en présence
de sels biliaires et de fermenter le lactose avec
production de l’acide et de gaz en 48h à une
température de 35- 37°C.

2. Les coliformes fécaux ou thermo tolérants :

Présentent les mêmes propriétés mais qui ils se

développent à 44°C dont l’origine fécale est plus
nette.

3. Entérocoques :

Bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes,

formant des chainettes, non sporulées, catalase
négative, possédant l’antigène D, cultivant en
anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables d’hydrolyser l’esculine
en présence de bile. Ils se répartissent en deux genres streptococcus
et enterococcus.

Matériels utilisés :

- Unité et rampe de filtration

- Le milieu de culture : gélose lactosée au TTC et Tergilot 7

La gélose lactosée au TTC et au Tergitol 7 permet d’effectuer les
recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries
coliformes dans les eaux, notamment celles destinées à la
consommation humaine, par la méthode des membranes filtrantes.
 - Le Tergitol 7 inhibe la croissance des microorganismes à Gram
positif, limite l'envahissement par les Proteus et favorise la
récupération des coliformes.
- Les coliformes présentent des colonies de coloration jaune ou
orangée, à l'intérieur d'un halo jaune visible sous la membrane.
Celui-ci est provoqué par l'acidification du lactose en présence de
l'indicateur coloré, le bleu de bromothymol,
- Les autres microorganismes présentent des colonies dont la
coloration rouge est due à la réduction du TTC en formazan insoluble.
- Les germes qui ne fermentent pas le lactose présentent des
colonies entourées d'un halo bleu.
Pour 1 litre de milieu :
- Peptone pancréatique de viande 10,0 g
- Extrait de viande 5,0 g
- Extrait autolytique de levure 6,0 g
- Lactose 20,0 g
- Tergitol 7 0,1 g
- Bleu de bromothymol
50,0 mg
- Chlorure de 2, 3, 5
triphényltétrazolium
25,0 mg
- Agar agar bactériologique 10,0 g
pH du milieu prêt-à-l'emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.

- Eau - - Etuve -
- Papier filtre - - Pince -

 Mode opératoire :

Devant un bec-bunsen et sur une paillasse javellisée.

1. Lavage et stérilisation de l'équipement de filtration

pour flambage et mise en place de la pompe à vide.

2. Prendre une membrane filtrante stérile prés du bord

à l'aide d'une pince stérilisée par flambage à la flamme
et la déposer sur le support du filtre.

3. Placer l'entonnoir sur le support et le fixer fermement verser dans

chaque entonnoir un volume 100ml de l'échantillon bien homogénéise.

4. Faire le vide jusqu'a filtration totale de l'échantillon.

5. Retirer l'entonnoir et déposer la membrane filtrante à l'aide d'une

pince stérile sur un milieu gélosé.

6. Déposer la membrane en la déroulant pour tenir un contact étroit

avec la gélose (la présence de bulles d'air est signalée par des taches
blanches).

7. placer la boite de pétri dans

l’étuve :
 faire l’incubation a 37°c pendant 48h pour trouver les coliformes totaux,
La seconde membrane servira à rechercher les coliformes fécaux et
donc elle sera incubée à 44°c pendant 48 h .

Résultats :

-Après incubation, seuls les coliformes totaux poussent sur le milieu gélosé
sous forme de colonies de coloration jaunes ou orangé trouvé à l’intérieur d’un
halo jaune .Cette coloration est du à la dégradation du lactose par ces bactéries
en présence de BBT( bleu de bromothymol).On ne d’détecte pas les coliformes
thermorésistants .

Exploitation des résultats :

Après le dénombrement de colonies sur la membrane, on peut également

calculer la concentration bactérienne N selon la formule suivante :

NUFC/ml =n/v

Avec :

n : nombre d’Unité formant colonies (UFC)

v : volume de produit filtré (en ml)

Dans notre manipulation : n=10 UFC et v= 50 ml

N = 10/50 = 0,5 UFC/ml

Seuil bactériologique =2*103UFC/ml

N=0.5UFC/ml<seuil donc l’échantillon de l’eau n’est pas contaminé par

les coliformes.

Manipulation n°2 :
Dénombrement sur milieu
solide
Technique de dilutions successives de facteur 10 :

Objectif :

Le but des techniques de dénombrement est de déterminer la concentration

bactérienne contenue dans une préparation initiale.

Principe :

Les bactéries à dénombrer présentent dans l’inoculum sont introduites soit à la

surface, soit dans la masse d’un milieu gélosé. Chaque bactérie isolée donne
naissance à une colonie ou UFC pour « unité formant colonie ».

Matériels utilisés :

- Suspension bactérienne
- Diluant stérile
- Boites de pétri contint le milieu TSA

La gélose tryptone soja est un milieu de culture utilisé en microbiologie

pour des bactéries peu exigeantes aérobies et anaérobies. En gélose il
possible de s’en servir tel quel notamment pour des numérations.

- Tubes à essai
- Pipettes stériles
- Etuve pour l’incubation

Mode opératoire :

• Homogénéiser la suspension microbienne à prélever (agitation par

mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l’aide d’un vortex).
• Ouvrir et flamber l’ouverture du tube.

• Prélever 1 ml de suspension à l’aide de la pipette plastique stérile (ou pipette

automatique). Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm.

• Flamber et refermer le tube. Il est conseillé de replacer le tube sur le portoir

à une place montrant qu’il a déjà été prélevé (en retrait par exemple).

• Ouvrir le tube de 9 ml de diluant, flamber l’ouverture, y introduire le volume

prélevé (sur la paroi sans toucher le liquide). Éviter tout contact entre la pipette
contenant l’inoculum et le diluant stérile.

• Flamber et refermer le tube, jeter la pipette souillée dans le bac à eau de

Javel.

• Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande).

• Prélever un volume précis au dixième de millilitre à l’aide d’une pipette

stérile de 1 ml et déposer 0,1 ml de la dilution au centre de la surface de la
gélose de la boite de pétri.

• Étaler à l’aide d’une pipette râteau le volume sur toute la gélose.

Il ne faut qu’une seule pipette de 1 ml pour ensemencer toutes les boîtes si

elles sont ensemencées de la dilution la plus grande à la dilution la plus petite
(du plus diluée au plus concentrée). Exemple : 10-3, 10-2 puis 10-1.
•Incubation de boites pendant 48 heures à 37°C.

Résultats : Echantillon Dilution 10-1 Dilution 10-2 Dilution 10-3

pur
Nombre de 150 13 0 0
colonies

Appareil pour dénombrer les colonies

Exploitation des résultats :

On travaille sur les boites qui contiennent un nombre de colonies entre 30 et

300.

Pour calculer la concentration bactérienne on applique la formule suivante :

N= colonies /V ml *(n1+0.1*n2)*d1

Avec :
N : nombre d’UFC par gramme ou par ml de produit initial

Colonies : somme des colonies des boites interprétables

V ml : volume de solution déposée (1ml)

n1 : nombre de boites considéré à la première dilution retenue

n2 : nombre de boites considéré à la seconde dilution retenue.

Dans notre manipulation on a utilisé que des boites de la première dilution

n2=0.

d1 : facteur de la première dilution retenue

Application numérique :

N = 150 /1*1*10-1 = 150*10 UFC /ml

Seuil bactériologique =2*103UFC/ml

N=150*10UFC/ml<seuil donc l’échantillon de l’eau n’est pas

contaminé par les coliformes.
 Manipulation n°3 :
Dénombrement sur milieu
liquide 
*Technique du nombre le plus
probable(NPP) *:
1. Principe de la technique :

Cette méthode permet de révéler de plus faibles quantités de germes que la

plupart des méthodes de numération en milieu solide. Elle repose sur une
analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus probables. Cette
méthode est applicable aux échantillons ayant une teneur plus ou moins élevée
en MES, elle consiste à ensemencer des milieux de culture par dilution, les
tubes ensemencés contiennent un milieu nutritif, dans notre cas milieu Lauryl
pour les coliformes , après incubation on note la croissance et la production de
gaz dans chaque tube, enfin on compte le nombre des tubes positifs pour
chaque dilution et on fait la lecture du NPP correspondant en utilisant la table
de MAC CRADY.
*Les milieux de cultures utilisés :

Bouillon de Lauryl : Ce milieu est utilisé pour le test présomptif des coliformes
d’enrichissement sélectif utilisé pour la recherche et le dénombrement des
coliformes dans les eaux par la méthode de NPP. Le lauryl sulfate de sodium
inhibe le développement de la flore secondaire contaminant.

Bouillon vert brillant : Test confirmatif pour les coliformes totaux. Avec
la cloche de Durham permet le recueil des gaz signant la présence
de coliformes, à condition que le milieu ait été agité correctement pour
que les bactéries soient bien réparties, y compris sous la cloche. Le
trouble du milieu et la production de gaz sont dues à la fermentation
du lactose par les coliformes.

2. Modes opératoire :
Analyses des coliformes fécaux et totaux :

• Test présomptif : (on utilise un échantillon de volume de 10 ml)

Pipeter 1ml de échantillon et verser le sur le tube de l’eau physiologique.

• Pipeter 1ml à partir du tube 1 et verser le sur le tube de l’eau physiologique.
• Pipeter 1ml à partir du tube 2 et verser le sur le tube de l’eau physiologique.
• Pipeter 1ml à partir du tube 3 et verser le sur le tube de l’eau physiologique.
• Prendre les 9 tube de Rothe.
• Pieter et verser dans chaque tube 1ml à partir des dilutions précédentes.
• Incuber les 9 tubes dans une étuve à T=37°C (le lecteur après 24 et 48h)
Préparation des dilutions à partir de la solution mère (10-1, 10-2, 10-3).

Les tubes présentant un trouble microbien ou une pastille violette (blanchâtre)

au fond des tubes
 Test confirmatif :

On procède à la confirmation de chaque culture provenant des tubes ayant

donné une réaction positive, en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée le
bouillon lactosé au vert brillant pour les coliformes totaux

Ensemencement 1 mL de chaque dilution est introduit dans un tube de

BLBVB + cloche. Homogénéiser l’inoculum afin qu’il se répartisse dans tout
le tube, cloche comprise. 2.1.3. Incubation 24 heures à 30°C

La présence d’un trouble (culture) et la production de gaz dans la cloche (au

moins 1/10 du volume de la cloche) permet de conclure à la présence d’au
moins un coliforme dans le mL d’inoculum de la dilution testée.

3.Les résultats :
.Test présomptif :

10-1 10-2 10-3

Résultat - - - - - - + - -

Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 100 .

Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de produit pur.

 Concentration en micro-organismes dans le produit pur strictement inférieure 1
microorganisme par mL. [N] < 1 micro-organisme par mL

.Test confirmatif :

10-1 10-2 10-3

Résultat - - - - - - +
Chiffre attribué à 0 0 1
chaque dilution

Interprétation statistique :

Méthode du NPP (table de Mac Grady) Chaque essai doit être doublée ou
triplée : ensemencement de 3 tubes pour chaque dilution.

La méthode du Nombre le Plus Probable ou NPP, dérivée des études de

MacGrady, consiste à interpréter les résultats en comparant les trois essais et
leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation.
4. Expression des résultats et discussion :

On compte le nombre de séries de tubes positifs et le nombre de tubes négatifs

et on obtient les résultats en extrapolant sur la table de MAC GRADY.la formule
utilisée est la suivante.

N=NPP/(FD*V)
Avec:

NPP: nombre le plus probable trouvé dans la table de MAC CRADY.

FD : le facteur de dilution : égale à l’inverse de la dilution la plus faible.

N : nombre de bactéries exprimées en coliformes/ml.

Dans notre cas, on a 001. Dans la table de Mac Grady, le NPP

correspondant à est 0.3.
Application numérique :
N= NPP*(fd*v) = 0.3 /( 10-1 *1)

N= 3.10-1UFC/ml<seuil bactériologique =2. 103UFC/(g,ml)

Donc d’après cette technique l’échantillon de l’eau minérale utilisée est non
contaminé par les coliformes
5. Conclusion générale :

Au cours de travail de l’atelier on utilise trois techniques différentes pou savoir

si l’échantillon d’eau utilisée est contaminé ou non par les microorganismes de
types coliformes.

D’après ces trois techniques le résultat trouvé est le même que l’échantillon est
non contamine par des coliformes et la technique le plus précise entre les trois
méthodes « technique du nombre le plus probable (NPP) » confirme la réponse
avec comparaissions au seuil bactériologique.

On peut conclure donc que l’eau n’est pas contaminée.