Slide 1

Metodologia cercetării medicale în

epoca genomicii și a proteomicii
Medicina Translațională
Curs 3
Slide 2

Medicină Translațională

Medicina translațională este o ramură biomedicală care se bazează pe trei piloni: activitate
de cercetare fundamentală (benchside), activitate clinică (bedside), și comunitate. Scopul
medicine translaționale este de a combina discipline, resurse expertise, și tehnici specific
celor trei piloni pentru îmbunătățirea prevenției, diagnosticului, și teratamentul afecțiunilor.
Slide 3

Medicină Translațională

• Randall J. Cohrs et al, http://dx.doi.org/10.1016/j.nhtm.2014.12.002

Slide 4

Medicină Translațională

• Definiție scurtă
• Medicina translațională reprezintă aplicarea interdisciplinară a cercetării
biomedicale pentru îmbunătățirea managementului pacienților
Slide 5

Medicină Translațională

• Faekah Gohar et al, doi.org/10.3389/fmed.2018.00294

Slide 6

Norme de Bună Practică de Laborator (GLP)

• Definiția OECD (Organisation for Economic Co-operation and

Development)
• Normele de Bună Practică de Laborator (GLP) reprezintă un sistem al
managementului calității reglementând procesul de organizare și condițiile
sub care studii de siguranță non-clinice și de mediu sunt planificate,
desfășurate, monitorizate, înregistrate, arhivate și raportate.

Principiile GLP se aplică testării non-clinice a siguranței compușilor din produsele

farmaceutice, pesticide, produse cosmetic, medicamente veterinare, aditivi alimentari, și
substanțe chimice industriale.
Slide 7

Norme de Bună Practică de Laborator (GLP)

Reglementare
• Europa
• EMA
• OECD

• USA
• FDA
• EPA

EMA – Agentia Europeana a medicamentului

OECD – Organizatia pentru cooperare economica si dezvoltare
FDA – Agentia federala a medicamentului
EPA – Agentia de protective a mediului
Slide 8

Norme de Bună Practică de Laborator (GLP)

Principiile GLP
1. Organizarea laboratorului și lista de personal
2. Programul de asigurare a calității
3. Facilități
4. Echipamente, materiale, și reactivi
5. Sisteme de testare
6. Elemente de testare și referință
7. Proceduri operaționale standard
8. Realizarea studiului
9. Raportarea rezultatelor studiului
10. Depozitarea și arhivarea datelor și a materialelor

• Organizarea laboratorului și lista de personal

• Asigura numărul suficient de personal calificat, facilități adecvate, echipamente și
resursele necesare sunt disponibile pentru desfăsurarea studiului
• Programul de asigurare a calității
• Personal calificat desemnat cu evaluarea si asigurarea diseminarii documentelor
de studiu si a procedurilor operationale
• Facilități
• Locatia, organizarea spatiala, calitatea constructiei adecvate. Numar sufficient de
camera, de spatii de stocare etc. Laboratorul trebuie sa prezinte suficiente spatii,
arii astfel incat sistemele de testare si locul de desfasurare a proiectelor
individuale sa fie izolate (pentru a preveni perturbare/influentarea rezultatelor)
• Echipamente, materiale, și reactivi
• Sisteme informatice validate pentru generarea, depozitarea si accesarea
informatiilor. Aparatele si matrialele nu trebuie sa interfere cu sistemele de
testare. Substantele chimice si reactivii trebuie sa fie etichetati, cu mentionarea
concentratiei, a hazardului prezentat, data de expirare, informatii specific privind
depozitarea.
• Sisteme de testare
• Sistemele de testare – depozitare, manipulare in conditii de siguranta a
sistemelor biologice folosite pentru a asigura validitatea datelor. Sitemele
animale si de plante nou primate trebuie izolate pana la evaluarea starii de
sanatate
• Elemente de testare și referință
• Caracterizarea sistemelor de testare si de referinta include: data primirii, data
expirarii, cantitatile primate, și istoricul utilizarii lor in laborator.
• Proceduri operaționale standard
• Proceduri operationale standard propii laboratorului care sunt aprobate de
serviciul local de management al claitatii. Menirea lor este asigurarea calitatii si a
integritatii datelor obtinute de laborator.
• Realizarea studiului
• Planul de studio existent inaintea demararii procedurilor de testare, aprobat de
directorul de studio. Continutul: datele de identificare a studiului, informatii
privind sponsorul si institutia de testare, sistemele de testare si referinta.
Documentarea evolutiei studiului, a rezultatelor, a probelemelor aparute se va
face prompt, precis intotdeauna cu mentionarea datei intrarii
• Raportarea rezultatelor studiului
• Raport generat de tot prsonalul implicat si semnat individual. Vor fi mentionate
sistemele de testare de referinta, instituia, informatii privind sponsorul.
• Depozitarea și arhivarea datelor și a materialelor
• Arhivarea datelor se va face local in cadrul laboratorului. Informatiile notate:
• planul de studiu, datele brute, sistemele de tesatre si de referinta, si
raportul final al studiului
• rapoartele inspectiilor de calitate
• Documentația pregatirii si calificarea personalului
• Rapoartele de calibrare si mentenanta a echipamentului
• Copii ale procedurilor standard din perioada studiului
Slide 9

Cercetarea medicală fundamentală în epoca

genomicii și a proteomicii

https://www.aapmr.org/quality-practice/evidence-based-medicine
https://www.cancer.gov/sites/g/files/xnrzdm211/files/styles/cgov_enlarged/public/cgov_infographic/900/100/files/nci-
precision-medicine-infographic.png?itok=aKhzhw5v

Medicina bazata pe dovezi (EBM) – abordare sistematica in rezolvarea cazurilor clinice care
presupune integrarea: (1) celor mai recente si de incredere date de cercetare, (2) expertiza
clinica, și (3) valorile pacientului.
Medicina de precizie – strategie pentru prevenirea si administrarea terapiei personalizate
care incorporeaza variabilitatea genetica individuala, variabilitatea factorilor de mediu, si
variabilitateapacientului și a medicului curant.
Slide 10

Cercetarea medicală fundamentală în epoca

genomicii și a proteomicii
⚫ Exemplu afecțiune
− LEUCEMIA MIELOIDĂ CRONICĂ

Deininger, et al. Blood 2000; 96: 3343-3356.

Leucemia mieloidă cronică este una dintre primele afectiuni care a fost definită de prezența
unei mutații recurente – cromozomul Philadelphia, t(9;22), și de asemenea este una dintre
primele afecțiuni care a beneficiat de tratament țintit – imatinib.
Slide 11

LISTĂ TERAPII ȚINTITE

https://www.mycancergenome.org/content/page/overview-of-targeted-therapies-for-cancer/
Slide 12

LISTĂ TERAPII ȚINTITE

etc…

https://www.mycancergenome.org/content/page/overview-of-targeted-therapies-for-cancer/
Slide 13

LISTĂ TERAPII ȚINTITE

https://www.mycancergenome.org/content/page/overview-of-targeted-therapies-for-cancer/
Slide 14

Genomica, Proteomica. Tipuri de studii

• GENOMICA
• Ramura biologiei moleculare care se ocupă cu studiul structurii, funcției, evoluției, și
determinarea secvenței genomului unui organism

• PROTEOMICA
• Ramura biologiei moleculare care se ocupă cu studiul intregului set de proteine a unui
sistem sau organism. Sub umbrella termanului de proteomică intră și metodele folosite
pentrudescrierea proteinelor: purificarea proteinelor, spectometrie de masa, etc.
Slide 15

Genomica, Proteomica. Tipuri de studii

• Metode de descriere a genomului
• Metode bazate pe amplificarea acizilor nucleici
• PCR classic cuplat cu electroforeză de acizi nucleici
• Real time PCR
• Droplet digital PCR
• Secvențiere: Sanger, next-generation sequencing

• Metode de citogenetică moleculară

• Multicolour-FISH
• aCGH

Toate metodele de analiza a acizilor nucleici presupune un pas de extractive a lor (AND
și/sau ARN) dintre probele biologice.
FISH – fluorescent in situ hybridization
aCGH- array comparatice genomic hybridization
Slide 16

Genomica, Proteomica. Tipuri de studii

• PCR classic cuplat cu electroforeză de acizi nucleici

Determinarea NPM1 si FLT3-ITD se realizeaza prin electroforeză capilara dupa efectuarea

unei reactii PCR clasice cu primeri marcati fluorescent. Informatia obtinuta ajuta: la
stratificarea prognostica a pacientilor cu leucemia acuta mieloida (prezenta mutatiilor FLT3-
ITD si NPM1), si la determinarea indicatiei de tratament cu inhibitor de FLT3-ITD.
Slide 17

RT-PCR cantitativ
exemplu Determinare Copii ABL1

10 000 copii plamide ABL1

1 000 copii plamide ABL1
100 copii plamide ABL1

RT-PCR cantitativ – metodă de urmărire a unor afecțiuni oncologice

Metoda catitativa pe baza pe standard – folosind plasmide cu concentratii cunoscute se
inregistreaza valoarea de Ct (cycle threshold – ciclul prag) de la care incepe se detecteaza
fluorescenta – punct in care amplificarea logarimtmica atinge brusc rezolutia aparatului de
qPCR
Slide 18

RT-PCR cantitativ
exemplu Determinare Copii ABL1

12 885 copii ABL1 din probă

Cuantificare proba clinica pe baza standardelor de plasmide folosite

Slide 19

Exemplu Determinare Copii ABL1

Plasmid
100 copii

Plasmid
1 000 copii

Plasmid
10 000 copii

Proba paceint
10 000 copii

Probe in duplicat tehnic (aceeasi proba de 2 ori) – Curba de cunatificare – determinate Excell
Slide 20

Droplet digital PCR – metoda cantitativă, cu putere superioară de cuantificare vs RT-PCR

Slide 21

Exemplu 1 Secvențiere Sanger

Mutație c.743G>A – gena TP53

Exemplu proba leucemice limfocitara cronica pentru indetificare mutatii patogene a genei
TP53.
Mutatie punctiforma prin substitutie
Slide 22

Exemplu 2 Secvențiere Sanger

Mutație c.626_627delGA gena TP53

Exemplu proba leucemice limfocitara cronica pentru indetificare mutatii patogene a genei
TP53.
Deletie 2 perechi de baze
Slide 23

P Stefaniuk, et al.
doi: 10.2147/CMAR.S283903

Tabel cu medicatia eficienta in cazul pacientilor cu leucemie limfocitara cronica si mutatie

TP53
Slide 24

Rasime Kalkan, et al. DOI: 10.3109/19396368.2015.1109007

Exemplu de FISH multicolor.

FISH – fluorescent in situ hybridization
Slide 25

Genomica, Proteomica. Tipuri de studii

Bilal Aslam, et al, https://doi.org/10.1093/chromsci/bmw167

Toate metodele de descriere a proteomului presupun o etapă anterioară de extracție a

proteinelor totale din probele biologice.
Slide 26

Genomica, Proteomica. Tipuri de studii

• Majoritatea studiilor pe subiecți umani sunt studii observaționale,

retrospective sau prospective.

• Cel mai frecvent studiile aplează fie doar la metode de analiză a genomului,
sau mai rar, asocierea dintre metode genomice și metode proteomice.
• Metodele de analiză a proteinelor sunt metode mai laborioase vs metodele genomice

• Număr mai mare de specialisți cu expertiză în metode genomice vs metode de analiză a

proteinelor
Slide 27

Studiu observațional retrospectiv

Pe un lot de pacienti de 212 femei sanatoase la momentul inrolarii in studiul observational
prospectiv Women’s Health Initiative, au fost evaluate in cadrul acestui studiu pentru riscul
de aparitie al leucemiei acute mieloide.
Concluzii: mutatiile care preced aparitia leucemiei acute mieloide pot fi detectate in sangele
periferic anterior dezvoltarii leucemiei acute mieloide.
Slide 28

Desai et al Nat Med. 2018 Jul;24(7):1015-1023

Figura 1 spectrul mutatiilor intalnite in randul celor 2 loturi de pacienti

Slide 29

Desai et al Nat Med. 2018 Jul;24(7):1015-1023

Analiza multivariata pentru evaluarea riscului de dezvoltare a leucemiei acute: cele mai
semnificative mutatiei TP53 si IDH1/2.
Slide 30

Concluzii principale
Tumorile renale cu celule clare care prezintă în stroma infiltrate cu limfocite T
CD8+ raspund la terapia cu inhibitori ai punctelor de control imun vs tumorile
care sunt CD8-

David Clark, et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.
DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.007

Studiu retrospectiv observational – combinatie metode genomice si proteomice

Slide 31

https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/types/immunotherapy/checkpoint-inhibitors
Slide 32

Rolul argumentelor morfologice şi imagistice

în cercetarea medicală
• În oncologie toate diagnosticele se bazează în principal pe criterii
morfologice
• În plus, metodele imagistice reprezintă una dintre principalele
metode de descriere a structurii și a interacțiunii dintre proteine
și/sau dintre protein și medicamente.
Slide 33

Imagine microscopie confocala care evaluaza localizarea celulara a proteinei FLT3-ITD.

Flt3-ITD se localizeaza anormal in interiorul citoplasmei.
Constructul FLT3-ITD A3 – creste expresia la nivelul suprafetei celulare
Constructul FLT3-ITD R3 – nu influenteaza semnificativ expresia la suprafata celulei
Slide 34

Cristalografie
cu raze-X

Zorn et al, DOI:10.1371/journal.pone.0121177

(A) General kinase features are illustrated on the co-crystal structure of FLT3 bound to
quizartinib. The kinase is in light blue with the P loop is shown in green, the αC helix is
shown in dark blue, and the activation loop is shown in red. (B) Structural changes in kinase
domain of FLT3 that occur upon receptor activation are illustrated. The active conformation
of FLT3 is modeled from the active c-Kit structure (PDB 1PKG).