TEMA 1.

1: Técnicas de Aislamiento, Purificación y Concentración de ácidos

nucleicos.
AISLAMIENTO DEL ADN

La mayoría de las técnicas de biología molecular constan de un primer paso que consiste en el
aislamiento de:

 ADN genómico: que puede ser extraído de cultivos celulares y de tejidos. Es de utilidad para
conseguir la genoteca de un animal o una línea celular.

 Plásmidos bacterianos: a partir de un botón o pelet de bacterias aislamos los plásmidos y

posteriormente hacemos un análisis de restricción.

Independientemente del uso de determinados métodos concretos, el protocolo de aislamiento del

ADN siempre presenta un fundamento estándar y para ello cuenta con tres etapas necesarias:

1. Lisis celular: consiste en la rotura mecánica en seco de células eucariotas y bacterias para
que el ADN y los plásmidos queden accesibles respectivamente formando un homogenado.
A veces se emplea un medio líquido para realizar una rotura física.

Para ésta lisis se requiere de un detergente que se encargue de romper las membranas celulares,
y de la lisozima que destruya la pared bacteriana.

A continuación se usa un buffer que suele contener un agente quelante llamado EDTA. Éste se
encarga de atrapar cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+ entre otros) que sirven como cofactores de
enzimas que pueden degradar ácidos nucleico, para así protegerlo. Además, ese buffer contiene
proteinasas (enzimas que rompen proteínas) como la proteinasa K, que funciona en condiciones
muy duras (en presencia del detergente) y digiere a casi cualquier proteína.

2. Desproteinización: consiste en eliminar al menos los restos de proteínas que se encuentran

“ensuciando la muestra” (aunque también otros componentes) para facilitar la purificación del
ADN. Para conseguir un sobrenadante más o menos transparente (que contiene el ADN)
realizamos una extracción fenol/cloroformo. Este método era el empleado antiguamente,
pues hoy sabemos que su uso se encuentra limitado por la elevada toxicidad del fenol y en
menor medida del cloroformo. En su lugar actualmente usamos columnas.

3. Recuperación del ADN: consiste en la precipitación del ADN diluido en el sobrenadante con
el uso de alcohol (etanol 70%) y sales. Finalmente, se toma el pelet de AND y se redisuelve
en el tampón Tris o a veces simplemente en agua.

1. LISIS CELULAR:

El típico buffer de digestión para la lisis celular contiene principalmente:

- Tampón Tris (agua tamponada a pH 8) que sirve casi para todo.

- EDTA que como vimos secuestra cationes divalentes que usan las DNAasas como cofactor
(Ca2+ y Mg2+ entre otros).

- Detergente: un ejemplo es el SDS que solubiliza lípidos, y que en este caso concreto también
desnaturaliza proteínas (nos ayuda a quitarlas).

- Proteinasa K: digiere proteínas.

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Detergentes:

Los detergentes son componentes bastante importantes que se emplean muchísimo no solo en
estos protocolos, sino también en otros de bioquímica molecular. Existen diferentes tipos de
detergentes, con distintas propiedades que hacen que su uso sea específico para cada protocolo
según nuestro objetivo (no son equivalentes en su uso).

Todos son moléculas anfipáticas y como tales presentan 2 partes: una hidrofílica y otra hidrofóbica.
Según su cabeza hidrofílica podemos distinguir:

- Detergentes iónicos: pueden ser aniónicos o catiónicos.

- Detergentes no iónicos

Además, existe un tipo de detergente más particular llamado “Zwitterionic” o Anfotérico, que
tiene una cabeza hidrofílica y una cola con una región polar y otra no polar.

NOTA: el SDS es el típico detergente aniónico desnaturalizante que emplearíamos cuando además
pretendiésemos desnaturalizar a las proteínas. Sin embargo, a veces en otros protocolos
requerimos de detergentes que no iónicos que no afecten a las proteínas como el NP-40.

*Usos principales:

 Disrupción de interacciones:
 Proteína-Proteína (detergentes iónicos)
 Proteína-Lípido
 Lípido-Lípido

 Desnaturalización de proteínas (detergentes iónicos)

 Prevención de uniones inespecíficas en inmunodetección. Al realizar un Western Blot

sabemos que es necesario el bloqueo de la membrana de nitrocelulosa, para que así se
establezcan uniones específicas entre el antígeno de la membrana y el anticuerpo. De esta
manera, con el uso de un detergente evitamos las uniones inespecíficas entre la membrana y
los anticuerpos.

 Cristalización de proteínas. Se trata de un procedimiento realizado por ensayo-error, es decir,

hacemos interaccionar a las proteínas con diferentes componentes y vemos si las proteínas
alcanzan las condiciones óptimas de cristalización o no; en el caso de que cristalice se estudia
por difracción de rayos X. Uno de dichos componentes son los detergentes.

*Propiedades:

Los detergentes dado su carácter anfipático pueden formar miscelas; unas esferas donde los
fosfolípidos exponen sus cabezas hidrofílicas hacia afuera y las colas hidrofóbicas hacia adentro.
Para que esto ocurra son necesarias una serie de condiciones:

- Concentración miscelar crítica (CMC): concentración mínima del detergente que permite la
formación de miscelas.

- Temperatura miscelar crítica (CMT): temperatura mínima a la cual es posible la formación de

miscelas. Normalmente a temperaturas frías el detergente precipita y no se pueden generar
estas estructuras, por ello debemos calentarlo para que vuelva a entrar en suspensión.

- Peso molecular micelar: es mayor cuanto mayor es el tamaño de las miscelas. A su vez, este
tamaño depende del tipo de detergente que usemos.

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Los detergentes más empleados son: el SDS (detergente iónico; aniónico), y Triton X-100, NP-40,
Tween 80 (detergentes no iónicos).

Las propiedades mencionadas varían según el tipo de detergente:

 La CMC es más baja en detergentes no iónicos que en los iónicos. Esto quiere decir, que
con muy poca concentración de detergentes no iónicos se forman miscelas, mientras que en el
caso del SDS se requiere mayor concentración.

 El peso molecular miscelar es más alto en detergentes no iónicos que en los iónicos.
Debido a ello, las miscelas formadas por detergentes no iónicos serán de mayor tamaño que
las formadas a partir de SDS.

 Las sales hacen que disminuya la CMC y aumente el peso molecular micelar, pero sobre todo
en el caso de los detergentes iónicos.

Con la finalidad de saber si un detergente es el adecuado para el experimento que pretendemos

realizar necesitamos conocer sus propiedades. Esta información tiene mucha utilidad en la práctica
para la purificación de proteínas, porque “al romper” las células o tejidos empleamos detergentes,
que finalmente habrá que eliminar para así conseguir la proteína purificada.

Para acabar con los detergentes realizamos una diálisis, que será más efectiva en el caso de que
los detergentes que hayamos empleados sean iónicos, pues estos generan miscelas más
pequeñas capaces de atravesar los poros de la membrana semipermeable de un tamaño concreto.
Si la miscela fuese de tamaño superior al poro, no podría atravesar la membrana y la purificación
de la proteína no sería posible. Por ello el SDS es el detergente más usado en el caso de que no
importe el estado de la proteína, ya que como sabemos es también es un detergente capaz de
desnaturalizar a las proteínas.

2. DESPROTEINIZACIÓN:

Con el fin de eliminar los restos de proteínas de la muestra (obtenidos por la acción de la
proteinasa K), además de los restos lipídicos se usa el método de extracción fenol/cloroformo. Este
método hoy en día se encuentra en desuso, puesto que el fenol es un compuesto muy tóxico capaz
de quemar la piel. Debido a ello, son contadas las ocasiones en las que se emplea y se debe de
trabajar en condiciones de seguridad (con guantes y en campanas de extracción).

La muestra acuosa o lisado se mezcla por agitación con fenol y cloroformo, y finalmente se
centrifuga. Así obtenemos:

- Fase acuosa: superior, menos densa y más clara donde quedan disueltos los nacidos
nucleicos (ADN y ARN).

- Fase orgánica: inferior y más densa donde quedan los lípidos de membrana.

- Interfase proteica: queda localizada entre las dos fases, es blanquecina y contiene las
proteínas desnaturalizadas por el cloroformo y el fenol.

NOTA: es una separación por densidad: el fenol y cloroformo tienen una mayor densidad que el
agua, por lo que el agua queda arriba (fase acuosa) junto con las ácidos nucleicos y los otros dos
compuestos debajo (interfase).

3. RECUPERACIÓN DEL ADN:

Tomamos con una pipeta la fase acuosa, en la que no solo tenemos ácidos nucleicos sino que
cabe la posibilidad de que nos encontremos sales y en ciertas ocasiones el agente quelante (que
solo se usa cuando la muestra es rica en DNasas).

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El siguiente paso consiste en precipitar el ADN que se puede hacer usando muchos compuestos
diferentes, pero siempre tienen que ser un:

 Alcohol: interacciona con las moléculas de agua que forman la capa de hidratación (hydration
shell) que reviste a los ácidos nucleicos (éstos no se encuentran “sueltos”), quitándosela.

 Catión monovalente o sal: una vez que actúa el alcohol, los cationes pueden acceder a los
grupos fosfatos cargados negativamente de los ácidos nucleicos, y se encargan de
neutralizarlos y precipitarlos.

Con esta precipitación logramos seguramente eliminar la mayoría de los componentes de menor
densidad que el ADN (menos pesados que el mismo), como son las sales y el agente quelante.
Pero cuando el ADN precipita sigue en suspensión, por ello es necesario realizar una
centrifugación para obtener el pelet en el fondo del tubo. Este pelet debe de ser transparente si se
ha conseguido purificar el ADN, puesto que de ser blanquecino quedarían aún muchas sales. En
ocasiones en las que el ADN se encuentra en grandes cantidades podemos observar incluso la
formación de un hilo blanco.

Tras retirar el sobrenadante dejamos secar el pelet y finalmente, lo resuspendemos en un tampón

como el tampón Tris, o a veces simplemente en agua.

Sal (catión monovalente):

Las sales que empleamos en la precipitación del ADN son muy variadas, y su uso será más
adecuado o menos dependiendo del posterior tratamiento que le vayamos a dar al ADN. Por
ejemplo: si empleamos como sal al acetato amónico, los iones amonios inhiben la actividad de la
enzima T4 polinucleótido quinasa por lo que posteriormente no podremos tratar al ADN con esa
enzima.

Alcohol:

Los más empleados son el etanol y el isopropanol, que también cuentan con sus ventajas e
inconvenientes:

- Etanol: es de fácil evaporación lo cual es algo necesario para que no queden trazas de alcohol
que dificulten la resuspensión del material genético. Su uso genera una menor co-precipitación
de sales.

- Isopropanol: es de peor evaporación que el etanol, pero su uso genera mayor co-precipitación
de sales.

Una consideración de tipo práctica es el volumen de ácidos nucleicos que queramos precipitar; ya
que si el volumen de ADN es muy grande, añadimos 1 volumen de isopropanol o 2,5 volúmenes de
etanol. Aunque sea peor el uso de isopropanol, en ocasiones conviene su empleo ante volúmenes
grandes de ácidos nucleicos, pues a veces no tenemos un recipiente con el volumen adecuado
para efectuar el procedimiento. Cómo este alcohol es de difícil evaporación, para solventar el
problema se añade un tampón que elimine sus restos.

NOTA: añadir 1 volumen de alcohol (en este caso), es lo mismo que añadir el mismo volumen de la
sustancia que tenemos.

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Extracción rápida de ADN genómico:

Con la práctica se adquiere la experiencia necesaria para saber distinguir entre las ocasiones en
que es necesario ser muy finos siguiendo el protocolo y las ocasiones en las cuales podemos
prescindir de algunos pasos.

Un ejemplo de estos últimos casos en los que no es necesaria la purificación del ADN, es al
realizar un genotipado de la cola de un ratón. Este proceso consiste en cortar un trozo de la cola
del ratón, introducirlo en un tubo, añadirle NaOH y lo sometemos a calor. Posteriormente lo
volteamos, pues no importa que el ADN se rompa en trozos de pequeño tamaño, ya que vamos a
amplificarlo por PCR. Volvemos a someterlo a calor, neutralizamos con tampón Tris y volvemos a
voltear. Finalmente, centrifugamos para que los pelos de la cola del ratón se vayan al fondo del
tubo, cogemos el sobrenadante y lo diluimos en un nuevo tubo a partir del cual podremos realizar la
PCR.

AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOSEXAMEN

El aislamiento de plásmidos es de los métodos más frecuentes que se llevan a cabo en el

laboratorio. El protocolo más antiguo que más aísla y en el que se basa, es el de lisis alcalina.
Aunque hoy en día se usan los kits creados por empresas para este procedimiento, estos siguen
fundamentándose en el protocolo de antaño.

Hay que tener en cuenta la nomenclatura del proceso según el volumen de ADN que queramos
extraer, que a su vez depende del volumen del cultivo de E. Coli empleado para la preparación:

- Miniprep: la cantidad de ADN que necesitas extraer es mínima, por lo que requiere entre 150-
200ml del cultivo (poco volumen).

- Midiprep: la cantidad de ADN que necesitas extraer es mayor, por lo que se requiere mayor
volumen del cultivo.

- Maxiprep: la cantidad de ADN que necesitas extraer es mayor que en el caso anterior, por lo
que se requiere un mayor volumen de cultivo de E. Coli (en torno a 1L).

La caja del kit varía sus dimensiones según el volumen de ADN y del cultivo: a mayores
dimensiones, vendrán más volúmenes de las distintas soluciones y las columnas también serán
más grandes.

Pasos:

1. Resuspensión del pelet de bacterias con el uso de un tampón (con Tris, glucosa y EDTA).

2. Lisis alcalina: usamos un tampón de lisis que contiene por un lado hidróxido de sodio
(NaOH) que desnaturaliza los ácidos nucleicos, y por el otro el detergente SDS que ayuda a
solubilizar los lípidos y a desnaturalizar a las proteínas.

3. Neutralización: usamos acetato de potasio (KAc) para neutralizar al NaOH permitiendo así la
renaturalización de los plásmidos, pero ni el ADN genómico ni las proteínas vuelven a
naturalizarse. De esta manera, el ADN genómico, las proteínas y lípidos precipitan.

4. Eliminación del lisado: consiste en la eliminación de todo aquello que no nos sirve (ADN
genómico, lípidos y proteínas). Se puede efectuar de dos maneras:

a) Centrifugación: con esta técnica el precipitado acaba en el fondo del tubo formando un
pelet blanquecino y en el sobrenadante quedan los plásmidos. Podemos retirar ese
sobrenadante y así conseguir aislar el ADN plasmídico.

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 b) Filtración: con esta técnica el sobrenadante se pasa por una columna con una membrana
de afinidad por el plásmido, de tal forma que el plásmido queda retenido por la membrana
y el plasma se desecha. Después recuperamos el ácido nucleico de la membrana
mediante el proceso de elución.

NOTA: este proceso de eliminación del lisado podríamos haberlo hecho tradicionalmente a través
de la extracción fenol-cloroformo.

Filtración: Columnas de Absorción

Estas columnas de absorción están compuestas normalmente por membranas de sílice, una
sustancia que se dispone a modo de gel y que presenta grupos cargados negativamente.

En presencia de un alcohol (agente caotrópico) y de una sal se forma una estructura parecida a un
“sándwich”, es decir, entre las cargas negativas de la membrana de sílice y del plásmido (grupos
fosfatos) por el que presenta afinidad se disponen las sales sirviendo como “puentes de unión”.
Este es el principio químico en el que se basa la absorción de los ácidos nucleicos a la membrana.

Para eluir los plásmidos adheridos a la membrana de sílice diluimos con agua. El agua lava el
sodio, distorsiona el “sándwich” y forma una capa de hidratación sobre la membrana de sílice
quedando sus grupos negativos de ésta apantallados. Así conseguimos que el material genético se
desprenda de la membrana de sílice y pueda eluirse siendo recogido finalmente.

Probablemente como los iones de Na se encuentran, pueden contribuir a neutralizar a los grupos
fosfatos del ácido nucleico, para que de esta forma atraviese la membrana de sílice a través de una
serie de poros.

Agente caotrópico:

Es un “cajón desastre” en el que se encuentra cualquier compuesto químico que altere la estructura
de las macromoléculas de dos formas:

1. Rompiendo interacciones no covalentes: puentes de hidrógenos, interacciones

hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals e interacciones electrostáticas.

2. Desestabilizando la capa de hidratación de las biomoléculas; como consecuencia:

desnaturaliza proteínas e incrementa la solubilidad de sustancias apolares.

AISLAMIENTO DE ARN

Actualmente se lleva a cabo a través de kits, pero al igual que antaño sigue siendo un proceso
mucho más complejo que el aislamiento del ADN. El ARN no es equivalente al ADN, sino que hay
que tener determinadas consideraciones al ser el ARN mucho más sensible, pues es:

- Menos susceptible a rotura mecánica que ADN, al ser moléculas más pequeñas (ventaja).

- Más susceptible a degradación enzimática por RNasas. En el caso del ADN colocábamos un
agente quelante (EDTA) aunque no es necesario, pero en el caso del ARN siempre hay que
ponerlo porque las RNasas se encuentran por todos lados.

- Más lábil y delicado desde el punto de vista químico, pues no se puede resuspender en agua y
si lo quieres conservar mucho tiempo requiere de un proceso de hidrólisis básica.

- El ARNm se encuentra asociado frecuentemente a proteínas por lo que requiere una

desproteinización más eficaz.

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Sin embargo, el protocolo básico es el mismo porque se efectúan son los mismos pasos: lisis,
desproteinización y recuperación del ARN.

El protocolo se complica considerablemente cuando queremos aislar un tipo de ARN concreto,

porque la diversidad existente es grande (ARN total, ARN total citoplásmico, ARN nuclear, ARN
mensajero, ARN poli A+ celular, ARN poli A+ citoplásmico, ARN poli A- y ARN mitocondrial). Al
protocolo básico habrá que añadirle otros pasos para ir eliminando los ARN que no nos interesan.

Aislamiento de ARN total:

1. Lisis caotrópica: el uso de una agente caotrópico nos sirve para romper las membranas
nucleares, membrana de los orgánulos y la propia membrana plasmática. De esta forma
obtenemos una mezcla de ARN y ADN mitocondrial, ARN heterogéneo nuclear, ADN
genómico... entre otros ácidos nucleicos que hay que separar a nuestra conveniencia.

El uso de compuestos altamente desnaturalizantes (guanidinium thiocyanate, SDS, sarcosyl, urea o

fenol) son usados para la disrupción del tejido, inactivación de RNasas y desnaturalización de
proteínas. Aunque se hayan inactivado las ARNasas, esto no quiere decir que no debamos trabajar
con minuciosidad ya que las ARNasas son superresistentes.

NOTA: si lo que pretendiésemos es aislar el ADN, no inactivaríamos las RNasas, sino que los
colocaríamos en algún paso para eliminar el ARN. De hecho el primer buffer de esta lisis alcalina
lleva RNasas para eliminar el ARN.

2. Desproteinización: extracción fenol/cloroformo.

3. Extracción del ARN: consiste en separar el ADN y el ARN, para lo que existen varias
posibilidades:
a) Por gradientes de densidad: se usa un medio de CaCl por ejemplo, que permite
separar por densidad los diferentes componentes de la muestra (que son normalmente
polímeros). Al centrifugar obtenemos arriba las proteínas (de menor densidad), bajo
éstas el ADN, y finalmente debajo el ARN (más denso). Este es un método muy antiguo
que actualmente no se usa.
b) Columna de absorción: suelen tener una membrana especiales de sílice que tienen
afinidad o bien por el ARN o bien por el ADN, pero se desconoce el verdadero principio
que las rige.

Aislamiento de ARN citoplásmico:

Se realiza una lisis hipotónica con el detergente NP-40 que es muy suave, no desnaturaliza a
proteínas y preservan la integridad de los núcleos y de los orgánulos. Esto se debe a que en
condiciones hipotónicas se lisan las membranas plasmáticas, pues la nuclear es mucho más
robusta y estable.

No nos interesa el contenido del núcleo ni de los orgánulos, de ahí que no aislemos el ARN
heterogéneo nuclear, ni el ADN nuclear, ni el ARN y ADN mitocondrial. Vamos a obtener todo lo
que hay en el citoplasma, por lo que no tenemos grandes problemas por la contaminación de ADN
(pues está en el núcleo o en los orgánulos).

Como se trata de una lisis que usa detergentes más suaves, tenemos que tomar precauciones
frente a las RNasas a través de los llamados RNasin y RNase OUT, dos compuestos que son muy
caros por su difícil producción.

Aislamiento de ARN poli A celular o citoplásmico:

Realizamos una cromatografía de afinidad con columnas de oligo (dT)-celulosa con afinidad por
todo aquello que se encuentre poliadenilado, de tal manera que el ARN poli A se une al oligo (dT)-
celulosa, mientras que el ARN no poliadenilado y el ADN son lavados a través de la columna a

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altas concentraciones de sal. Para eluir el ARN poli A que queda en la columna bajamos las
concentraciones de sal.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

Por lo general al usar un determinado kit ya sabemos el rendimiento del procedimiento, y no es

necesario conocer la concentración de ácidos nucleicos, aunque si luego como resultado no ves
ADN te planteas hacer medidas.

Por tanto, el cálculo de la concentración de ácidos nucleicos aislados se realiza solo en algunas
ocasiones, como cuando queremos transfectar a una célula y tenemos que calibrar bien la cantidad
de ADN usada. Se puede determinar de tres maneras:

1. Espectofotometría: se basa en la capacidad que tienen determinadas moléculas de

absorber la luz en el campo ultravioleta. Consiste en tomar una muestra de ADN y diluirlo en
un volumen adecuado, introducirlo en una cubeta y medir su absorbancia para una
determinada longitud de onda. Después a partir de la siguiente fórmula que relaciona la
concentración de ADN con su absorbancia máxima (260nm), calculamos su estricatmente
su concentración:
𝑪 = 𝑶𝑫𝟐𝟔𝟎 𝒙 𝑽 𝒙 𝑭

Una vez calculada la concentración, hay que tener en cuenta que esa no es la
concentración total de ácidos nucleicos asilados, sino que solo la que corresponde a la
muestra de la cubeta. Por ello lo que debemos hacer es a través del factor de dilución (F)
extrapolar la concentración a la del tubo total.

Otro parámetro del que depende la concentración es del factor de multiplicación (V), que
es constante para cada tipo de ácido nucleico: 50 para ADN bicatenario, 40 para ARN y 33
para ADN monocatenario.

NOTA: Una PCR cuantitativa debe hacerse con un gran número de controles y suele tener una
finalidad comparativa. Además, requiere de patrones cuantificados con otra técnica como la de la
absorbancia.

Influencia del fenol en la lectura de la absorbancia de ácidos nucleicos:

El fenol es una sustancia que hay que tener en cuenta para que no distorsiones la lectura de la
concentración de ácidos nucleicos. Si al retirar el sobrenadante tomamos algo de fenol podemos
obtener resultados no certeros, pues aunque el ADN siga absorbiendo a la misma longitud de onda
(260nm) se da una sobre-estimación de tal manera que la absorbancia parece aumentar por
encima del valor verdadero, y con ello también aumenta la concentración de ADN.

Indicadores de la pureza de los ácidos nucleicos aislados:

La relación entre las absorbancias nos da una idea de la pureza del ácido nucleico que hemos
aislado:

Proporción ADN ARN Problemas

A260/A280 1,8 2 Por debajo de 1,8 sugiere una gran contaminación por proteínas.
A260/A230 2-2,4 2-2,4 Por debajo de 1,8 sugiere una contaminación por un compuesto
orgánico.
A260/A240 1,4 1,4 Por debajo de 1,4 sugiere una excesiva cantidad de sal.

2. Electroforesis: consiste en cargar el gel de agarosa con un patrón de ácidos nucleicos de

concentración conocida, que bien podemos comparar o elaborar nosotros mismos con el
uso del espectrofotómetro. Después cargamos los diferentes pocillos con diluciones de

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 factor 2 del ADN que queremos cuantificar, y vemos como la intensidad de la
fluorescencia que emite la banda va en proporción a la concentración del ácido
nucleico. Hay que tener en cuenta que lo que aparece en el gel no es concentración sino
cantidad, por lo que lo extrapolamos a concentración dividiendo entre el volumen.

Para calcular la concentración del ADN que hemos colocado observamos a cuál de las
bandas del marcador se parece más. Como conocemos la cantidad del marcador de ADN
que hemos introducido podemos saber cuánta cantidad tiene cada banda del mismo según
su tamaño. Así, comparando con éste podemos saber más o menos el orden de magnitud
de la cantidad de ADN aislada.

NOTA: en este caso no varían los resultados ante una contaminación por fenol.

Integridad del ARN total aislado:

Realizamos un Northern blot en condiciones desnaturalizantes, para lo que usamos un gel de

agarosa. En estas condiciones el ARN mantiene su integridad.

Si hemos conseguido aislar el ARN total tenemos que ver dos bandas cercanas, de las cuales la
superior se corresponde con el ARN 28S y la inferior con el ARN 18S. Si la banda superior
presenta una intensidad de entre 2-2,5 veces mayor a la de abajo, nuestra muestra presenta una
integridad más o menor buena.

Cuando el ARN pierde su integridad (se degrada), las bandas se extienden y no se pueden
diferenciar (se observa un “manchurrón”). Este ARN ya no nos es útil para seguir trabajando.

Cuando existe contaminación por ADN genómico, vemos las dos bandas de ARN pero sus
límites quedan distorsionados. Esto también puede ocurrir en el caso del ADN, en el pocillo los
plásmidos pueden migrar de diferente manera y se enturbiado por el ADN genómico de la bacteria.

NOTA: los geles de agarosa nos pueden ser útiles para indicar la cantidad de ácidos nucleicos,
para darnos su integridad y el grado de contaminación.

3. Fluorimetría: es un método poco frecuente para medir la concentración de ácidos

nucleicos, pues se requiere de un fluorímetro. Al igual que el ácido nucleico absorbe,
emite fluorescencia a una determinada longitud de onda. El agente intercalante
empleado para ver la emisión de fluorescencia en una electroforesis suele ser el Bromuro
de Etidio (EtBr). En el caso del ADN se puede emplear como agente intercalante el
H33258.