Alunos HPLC

INSTITUTO FEDERAL DO SERTÃO
PERNAMBUCANO
DISCIPLINA: ANÁLISE INSTRUMENTAL
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE)
• É uma técnica cromatográfica que utiliza como Fase móvel

(FM) um líquido e equipamentos sofisticados para a
separação dos componentes de uma amostra pela interação
com a Fase Estacionária (FE) e a Fase Móvel (FM);
• Utiliza-se colunas empacotadas e FM pressurizada, obtida

com auxílio de bombas de alta pressão, para permitir uma
vazão mais rápida da FM;
• É conhecida como Cromatografia Líquida de Alta Pressão, ou

de Alta Velocidade. É também conhecida como HPLC do
inglês – High Performance Liquid Chromatography
(Cromatografia Líquida de Alto Desempenho ou de Alta
Performance).
Skoog D. A.; Holler F. J.; Nieman T. A.; Princípios de Análise Instrumental, 2009.
2
Collins C. H.; Braga G. L.; Bonato P. S. Fundamentos de Cromatografia, 2010.
APLICABILIDADE
PESTICIDAS VITAMINAS
FÁRMACOS
PROTEÍNAS
ALIMENTOS
CORANTES POLÍMEROS
3
SISTEMA DE HPLC
4
INSTRUMENTOS COMERCIAIS
5
RESERVATÓRIO PARA FASE MÓVEL
6
RESERVATÓRIO PARA FASE MÓVEL
• Filtro do Reservatório:
 Captar a FM e evitar que partículas
suspensas na FM obstruam os
capilares ou contaminem a bomba;
 Filtros de 10 a 40 µm
Limpeza periódica do
filtro é essencial !!!!!
Collins C. H.; Braga G. L.; Bonato P. S. Fundamentos de Cromatografia, 2010. 7

Para a seleção de uma FM são considerados
três critérios:
1) Características Físicos – Químicas;

2) Força Cromatográfica;
3) Seletividade.
Skoog D. A.; Holler F. J.; Nieman T. A.; Princípios de Análise Instrumental, 2009. 8
1 - Características Físicos-Químicas da
FM:
 SER DE ALTO GRAU DE PUREZA;
As impurezas da FM podem diminuir a sensibilidade do detector
 DISSOLVER A AMOSTRA SEM DECOMPOR SEUS
COMPONENTES;
O solvente da amostra, normalmente, é a própria FM
 NÃO DECOMPOR OU DISSOVER A FE;
Não utilizar Fases Móveis agressivas
 TER BAIXA VISCOSIDADE E BAIXO PONTO DE
EBULIÇÃO;
 SER COMPATÍVEL COM O TIPO DE DETECTOR.
9
ELUIÇÃO
É o desenvolvimento da amostra no sistema cromatográfico.
1. Isocrática:
• Mesma composição de fase móvel durante a eluição.
Ex: Hexano ou Metanol/Água 80:20 (v/v)
2. Gradiente:
• Composição da fase móvel varia durante a eluição;
• Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes
funções químicas.
10
2 – Força Cromatográfica da Fase Móvel
 Mede a capacidade da FM em interagir com os componentes
da amostra;
 A força cromatográfica do solvente é atribuída em função

da polaridade da FE.
 Se a FE for polar grau de polaridade do solvente semelhante Solvente
forte
 Se a FE for polar grau de polaridade do solvente diferente Solvente
fraco
É selecionada através da análise do fator de retenção (k).
11
Exemplo:
Ajuste da Força Cromatográfica
ACN:H2O/80:20
ACN:H2O/90:10 ACN:H2O/70:30
ACN:H2O/60:40
FE apolar: C8 mixture of aromatic compounds
Harris D. C.; Análise Química Quantitativa, 7ª ed, LTC, Rio de Janeiro, 2008. 12
ACN:H2O/50:50
Baixa resolução entre

ACN:H2O/40:60
os picos 2 e 3
ACN:H2O/30:70 Boa resolução mas tempo

de análise muito longo
ACN:H2O/35:65
Ajuste da Força Cromatográfica com
Gradiente
3 – Seletividade da Fase Móvel
 Quando existirem picos sobrepostos no cromatograma, a
solução é alterar a seletividade;
 Deve-se trocar um dos solventes da FM, alterando sua
seletividade e mantendo a mesma polaridade.
 Na troca do solvente na mistura para manter a mesma
polaridade,usa-se a equação:
XC x Sc = XB x SB
XC = XB x SB
SC
Onde:
XC: fração em volume do novo solvente
SC: fator força peso do novo solvente
XB: fração em volume do solvente inicial
SB: fator força peso do solvente da mistura inicial
16
 Os efeitos da FM que contribuem para a seletividade
são considerados como resultado das interações do tipo:
Básico
Ácido Dipolar
Triângulo de seletividade para os solventes em fase reversa, --- fase normal.
17
Harris D. C.; Análise Química Quantitativa, 7ª ed, LTC, Rio de Janeiro, 2008.
Exemplo:
Ao se realizar uma separação de uma amostra empregando a fase
estacionária no modo reversa e a fase móvel MeOH:H2O/70:30 (v/v).
THF:H2O ACN:H2O
XTHF = XMeOH x SMeOH XACN = XMeOH x SMeOH

STHF SACN
XTHF = 0,70 x 2,6 =0,40 XTHF = 0,70 x 2,6 =0,57

4,5 3,2
THF:H2O/ 40:60 ACN:H2O/ 57:43
18
Sistema de Bombeamento
19
Bombas de Alta Pressão
 Tem por finalidade enviar um fluxo

constante e reprodutível da FM para o
Sistema Cromatográfico;
 Requisitos:
• Ser de Material inerte;
• Devem gerar altas pressões;
• Versatilidade: permitir eluição por gradiente.
20
Principais tipos de bombas usadas em
CLAE
 Bombas Recíproca Bombas de Deslocamento ou

tipo Seringa
Para a
coluna
Para a
coluna
Anel Reservatório
Hermético da fase móvel
Anel
Válvulas Hermético
unidirecionais
Motor
Do reservatório
da fase móvel
21
Sistema de Injeção
22
Existem duas possibilidades para injeção da
amostra:
a) Com válvula injeção manual;
b) Com um sistema de injeção automática.
Injetores Manuais
23
Alças de amostragem substituíveis (LOOP)
Posição para carregar Posição para injetar
24
Sobrecarga de Volume da Amostra
 Para se aproveitar de todos os pratos que

uma coluna possui, não se deve injetar um
volume maior que 1% do volume da coluna
vazia.
25
Colunas
26
Colunas Cromatográficas
27
Coluna de Saturação
 Também chamada de pré-
coluna, fica localizada entre a
bomba e o injetor;
 Mesma FE da coluna de
Separação;
 Usada para condicionar a FM

em Cromatografia líquido-
líquido;
 Protege a coluna de separação,

aumentando seu tempo de vida.
28
Coluna de Guarda
 Localizada entre o injetor e a
coluna de separação;
 É usada para prevenir que

impurezas contaminem a coluna
de separação;
 Mesma FE da coluna de
separação.
 Protege a coluna de separação,

aumentando seu tempo de vida.
29
Coluna de Separação
 É responsável pela separação dos componentes da amostra;

 Constituída de material inerte;
 A sílica fundida é muito utilizada na confecção de colunas
capilares.
30
Coluna de Separação
Dependendo do diâmetro interno, têm-se a
seguinte classificação.
Tabela 1: Classificação das colunas de separação
Nome preferido Comprimento Diâmetro interno vazão Tamanho da
(cm) (mm) (µL/min) partícula(µm)

1.000-
Colunas rápidas 3,0-10,0 2,0-6,0 5.000 3
1.000-
Convencional ou Analítica 5,0-30,0 2,0-6,0 3.000 3; 5; 10
Small bore ou microbore 10,0-100,0 1,0-2,0 5-200 1; 3; 5
Capilar recheada 20,0-200,0 0,1-0,5 0,1-20 1; 3
Capilar semipermeável 100-10.000 0,02-0,1 0,1-2 1; 3
Capilar aberto ou tubo
aberto 100-10.000 0,01-0,075 0,05-2 a
Preparativa > 20 > 10 > 1.000 > 10
a: Filme líquido ligado nas paredes
31
Efeitos da Temperatura na coluna de
Separação
O aumento da temperatura
 Aumenta a viscosidade da
FM;
 Diminui o tempo de retenção;
 Com isso pode melhorar ou

piorar a resolução entre os
picos.
Desvantagens
O aumento da temperatura pode degradar
a FE e diminuir o tempo de vida da coluna
32
TIPOS DE RECHEIO DE COLUNA
SÍLICA
ALUMINA
RESINA
TROCADORA
DE ÍONS
A sílica é o material de recheio mais comum em Cromatografia Líquida
Algumas propriedades físicas podem ser

classificadas:
a) Rigidez da Partícula;
b) Estrutura da Partícula;
c) Tamanho da Partícula.
33
a) Rigidez da Partícula:
 Rígidos: Sólidos à base de sílica, resistem a altas
pressões;
 Semi-rígidos: Partículas porosas de poliestireno

entrecruzados de divinilbenzeno = CLAE por
Exclusão e Troca iônica;
 Não-rígidos: agarose ou dextrose. São aplicados na

separação de moléculas grandes.
34
b) Estrutura da Partícula:
 Partículas Porosas;
Partículas não-Porosas (1 – 2µm )
c) Tamanho da Partícula:
35
A SÍLICA
 É um sólido inorgânico (SiO4);
Os átomos de Silício internos tendem a manter uma estrutura tetraédrica com o
Oxigênio ( Ξ Si-O-Si Ξ ) Ligação
siloxano
Os átomos de Silício mais externos completam seu nº de coodenação com os grupos
OH ( Ξ Si-OH )
Grupos
silanóis
Possui uma alta resistência mecânica;

Grande área superficial (100 a 300m2.g-1).
OH OH OH OH OH OH
Sílica
Características das Fases Estacionárias
usadas em CLAE
 Cromatografia Líquido - Sólido;
 Cromatografia Líquido - Líquido;
Cromatografia Líquido-Líquido com Fase Quimicamente
Ligada
• Fase Normal
• Fase Reversa
Cromatografia por Troca Iônica;
Cromatografia por Exclusão de tamanho;
Cromatografia por Afinidade;
Cromatografia Líquido-Sólido
 Cromatografia por adsorção
É a forma clássica da Cromatografia líquida; baseia-se na
competição entre o soluto e a FM, para ocupar os sítios ativos na
superfície da FE.
 Tipos de Adsorventes (FE):

Sílica e Alumina ( As características de adsorção são
comparáveis uma a outra)
 Polaridade das fases cromatográficas:

FE é um sólido com sítios polares e FM um líquido menos polar
Cromatografia Líquido – Líquido
 A FE é um líquido imiscível na FM;
A FE consiste em um líquido sorvido em um suporte
sólido devido a forças físicas de Van der Waals
 Também conhecida por Cromatografia por

Partição;
Baseia-se na diferença de solubilidade dos componentes
da amostra entre a FE e a FM
Cromatografia Líquido-Líquido
Tabela 2 : Fases móveis e estacionárias mais utilizadas em CLL
Fases estacionárias Fases móveis
Polar Apolar
β, β’-oxidipropionitrila Carbowax Hidrocarbonetos saturados: hexano e
(400, 600, 750, etc.) heptano; solventes aromáticos: tolueno
Glicóis (etileno, dietileno) e xileno; hidrocarbonetos saturados
Ciano-etil-silicone misturados (até 10%) com dioxano,
metanol, etanol, clorofórmio,cloreto de
metileno.
Apolar Polar
Esqualano Água e misturas álcool-água;
Zipax-HCP acetonitrila e misturas acetonitrila-
Ciano-etil-silicone água
41
Cromatografia Líquido – Líquido
 Desvantagens:
• A solubilidade da FE na FM, que
rapidamente deteriora a Coluna.
Duas maneiras de solucionar esse problema:

1. Saturar a FM com FE através de uma coluna de saturação;
2. Utilizar FE líquida imobilizada, ou uma FE quimicamente
ligada a um suporte.
42
Cromatografia Líquida com Fase
Ligada
 Baseia-se na separação por Partição e por Adsorção;
 Os suportes cromatográficos utilizados são:
Alumina, Vidro de porosidade controlada, Carbono grafitinizado, Titânia
(TiO2), Zircônia (ZrO2) e a Sílica(SiO4)
Principais características dos suportes cromatográficos:

• Inerte;
• Ter área superficial grande;
• Apresentar poros grandes;
• Ter alta resistência mecânica;
• Apresentar muitos grupos ativos na superfície.
43
Ligada
 Obtenção das Fases Estacionárias
Quimicamente Ligadas.
• Reação Química na superfície da Sílica com um Agente
sililante.
__
Onde: X = Cl ou OR
Ligada
Cl HCl
+
(Organoclorossilano)
RO
+ ROH
(Organoalcoxissilano)
Onde “R” é uma cadeia Alifática

45
Ligada
 Se ao final da cadeia alifática, existe um grupo
polar Tem-se a Cromatografia líquida de
Fase Normal (CLAE-FN)
 Se ao final da cadeia alifática, existe um grupo

apolar Tem-se a Cromatografia líquida
de Fase Reversa (CLAE-FR)
46
Ligada
Tabela 3 : Principais radicais R utilizados fases estacionárias de
Cromatografia Líquida com fase Ligada
Fase normal Fase reversa
- C2H4CN (ciano) Cadeia C8 (- octil)
-C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol) Cadeia C18 (-octildecil)
-C3H6NH2 (amina)
-C3H6N(CH3)2 (dimetilamina)
Cromatografia líquida de Fase
Reversa (CLAE-FR)
Vantagens Desvantagens
 Fases móveis menos tóxicas  Silanóis residuais:
e de menor custo:  Mecanismo duplo de
modificador orgânico + retenção;
água;  Problema na separação de
compostos básicos.
 Boa estabilidade frente à
vários solventes;  Intervalo de pH: 2< pH < 8
 Devido ao uso da Sílica
 Rápido equilíbrio após a
troca do solvente;
 Compatível com gradiente;
 Análises rápidas;
 Vasto campo de aplicação.
48
Cromatografia por Troca Iônica
 Baseia-se na atração entre os íons do soluto e os sítios
carregados, ligados quimicamente à FE.
 A FE é constituída de resinas poliméricas porosas ou por

partículas microporosas de sílica.
Ambos com grupos iônicos ligados quimicamente
 O grupo trocador ligado covalentemente podem ser:

 Trocadores aniônicos são grupos carregados
positivamente na FE e atraem os ânions do soluto;
 Trocadores catiônicos são grupos carregados
negativamente na FE e atraem os cátions do soluto
49
 A FE a base de resinas orgânicas:
50
 Os grupos trocadores de íons mais utilizados são:
• SO3- = trocadores fortes de cátions

• CO3- = trocadores fracos de cátions
• NR3+ = trocadores fortes de bases
• NHR2+ = trocadores fracos de bases
51
Cromatografia por Exclusão
 Baseia-se em uma separação seletiva das moléculas
do soluto através de seus tamanhos, entre duas fases
líquidas separadas;
A estrutura da FE contém poros de tamanhos

controlados;
 O recheio ou “gel” é constituído de macromoléculas

que têm ligações cruzadas, inchado com o mesmo
líquido que carrega as substâncias a serem separadas.
52
Cromatografia por Exclusão
53
Cromatografia por Afinidade
 Distingue-se dos outros métodos cromatográficos por
basear-se nas propriedades biológicas;
 É a mais específica das modalidades encontradas em

CLAE;
 Baseia-se em interações bioquímicas, tais como:

 Antígeno – Anticorpo;
 Enzima – Inibidor;
 Lectina – Glicose.
54
Cromatografia por Afinidade
As fases estacionárias são preparadas normalmente

em um suporte de sílica por ligação do componente
desejado.
55
Vantagens da CLAE
• Possui uma maior variedade de FE de

interação seletiva com moléculas da
amostra;
• Permite separações de componentes

termicamente instáveis;
• Maior versatilidade.
56
Desvantagens da CLAE
• Alto custo da instrumentação;
• Alto custo de operação;
• Falta de um bom detector universal;
• Necessidade de experiência no
menuseio.
57
Referências Bibliográficas
• Harris D. C.; Análise Química Quantitativa, 7ª ed, LTC, Rio de Janeiro,
2008.
• Collins C. H.; Braga G. L.; Bonato P. S. (coordenadores). Fundamentos de
Cromatografia, Editora Unicamp, Campinas, 2010.
• Skoog D. A.; Holler F. J.; Nieman T. A.; Princípios de Análise Instrumental,
6ª ed., Bookman, Porto Alegre, 2009.
58
Obrigado!

Alunos HPLC

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Alunos HPLC

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

INSTITUTO FEDERAL DO SERTÃO

• É uma técnica cromatográfica que utiliza como Fase móvel

• Utiliza-se colunas empacotadas e FM pressurizada, obtida

• É conhecida como Cromatografia Líquida de Alta Pressão, ou

Collins C. H.; Braga G. L.; Bonato P. S. Fundamentos de Cromatografia, 2010. 7

1) Características Físicos – Químicas;

 SER COMPATÍVEL COM O TIPO DE DETECTOR.

 A força cromatográfica do solvente é atribuída em função

É selecionada através da análise do fator de retenção (k).

FE apolar: C8 mixture of aromatic compounds

Baixa resolução entre

ACN:H2O/30:70 Boa resolução mas tempo

XTHF = XMeOH x SMeOH XACN = XMeOH x SMeOH

XTHF = 0,70 x 2,6 =0,40 XTHF = 0,70 x 2,6 =0,57

THF:H2O/ 40:60 ACN:H2O/ 57:43

 Tem por finalidade enviar um fluxo

 Bombas Recíproca Bombas de Deslocamento ou

Posição para carregar Posição para injetar

 Para se aproveitar de todos os pratos que

 Usada para condicionar a FM

 Protege a coluna de separação,

 É usada para prevenir que

 Protege a coluna de separação,

 É responsável pela separação dos componentes da amostra;

(cm) (mm) (µL/min) partícula(µm)

 Diminui o tempo de retenção;

 Com isso pode melhorar ou

A sílica é o material de recheio mais comum em Cromatografia Líquida

Algumas propriedades físicas podem ser

 Semi-rígidos: Partículas porosas de poliestireno

 Não-rígidos: agarose ou dextrose. São aplicados na

Partículas não-Porosas (1 – 2µm )

Possui uma alta resistência mecânica;

 Tipos de Adsorventes (FE):

 Polaridade das fases cromatográficas:

 Também conhecida por Cromatografia por

Duas maneiras de solucionar esse problema:

Principais características dos suportes cromatográficos:

Onde “R” é uma cadeia Alifática

 Se ao final da cadeia alifática, existe um grupo

- C2H4CN (ciano) Cadeia C8 (- octil)

-C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol) Cadeia C18 (-octildecil)

 A FE é constituída de resinas poliméricas porosas ou por

 O grupo trocador ligado covalentemente podem ser:

• SO3- = trocadores fortes de cátions

A estrutura da FE contém poros de tamanhos

 O recheio ou “gel” é constituído de macromoléculas

 É a mais específica das modalidades encontradas em

 Baseia-se em interações bioquímicas, tais como:

As fases estacionárias são preparadas normalmente

• Possui uma maior variedade de FE de

• Permite separações de componentes

• Alto custo da instrumentação;

• Alto custo de operação;

• Falta de um bom detector universal;

You might also like