Boas Práticas em

Laboratório de Prof. MSc. Brunno Pinho

Microbiologia
Relato
Relato fictício de médica atuante em Hospital Público:

“Não há possibilidade de acreditar nos resultados de cultura do

laboratório, em diversas vezes não são identificados patógenos
de pacientes com infecções bacterianas, enquanto que outros
pacientes apresentam resultados que indicam bactérias
multirresistentes e as condições clínicas não são compatíveis
com os resultados.”
Boas práticas em Laboratório
Reflexão:

O que torna um laboratório de microbiologia confiável?

Como o analista clínico deve atuar para garantir resultados

confiáveis?

Como o responsável técnico deve garantir a competência da

equipe?
Legislação
 Legislação
RDC n. 11/2012 – ANVISA:
- Dispõe sobre o funcionamento dos laboratórios analíticos:

- Laboratórios devem possuir licença sanitária atualizada fixada em

local visível ao público;

- Laboratório deve contar com um RT, legalmente habilitado;

- Direção do laboratório deve garantir aplicação de política de

qualidade, infra-estrutura, recursos humanos, equipamentos,
procedimentos para redução de danos e rastreabilidade adequados.
 Legislação
RDC n. 11/2012 – ANVISA:
- Dispõe sobre o funcionamento dos laboratórios analíticos:

- Laboratórios devem dispor de profissional responsável pelo sistema

de gestão de qualidade;

- Procedimentos e instruções internos devem ser documentados e

estar disponíveis para fiscalização;

- Documentos devem ser identificados, contendo título, data da

última revisão, paginação, número total de páginas, objetivo e
emitente.
 Legislação
RDC n. 11/2012 – ANVISA:
- Dispõe sobre o funcionamento dos laboratórios analíticos:

- Laboratório deve realizar auditoria interna de suas atividades a cada

12 meses, devendo ser mantidos relatórios de auditorias e medidas
corretivas;

- Laboratório deve ter lista atualizada de todo o pessoal, contendo

informações relacionadas a formação na área, treinamentos e
reciclagens.
 Legislação
RDC n. 11/2012 – ANVISA:
- Dispõe sobre o funcionamento dos laboratórios analíticos:

- Instalações do laboratório devem garantir separação entre áreas de

atividades incompatíveis, controle de acesso às áreas restritas,
condições para realização de limpeza e desinfecção das áeras.
Equipe multiprofissional
Equipe Multiprofissional
Considerações gerais:
- Membros da equipe devem possuir
formação básica e/ou experiência
prática relevante em microbiologia;

- Laboratório deve manter registro de

todo o pessoal técnico, descrevendo
qualificações, treinamento e
experiência.
 Equipe Multiprofissional
Considerações gerais:
- Gerência do laboratório deve garantir e comprovar treinamento
básico para toda a equipe, em técnicas como:

- Plaqueamento, contagem de colônias, preparação de meios de

cultura, diluições em série e técnicas de identificação;

- A competência da equipe deve ser garantida com planejamento

de reciclagem e novos treinamentos;

- Equipe deve ser treinada para contenção de micro-organismos.

Monitoramento ambiental
 Ambiente
- Medidas ambientais devem ser estabelecidas para controle de
contaminação, tais como:

- Equipamentos devem ser exclusivos para o laboratório de

microbiologia, como vidrarias, autoclaves e afins;

- Separação dos locais de armazenamento de produtos estéreis e

de produtos do laboratório de microbiologia;

- Deve haver fornecimento de ar separado para laboratório de

micro e áreas de produção, sendo este de boa qualidade.
 Ambiente
- Medidas de monitoramento ambiental:

- Monitoramento do ar ativo;

- Exposição de placas ou placas de contato;

- Temperatura;

- Diferencial de pressão.
Equipamentos
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Agitador do tipo rotatório (Shaker)

 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Agitador magnético
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Contador de colônias
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Estufa incubadora microbiológica

 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Incubadora de banho-maria
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Estufa de esterilização
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Potenciômetro (pHmetro)
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Balanças de precisão
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Autoclave
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Bico de bunsen
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Geladeiras e congeladores
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Geladeiras e congeladores

- Utilizada para conservação (separadamente) de meios de

cultura estéreis, soluções e amostras;

- Jamais poderá guardar refeições ou qualquer alimento que será

consumido;

- Culturas vivas não devem ser congeladas.

 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Microscópio óptico
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Auxiliar de pipetagem
 Equipamentos
- Equipamentos comuns em laboratório de microbiologia:

- Cabines de fluxo laminar horizontal e vertical

Reagentes e Meios
de Cultura
 Meios de cultura
- Meios de Cultura:

- Material nutriente e estéril utilizado para o crescimento de

microrganismos em condições ideias em laboratório;

- Possui diferentes tipos, devendo o analista clínico indicar o

melhor meio de cultura para isolamento do microrganismo
analisado;

- Não há meio de cultura universal que serve para todos os tipos

de microrganismos.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura - Classificação:

- Seletivos: Favorecimento de microrganismos de interesse, com

supressão de microrganismos indesejados (Ex. Ágar Sabouraud
dextrose);

- Diferenciais: Meios que conferem características específicas para

certas colônias, que em condições normais seriam idênticas a
colônias de outros microrganismos (Ex. Ágar Sangue).
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Diferenciais – Águar hipertônico
Manitol:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Enriquecimento e transporte:

- Enriquecimento: Meio seletivo elaborado para amplificar um

número pequeno de microrganismo específico, geralmente é
líquido (Ex. Meio de Thayer-Martin);

- Transporte: Meio utilizado para transportar amostras (Ex. Stuart)

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Stuart:

- Meio de transporte e conservação, não utilizado para

diferenciação;

- Meio semi-sólido, não nutritivo, para preservar espécies;

- Utilizado para transporte de amostras para análise de H.

influenzae, Streptococcus pyogenes, P. aeruginosa, dentre outros.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Stuart:

- Possui carência de nitrogênio, impedindo assim a multiplicação de

microrganismos;

- Composição nutritiva garante sobrevivência;

- Cor original do meio: Branco opalescente.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Stuart:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Stuart:

- Coletar amostra com haste flexível, tocando área supostamente

contaminada/infectada;

- Colocar haste flexível no meio Stuart;

- Identificar amostra, enviar ao laboratório em ate´72 horas.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Stuart:

- Não indicado para bactérias intestinais;

- Indicado para investigação de microrganismos anaeróbios;

- Amostras podem ser de tecidos extraídos em cirurgias, biópsias de

tecidos, pus ou aspirados extraídos de seringas.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Cary Blair:

- Meio de coleta, transporte e conservação de amostras,

especialmente de fezes;

- Microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem

bem nesse meio;

- Carência de nitrogênio, impede multiplicação de microrganismo,

garantindo apenas sobrevivência.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Cary Blair:

- Meio adequado para transporte de patógenos entéricos, como os

dos gêneros Campylobacter spp, Yersinia spp e Víbrio spp;

- Possui apresentação semissólida e líquida;

- Cor original: Branco opalescente.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Cary Blair:

- Procedimento envolve a coleta de material fecal por swab,

introduzindo-o nas efzes por 1 a 2 minutos;

- Inocular o material na profundidade do meio semissólido e fechar

hermeticamente;

- Manter em temperatura ambiente (22°C a 25°C), por até 4-6 horas

e semear em meios apropriados.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Cary Blair:

- Procedimento envolve a coleta de material fecal por swab,

introduzindo-o nas efzes por 1 a 2 minutos;

- Inocular o material na profundidade do meio semissólido e fechar

hermeticamente;

- Manter em temperatura ambiente (22°C a 25°C), por até 4-6 horas

e semear em meios apropriados.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Nutriente:

- Indicado para análise de água, alimentos e leite;

- Meio de cultivo preliminar de amostras submetidas a exames

bacteriológicos e isolamento de culturas puras;

- Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente,

para laboratórios que não dispõe de crioconservação
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Nutriente:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Nutriente:

- Cor original do meio é branco opalescente.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Salmonella-Shigella (SS):

- Utilizado para selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella

em amostras de fezes, alimentos e água;

- Ágar SS possui componentes que inibem microrganismos gram-

positivos;

- Incorporação de Lactose ao meio permite diferenciar se o

microrganismo é lactase positiva (Produção de ácido a partir de
fermentação, que resultam em colônias cor de rosa).
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Salmonella-Shigella (SS):

- Presença de Tiossulfato de sódio e citrato férrico permitem a

detecção de H2S (Sulfeto de hidrogênio);

- Evidenciado pela formação de colônias de cor negra no centro;

- Auxilia na diferenciação entre Salmonella e Shigella.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Salmonella-Shigella (SS):
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Salmonella-Shigella (SS):

- Meio não pode ser autoclavado, placas devem ser armazenadas

em geladeira a 4-8°C;

- Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas;

- Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Salmonella-Shigella (SS):
- Interpretação
Achado Interpretação
Colônias com centro negro Suspeita de Salmonella
Colônias incolores Suspeita de Shigella
Colônias cor de rosa Suspeita de E. coli ou Klebsiella spp
Bactérias não fermentadoras de
Incolores
lactose
Bactérias fermentadoras de lactose Cor rosa
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar MacConkey:

- Meio possui componentes que inibem o crescimento de bactérias

G+, especialmente enterococos e estafilococos;

- Não é tão seletivo para G-;

- Utilizado para isolar BGN (enterobactérias e não fermentadores) e

verificar a fermentação ou não da lactose.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar MacConkey:

- Procedimento envolve inoculação das placas e incubação por 18 a

24 horas;

- Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas;

- Cor original do meio é rosa avermelhado.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar MacConkey:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar MacConkey:
- Interpretação

Achado Interpretação
Colônias cor de rosa Fermentadoras de lactose
Colônias incolores Não fermentadoras de lactose
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:

- Oferece ótimas condições de crescimento à maioria dos

microrganismos, não é considerado como meio seletivo;

- Conservação dos eritrócitos íntegros favorece a formação de halos

de hemólise nítidos;

- Úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus

spp.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:

- Usado para isolamento de microrganismos não exigentes;

- Diferenciação por padrão de hemólise de Streptococcus spp e

Staphylococcus spp.;

- Usado em provas complementares como satelitismo (Para

identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:

- Inoculação deve ser por meio da técnica de semeadura por

esgotamento;

- No final da semeadura, picar o meio com a alça para verificar

hemólise em profundidade;

- Incubar a 35°C em 24 horas.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:
- Interpretação

Achado
Halo transparente ao redor da colônia
Halo esverdeado ao redor da colônia
Ausência de halo ao redor das
colônias
Interpretação
Beta hemólise (lise total dos
eritrócitos) - Streptococcus
Alfa hemólise (lise parcial dos
eritrócitos)
Gama hemólise (Sem hemólise,
eritrócitos íntegros)
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Sangue:
- Interpretação
Atividade
Atividade
1) Organizar tabela de interpretação de Ágar
Sangue, para microrganismos beta
hemolíicos, alfa hemolíticos e gama
hemolíticos.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:

- Meio deficiente em eletrólitos, contém cistina e lactose;

- Ágar diferencial, que muda de coloração, permite avaliação de

fermentação de lactose;

- É indicado para urocultura.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:

- Utilizado para isolar e quantificar microrganismos G+, G- e

leveduras;

- A deficiência de eletrólitos inibe o crescimento de cepas de

Proteus.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- E. coli: Crescimento de colônias amareladas, escuras no centro

(fermentadores de lactose);

- E. coli não fermentadoras: Colônias azuis.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- Klebsiella: Colônias mucosas, cor variável de amarelo a branco

azulado.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- Proteus: Colônias azuis translúcidas, geralmente menor que E. coli.

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- Salmonella spp.: Colônias planas, cor azul

 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- Enterococcus faecalis: Colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de

diâmetro;

- Staphylococcus aureus: Colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm

de diâmetro.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar CLED:
- Interpretação:

- Pseudomonas aeruginosa: Colônias verdes, com superfície

prateada e periferia rugosa.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Chocolate:

- Utilizado para cultivo de microrganismos exigentes, como H.

influenzae, Neisseria spp., Moraxella spp.;

- Baseado em sangue hemolisado. Hemólise libera componentes

fundamentais para crescimento de microrganismos exigentes.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Chocolate:
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Chocolate:
- Interpretação:

- Cor original do meio: Castanho escuro;

- Colônias pequenas com pigmentação amarela: Sugestivo de

Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.;

- Colônias pequenas com pigmento creme claro: Sugestivo de

Haemophillus spp.
 Meios de cultura
- Meios de Cultura – Ágar Chocolate:
- Interpretação:

- Recomenda-se fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e

corar por Gram, fazendo a diferenciação morfotintoriais.
Exercícios de fixação
Perguntas
1) (CESPE – 2014) O meio Ágar SS possui
componentes que inibem o crescimento
de microrganismos gram negativos.

A) Certo
B) Errado
Perguntas
1) (IDECAN – 2007) Frequentemente há
necessidade de se usar meios de cultura
para manutenção ou diagnóstico de
algum parasita. Sendo assim, assinale a
alternativa que indica o meio de cultura
utilizado para transporte ou conservação
temporária de tricomonadídeos:
A) Meio NNN
B) Ágar chocolate
C) Meio de Stuart
D) Meio de Diamond
Perguntas
1) (AOCP UFPB – 2019) Os meios de cultivo de
microrganismos podem exercer funções específicas,
como crescimento, isolamento, enriquecimento,
dentre outras. Sobre os meios de cultura, assinale a
alternativa correta:
A) Meio de Stuart é um meio utilizado para o
transporte e conservação de amostras
B) Caldo malonato e caldo citrato são excelentes
meios de transporte
C) Ágar CLED tem como utilidade principal a
realização de testes de sensibilidade
Perguntas
1) (IPEFAE – 2019) Com relação ao meio de cultura
Cary Blair, considera-se a cor adequada do meio
como:
a) Branco opalescente
b) Vermelho alaranjado
c) Preto
d) Vermelho tijolo
e) Amarelo citrino
Perguntas
1) (CESPE – 2014) O meio de Cary Blair é um meio
seletivo rico em fontes de nitrogênio e adequado
para isolamento de Neisseria meningitidis:

a) Certo
b) Errado
Perguntas
1) (P. Nova Odessa - 2019) Sobre o meio de Cary Blair,
indique as assertivas corretas:
a) O meio de Cary Blair foi formulado a partir do meio
de Stuart, uma vez que microrganismos
patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem
bem nesse meio
b) A carência de uma fonte de nitrogênio impede
consideravelmente a multiplicação de
microrganismos e a composição nutritiva garante a
sobrevivência deles
c) O que difere este meio do meio de Stuart é a adição
de solução salina e retirado o azul de metileno
Perguntas
1) (UFMT - 2018) Relacione as alternativas com as
assertivas abaixo:
a) Ágar Thayer-Martin Chocolate
b) Lowenstein Jensen
c) Ágar citrato Simmons
d) Cary Blair

( ) Isolamento primário de micobactérias

( ) Isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e
meningitidis
( ) Diferencia gênero e espécie de enterobactérias
( ) Transporte de material fecal
Perguntas
Assinale a sequência correta:

a) 1, 2, 3 e 4
b) 3, 4, 2 e 1
c) 4, 3, 1 e 2
d) 2, 1, 3 e 4
Perguntas
(AOCP – 2016) Assinale a alternativa que apresenta um
meio de cultura de transporte utilizado para
conservaçaõ de fezes:

a) Ágar chocolate
b) Lowenstein Jensen
c) Ágar MacConkey
d) Ágar Thayer-Martin
e) Cary Blair
Perguntas
(AOCP – 2014) Referente a análise microbiológica da
água, aponte o meio mais indicado:

a) Ágar nutriente
b) Ágar Lowenstein Jensen
c) Ágar Sabouraud
d) Ágar CLED
Obrigado
Brunno Pinho

brunnogpinho@gmail.com

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