M.SC.

ISABEL FLORES GUZMÁN

 Aceleran No sufren
Proteinas Disminu-
la Especificas modifica-
formadas yendo la
velocidad con el cion
por energia de
de sustrato durante la
celulas activacion
reaccion reaccion
VELOCIDAD DE REACCIÓN
Cantidad de producto formado por unidad de tiempo

ENERGIA DE ACTIVACION Es la mínima energía que se necesita para iniciar una

reacción química

SUSTRATO Molécula sobre la cual actúa la enzima para formar

productos
SITIO ACTIVO Es la zona de la enzima en el cual se une el sustrato
para producir la reacción

APOENZIMA Parte proteica de la enzima, sin cofactores o grupos

prostéticos. Es catalíticamente inactivo

COFACTOR Pequeñas moléculas, orgánicas o inorgánicas que

requiere la apoenzima para ser activa
GRUPO PROSTETICO Similar al cofactor, pero esta fuertemente unido al
apoenzima

HOLOENZIMA Es la enzima activa. Formada por la adición de

cofactores o grupos prostéticos a la apoenzima
 Catalizan la reacción bajando la energía requerida para pasar de sustrato a
producto
 TEMPERATURA

 Un incremento de la temperatura de
10°C dobla la velocidad de reacción.
 Cada enzima tiene una temperatura
optima de reacción próxima a la
fisiológica (37°C)

 Temperatura optima= T en la que se obtiene la máxima actividad enzimática

 TEMPERATURA
 PH

 PH enzimas intracelulares=7.0
 PH enzimas digestivas= 1.0- 6.0
 PH enzimas de cavidad oral= 8.0 – 12.0
 CONCENTRACION DE LA ENZIMA
 CONCENTRACION DE SUSTRATO
 INHIBICION COMPETITIVA

 El inhibidor tiene una estructura similar

al sustrato
 Los dos compiten por unirse al sitio
activo de la enzima
 INHIBICION NO COMPETITIVA

 El inhibidor se une a la enzima en un

sitio diferente al sitio activo
 Esta unión ocasiona cambios en la
estructura de la enzima y no es capaz
de unirse al sustrato
 Es una enzima de la glucolisis, es un tetrámero con subunidades codificadas por
tres genes diferentes que originan tres isoenzimas:
1. Aldolasa A.- tetrámero A₄, se expresa en la mayoría de los tejidos, pero domina en
el musculo.
2. Aldolasa B.- tetrámero B₄, se expresa sobretodo en el hígado.
3. Aldolasa C.- tetrámero C₄, que se expresa en el cerebro.
 Las aldolasas A y C son enzimas constitutivas que no pueden hidrolizar la fructuosa-
1-P. En cambio, la Aldolasa B es inducible por la dieta y tiene una actividad similar
para la hidrolisis de la fructuosa-1,6-bifosfato y para la fructuosa-1-P.
 La actividad de la Aldolasa sérica se incrementa en:
- Enfermedades hepáticas
- Infarto de miocardio
- Enfermedades del musculo esquelético
- Distrofias musculares, rabdomiolisis, traumatismos musculares o
miositis
MUESTRA: -Suero o plasma.
- Evitar hemolisis (la concentración de Aldolasa en el interior de los
hematíes es 10 veces mayor que la sérica)
- Separar el suero del coagulo inmediatamente (Se libera Aldolasa
desde el interior de los hematíes y su actividad puede
incrementarse hasta un 50%)
Para su determinación se emplea una serie de reacciones acopladas que llevan a un
consumo de NADH , que puede monitorizarse de forma continua a 340 nm:

𝑨𝒍𝒅𝒐𝒍𝒂𝒔𝒂
𝐅𝐫𝐮𝐜𝐭𝐮𝐨𝐬𝐚 − 𝟏, 𝟔 − 𝐏 > 𝐃𝐢𝐡𝐢𝐝𝐫𝐨𝐱𝐢𝐚𝐜𝐞𝐭𝐨𝐧𝐚 − 𝐏 + 𝐠𝐥𝐢𝐜𝐞𝐫𝐚𝐥𝐝𝐞𝐡𝐢𝐝𝐨 − 𝟑 − 𝐏

𝑻𝒓𝒊𝒐𝒔𝒂 − 𝑷 𝒊𝒔𝒐𝒎𝒆𝒓𝒂𝒔𝒂
𝐆𝐥𝐢𝐜𝐞𝐫𝐚𝐥𝐝𝐞𝐡𝐢𝐝𝐨 − 𝟑 − 𝐏 > 𝐃𝐢𝐡𝐢𝐝𝐫𝐨𝐱𝐢𝐚𝐜𝐞𝐭𝐨𝐧𝐚 − 𝐏
𝑮𝒍𝒊𝒄𝒆𝒓𝒐𝒍 − 𝒅𝒆𝒔𝒉𝒊𝒅𝒓𝒐𝒈𝒆𝒏𝒂𝒔𝒂
𝟐 𝐝𝐢𝐡𝐢𝐝𝐫𝐨𝐱𝐢𝐚𝐜𝐞𝐭𝐨𝐧𝐚 − 𝐏 + 𝐍𝐀𝐃𝐇 + 𝟐 𝐇 + > 𝐆𝐥𝐢𝐜𝐞𝐫𝐨𝐥 − 𝟏 − 𝐏 + 𝟐𝐍𝐀𝐃⁺
 Enzima citosolica unida a estructuras miofibrilares que cataliza la fosforilacion de
creatina empleando Mg2+ formando un compuesto de alta energía para la
contracción muscular.

 ELEVACION DE CK:
- Lesiones graves del musculo esquelético
- Lesiones cardiacas ( CK-MB)
 pH optimo 6,8
 El método recomendado por la IFCC:
 Hidrolizan el almidón, glucógeno y otros oligosacáridos y polisacáridos semejantes,
dando glucosa y maltosa como productos finales de la hidrólisis.
 Es una metaloenzima que requiere Ca²⁺, pH optimo es de 6,9 – 7,0
 Se produce predominantemente en las glándulas salivales (isoenzima S o salival) y
en el páncreas exocrino (isoenzima P o pancreática). Tambien esta presente en
otros tejidos: intestino, testiculos, ovarios, trompas de falopio, pulmon, musculo y
tejido adiposo.
 En el suero se encuentran ambas isoenzimas, el 65 % de la amilasa plasmática es
de tipo S y la pancreática representa el 40-50%
 HIPERAMILASEMIA:
- Pancreatitis aguda (Incremento de mas de tres veces del limite de
referencia, a las 6-8 horas del inicio de los síntomas)
- Parotiditis
- Alteraciones gastrointestinales
- Abuso de ciertos fármacos
- Intoxicación aguda de alcohol
 SACAROGENICOS: Miden la aparición de Glucosa producida en la reacción,
mediante reacciones enzimáticas acopladas.
 CROMOGENICOS O DE FLUORESCENCIA: Miden el incremento de color o la
fluorescencia por un compuesto que se libera en la hidrolisis de un sustrato.
 La IFCC recomienda el método directo:

Amilasa
EPS-------------------> 4,6 etilideno + 4 nitrofenil

α – glucosidasa
4 nitrofenil---------------------> Glucosa + 4 nitrofenoxido

 A 37°C la formación de 4 nitrofenoxido se monitoriza cinéticamente y es

proporcional a la actividad enzimática
PROCEDIMIENTO:

BLANCO MUESTRA
Reactivo de trabajo 1ml 1ml
Incubar 3 minutos en baño de agua a 37oC
Muestra - 20 ul
• Mezclar
• Leer (340 nm) la absorbancia inicial a los 30 segundos
• Leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos
LIMITE DE REFERENCIA
α-amilasa a 37°C < 107U/L

MUESTRA:
Suero o plasma heparinizado
(No usar plasma con EDTA, quela el Ca²⁺
necesario para la actividad amilasa)
INTERFERENCIAS
 Hemólisis, la presencia de glóbulos
rojos y glóbulos blancos, ya que estos
aumenta el proceso de la glucólisis.
 Fármacos que producen un aumento y
disminución de la glucosa.
 Es una glucoproteina pequeña (48kDa), hidroliza los esteres de glicerol y
triglicéridos, y actúa en las posiciones 1 y 3 del triglicérido para producir dos ácidos
grasos y un monoglicerido.
 Actúa en la interfase grasa-agua de la emulsión que forman las sales biliares.
 Requiere el cofactor colipasa, cuya función es unir la lipasa con la grasa
emulsionada y estabilizarla para impedir que sea inactivada por las sales biliares.
 La principal fuente de actividad lipasa sérica en el páncreas, otras fuentes son la
mucosa intestinal y el tejido adiposo.
 Elevación de Lipasa:
- Pancreatitis (Incremento de mas de cinco veces del limite de
referencia dentro las 24-48 horas del inicio de los síntomas y
permanece elevada durante 5 a 7 días)
- Alteraciones del arbol biliar
- Obstrucciones pancreaticas.
 Se basa en la hidrolisis de triglicéridos que producen acidos grasos que se pueden
cuantificar posteriormente por titulación con NaOH con el uso de fenolftaleína o
determinando el descenso de turbidez mediante turbidimetria o nefelometría.

 Técnicas alternativas: Reacción Trinder.

LIMITE DE REFERENCIA:

Depende del método

LIPASA: 21-67 U/L a 37°C

MUESTRA:
Suero o plasma heparinizado
 LDH cataliza la oxidación reversible de L-lactato a piruvato, empleando NAD+. El pH
alcalino favorece el paso de lactato a piruvato, mientras que el pH acido o neutro
favorece la reacción contraria.

 ELEVACION DE LDH:
- Debido a su amplia distribución celular, su elevación es inespecífica
y ocurre en lesiones cardiacas, hepáticas, musculares, renales.
 El método optimizado de acuerdo a la Sociedad Francesa de Bioquímica clínica
(SFBC):

LDH
Piruvato + NADH + H+ ----------------> L- lactato + NAD+
 Se encuentran en todas las células y participan en el metabolismo de los aa y en la
gluconeogénesis
 Catalizan la transferencia reversible de un grupo amino desde un α-aminoácido
hasta un α-cetoacido, empleando como cofactor piridoxal-P
 ALT (GPT) es una enzima citosolica que transfiere el grupo amino desde el
glutamato hasta el piruvato, para formar α-cetoglutarato y alanina:
 AST (GOT) transfiere el grupo amino desde el glutamato y el oxalacetato para
formar α-cetoglutarato y aspartato:
 GOT/AST GPT/ALT
✓ Hígado ✓ Hígado
✓ Corazón ✓ Corazón
✓ Musculo esquelético ✓ Musculo esquelético
✓ Riñón ✓ Páncreas
✓ Páncreas ✓ Bazo
✓ Bazo ✓ Pulmón
✓ Pulmón ✓ Eritrocitos
✓ Eritrocitos
 ELEVACION DE AMINOTRANSFERASAS:
- Enfermedad inflamatoria hepática
- Esteatosis no alcohólica
- Cirrosis hepática o hepatocarcinoma (GOT>GPT)
- Colestasis extrahepatica
- Infarto de miocardio (GOT )
- Algunos medicamentos (opiáceos, antibióticos, entiepilepticos)
 El pH optimo de las reacciones esta entre 7,3 – 7,8
 La actividad de GOT se determina por las siguientes reacciones:

 La actividad de GPT se determina por las siguientes reacciones:

PROCEDIMIENTO:

BLANCO MUESTRA
Reactivo 1 800 ul 800 ul
Reactivo 2 200 ul 200 ul
Incubar 3 minutos en baño de agua a 37oC
Muestra - 100 ul
• Mezclar
• Leer (340 nm) la absorbancia inicial a los 60 segundos
• Leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos
LIMITE DE REFERENCIA GOT:

 Hombres: Hasta 37 U/L

 Mujer: Hasta 31 U/L

LIMITE DE REFERENCIA GPT:

 Hombres: Hasta 59 U/L

 Mujer: Hasta 41 U/L

MUESTRA:
Suero o plasma heparinizado
 Hidrolizan esteres de fosfato en medio alcalino, usando Mg2+

 La actividad de ALP esta presente en tejidos: Sinusoides, canaliculos biliares del

hígado, osteoblastos, epitelio intestinal, placenta, bazo, riñón.

 ELEVACION DE ALP:
- Elevada actividad osteoblastica
- Alteraciones del árbol biliar, colestasis intra-extrahepatica
 pH alcalino 10,2
 El método recomendado por la IFCC:

ALP/Mg 2+/pH 10,2

4-nitrofenilfosfato ---------------------------> 4-nitrofenoxido + fosfato
 Interviene en la transferencia de restos Υ- glutamilo a péptidos, aa. o agua.
 Se localiza en el túbulo renal, hígado, páncreas e intestino.
 Participa en el transporte de aa, transfiriendo Υ-glutamilo desde el glutatión hasta el
aa

 ELEVACION DE ALP:
- Alteraciones biliares y hepáticas
- Colestasis
- Consumo habitual de alcohol
- Fármacos: antiepilépticos, fenitoina o fenobarbital
 El método recomendado por la IFCC:

L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina ---------------->

L-γ-glutamilglicilglicina + 5-amino-2-nitrobenzoato
 Es una proteína de 17,5 kDa con hierro hémico que une oxigeno en el musculo
cardiaco y esquelético.
 Debido a su bajo peso molecular y su localización citoplasmática, aparece
rápidamente en circulación tras una lesión muscular.
 Posee una vida ,edia plasmática muy corta y se elimina por la orina.
 La mioglobina es un marcador sensible, pero poco especifico, para el infarto de
miocardio, debida a su alta concentración en el musculo esqueletico.

 ELEVACION DE MIOGLOBINA:
- Miopatias
- Traumatismo.
- Ejercicio intenso
- Trombosis
La enzima CK es un dímero compuesto de subunidades procedentes:
del músculo ( M )
del cerebro ( B ).
Se han identificado tres isoenzimas: MM,MB y BB.
La CK sérica normal constituye predominantemente la isoenzima CK-MM. En las
enfermedades del músculo esquelético, especialmente en la distrofia muscular, se
observan niveles séricos elevados de CK. La fracción CK-MB se halla principalmente
en el tejido miocárdico y su presencia se detecta, por lo general, en las 48 horas
siguientes al inicio de un infarto de miocardio. La utilización de la CK total y de la CK-
MB en el diagnóstico del infarto de miocardio es la aplicación única más importante de
la medida de la CK en química clínica.
 ELEVACION DE CK-MB:

El aumento y posterior caída de la concentración de CK-MB en determinaciones

seriadas son característicos de infarto de miocardio.
El aumento ocurre entre las 4-6 horas tras el inicio de los síntomas, y llega a su
concentración plasmática máxima a las 12-24 horas. La concentración de CK-MB
correlaciona con la extensión del infarto y con el riesgo de mortalidad a corto y largo
plazo.
 Según la Comisión Internacional de Nomenclatura Bioquímica, una unidad
enzimática (unit.U) es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1
micromol de substrato o coenzima por minuto en las condiciones determinadas de la
prueba (T°, PH y concentración de substrato óptimos)
 La unidad de medida internacional de la actividad enzimática es el katal (kat)
(numero de moles de sustrato transformados por segundo), se expresa mas
habitualmente en unidades internaciones(UI; numero de micromoles de substrato
transformados por minuto)
 La actividad catalítica no se refiere a la cantidad o al peso de la enzima, se entiende
por actividad especifica, la actividad por unidad de peso proteína, por tanto la
concentración debe expresarse en términos de UI/L por ser la de uso mas
generalizado.
 𝑲𝟏 𝑲𝟑
𝐄+𝐒 < > 𝐄−𝐒 >𝐏+𝐄
𝑲𝟐

La velocidad máxima de la reacción se alcanzara cuando toda la enzima se encuentre unida al

substrato.
CALCULOS:
BLANCO MUESTRA
Reactivo 1 800 ul 800 ul
Reactivo 2 200 ul 200 ul
Incubar 3 minutos en baño de agua a 37oC
Muestra - 100 ul
• Mezclar
• Leer (340 nm) la absorbancia inicial a los 60 segundos
• Leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos

 Calcular el promedio del incremento del incremento de la absorbancia por minuto

( ∆ Abs/min)
CALCULOS:

 Calcular el promedio del incremento del incremento de la absorbancia por minuto

( ∆ Abs/min)

U/L = ∆ Abs/min x FACTOR

EJEMPLO
Tiempo de Pre lectura (60 seg) = 1,380
Tiempo de Lectura 1 (60 seg) = 1,374
Tiempo de Lectura 2 (60 seg) =1,366
Tiempo de Lectura 3 (60 seg) = 1,343
FACTOR: 1750
U/L = ∆ Abs/min x FACTOR
1,380-1,374 = 0,006
1,374 – 1,360 = 0,008
1,366 – 1,343 = 0,023
0,006 + 0,008 + 0,023 = 0.037
∆ Abs/min= 0,037 /3 = 0,012
U/L = 0,012 x 1750
U/L = 21
EJEMPLO 2:

Tiempo de Pre lectura (60 seg) = 1,2806

Tiempo de Lectura 1 (60 seg) = 1,0373
Tiempo de Lectura 2 (60 seg) =0,7806
Tiempo de Lectura 3 (60 seg) = 0,5820
FACTOR: 1750

U/L = ∆ Abs/min x FACTOR

EJEMPLO 2:
Tiempo de Pre lectura (60 seg) = 1,2806
Tiempo de Lectura 1 (60 seg) = 1,0373
Tiempo de Lectura 2 (60 seg) =0,7806
Tiempo de Lectura 3 (60 seg) = 0,5820
FACTOR: 1750
U/L = ∆ Abs/min x FACTOR
1,2806-1,0373 = 0,2433
1,0373 – 0,7806 = 0,2567
0,7806 – 0,5820= 0,1986
0,2433+ 0,2567 + 0,1986= 0,232
∆ Abs/min= 0,6986 /3 = 0,233
U/L = 0,233 x 1750
U/L = 407