Análisis químico instrumental

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6. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA - VISIBLE

6.1 Conceptos previos:

Radiación electromagnética: es la propagación de energía a
través del espacio sin soporte de materia, es decir, a través
de ondas producidas por la oscilación o aceleración de una
carga eléctrica (dualidad onda-partícula).

Naturaleza ondulatoria: caracterizada p o r su frecuencia

(ν) o longitud de onda (λ).

Naturaleza corpuscular, partícula: formada por fotones con

energía (E) E = h·ν, donde h es la constante de Plank.

La radiación electromagnética se puede ordenar en un

espectro que se extiende desde ondas de frecuencias muy
elevadas (longitudes de onda pequeñas; rayos gamma)
hasta frecuencias muy bajas (longitudes de onda altas; ondas
de radio). La luz UV-visible es sólo una pequeña parte del
espectro electromagnético, visible (780-380nm); UV (380-
200nm).

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Esta radiación puede ser emitida por sustancias bajo

condiciones de gran excitación, como, por ejemplo, altas
temperaturas o descargas e l é c t r i c a s . La radiación
electromagnética al incidir sobre l a materia puede sufrir los
siguientes procesos:

1. Absorción

2. Transmisión

3. Reflexión

4. Refracción

5. Dispersión

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6.2 Espectroscopia UV-Visible

Para que la radiación electromagnética incidente,

interaccione con la materia tiene que tener una λ del mismo
tamaño o menor que las dimensiones del cuerpo irradiado.
Es por ello que la radiación de la región del ultravioleta (≈ 1-
400 nm) nos permite obtener información de las transiciones
electrónicas de las moléculas.

La espectroscopia UV-Vis se basa en el análisis de la cantidad

de radiación electromagnética (en el rango de longitudes
de onda del ultravioleta y visible) que puede absorber o

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transmitir una muestra en función de la cantidad de

sustancia presente.

Todas las técnicas de absorción suponen que cuando una

radiación incide sobre una muestra se produce una
absorción parcial de esta radiación, lo que hace que se
produzca una transición entre los niveles energéticos de la
sustancia: átomo, molécula o ion, X, pasando esta al estado
excitado, X*, el resto de radiación es transmitida. Así
analizando una u otra podemos relacionar la cantidad de
especie activa presente en la muestra.

∆E = Ef -E0 = hν

∆E es característico de cada sustancia, lo que nos

proporciona un análisis cualitativo de un analito en una
muestra. Además, la cantidad de E absorbida o transmitida
es proporcional a la concentración de X con lo que también
podemos hacer un análisis cuantitativo.

La proporcionalidad ente intensidad de luz absorbida o

transmitida y la concentración de analito viene definida por
la ley de Lambert-Beer.

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6.3 FOTOCOLORIMETRIA

Introducción
Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de
radiación en la zona visible por sustancias coloreadas. En algunas
ocasiones, la muestra que deseamos determinar no posee color por sí
misma; en tal caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo de color empleando
reactivos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que interesa
estudiar.
La colorimetría y fotocolorimetría no son en realidad técnicas distintas y la
diferencia estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se
denomina colorímetro a aquellos aparatos en los que la longitud de onda con
la que vamos a trabajar se selecciona por medio de filtros ópticos; en los
fotocolorímetros o espectrofotómetros la longitud de onda se selecciona
mediante dispositivos monocromadores.
Puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la
atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación
incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas
se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este
espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la
radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación
Ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se
sitúa por encima de los 800 nm.
Así es como cada sustancia coloreada absorberá luz a determinada longitud
de onda, y la intensidad de la luz debe variar de acuerdo a la concentración
de la sustancia en la solución, el color que se observa, como luz invisible es
el producto o resultado de la luz transmitida.
Las transmisiones electrónicas que se producen en la zona de radiación
visible y de radiación ultravioleta se deben a la absorción de radiación o de
luz por determinados grupos ópticos, enlaces y grupos funcionales en el

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interior de la molécula, la longitud de onda de la absorción y la intensidad

dependerán de muchos grupos.
La longitud de onda es una medida de la energía que se necesita, para la
transmisión, su intensidad dependerá, de la probabilidad de que la transición
se produzca, cuando interaccione el sistema electrónico y la radiación, y
también del estado excitado.
- Los electrones de una molécula pueden clasificarse en cuatro tipos
diferentes:

▪ Electrones de capa cerrada, que no participan en el enlace, tienen

energía de excitación muy elevada y no contribuyen a la absorción
en las zonas de radiación visible o la radiación UV.
▪ Electrones covalentes, de enlaces simples (ê sigmas). Estos
también poseen energía de excitación, demasiadas elevadas para
contribuir a la absorción visible o UV.
▪ Electrones apareados de capa externa que no participan en el
enlace, como los de N, O, S y los alógenos, además se encuentran
unidos con menos fuerzas que los enlaces sigma y puede excitarse
con radiación visible o ultravioleta.
▪ Electrones en los orbitales ∏ (pi), en los enlaces dobles y triples.
Estos se excitan con gran facilidad, y a ellos se debe la mayoría de
espectros electrónicos de la zona de radiación visible y UV.
Estos electrones en orbitales que la molécula posee y que pueden ser vacíos
u orbitales en anti enlaces; corresponde a niveles de energía de estado
excitado ∏ o σ, por tanto, al absolverse la radiación, se produce una
transmisión electrónica a un orbital de anti enlace.

Las mediciones espectrofotométricas se basan en la ley de LAMBERT, la

cual permite cuantificar la concentración de una muestra, relacionándola con
la cantidad de luz absorbida por la misma.

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Establece que la concentración de una sustancia es directamente

proporcional a la cantidad de la luz absorbida inversamente, proporcional al
logaritmo de la luz transmitida.
A= ECL

Donde:
A= Absorción
E= Coeficiente de extinción molar
C= Concentración de la solución
L=Diámetro del tubo o celda.

LEYES DE LA ABSORCIÓN
Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida.
La proporción de luz transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula
de la siguiente manera:
T = I / I0

Donde:
I = la intensidad de luz transmitida por la muestra
I0 = la intensidad de luz incidente
La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como
porcentaje si se multiplica por 100 y sus valores están en el rango de 0 -
100%:
%T = (I / I0) x 100

La relación (I / I0), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar
de luz transmitida. En ese caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una
muestra.

La Absorbancia es adimensional, varía en el rango de 0 - ¥ y se define como:

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A = log 1/T = log10 (I0 / I)

Por sustitución se comprueba que la Absorbancia y el porcentaje de

transmitancia están relacionados mediante la siguiente expresión:
A = log (100 / %T)

A = 2 - log (% T)

LEY DE LAMBERT:
“La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de
la intensidad de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una
fracción igual de la luz que pasa a través de él¨. Esto lleva a un decaimiento
exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso óptico en la muestra,
que puede ser expresado matemáticamente como sigue:
Log10 (I0/I) = A = K b

Donde:
b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y
K es una constante del medio, que fue descifrada por Beer.

LEY DE BEER:
¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de
cromóforo que la luz atraviesa¨. La constante K, es proporcional a la
concentración de cromóforo (c): K = a c, donde a es la absortividad o
coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí misma. La
absortividad “a” es una constante que depende de:
▪ La longitud de onda de la luz incidente,
▪ La identidad de la sustancia analizada y.

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▪ Del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con

otras sustancias) La constante “a” representa la probabilidad de
absorción a una longitud de onda determinada

LEY DE LAMBERT- BEER

La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a
través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también
entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si
conocemos l y α, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir
de la cantidad de luz transmitida.
Las unidades de c y α dependen del modo en que se exprese la
concentración de la sustancia absorbente. Si la sustancia es líquida, se suele
expresar como una fracción molar. Las unidades de α son la inversa de la
longitud (por ejemplo, cm-1). En el caso de los gases, c puede ser expresada
como densidad (la longitud al cubo, por ejemplo, cm-3), en cuyo caso α es
una sección representativa de la absorción y tiene las unidades en longitud
al cuadrado (cm2, por ejemplo). Si la concentración de c está expresada en
moles por volumen, α es la absorbencia molar normalmente dada en:
(mol cm -2.)
El valor del coeficiente de absorción α varía según los materiales
absorbentes y con la longitud de onda para cada material en particular. Se
suele determinar experimentalmente. La ley tiende a no ser válida para
concentraciones muy elevadas, especialmente si el material dispersa mucho
la luz. La relación de la ley entre concentración y absorción de luz está
basada en el uso de espectroscopía para identificar sustancias.
Dónde:

A es la Absorbancia (o absorbencia)

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I0 es la intensidad de la luz incidente

I1 es la intensidad de la luz una vez ha atravesado el medio
L es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo
c es la concentración de sustancia absorbente en el medio
α es el coeficiente de absorción o la absorbancia molar de la sustancia
λ es la longitud de onda del haz de luz
k es el coeficiente de extinción

6.4 LEY DE LAMBERT- BEER

Es el resumen de dos leyes que nos permiten relacionar la fracción de

radiación absorbida con la concentración del analito y el espesor del medio.
Se cumple para cualquier proceso de absorción en cualquier zona del
espectro y se basa en que cada unidad de longitud a través de la cual pasa
la radiación absorbe la misma fracción de radiación.

6.5 ESPECTOFOTÓMETRO

Es el equipo que utilizamos para medir la absorción o transmisión de luz por

parte de una muestra. Consta de los siguientes partes:

Fuente de luz: suele ser una lámpara que emite una luz (por incandescencia
de un filamento) policromática, es decir que contiene distintas longitudes de
onda con distintas intensidades, I0.

Sistema óptico: a través de filtros, lentes y redes de difracción se focaliza el

haz de luz y se selecciona una longitud de onda fija.

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Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un espesor

conocido, normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso óptico,
sobre la que se hace incidir el haz de luz monocromática

Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza

y selecciona por longitudes de onda
Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida a
cada longitud de onda y la transforma en señal eléctrica que un ordenador
pueda procesar.

Para realizar un espectro de una muestra determinada se conecta la fuente

de luz que como ya hemos dicho emite luz policromática, a través del sistema
óptico voy irradiando la muestra con luz en un intervalo de λ y detectando
cuanta de esa luz incidente I0, es transmitida, I, por la muestra a cada λ.

RECTA DE CALIBRADO

Seleccionando la longitud de onda máxima a la que absorbe mi sustancia y

utilizando unas muestras patrón, de concentración conocida puedo

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obtener los datos de absorbancia frente a concentración, A vs [ ] ,

que debidamente representados dan lugar una recta (Ec. Lambert-Beer)
de calibrado. A través de una recta de calibrado este método nos sirve como
análisis cuantitativo de una sustancia determinada.

Para una muestra de concentración desconocida tan solo hay que medir su
absorbancia a la longitud de onda del máximo y extrapolar en la curva de
calibrado el valor de la concentración.

DEFINICION DE ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría es un método analítico que utiliza los efectos de la

interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia (átomos y
moléculas) para medir la absorción o la transmisión de luz por las sustancias.

La espectrofotometría se refiere a los métodos, cuantitativos, de análisis

químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias
químicas. Se conocen como métodos espectrofotométricos y, según sea la
radiación utilizada, como espectrofotometría de absorción visible
(colorimetría), ultravioleta, infrarroja.

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Aplicaciones de la espectrofotometría visible y ultravioleta.

• La espectrofotometría es de gran utilidad en el análisis de espacies
químicas sobre todo para el químico analítico.
• En bioquímica se utiliza por ejemplo para:
• Identificar compuestos por su espectro de absorción.
• Conocer la concentración de un compuesto en una disolución.
• Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de análisis químico.
• Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.
• El espectrofotómetro es de gran utilidad en análisis cuantitativo de
proteínas, en la determinación de ácidos nucleicos incluyendo ADN /
ARN, enzimas.

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