sane on ae ; ey Bren | ey - Wittig) rat - iM DDPbpp KEKE Co0000 ann) an cre CoINDICE INTRODUCCIO! Prin cipios UeOrics sessceoneresneeeeae Reglamento del laboratorio PRIMERA SESION PREPARACION DE LAS MU! EN UN MEDIO SELECTIVO STRAS ¥ CULTIVO it 1. Preparacién de la zona estéril para el trabajo microbi0l6gicd eases Hl TL. Cultivo de la muestra de agua en el medio MacConkey.. 12 TIL Manejo del material contaminado snes 13 SEGUNDA SESION AISLAMIENTO Y OBSERVACION DE "ARACTERISTICAS MACROSCOPICAS ¥ MICROSCOPICAS DE LAS ENTEROBACTERIAS session wo 1. Seleccién de las colonias desarrolladas en el agar MaeConkey. I. Resiembra de las colonias desarvolladas ene agar MaeConkey um IIL. Observacin microseépica de los cultivos seleccionados CUADRO 1. CARACTERISTICAS DE LA COLORACION DE LAS COLONIAS DE ENTEROBACTERIACEAE ENAGAR MacConkey ..... sonemnee UT CUADRO 2, RESULTADOS DE LAS OBSERVACIONES MICROSCOPIC, TERCERA SESION PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS rss 1. Pruebas de identificacién bioquimica de las cultives pures seleccionados TABLA 1, RESULTADOS ..... TL Observacién micrascépica de los cultivos purus seleecionad0s sun CUARTASESION IDENTIFICACION DE LAS ENTEROBACTERIAS: L Interpretacion de las pruebas de identificaciém bioquimi¢a sn ssess TL Manejo del material contaminado . (CUADRO 3, CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION DE LAS ENTEROBACTERIACEAE MAS COMUNES......25 CUESTIONARIO LAMINA 1 ssn BIBLIOGRAFIA....Considerando que el estudio de las enfermedades trans- misibles ocasionadas por microorganismos patégenos Constituye el objeto de transformacién del médulo Pro- cesos Celulares Fundamentales (PCF) del Tronco Comitin ional de Ciencias Biolégicas y de la Salud (TCD de CBS), el objetivo del presente texto es introducir alas alumnos de este médulo cn el manejo de. ia, tomando como modelo el aislamiento-e identificacidn de ‘enterobacterias a partir de muestras de agua. fa de cuatro se |. Preparacién de las muestras y cultivo en un medio selective, 2. Aislamiento y observacién de las caracteristicas macroscdpicas y microscépicas de las entero bacterias, 3. Prucbas bioquimicas para enterobacterias, 4. Identificacién de las enterobacterias, El objetivo de la primera sesién es que el alumno aprenda at preparar la muestra y a sembrarla por estria cruzada para obtener colonias aisladas. EI objetivo de la segunda sesién es que el alumno aprenda a observar y determinar las caracterfsticas macrosc6picas y microscépicas de las colonias aisladas, Asi como, obtener cultivos puros, El abjetive de la tercera sesién es que el alumno conezea los fundamentos de las prucbas bioquimicas y realice las que se requieren para identificar a las enterobacterias, EI objetivo de la cuarta sesién es que el alumno aprenda a interpretar las pruebas bioquimicas y finalmente identifique las enterobacterias aisladas. Es recomendable que el alumno resuelva el cues: tionario planteado al final de este documento, para auito- evaluar el logro de los resultados obtenidas a lo largo de las sesiones y colateralmente retroalimentar los conceptos bisicos revisados en el aula Ademés, la metodologia propuesta en este texto puede servir de apoyo metodoldgico para el desarrollo del trabajo de investigacién modular. Pero es necesario que el alumno consuite la bibliografia especializada cuando se trate de otro tipo de bacterias, para levar a cabo un andlisis microbioldégico adecuado. Principios teéricos Enterobacteriaceae Las Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, distribuidos en la naturaleza.en forma amplia, Se encuen. tran en el suelo, en el agua, sobre las plantas y como su nombre lo indica se-encuentran dentro del tracto intesti- nal de los seres humanos y de los animales, Se aislan con mucha frecuencia de muestras clinicas. La familia Enterobacteriaceae esti formada por aproximadamente 31 géneras y 139 especies y miles de serotipos, Algunos miembros de la familia siempre se asocian a enfermedades cuando se afslan en el hombre, por ejemplo: Shigella, Salmonella, Yersinia pestis Mientras que otros son miembros de la flora normal que producen infecciones oportunistas, por ejemplo: Esche- richia coli, Klebsiella pneumaniae, Proteus mirabilis. Las enterobacteria son causantes de un gran nii- mero de enfermedades infecciosas en el humano, entre las mas comunes se encuentran los sindromes diarreicos ¥ disentéricos, causados por cepas de Escherichia coli, Salmonella y Shigetta. La fiebre tifoidea, causada por especies de Salmonella. Se tienen casos de neumonia causados por Klebsiella pneumoniae, Especies de Pro- teus, &. cali y varios miembros del grupo Klebsiella- Enterobacter se aisian de heridas trauméticas, contami nadas con tierra 0 material vegetal o de incisiones abdominales después de una cirugia. El shock endoté- xico es una manifestacién potencialmente letal de la infeceién por enterobacterias. Pasos para una identificacién presuntiva Los pasos a seguir para determinar si una bacteria lada a partir de muestras de alguna fuente de conta- minacién, puede pertenecer a la familia Enterobacteri- aceite, son los siguientes. En primer lugar se obtiene una preparacién tefiida con Gram, que puede revelar bacilos y cocabacilos6 METONOS MASICOS MARAE AISLAMIENTO EID gramnegativos, cuyo tamafio varia de 0.5.42 um de an- cho y de 2 a 4 jam de largo. Sin embargo, Ia diferen- ciacién de especies no puede hacerse sobre la Ginica base de la morfologia can la tineién de Gram, EI segundo paso es observar las caracteris morfolégicas de In colonia cuando crece en un medio s6lido, Tipicamente, los miembros de Enienabacteriaceae producen colonias mucoides 0 secas relativamente gran- des, dependiendo del medio de crecimiento es el color de las colonias. Por ejemplo, colonias color gris opaco cen agar sangre sugiere cepas de Klebsiella pneumoniae; -colonias rojas en agar MacConkey o que tienen brillo ver- de metélico sobre agar eosina azul de metileno (EMB), indiean que la bacteria eseapaz de formar Acido a partir de la lactosa presenic en el medio. Sin embargo, la dife- renciacién de Enterobacteriaceae se basa en la presen- oausencia de diferentes enzimas-codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Eltercer y definitivo paso para una identificacién de los miembros de Enterobacteriaceae requiere un con- {junto de pruebas bioquimicas. Estas pruebas caracterizan las enzimas que dirigen el metabolismo de las bacterias. alo largo de uno o mas caminos que pueden ser detce- tados por medios especiales. Los sustratos sabre los cuales pueden reaccionar estas enzimas estin incor- porados al medio de cultivo, junto con un indicador que puede detectar Ia utilizacisn del sustrate o la presencia de productos metabdlicos especificos. Mediante Ia selec= cién de una serie de medios que midan las diferentes caracteristicas metabdlicas de los microorganismos, se puede determinar un perfil bioquimico para hacer una clasificacién de especies. Enel case de las Enterabacteriaceae, con unas pocas excepeiones, todos los. miembros demucstr: siguientes caracteristic: + Fermentadores de glucosa. + Citocromo oxidasa negativa. + Reduccién de nitrato a nitrite, Medios de aislamiento En general existen tres tipos de medios para cl aisla- miento de bacterias: los medios no selectives, los sele tivos y los de enriquecimiento. Los primeros permiten el crecimiento de cualquier microorganismo y se utilizan generalmente para un aislamiento primario. Los segundos come su nombre lo indica sirven para cl crecimiento selective de uno 0 varios tipos de bacterias. IFICACION DE ENTEROBACTERIAS DEL AGUA Los de enriquecimiento contienen suplementos que permiten aumentar el mimero de un tipo de bacterias e inhibi el crecimiente de otras. Para recuperar las bacterias de interés a partir de una muestra que puede contener una mezcla de micro- organismos, deben utilizarse medios de cultivo selec- tivos, Se debe conocer la composicién de cada férmula, la concentracién relativa y el propésito de cada com- puesto que se ineluye. Porejemplo, ¢l agar $S contiene alrededor de cinco veces la concentracién de sales biliares del agar MacConkey por lo que es més inhi- bitorio para E. coli y mas selective para la recuperacién de especies de Salmonella. Se dispone de tres tipos generales de medios para la recuperacién de Enterobacteriaceae a partir de muestras que potencialmente alojan mezelas de bacterias: 1) medio no selectivo para aislamiento primario (por ejemplo, agar sangre}: 2) agar selectivo y diferencial (por ejemplo, agar MaeConkey y agar Salmonella-Shigella) y 3) caldos de enriquecimiento (por ejemplo: caldo selenito), Medios de aislamiento selectivos para Enterobacteriaceae Existen dos medios principales para el asila selectivo de Enterobacteriaceae: el agar MacConkey y el agar cosina azul de metileno (EMB). Los agares MacConkey y EMB son solamente moderadamente inhibitorios y fueron disefiadox en un principio para wel crecimientode bacterias grampositivas, Muchas pecies de bacterias grammegativas exigentes también das, sin embargo, todas las Enterobacte riaceae crecen bien. La decisién de usar agar Mac- Conkey @ EMB es ante todo una cuestién personal, dado que las especies bacterianas que utilizan lactosa pueden ser diferenciadas por ambos medios. A continuacién se describen estos medios. Agar MacConkey: es un medio diferencial para la seleceién y recuperacién de Enterabacteriaceae y bacilos gramnegativos entéricos relacionados. Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y de algunas gramnegativas exigentes. Contiene lactosa como iinica fuente de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias que tienen distintos tonos de color rojo, debido al cambio por la produccién de acidos mixtos del colorante indicador rojo neutro (color ro- joa un pH menor de 6.8). Las colonias de bacteriasno fermentadoras de tactosa aparecen sin color y Lransparentes. Enel cuadro I, se explica de manera mas especifica el color que adquieren las colonias de tas diferentes enterobacterias, El cuadro se colocaen fa sexién dos para que el alumno lo tenga presente en el momento de hacer sus observaciones, Agar EMB: es un medio diferencial para el ai miento y deteccidn de Emterobacteriaceae 0 debacilos coliformes. Contiene colorantes anilinicos (eosina y azul de metileno), que inhiben a las bacterias grampo- sitivas y a las gramnegativas exigentes. Estos colorantes se combinan para formar un precipitado a pH sicido y de ese modo sirven ademds como indicadores de la produccién de dcido. El medio puede contener s6lo lactosa como fuente de carbone y da reacciones mis en paralelo al agar MacConkey, pero también puede estar adicionado con sacarosa y detectar fermentadores de sacarosa. Las colonias de bacterias fuertemente fermentadoras de lactosa como E. coli, se ven de un color negro verdoso con brilla metalice. Las fe tadoras débiles como Klebsiella, Enterobacter, Serra~ tia y Hafaic, producen colonias. piirpura, fermentadoras que incluyen Proteus, Salmonella y Shi- gella, producen colonias transparentes. ‘Medios de aislamiento altamente selectives para Enterobacteriaceae Los medios se hacen altamente selectivos al agregar sustancias inhibidorasen concentraciones mas altas que en agar MacConkey-o EMB. Estos medios son utilizados primariamente para inhibir el crecimiento de E. coli y otros coniformes, pero permiten el crecimiento de es- pecies de Salmonella y Shigella. Los mas cominmente izados son el agar Salmonella-Shigelta (SS), ¢l agat silosa-lisina-desoxicolate (XLD) y el agar Hektoen entérico (HE). La decisién respecto de cual de estos medios utilizar para el aislamiento de patégenos e ricos depende de Ia preferencial personal y de las ‘especies que van a ser seleccionadas. A continuaci6n se describen estos medios. Agar SS: es.un medioaltamente selectivo formulado para inhibir el crecimiento de la mayoria de las bacterias coliformes y permitir cl desarrollo de de Sai- monella y Shigella. Comtiene altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio que inhiben a todas las bacterias grampositivas y muchas gramnegativas ineli- MiTOD06 RASICOS RARA LL AISLAMIESTIO F IDENTIEICACIGN DEENEEROBACTERIAS BELAGUA 7 yendo las coliformes. La lactosa es la Gnica fuente de carbone y el roje neutro es el indicader para la detec i6n de dcido. Presenta tiosul fato de sodio como fuente de azufre, cualquier bacteria que produce HS se detecta por un precipitado negro formado con citrato férrico. Las colonias fermentadoras de lactosa aparece de color rojo, come cepas poco frecuentes de Salmonetta arizone. Las colonias de Salmonella aparecen sin color con centro negro, debido a la produccién de H,S. La especies de Shigella muestran colonias sin color y sin ennegrecimicnto Agar HE: incrementa el rendimiento de especies de Salmonella y Shigetia a partir de flora normal numerosa. Contiene alta concentracién de sales biliares que inhiben el crecimiento de todas las bacterias grampositivas y fetarda el de muchas cepas coliformes. Las bacterias producen sicidos a partir de lactosa y sacarosa, y la fucsina dcida al reaccionar con azul de timal, produce un color amarillo a pH bajo. Contiene tiosulfato de sodio como fuente de azufre y la produccién de HS se detecta mediante citrato férrico de amonio. Las bacterias fermentadoras rpidas de lactosa, como E, coli, son inhibidas moderadamente y producen colonias naranja brillantes a rosado salmén. Las colonias de Salmonella son azul-verdosas con centros negros de HS. Shigella aparece mas verde que Salmonella y las colonias palidecen hacia la periferia, Las cepas de Proteus son inhibidas en cierta forma y las colonias que desarrollan son pequefias y transparentes. Agar XILD: es menos inhibidor de bacilos coli- formes que el agar HE y fue diseftado para detectar Shigella en heces después del enriquecimientoen caldo para gramnegatives. Contiene sales biliares en cancen- tracién relativamente baja que hace que el medio sea menos selectivo que el SS y el HE. Contiene tres carbohidratos para la produccién de acidos y el indi- cador de pH es el rojo fenol. Las bacterias lisina positiva, como especies de Salmonella, producen colonias inicialmente amarillas por la utilizacién de xilosa y colonias rojas retardadas por la descar- boxilacién de la lisina. La detecci6n de H,S es similar al del agar HE. £. coli, especies de Klebsietla- Enterobacter y de Proteux producen colonias amarillas. La mayoria de las especies de Salmonella producen colonias rojas con centros negros. Shigetta, Providencia y muchas especies de Proteus no utilizan ningtin carbohidrato y producen colonias transpa- rentes. Las colonias de Citrobacter son amarillas con centro negro.{8 METODOS BASICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIICACION I Medios de enriquecimiento para Enterobacteriaceae Estos medios se utilizan para favorecer el crecimiento de ciertas especies bacterianas al mismo tiempo que inhibe el desarrollo de microorganismos no descados, Los caldos de enriquecimiento se emplean principal. mente para la recuperacién de especies de Salmonella y Shigella de muestras donde el ntimero de bacterias se encuentran en un nimero relativamente bajo. Estos medios funcionan bajo el principio de que E. cali y otras bacterias gramnegativas se mantienen en una fase de retardo prolongade por los inhibideres quimicos presentes en el caldo. Las especies Salmonella y Shigella se inhiben mucho menos, entran en una fase exponencial de crecimiento y son recuperadas mucho mas répido de las muestras. Sin embargo, después de varias horas, | medio de enriquecimiento deja de suprimir ct cre micnto de E, coli y otros mieroorganismos entéricas, Jos cuales en Gltima instancia sobrecrecen en el c1 Por lo tanto, para la recuperacin de especies de Salmonella y Shigella, se recomienda que el caklo de enrique- cimiento se subcultive antes de las 8 horas. Los dos medios de enriquecimiento mis comunes son el caldo selenito y el caldo gramnegativ (GN). Caldo Selenito: se recomienda para el aislamiento de salmonelas de muestras que tienen altas concen- traciones de bacterias mixtas como heces, orina o aguas: cloacales, que tienen altas concentraciones de bacterias mixias. El selenito de sodio inhibe £, coli y otros, bacilos coliformes, incluyendo muchas cepas de Shi- gella. El medio funciona mejor en condiciones anae- robias, Se recomienda el subcultivo dentro de las 8-12 horas a agar SS. Caldo GN: sirve para la recuperacién de especies de Salmonellery Shigella cuando estén en bajo ntimero en las muestras fecales. Contiene baja concentracién de desoxicolato por lo que es menos inhibidor para E. coli y otros.coliformes. La mayoria de las cepas de Shigella crecen bien, El desoxicolato y el eitrato que contiene el caldo, son inhibidores de bacterias grampositivas. Con- tiene una concentracién elevada de manitol, por lo-que inhibe el crecimiento de Proteus y a su vee apoya el crecimientode Salmonella y Shigella, ya que ambax son capaces de fermentar manitol. El caldo puede volverse turbie dentro de las 4-6 horas después de la inoculacién, se recomienda el subcultivo en agar HE 0 XLD dentro de este lapso, ENTEROMACTERIAS DEB. AGUA Pruebas bioquimieas para la identificacién de Enierobacteriaceae A pesar de que los medios de aislamiento primarios se basan en reacciones bioquimicas que realizan las bac- lerias en ef medio, se requiere de otros métodes para la identificacién de la especie. Estos métodos son las pruebas bioquimicas, que se basan en ta determinacién de las caracteristicas fenotipicas adicionales que reflejan el genotipo y por lo tanto, ta identidad nica de los microorganismos que se analizan. Existen una gran cantidad de pruebas y numerosos esquemas disponibles para la identificacién final de especies de Enterobacteriaceae. * Utilizacin de carbohidratos: se determina el tipo icares que pueden fermentar las bacterias liza el agar hierro triple azticar (TSI) + Produccién de catalasa: se detecta si la bacteri presenta la enzima catalasa, se requiere de H,Q,. * Produccién de indol: sirve para comprobar ta presencia de la enzima triptofanasa, se utiliza el reaetivo de Kovae o el de Ehrlich, + Rojo de metilo: identifica las especies bacterianas que producen decides fuertesa partir de glucosa, se requiere del medio Voges-Proskauer/Rojo de metilo (VP-RM) in, + Prueba de Voges-Proskauer: mide la conver de acetil-metil-carbonil o acetoina en diacetite, necesita el medio VP, * Utilizacién de citrato: detecta la capacidad de un microorganisme para utilizar eitrato de sodie como tinica fuente de carbono, se requiere el medio citrato de Simmons, + Producciénde ureasa; determina sila bacteria peo: duce la enzima ureasa, se utiliza el caldo urea + Produccién de ficide sulfhidrica: se identifica si la bacteria es capaz de liberar azufre em forma de HS a partir de aminogeides que contienen azufre w olre compuesto que contenga azufre, este se puede observar en ef medio SIM 0 TSL + Movilidad: se determina si la bacteria presenta flagelos, se puede utilizar el medio SIM 0 MIO. * Actividad de o-nitrofenil-B-D-galactopiranésido: con esta prucha se detecta la presencia de la enzima B-galactosidasa, se conoce como prueba ONPG. * Descarboxilacién de lisina, ornitina y arginina: 2a para determinar si las bacterias cont seMETHODS BASIC CS PARA FL AISLAMIENTOVE IDENTIFICACION DEENTEROBACTHRIAS BEL AGUA Q cenzimas paradescarboxilar aminosicidos especificos,esto sc observa con el caldo descarboxilasa de Moeller. + Produccién de fenilalanina desaminasa: se de- tecta la presencia de Ia enzima responsable de la desa- minaci6n oxidativa de la fenilalanina, se utiliza el agar urea de Christensen. * Reduccién de nitratos: se comprucba sila bac- teria puede reducir los nitratos en nitritos, se requiere el caldo nitrato o agar nitrato, Los fundamentos, procedimientos, asi come la inter- pretaciGn de las pruebas que se utlizarin en esta prictica experimental se describircin més adelante en las sesiones tres y cuatro. Para que el alumno los tenga presentes en el momento de llevar a cabo los experimentos y realizar las observaciones pertinentes. Seleceién de medios para un aislamiento positive de Enterobacteriaceae A continuacién se da una guia para la selecciGn de medios que pueden ser adecuados para el aislamiente de Enterobueteriaceae a partir de muestras elinicas o de otra fuente de contaminacién: 1. Sembrar la muestra en agar MacConkey 0 EMB para un aislamiento primario de todas las especies de bacilos entéricos gramnegativos. 2. En caso que se requiera un asilamiento selective de especies de Salmonella o Shigella, sermbrar en placas de agar XLD o HE. 3. Para el paso anterior, si se sospecha que la muestra tiene una baja concentracién de Salmonella y Shi- -gella, enriquecer una porcién de la muestra inocu- lando en aldo selenito 0 GN. Si se utiliza calda selenito, subcultivaren agar HE dentro de las 8 a 12 horas. $i se utiliza caldo GN, subcultivar dentro de las d horas. 4. Seleccionar colonias sospechosas para la identi- ficacién bioquimica o para pruebas serolégicas.10. MIETODOS BASICOS PARA EL. AISLAMIENTO [: IBENTIFICACION DE REGLAMENTO DEL LABORATORIO |, Presentarse puntualmente en el horario y Laboratorio indicado por la Coordinacién de Laboratorio. 2, Leer la prictica antes de comenzar cada sesién, 3. Es obligatorio presentarse con bata de algadén de manga larga, cubrebocas y guantes de hule létex, ere- dencial actualizada, el material y equipo solicitado en cada sesion. 4, Recogerse el cabello antes de entrar al laboratoria, 5. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. 6, Dejar tinicamente lo que se va au de trabajo, 7. Limpiar y desinfectar las superficie de ln mesa de tra- bajo antes de iniciar y al que se deberd traer en todas las sesiones: Solucién desinfectante (hipoclorito de sodie al 10% o benzal diluido 1:10), toallas de papel secante (sanitas), una franela, detergente, un recipiente para preparar jabo- nadura y una esponja. 8. Presentarse a solicitar el material requerido en los interlaboratorios con Ia credencial actualizada. 9. El material entregado deberd ser revisade por los alumnos asegurdndose que se encuentre en buenas condiciones y se devolverd en las mismas condiciones. ENTEROMACTERIAS DEL AGUA 10. En caso de deterioro de dicho material, deberi ser restituido a la brevedad posible por parte de los alumnos de dicho grupo. 11. Informar al profesor de manera inmediata cualquier accidente de trabajo. 12. Esta prohibido fumar e ingerir alimentos dentro del laboratorio, 13. Todo el material que se va a incubar debe quedar cetiquetadocon los siguientes datos: J) Grupo; 2) Equipo; 3) Fecha y-4) Tipo de Material, Por lo que deberis traer masking-tape y plumén de tinta indeleble de punta delgada. Al finalizar la prictica, colocar el material en los recipientes para desecho de material biolégico 0 esterilizacién, de acuerdocon las instrucciones del pro- fesor. El material que se deseche debe quedar libre de ‘etiquetas o marcas, 14, Colocar las pipetas usadas sin fa trampa de algodn y con la punta hacia abajo en recipientes de hhipa- Clorito de sodio comercial diluido 1:10. 15. Depositar dentro de la bolsa de plistico especificada para desecho de productos biolégicos de color ROJO, el material de desecho de acuerdo con las instruc- ciones del profesor. Esnecesario apegarse al desarroll una de las sesiones, sspecificadoen cadaPRIMERA ON PREPARACION DE LAS MUESTRAS Y CULTIVO EN UN MEDIO SELECTIVO Contenido L. Prepar biclégico. I. Cultivo de fa muestra de agua en el medio Mac- Conkey. TIL. Manejo de mate n de La zona estérill para trabajo micro- ial comtaminado, Material y medios por equipo el interlaboratorio de cristaleria y reactivos ajax de agar MacConkey B) | Tubo estéril con tapén de rosca 0 de algodén de 16x150 mm C) | Pipeta estéril de 10 mL D) 2 Pipetas estériles de 1 mL E) | Propipeta o pipeteador manual F) | Mechero G) | Gradilla H) | Pipeta Pasteur 1) 250 mL de solucién salina isot ica (SSD, esteril, ‘Solicitar en el interlaboratorio de equipo | Microscopie por equipo de trabajo ‘Cada equipo debe traer en esta sesién A) Muestra de agua para el aislamiento de bacterias. En un frasco de vidrio incoloro de boca ancha y con tapén de rosea, colectar un volumen aproximado: de 50 ml. de agua de cualquiera de las siguientes fuentes: desagiie, riego de hortalizas, remojo de verduras, lavado de algtin puesto de tacos, jugos, mariseos 0 tortas, El maximo tiempo transcurrida después de colectar el agua, ex de 6 horas y debe guardarse a 4° C. B) 2 Asas bacteriolégicas C}5 Hisopos est Dy 6 Portaobjetos E) 6 Cubreobjetos F) Cubrebocas, G) Cerillos 0 encendedor | ASL AMIENTO £ IDENTIFICACKN DEENTEROBACTERIAS DELL AGUA || H) Material para preparar la.zona estéril para trabajo microbiolégico y para etiquetar las muestras, Soluci6n desinfectante preparada: Taer cualquiera de las siguientes soluciones, perfec- tamente etiquetadas: A) Hipoclorito de sodio al 10%: mezelar 100 ml de hipoclorito de sodio (clore comercial), com 900 mL de agua, envasar en frasco de plistico de boca angosta muy bien cerrado eon tuna tapa de rosea perfectamente etiquetado. B) Solucién de benzal diluida I:10.con agua y enva- sada en un Frasco ambar eon tapén de rosea, Perfectamente etiquetado, Una de las partes mas importantes del trabajo micto- bbiolégico es realizar tados los procedimientos en una zonade trabajaestéril, ya que extudi se trate de: pro vecdent dela propia persona que realiz celensayo. Por loqueesnecesario levara cabouuna adecuada preparacién de la zona de trabajo. En general.el control dé-los microonganismos se puede ilevara cabo limitando el erecimiento microbiano, proceso bien destruyendo los microorganismos qe es la muerte geliminacin de todos los organismos viables de un medio. Los: EGE ata aia > hiben el crerimniento bacteriano con hewterioctittens, Para realizar este control se utilizan E00 (AGMA 0 mictodos de este: Ge sealers deben garantizar a le todos los i presentesem la sustancia 0 material esterilizado! sinc pracy ‘Son productos quimieos que ‘matan 2 los microorganismos y se utilizan sobre objetos inanimados. En cambio los antisépticos son sustancias, quimicas que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismosy noon losuficientemente téxicos para. seraplicadas a las tejidos vivos.TINIE 2. METTODOS MASICOS PARA HLLAISLANMNTO 11D yee puede empl primerose utilizan homos y en el segundo autocta Sic cD 1 tem 170°C por F si la temperatura es meno el tiempo 1 esterilizacién por moclave es ef método mis utilizado en los laboratorios de micro biologia, La esterilizaciGn se produce cuando él vapor de agua a presién que se genera, desnaturali destruyende los microorga ave requiere una tempers Ao ‘rocedimiento: ra las proteinas, ecutive Ta puedes delimi EBD: centro det proximada de: mecheros 8 retirando estar sacs breboeas y 1 del laboraterio n esta direa para no-contam con miieroarganismos del ambiente ‘Cuando trabajes con cir es recomend! ero ya que estiin hechos de un mate- rial ficilmente inflamable y puedes sut aduras. Es importante que LEAS CON CUIDADO las s de proceder at cultivar fas buet presentes en el agua: 1 NUNCA pipetees con pipetas que no te algodén, inclusive para medir el agua y salina estéril. 2. Utiliza fa propipeta o pipetador manual para hacer tus mediciones, 2. Debes pasar por tapa de los tubes al abrirlos y cerrarlas. 3. Manipula tode el dentro del de 20 cm de ditimetro alrededor de Ia flama del mechero. solucién fla na del mechero boca 4. Debes desenvolver de Jas pipetas estériles por el extrema boquilla © por ro, dentro del zirea de 20 em de disimetro alrededor de la flaima del mechero. Cuando se irabaja con muestras com je GERD. ecomendables ss. Esto nos : bajar con i TTT para realizar cuentas viables, asf como un adecuado QR. Un le bacterias Gia. ya que el néimero es tan grande qui uieden jc igual forma, en u dilucién muy grande el ntimero de bacteri an bajo na dilucis QE clecir e inclusive yal En este caso sélo se re A. Preparacién de uno QOD 1m estéril eon tapsn de 2D covosamens asc mesic 3. Con una pipeta de 10 mL estéri bo de GEE (Manisa LA SOLUCION F CONDICIONE 4.Con Antes de sembrar Ia muestra de agua diluciGn en el agar MacConkey par estria cruzada, es importante que leas estas notas: 1 psu defect \eica se SS : Sapa Seamuestea sin diluir y otra perfectamente I: 3. Antes de realezar la siembrq Tinta inde ‘on unk mareador de ti i JUNCAEN La TAPY‘Coloca los siguientes datos: GSD i zodén de un hisopo estéril con Ia ontenido en forma circularcerca de un borde de una cajacde agar jer Figura La 2 a hacteriolbgica vive en la flama del mechero, para enfriar, sumerge dicha asa en-el borde del agar durante unos segundos yuna vez fria pracede a estriar el inéculo-en el primer ccuadrante de la caja Petri. Ver Figura Ib. 3. Esteriliza nuevamente elasa como se indicéen el pirrafo anterior, deja enfriar y estria el segundo cuadrante de la ‘caja empezando en uno de losextremos de la estria del primer cuadrante. Ver Figura te, 4. Flamea ef asa otra ver, deja enfriar y esiria el tercer -cuadrante, comenzando en el extremo de la estria del segundo cuadrante, donde no haya cruce con el estriado inicial. Ver Figura 1d ISL AMIESTOE IDENTIFICACION DI: ENTEROBACTERIAS 5. Flamea el asa de nuevo, deja enfriar y estria el dhtimo cuadrante, comenzando en el extreme de la estria det terver-cuadrante donde no haya cruce con el segundo estriado. Ver Figura Le. 6 QHGMBMBY na una estefa at 1 TD caja y después esteriliza el asa, Ver Figut 7. Coloca la tapa y fijala a la base de la caja con dos pedacitos de masking-tape calocados en los extremos opuestos. NO DEBES SELLAR LA PERIFERIA DELASCAIAS. 9, Revisa que pusiste la etiqueta a las cajas sefialando el grupo, tumo, No. de equipo y fecha. 10. GRRE. ce iia si =2 Si te " Después de concluir la sesidn es necesario que cumplas can las siguientes indicaciones: Figura 1. Siembra por estria cruzada14 miiro00 WAsICOS PAR HE AISLAMIENEO E IDERTEFICACION | GEESE PLOAOENOT al 10% 0 benzal en el frasco que contiene la muestra de agua que colcctaste y GUGSTIBGRG ve usaste para preparar las soluciones. De} SEE Knimo 20 minutos y vacia cl i ‘oi iL _ CONTAMINADO EN EL LABORATORIO. 2. Eageaga >< ipetas que usaste con la solueién de ipoctorite de Sodio 0 ben za! GSAT 3. GHREEID: lo hisopos y todo el material desechable on i SERED SH icte na vez hecho esto, el desecho biolégico para Mjabsn y desinfectarla con la solucién de hipoclorito de sodio o benzal. 5. Una vez que utilices la solucién de hipoclorito de sodio 31 10% seb: EESTI paulatinamente pierde su actividad des es recomendabl s ventaja reside en que su costo es més bajo en relaci6n con el benzal. TEROWACTEREAS DELAGUA, SEGUNDA SESION AISLAMIENTO Y¥ OBSERVACION DE LAS CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS ¥ MICROSCOPICAS DE LAS ENTEROBACTERIAS Contenido I, Seleccisn de colonias desarrolladas en el agar MacConkey. IL. Resiembra de las colonias desarrolladas en el agar MacConkey para obtener cultivo puro de bacterias. TIL, Observacién microscépica de lose ros sclec- cionados. Material, medias, colorantes ¥ microscopios por equipo ‘Solicitar en el interlaboratorio de cristaleria y reactivos A) 2 Cajas de agar MacConkey. B) I Mechero. C) I Matraz. con soluciin salina isotdnica estéril, D) 2 Juegos para tineién de Gram: cristal violeta, lugol, alcoho|-acetona, safranina, (POR GRUPO). E) | Puente para tincién. F) | Frasco gotera con aceite de inmersis G) | Pipeta Pasteur est¢ril (para la solucién salina isot6nica). Cada equipo deberd tracer en esta sesign A) I Asa bacteriolgica B) Toallas de papel secante (sanitas) C) | Bulbo de hule para pipeta Pasteur D) 10 Portaobjetos E) 10 Cubreobjetos F) Cerillos o encendedor G) Material para preparar zona estéril para trabajo microbioldgico y para etiquetar Las @QISHEEMIER- ada especie bacteriana s y se pucden @HSRERED segtin su ial, ya sen on. Para estudiarbos eanctrisi¢:s (iio: CGENSIGABED spree, ops de una bacter bas se ealicen — @GNSISTENGTAD ra, mensitranoss, gelatinosa, mucosa vo Pr ama butirosa, ada cofonit se neva que AGREED de Ins colonias seleceionadas del agar MaeConkey o coloni:t GHHUEMMSOIMEPSMEEED anota tus observaciones en la Tabla I de Resultados eS A continu: risticas de una colonia bs GERM Piittiforive, circular, imegutar, miceloide, ti suits, rzoide UID snr ct aoetsoen ons (Grande snc pequeita, puntiforme! i, rugosa, cerebriforme, en anillos wn algunas de las caracte- presenten lassiguientes caructeristi concéntricos. mbonada, Ver el Cuadro 1, para conocer el significado. de 1a colonia reportada, Asi camo, el posible tipo de nterobuacteria con el que estas trabajando. GOB e110 cl medion GH encuentras de tos tres tipos de colonia: wot. SERED (inicamentc GRATED16 METODOS B4SICOS PARA HAISLAMIENTO I: IDENTIFICACINN DE ENTEROBACTERIAS DELAGUA. Cundro 1. Caracteristicas de la coloracién de las colonias de Enterobacteriaceae en agar MacConkey Pe Crate Fermentadores Escherichia Colonias a GD “intensos de actos tnivroboree | OHM Rak eB prbepm: Klebsiella Fermentadores lentos Citrobacter Colonias levemente' « débiles de lactosa Providencia Normalment después Serratia de 24 hora: Hafnia entre las 24 y 48 horas de incubacién CD | Pies Colonia RGSS tra sparentes ‘Nola: ciertas especies atipicas | Salmanetla A excepcién de ciertas especies pueden fermentar lactosa. Shigella Edwarsiella Es imy inte que Las GGIGHEEDSe encuent borde de la caja de agar MacConkey, en donde se GERD oe ccc en Hevara a cabo la resiembra. Ver Figura 2b. caso de que éstas.tiltimas se encuentren muy cercanas unas 3. Una vex depositada la colonia en el medio decultivo, de otras, ¢s preferible colectarlas con el asa bacteriolégica el arrastre de! recta estéril y frfa, para disminuir el riesgo de contaminar indo una estria muy cerrada y conforme vayas la colonia seleccionada con la i finalizando el arrastrede las bacterias, abre paulatina- ciGn macrosedpica de mente la estria hasta que all finalizar esté totalm: acuerdo al siguiente método. abierta, Ver Figura 2c. M1. Resiembra de las cotonias desarrallidas 1. Divide cada caja para resiembra de agar MacCankey en 3 secciones (marca la base de la caja por fuera con un plum én), GUE sec in LTE “MI Observacién microseépica de |a colonia @OFESPOIRERIENV Figura 2a, “de los eultivos seleccionados Dentro de Ia zona estéril para trabajo microbiolégico: Un procedimiento itil para el examen de muestras es. epriradas a partir de 2. Calienta el asa al rojo vivo en la flama del mechero y | TARTAR, para enfriarla sumérgela en el medio de cultive _ pendiendo del tipo de microorganismos o parte del mismo cercanoal borde de la caja de Petri. Con el asaestéril que sedesee observar. Peer a eT y firia colecta Ia COLONIA AISLADA desarrollada en la caja de agar MacConkey del cultivo primario y deponaien ia session que te comesponde cere UNE SSS ee SSMETODOS BASICOS NARA HL ASL AMEND ‘Tincién de Gram La coloracién de Gram, descubierta por Hans Christian Gram, es una tincidn diferencs Esta tenica se basa en las diferencias estructurales de ta pared celular de las bacterias. En base a esta tincién se divide a la mayoria de las bacterias en dos grupos, bacterias grampositivas y bact ANGHEEIMGIERMMolcta de genciana) que aetiia cons un el cual penetra a Ia célul osteriormente s¢ adiciona yedo que sirve como mordiente para formar un oe aa me." ‘complejos son retenidos por Ia pat fas celulas grampositivas, avin después del tratamiento con el decolorante orgéinico (al- cohol-acetona), debido a la gruesa capa de pey glucano y deidos teicaicos de que pared celular, Las bacterias gramnegativas pierden la coloracién primaria debido a que los complejos yodo-cristal violeta salen de la c¢lula cuando los solventes orpnicos (alcohol-acetena), aumentan la permeabilidad, constitu Le tuna gran cantidad de lipidos. El colorant ‘contraste, utilizado bacterias geamnegativas, rvarse con el micrascopii debido a ue ahora el interior de la célula QHD Antes de llevar a cabo la observacién microscépica de los cultivos puros seleccionados ¢s necesario que leas con cuidados las siguientes indicaciones: «) GRIGG con agua y jabsn, desen- grisaloscon unas gotas de alcohol-acetona y séealos con una toalla de papel sii sino estén PERFECTAMENTE! IE GRASANNOBE OBTIENE UN BUEN FROTIS y con ello se dificulta la observacién microscépica de las bacterias. 5) Para preparar el frotis es necesario que recojas. x6 una para poder observar con elaridad en el microscopio Ia forma y la coloracién de las bact ©) Es recomendable q dor cara del portaobjetos jf. evitar errores al manipularlo. esté fijadoe! frotts con un QO METS UNTIFICACWON DE ENTEROBACTERIAS DEL AGUA 7 dpRecuerda qt aes de ara obtener una buena tincis tuna gota odos de cada uno de elloses mas que su c) SOMOOUBSUASHIENTESIOIED CUERPO DEL. MICROSCOPIO CONLAS MANOS 3520155 CON LOS COLORANTES. necesario 2c CERISE con iente s gramnegativas, El procedimicn(o GG ) No olvides trabajar dentro de GEE g) Coloca una gotita d@3@EEEBril cn un portaobjetos y con ayuda de! asa bacteriolégica estéril y fra, susperide una pequeila porcién del cultivo puro que resembraste en el agal mezcla homogénea. j/CRRTATTEPESASSALD asa hasta formar una pelicula fina y uniforme. ') GURIRAREGIEIED pas.indolo por ta flama det mechero, orientando: hacia arriba Ia cara del porta- objetos donde preparaste el frotis. El maximo calor aplicado debe ser soportable sobre el dorso de la mano, de la cara del partaobjetos orientada hacia la flama, para evitar la caleinacidin de las bacterias. jy Realiza la tincidn de Gram como a continuacién se describe. | Cubre el frotis con cristal violeta durante | minuto. 2, RETRTENG orate ATEN SAUCSAE GEOL 3. Qubrerefrotis con lugol durante | minuto. 4, Escurre y elimina el exceso de lugol con agua. Realiza tun goteo suave y continuo del agua de la Have para evitar destavamiento de las bacterias fijadas sobre el portaobjetos. 5. Deja resbalar por goteo lento-a partir de uno de los extremos del portaabjetos la mezcla de aleohol- acetona hasta que no se desprenda el colorante {aproximadamente 30 seg.) y lava inmediatamente con agua como s¢ indies en el punto No. 4, 6. Escurre las gotas de agua y cubre la preparacién eon safranina durante | minute y lava com agua de Ia Mave (punto No. 4).18 METODOS RASICOS PARA H AISLAMILNTO E IDENTIVICACION DE ENTEROBACTERIAS DLL AGUA 7, Deja secar la preparacién al aire perfectamente puesto que si quedan gotas de agua, se dificulta la observacién de las bacterias al aadir el aceite de inmersin sobre fa preparacién. No utilices papel para secar la preparacién. 8. Observa la preparacidncon el objetivo 10x éseco débil) y después con el de 40x (seco fuerte). 9. Coloca una gota de aceite de inmersién sobre la peepa- racién y obsérvala con cl objetivo 100x (inmersién), Anota tus observaciones en el Cuadro 2, Resultados de las Observaciones Microscépicas. Al terminar Ia sesién L.Lava y desinfeeta la mesa con la salucién de hipoclorito de sodie al 10% 0 con benzal diluido 1:10. 2. Recoge y deposita la basura.en el cesto destinado para tal fin, 3. Guarda en el refrigerador las cajas de Agar MacConkey ‘en las que realizaste el cultivo primario de las bacterias aisladas del agua Cuadro 2. Resultado de las observaciones microseépieas Hacer esquema de las preparaciones observadas con la tincién de Gram: Seco Debil: 10x Seco Fuerte 40x Inmersidn 100% OO © Seco Débil: 10x Seco Fuerte 40x. Inmersién 100% OO O Seco Débil: 10s Seco Fuerte 40x Inmersién 100% OOOTERCERA SESION PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS CONTENIDO. 1. Pruebas de identificacién biequimica de lox cultivos puras seleccion: os. Solicita A) B) | Mechero C) | Matraz con soluciGn salina isot6nica estéril (SSI) D) 2 Juegos p. n de Gram: cristal violeta, Ke para tingién ) | Frasce gotero con aceite de inn G) | Pipeta Pasteur esté isotdnica estéril) H) 8 Tiras de: papel filtro Whatman No.1 de 2x3 em esti 1) 1 Frasco gotero émbar can reactive para la prueba dle onidas J) | Frasco gotero dimbar con agua oxigenada al 3% K) 3 Tubos 13x 1mm con medio agar Hierro Triple i (TSI) (Medio inclinado, color anaranjado) L) 3 Tubos 13x 100mm con Caldo Urea (Color rosa) M3 Tubos de 13x1(Ximm con medio inclinado de agar Citrato de Simmons (Medio inelinade color verde) N) 3 tubos de 13x100mm con caldo semisélido de SIM (Color ambar) ©) 6 tubos de 13x100mm con caldo VP-RM (Voges Proskauer-Rojo de Metilo) (Color émbar) Solicitar en el interlaboratario de equipa | Microscopie por equipo Cada equipo debe traer en esta sesién A) Toallas de papel secante (sanitas) B) | Bulbo de hule para pipeta Pasteur C) 10 Portaobjetos ) 10 Cabieoty ) 1 Asa bacteriolég 1 Cerillos 0 encende G) Mt para preparar zona estéril para trabajo microbiolégico, plumén, marskiarg-cepe. Marea todos los tubos que vas a utilizar poniendo ‘una etiqueta con los siguientes datos: muestra y fecha, 1. Pruebas de identificacién bioquimica de [as cultivos puras seleceionadas L. Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que descompone el perdxide de hidrSgeno (H,O,) en lacatalasaesun hemoglobina, excepto ql la molécula estin en estado oxidado ( den lugar de reduido (Fe"*). Excluyendo a los estreptococos. lat fa de las bacterias descompone el HO, con ad 1 salvo qi idmigeno se forma camo uno de los productos f abplismo oxidative 0 aerébico de los hidratos de asc lo transforma en agua y oxigeno: 4,0, —+ no+ot catalasa Procedimiento gotas de alcoho tan esta prueba, te con una toalla de pel secante antesde realizar Realiza la prueba de La catalasa a los cultivas puras, de acuerdo a las siguientes indicaciones: Coloca sobre el portanbjetacon el ase bacterialégi porciGn del cultive puiro de las bacteria del medio Ma Conkey, posteriormente agrega una gotita deagua oxige- nada sobre la muestra, Las bacterias que son catalasa positiva fiberan oxigeno del agua oxigenada, cuya pre liberacién de pequetias bux hegativas no produ HL adicionarel agua oxigenads, Para evitar falsos positivos, nunca toques el agua oxigenada con el asa. Ano tus resultados en la Tabla t de Resultados.20) METODOS BASICOS HARA UL. AISL AMIN [ IDENTIFICACION DE ENTUROWACTERIAS BEL AGUA TABLA 1. RESULTADOS racteristicas de las bacterias observadas & COLONIA FORMA COLOR EVACION BORDE, CONSISTENCIA, TAMANO. OPACIDAD SUPERFICIE TINCION DE GRAM MORFOLOGIA MICROSCOPICA PRUEBAS BIOQUIMICAS CATALASA TACTOSA, OXIDASA. UREA SACAROSA MOVILIDAD, VOGES PROSKAUF! CITRATO DE SIMMONS: Prueba de oxida isa Lox ya transfiriendo eleetrone: citocromos son hemoprot 2s que contienen hierro abit de la cadena respiratoria. oxigeno, con formacidn de en los 10S AEFOBIOS ¥ a os, fa prueba sirve para identificar a aquellos organismos que carecen erabios obligados. La pruebaade ka liza cients reac ps colorantes, idrato de p-fenilendiamina, que aetdan ceptores antificiales de electrones, sustituyendo al oxigeno, es incelora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxigeno almosférice se ‘oxida, formando azul de indofenol. Todas las entero bacterias dan una reaccidn negativa, Pseudomana y Nei seria son posit jan comoel dltimo e: cilocrome oxidasa ul como como Procedimiento ndelcultivo man No.1 Con el axa ba Sgica colecta una pore puro y extiéndelo sobre un papel filtro Wha estéril de 2x3 em y sobre ésie adiciona dos gotas del reactive para la prueba de oxi Las ba oxid: positiv: producen un color negro © azul intenso en [0 segundos, La reaceién se considera retardada si ecurre entre los 10 y 60 segundos posteriores. Si se observa desarrollo de color después de los 60 segundos fa prueba se considera negativa, Para cevitar falsos positives es necesario que sostengas con las pinzas de discecidn, la tira de papet filtro estéril de uno de las extremos, evitande locar el centro de la misma, Anota tus resultadas en la Tabla I de Resultados. ige 2 cultivos puros del agar MacConkey, uno vo (colonias rojas) y el otro coloras}, que hayan resultado positivos a la prueba de catalasa (+) y negativos ala actos, prueba de oxidasa (-). Esto es porque todas las enterobacteri S presentan estas caracteristicas. ites pruebas de identi-Antes de efectuar las siguientes pruebas de identificacin es necesario que tomes en cuenta las siguientes indicaciones: A. Un juego de bioguimicas consiste en: | tubo con medio semisélido de SIM de calor dmbar, 2 tubos con caldo VP-RM de color Ambar, I tubo con medio inclinade de Citrato de Simmons de color verde, | ‘tubo con medio inclinado de agar hierro triple azdear de color naranja y 1 tuba con caldo urea de color rosa pallid. B. Unode los juegos de bioguimicas corresponde-a los, controles negativos o testiges de las pruebas. Estos. ccontroles se preparan introduciendoe! asa bacteriologica estéril y fria, sin muestra. Incuba estos tubos sin sembrar junto-eon los tubos inoculadosa 37° C durante 24 horas. C. Emplea los dos juegos de bioquimicas nestantes para cada cultivo puro seleccionado. D. No olvides trabajar dentro del area estéril de 20. em de didmetro alrededor de la flama del mechero, 3. Voges-Proskauer / Rojo de Metilo La reaccién de Voges-Proskauer recibe el nombre de dos microbiGlogos que trabajaron a comienzas del siglo xx, siendo los primerosen observar la reaceién de color rojo producida en medios de cultive apropiados por tratamiento con hidréxide de potasio (KOH). Poste- riormente se descubrié que el principio active formado por el metabolismo bacteriano es el acetilmetil-car- binol, un producto de la via butilenglicol. El dcido pirdvico, componente fundamental, formado por la degradacién fermentativa de la glucosa, es meta- bolizado luego a través de varias vias; una de las cuales Heva a la produccién de acetoina (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reaceién neutra. Algunos organismos como los del grupo Kiebsiella-Enterobacter producen acctoina como principal subproducta de la fermen- tacidn de la glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de oxigeno atmosférico xy de hidréxido de potasio al 40%, la acetoina se convierte en diacetilo y e! a-nafiol acta como catalizador para revelar el color rojo. La prueba de Rojo de Metilo determina la produccién de dcide y se requiere de organismos que produzcan fcidos orginicos (Lictico, aceético, fdrmico), a partir de _ METAS BASICOS PARA Ba. AISLAMIENT IDESTINICACION DME ESTTEROACTERIAS DEL.AGUA 2] la glucosa por Ia via de la fermentacion écida, El desarrollo de un color rojo estable en el medio indica la praduceién de Acido suficiente como para mantener ¢| pH a 4.4 0 menos, el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo indica una prucba negativa. Procedimiento Conel asa bacteriolégica tomaun inoculo denso del cultivo puro y resuspéndelo en das tubos de caldo VP-RM. (Yoges-Proskauer/Rojo de Metilo). Es importante que recuerdes que son dos tubos por colonia aislada. Deja incubar los dos tubos a 37° C durante 24 horas. 4, Citrato de Simmons El citrato de sodio es una sal del éeido citrieo, un compuesto orginico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de lox Acidos tricarboxilicos (Ciclo de Krebs), algunas bacterias, obtienen energia por via alterna de la fermentacién de los hidratos de carbono a través de la utilizacién del citrato, como fuente tiniea de carbono, Por supueste cualquier medio para detectar la utilizacién del citrato, debe estar desprovisto de proteinas y de hidratos de carbono. La utilizacién del citrato por una bacteria se detecta por la formacién de productos alcalinos. El medio inclu- ye citrato de sodio, como tinica fuente de carbone y fosfato deamonio como tinica fuente de nitrégeno, Las bacterias que pueden utilizar citrato, también pueden extract el nitrégeno de ta sal de amonio, con produceién de amoniaco, llevando a la alcalinizaci6n del medio por la conversién del NH”* en hidroxido de amonio (NH,OH). El azul de bromotimol es amarillo a pH menor de 6 y azul a pH mayor dé 7.6, el cual es el indicador, Procedimiento Con el asa bacteriolégica toma un inoculo ligero del cultivo puro y siémbralo en forma de una estria abierta sobre ef dea inclinads del medio inclinado de Citrato de Simmons. No punciones la capa profunda del medio puesto que sirve de control de color. Deja ineubar el tubo a 37° C durante 24 horas. 5. Indol EI indol es uno de los productos de degradacién del metabolismo del aminodcido triptéfano. Las bacteriasMIETODOS BASIOOS PARA I AISLAMIENTO H IDENTISICACION DME ENTEROWACTESIAS DE AGRA que poseen la enzima triptofanasa son capaces de utilizar tript6fano produciendo indol, cide pinivicey amoniaco (NH, ), Bl indol puede detectarse en un medio de prueba can triptéfano observando Ia aparicidn de colar rojo luego de agregar una solucién que contiene p-dime aminobenzaldehido (reactive de Kova). Procedimiento Conel asa bacteriotégica recta, colecta un inactslo poco denso del cultivo puro de bacterias y siémbralo por picadura en ef medio SIM introduciendo dicho inoculo por el centro y a3 mm del fondo del tubo y extrae el asa siguiendo Ia estria formada al picar el medio. Incuba el tubo a 37° C durante 24 horas. Los microorganismos que poseen Ia enzima ureasa hidrolizan urea, liberan amoniaco y producen un color rojo-rosado en el medio, Procedimiento Con el.asa bacteriolégica eoleeta un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y siémbralo en el caldo urea, Incuba el tubo a 37°C durante 24 horas. 7. Agar Hierro Triple Azicar (TSI) El principio de la fermentacién de hidratos de carbono se basa en los estudios de Pasteur en bacterias y levaduras, ‘que afirman que la accidn de muchas especies de micro- ‘organismos sobre su sustrato de hidrato de carbono da como resultado la acidificacién del medio. La utilizacion de los carbohidrates se puede determinar con cl agar Hierro Triple Azticar (TSI. El medio conticne tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa, se determina cucil de los tres puede ser fermentado por la bacteria. E: la prdctica, microorganismos que son incapaces de fermemtar glucosa por [o comin se detectan por las feacciones que producen en el agar Hierro Triple Auticar, Una reaceién de pico de flauta alcalino! profundidad alcalina (sin cambio), en este medio in- diea ausencia de produccién de dcido y una incapacidad del microorganismo para fermentar la glucosa y otros hidratos de carbono presentes. Esta sola reaccién es suficiente paraexeluir un microorganismo de ka familia Enterabacteriaceae. Procedimiento ‘Con el asa bacteriolégica recta, colecta un inécule poco denso: del cultive puro de bacterias y siémbralo por picaduraen cl fondo en forma de estriaen la superficie. Incuba el tubo a 37° € durante 24 horas. 1. Observacién micrascépica de los cultivas puros seleccionados Realizar la Tincién de Gram de los cultivos puros (resiembra de las colonias desarralladas en agar Mac- Conkey), igual queen la parte ai de la segunda sesign, terminar Ia sesién es importante que: |, Laves la mesa y la desinfectes con Ia solucign de hipoclorito al 10% 0 con benzal, 2. Guardes en refrigeracién (4° C) la caja de agar Mac- Conkey del cultivo puro ctiquetada. 3. Deposita la basura en el cesto destinade para tal fin.SMETO BOS BASICHS BARA. AISLAMIENTTOE IDESSIIICACION DEENTIROBACTERIASDELLMGUA 23 CUARTA SESION IDENTIFICACION DE LAS ENTEROBACTERIAS CONTENIDO 1. Interpretacién de las pruebas de ide bioguimica IL, Manejo de mate I contam: Material y reactives por equipo Solicitar en el interlaboratoria de cristal A) | Frasco gotero émmbar con él metilo B) 2 Pipetas de 1 mL. C) | Frasce gotero can salucién etilica de ot - naftol al 3% D) | Frasco gotero con solucién de hidréxido de potasio (KOH) al 40%, puede utilizarse hidréxiddo de sodio (NaOH) al 40% E) | Frasco gotero con re para la prueba de indol. F) | Perilla © propipeta y reactivas dicador rojo de tivo de Kovac o Ehrlich Los alumnos deben traer en esta sesién A) | Escobillén para lavar tubos de 13 x 100mm. B) Material para preparar zona estéril para trabajo: microbiolégico, plumén, masking-fape. Anota tus resultadas en Ia Tabla | de Resultados y comparalas con el Cuadro 3 de Caracteristicas para identificacién de Enterobacteriaceae mis comunes. 1. Voges-Proskauer. Adiciona a uno de los tubos del caldo Voges-Praskauer las siguientes reactivos en el orden indicado, Para evitar la comtaminacién de los reactivos en la prucha de Voges-Proskaver, utiliza una pipeta de | mL en cada une de ellos, }0.6 mL de la solucidn etilica de at nafiel al 5% 6).0.2 mL de la solucién de KOH al 40% ¢) Agita el tubo y déjalo en reposo de 10 a 15 minutos Interpretacién Prueba positiva: color rojo en el medio (presencia de acetoina). Prueba negativa: color amarillo-o cobrize en el medio, El tubo control, que es e! tubo que no contiene el woculabacteriano, pero s/seagregan los reactivos, debe dar una reacciGn negativa. Ver Lamina 1D. 2, Rojo de Metile: Adiciona 2 gotas del indicador rojo de metilo al otro tubo-con el caldo Voges-Proskauer yagita. Interpretacin Prucha positiva: Color rojo en el medio Reaccidn retardada: Color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo en el media El ubo-control debe dar una reaceiGn negativa Ver Lamina 1B. 3. Citrate de Simmons: Interpretacién Prueba positiva: Crecimiento.con un color azul intenso en la zona inclinada del pico de flawta Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio decolor en ef me El tubo control debe dar una rea Yer Limina IF. on negs 4, Indol: Agrega 2 gotas del reactivo de Kovae al tubo inoculade del medio de SIM. Interpretacién Praca positiva: Aparicidn de un calor rojo 1.03 minutos después de adicionar el reactivo. Prucba negativa: color amarillo, El tubo contral debe dar una reaecién negativa, Ver Lamina 1H. 5. Acido sulthidrico (H,S): analizar el medio SIM.24 METODOS BASIOOS PARAL, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOS DE ENTEROBACTERIAS DILLARUA Interpretacién Prueba positiva: Color negro en la picadura on todo el tubo Prueba negativa: Ausencia de color negro en el tubo El tubo control debe dar una reaccién negativa 6. Movilidad: observar el medio SIM Injerpretaciéin Prueba positiva: El medio de SIM debe encontrarse turbio Prueba negativa: Solo debe existircreci de Ia picadura. El tubo control debe dar una reaccidn negativa Ver Limina 11 toa 10 largo 7. Ureasa Interpretacion Color rosa fuerte (rosa mexicano), en el caldo ure: Prueba negativa: Coloramario o sin cambio en el cald urea El tubo control debe dar una Ver Lamina 1G. cién negativa 8, TSI (hierro triple aziear) Interpretacién Picode flauta roja/profundidad amarillo: Medio Alcalinot Acide (Ale/A), Glucosa fermentada; lactosa 0 sacarosa no fermentada. Pico de flauta amarilto/profundidad amarillo: Medio AcidofAcido (AVA). Glucosa, lactosa yfo sacarosa fermentada. Pico de flauta rojo/profundidad rojo: Media Alcalino! Alcalino(Ale/Ale). Reaccién negativa, no hay fermen- Lacign de ninguno de los carbohidratos. Ver Limina LJ Produccién de H,S: Medio de color negro. Ver Lamina 1. Produccién de gas durante fa fermentacion de cualquiera de los azticares: Hay formacién de burbujas con quebra- duras en el fondo de! agar. El tubo control debe dar una reaccién negativa.Ver Lamina 1K Anota tus resultados en la Tabla 1 de Resultados y compiralos con el Cuadro 3 de Caracteristicas para la identifiencién de Enterobacteriaceae mis communes, Describe las microorganismos que identi ficaste, que earacteristicas tienen y que implica- ciones sanitarias pueden presentan. Al finalizar la sesién; 1. Lava y desinfecta la mesa con la solucién de hipoclorito de sodio al 10% 0 con benzal 1:10 Recoge y deposita la basura en el cesto destinado para tal Fin 3. Saca del refrigerador y estufa todas las cajas de cultivo y tubos que ulilizaste. Este equipo de laboratorio debe quedar completamente vacio al coneluir la prictica 4, Coloca en un recipiente o en una gradilla los tubos ‘que utilizaste para realizar las pruebas bioquimicas, quitales el masking-fape que hayas utilizado para etiquetarlos, Tapa los tubos de la gradilla con pape! de estraza y rotula este paquete con el No. de equipo, Grupo, Tumo y fecha. Lleva él paquete al interla- oratorio para que sea esterilizado. Una ver esteri- lizados los tubos, se te devolveriin para que los laves ‘con agua y jab6n utilizando guantes de hule, Cuando estén limpios regrésalos al laboraterista. juelve con masking tape todas kas cajas de eultive ‘que utilizaste a lo largo-de la préctica, coldcalas den- tro de las bolsas de polictileno color rojo, que se encuentran en el contenedor de material biolégico contaminado. 6. Lleva las bolsas.con tu material de desecho al inci- nerador, Consulta con tu profesor © con el técnica laboratorista,THRIASDELAGUA 35, DE Li ‘Género: Shigella Grupos A,B,C sent “Tribu I Fdwarsielene ‘Ginero: Edwarsiella Eaves Tribu Ill: Salmoneliewe Genero: Safaronctleae “Tribu IV Cirobacterewe ‘Genero: Citrobacter Cfreindt Chxerh “Tribu Vs Rlebsietleae Genero: Klebsiella E pucimnoniae WA & awoar AIK a ‘Ginero: Enterobacter cad cal E cragnes AIA Genero: Haft He thes AeA, = = = = : = + ‘Genero: Pantoca F aszelommorans AWA | J+ = Te HE a [n 7 ‘Genero: Serratia t S mwancescens ALTA, + 7 an = ~—L— 7 Tribu VE: Profeeae ‘Género; Proteus Peder E mrinabs ‘Genero: Morganelta “IE von AWA = - 7 : ‘Genero: Provident Prerigert Alea = = = : Paci AloA = 7 : P alealifictens Alg/A +e - + = Tabu VIE ertnicae Genero: Yersinfeae Tocca WEA = Aduptado de Kenn rsh MOY, 904 de las ce skcalinet onde yeol. bhigrva triple aaiear: HS, sulle de hi uh reaceisn positivas # 90% 0 i copas panitivis Hs de SUPE al YOKE de Mas ec vas; M/A. pico de Mi sombrcads indican kas eeacciones claves. Proskauer: END, indok: CIT, citrate: URE OF © anise +H. fuerte 1s copa negalivas positiv ici: ns re ‘icidevfondo seid: AbefA. pico de flauta26 METODOS BASICOS Paka FL AISLAMIENEO E IDENTIBICACION DL ENTEROBACTERIAS DLL AGUA CUESTIONARIO | Explica el fundamento de los diferentes métodos fisicos y quimicos de esterilizacién. 2. Explica las ventajas y desventajas de las métodos de la pregunta anterior e indica cuindo es recomendable utilizar cada uno de éstos. 3. Indica los principales agentes desinfectantes y anti- sépticas utilizados en la desinfeccién, 4. ,Qué tipo de sustancias suelen ulilizarse comtinmente para desinfectar superficies? 5. Explica cual es el objetivede utilizarel mechero para preparar la Zona estéril paral trabajo microbiolégico y seftala qué factores influyen en la creacién de la zona estéril. 6. Menciona otros métodos usados en la industria y en los lnboratorins de investigacién para crear zonas de trabajo estérile: 7. Explica los riesgos que puedes correr sino recoges el frasco, los tubos y las pipetas después de concluir sesidn, 8. Explica los riesgos que puedes correr si no lavas y desinfectas la mesa de trabajo después de concluir cada sesién, 9. Realiza el diagrama de un microscopi una de sus partes e indica su funcién. 10, Explica qué tipos de bacterias pueden aislarse en el agua 11. Explica cual es el objetive de sembrar diluciones del agua. 12. Explica el fundamento del aislamiento por estria cruzada de: ada rit 13. Explica qué tipo de bacterias pueden aislarse en agar MacConkey. 4, Explicaa qué se le llama mediade cultivo bacteriolégico, 15. Explica qué es.un medio de eultive enriquecido. 16. Explica qué es un medio de ci 17, Describe las earacteristicas de la pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas, resal- tando sus diferencias 18. .Como se definen a las bacterias coliformes? 19. ;Qu¢ indica la presencia de bacterias coliformes en el agua? 20, {Cudl es la importancia clinica de las bacterias coliformes? 21. Todas las bacterias coliformes son de arigen fecal? 22, {Qué implicaciones epidemioligicas tienen la pre- sencia de enterobacterias en la muestra de agua que colectaste? 23. {Qué enfermedades gastrointestinales pueden transmitirse en el agua contaminada con materia fecal? {Qué signi {Cual es el objetivo de real identificacién IMViC? 26. gPor qué raz6n no es recomendable utilizar el asa bacteriol6gica para realizar la prueba de la oxidasa? 27, Determina el ntimeto de bacterias que hay en una colonia despugs de 24 horas de incubacién, Recuerda que una colonia de enterobacterias se origina a partir de una sola bacteria (UFC) y éstas se dividen en un tiempo promedio de 30 minutos, i las pruebas deME-Y0H0SB ASH7OS MARA H, AISLAMIENTD EADENTINCACION DE ENTEROB ACTERIAS DEL AGUA 27 LAMINA 1 J K A: Bacteriasfermentadorasde lato (lan agar MacCnkey: B: BacesasFermeniadoras dies de lctosa (ac. en azar MacConkey. = Bactrias no fermentadoras de letoxa (la -) en agar MacConkey: D: Procha de Voges-Proshauer, el tubo deta erect muestra cl olor ro incenso caractritcn de a reaceién postva el tbo de a iaguerda mocsra la eaceicn negaivcE: Prucbade Rojode Metio, tubo cle derechx presenta cteoloc rojo deta reacci positiva, tubo de I iquieada reaccin negativa no cambia ecole del medi: F Prueba de Citra de Simmons, el who verde indica una reacciin negaiva,el tubo azul indica una reacein positva: G: Podacciéa be areas. el tubo dela izquierda muestra el color rosa mexicano caracteristco de lareacccn pasitiva.en eleaido ural bade lnderecha o-mucsra cambio on el color, lo que indica una reaccign negativa; H: Prueba de fndol, al agregar el reactvo de Kavac al medio:SIM, Forma va anil rojo en la superficie idicando uns reaccign positivs (Who dela derecha), la reacein negativa dana coloracicn amailia {tubo de la izquierda):L: Movilidad, crecimiento bactriano cn meio SIM, el tubo-de Is i2goienda presenta erecimien no slo en ka Picadas, tambign se ve srecimsnto alrededor dela picadura polo que sub s6¥e turbo, Io que indica mavilidad positiva de la derocha silos ve erevimiento cn la paar lo que indica movil! negativa; ‘TSI agar hiero triple azca El tubo del iaguierca muestra el color negro de la procucevn de HS. e-l tubo del centro se observa la eaccidn de una bacteria que fermenta slucnsa, laciosa y/o sacarsa,picode lia amarilofondo amarillo (AVA), el tubo de la derecha musta la reaccidn eaters de Jocteras ferme tadoras de glacosa, pero no fermeniadorasde lates yo scares. pico de Mautarojotfando amarillo (Ak#A):K:Prolaciin de gas. emeste tubo de TSI se moestraclaramente In produccidn de gas, se desprende cl agar del faado del tho ereando wna buruja de 426. veces slo se observa cf rompiesicat del agar28 METODOS BASICOSS FARA EL AISLAMIENTO E 1DENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS DELLAGUA _ BIBLIOGRAFIA Bryan AH, Bryan ChA, Bryan ChG. 1976, Bacteriatogia, Principios y Prdcticas. Traduccién de la 6" Edicisn, Editorial CECSA, México, Cowan ST, Barrow GI, Feltham RKA, Stee! KJ. 1993 Cowan and Steel's Manual for the Identification of ‘Medical Bacteria, 3* Edition. Cambridge University Press, Inglaterra, Davidsohn I, Henry JB. 1987. Todd-Sanford, Diagndstico linico por el laboratorio. Salvat Ediares, Espaiia. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. 2004, Bailey Scott - Diagndstico Micrabiolégico. 11" Edicién. Editorial Médica Panamericana, México. Konneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreekenberger PC, Winn WC. 2003, Diagndstico Microbiolégico. Texto y Atlas Color. 5* Edicién, 1" reimpresién, Editorial Médica Panamericana, México. Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Truant JP. 1982. Microbiologia Clinica. 3* Edicién. Editorial Médica Panamericana, Argentina, MacFaddin J.F. 2003. Pruebas Biogutinicas para fa Mdentificacién de Bacterias de Importancia Clinica ¥ Edicién, Editorial Médica Panamericana, México, Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2004. Brock Biologia de los Microorganismas. 10" Edicién Pearson Prentice Hall, Espaiia Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 1999. Microbiologia. # Edicion. McGraw-Hill Interamericana, Espaiia, ‘Tay Zavala J, Gutiérrez Quiroz M, Lopez Martinez R, Manjarrez Zavala ME, Molina Lépez J, Editores. 2003. Microbiologia y Parasitologia Médicas. 3° Edicion. Méndez Editores, México.METODOS BASICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS DEL AGUA, se termind de imprimir en el mes de septiembre de 2007 en tos Talleres Graficos de ta Direccidn de Publicaciones y Promocién Editartal de Rectaria General de la Universidad Autinoma Metropolitana, Se tiraron 500 ejemplares sobre papet grifico bond de 60 ke en tipas Times de IP ¥ 13 pls. em interiores y de 32 y 17 pis, para porta- da, Disesto de poriada y formactén: BCG Ma. de Laurdes Pérez Granadas.