Práctica 5. Deshidrogenasa Láctica.

Equipo 6: 1

 Alcántara Vargas Vanessa Saori.

 Hernández Sosa Michell Andrea.
 Meza Bravo Nadia Montserrat.
 Ramírez Anguiano Andrea.
 Sotero Francisco Luis Miguel. Grupo: 2PM1
 Torres Silva Nayeli Ivonne.

OBJETIVO.
El alumno determinará cualitativamente, mediante la observación de los grados de
decoloración, las relaciones existentes entre la actividad de la deshidrogenasa
láctica (LDH) y la presencia de nicotinamida adenin dinucleótido (NAD), en función
de los siguientes aspectos:
• Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD.
• Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno

OBSERVACIONES.
1. Obtención de Enzima LDH
Lo primero que se tuvo que hacer para la realización de la práctica fue la obtención
de la enzima LDH para esto se hizo uso de un pedazo de pollo el cual fue cortado
a 3 gramos para posteriormente colocarlo en un mortero frío, añadir arena de cuarzo
y molerlo perfectamente, después de un tiempo se le añadió 10 ml de NaCI al 0.9%
por gramo, lo que en consecuencia se le procedió a colocar 30 ml y se dejo
reposando en el refrigerador una estimación de 15 minutos.
Pasado este tiempo se filtró el contenido en un embudo sobre un vaso de
precipitado, esta solución fue colocada en dos tubos de 13x100 mm y centrifugados
durante 15 minutos, después con ayuda de una pipeta Pasteur se recuperó el
sobrenadante en un tubo de 13x100 mm dando como resultado la enzima LDH.
2. Obtención de Coenzima NAD.
En el experimento, lo primero que se observó fue el pedazo de pollo con los 24 ml
de agua destilada, empezando a notar una coloración blanquecina en el minuto
2:50.
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Para el minuto 4:00 empezamos a ver como subían burbujas por

nuestro matraz y notamos que el pollo ya se había cocido
(Figura 1). Al momento de molerlo en el mortero, vemos
que el pollo es más fácil de moler, pero siguen quedando
pocos residuos (Figura 2). Después de centrifugar se
observa como en la parte de abajo hay un precipitado el
cuál dejaremos en el tubo para solo recolectar el líquido
que trae consigo la coenzima NAD para ayudar en el
experimento de la detección enzimática. Figura 2. Se empieza a
Figura 1. El minuto 4:00 donde moler el pollo.
comienza a burbujear nuestra
solución.
3. Detección Enzimática del LDH.
Utilizando la tabla (Figura 3), se
prepararon los cuatro tubos de ensayo
con las soluciones y cantidades
indicadas. De esa forma podríamos
observar la detección de la enzima.

A los 4 tubos con sus respectivas Figura 3. Tabla de las sustancias que deben agregarse a nuestros 4 tubos de
soluciones, al agregar el azul de ensayo.

metileno, se nota que las 4 cambian de color y es la misma intensidad en los 4.

(Figura 4.)

Después a los 4 tubos se les agrega 1 ml de aceite mineral, esto es para

crear un tipo de tapón en la superficie de cada tubo. Y se
llevaron a incubar a una temperatura de 37°C, durante 5
minutos. (Figura 5).

Después del baño maría, podemos notar que solo el tubo 2

tomó una coloración más clara a diferencia de los otros 3.
Figura 4. Se puede
observar la coloración en (Figura 6). Figura 5. Se ponen los 4 tubos a baño
los 4 tubos es la misma. maría.
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El azul de metileno es aceptor de equivalentes

reducidos y se decolora en presencia de estos.
En la reacción de oxidación de lactado a piruvato
ocurre la reducción de la coenzima NAD+ a
NADH+ produciendo la decoloración de azul de
metileno.
La enzima lactato deshidrogenasa es una
oxidorreductasa regulada a partir de la
concentración de NAD, produciendo la reducción Figura 6. Se observa la diferente coloración el tubo 2, mientras
que los tubos 1, 3 y 4 tiene la misma coloración azul rey.
de piruvato en presencia de NADH+ H.

RESULTADOS.
1. Obtención de Enzima LDH
Al seguir los procedimientos, en ambos tubos nos dio un sobrenadante el
cual era la enzima Lactato deshidrogenasa (LDH), que después
recuperamos con cuidado sin mezclar de nuevo y pasamos a un tubo libre
para después ser utilizado como un catalizador en el experimento número
3.

Figura 12. Filtramos el contenido

2. Obtención de Coenzima NAD.
Figura 13. Resultado del mortero en un embudo con
final de los tubos con
De la pierna de pollo, obtenemos 3 gramos que se colocaron en un una grasa
la enzima LDH.
vidrio de reloj y con ayuda de un bisturí vamos a cortar en pedacitos
el pollo para colocarlo en matras. (Figura 7).

En un matraz colocamos 24 ml de agua destilada, y después se le

agregan los pedacitos de pollo. (Figura 8). Después de esto se
va a poner a ebullir durante 5 minutos. Dentro de estos minutos Figura 7. Se corta el pollo en
pedazos muy chiquitos.
nos percatamos que el pollo se cocina y burbujea la solución,
dando un olor a caldo de pollo. (Figura 9).

Figura 8. Se coloca el pollo

en el matraz junto con 24ml
de agua destilada.
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Después de esos 5 minutos, se coloca en un mortero con arena de

cuarzo para moler la solución, una vez terminado de moler por medio de
una gasa y un embudo (Figura 10), se filtrará el líquido en dos tubos de
ensayo.

Una vez repartida la solución en ambos tubos, se llevan a

Figura 9. Se pone a calentar
centrifugar durante 15 minutos, ya pasando los 15 minutos la solución por 5 minutos.
nuestros tubos toman un color blanquecino y con una pipeta
quitamos el sobrenadante para así tener la coenzima NAD. (Figura
11).

Figura 10. Se filtra la

Figura 11. Resultado final de
solución del matraz para
esta parte de la práctica con la
poder obtener el líquido
obtención de la coenzima.
nada más.

3. Detección Enzimática del LDH.

Preparamos 4 tubos siguiendo la tabla
(Figura 12)
 Tubo #1
Se puso a la enzima de LDH en un
ambiente con Cianuro de potasio,
Figura 12. Tabla de las sustancias que deben agregarse a nuestros 4 tubos de
Lactato de sodio, Azul de metileno, y ensayo.

agua destilada por lo que se observó en

presencia de estos reactivos, la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa
puede disminuir significativamente debido a la inhibición competitiva y no
competitiva de la enzima.
 Tubo #2
En este caso juntamos la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y la
enzima de lactato deshidrogenasa al mezclarse con los reactivos mencionados en
la tabla correspondientes al tubo 2 observamos que puede afectar la actividad de la
enzima LDH y la disponibilidad de la coenzima NADH, lo que puede tener un
impacto en la producción de ATP y en la respiración celular en la célula.
 Tubo #3
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Aquí nuevamente hicimos lo indicado en la tabla teniendo casi los mismos

componentes que en el tubo anterior aquí solo quitaremos al lactato de sodio y se
tiene la hipótesis de que hacen una reacción similar puede afectar la actividad de la
enzima LDH y la disponibilidad de la coenzima NADH, lo que puede tener un
impacto en la producción de ATP y en la respiración celular en la célula.
 Tubo #4
Ya por último tenemos el tubo #4 en donde se colocó solamente a la coenzima de
NAD a reaccionar con los reactivos indicados en la tabla y obtuvimos que la
presencia de cianuro de potasio, lactato de sodio y azul de metileno puede disminuir
la disponibilidad de la coenzima NAD+ en la célula, lo que puede tener un impacto
en la producción de ATP y en la respiración celular. Además, la presencia de lactato
de sodio y azul de metileno también puede afectar la disponibilidad de NADH, lo
que puede afectar la capacidad de la enzima lactato deshidrogenasa para catalizar
su reacción.

Ilustración. 1 Así son los resultados finales de nuestra

práctica.

DISCUSIÓN.
En el experimento pudimos observar las diferentes coloraciones que nos dio en
cada tubo y como estos son de un tono fuerte a un tono claro. Debido a estas
coloraciones pudimos determinar las relaciones que existen entre la actividad LDH
y la presencia de NAD ya que cada tubo se tiñó de un tono diferente debido a la
presencia o ausencia de algún reactivo como el NAD, el LDH, agua destilada y el
lactato de sodio.
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La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la reducción del piruvato a lactato

utilizando como como aceptor de hidrógenos a la coenzima NADH a NAD+ y esto
se puede observar en los resultados del tubo 1 y 4 ya que no hay cambios
contundentes en su coloración por la falta de alguno de los dos. De igual manera,
el equilibrio de la reacción del lactato deshidrogenasa es dependiente del PH, por
lo cual en un PH alcalino favorece la conversión de lactato a piruvato y un ph neutro
favorece la reacción inversa y esto se comprueba en los tubos 2 y 3 del experimento
ya que ambos están de un tono diferente al resto por lo cual se comprueba lo antes
dicho.

CUESTIONARIO.
1. Explique cómo funciona el Ciclo de Cori.
Ciclo que tiene lugar en el metabolismo de los
hidratos de carbono, en el que el glucógeno
muscular se oxida a ácido láctico; este llega al
hígado, donde se convierte, vía gluconeogénesis,
en glucosa, la cual es transportada nuevamente al
músculo, donde se almacena como glucógeno.
El exceso de ácido láctico producido en músculo
se debe a una contracción muscular rápida en condiciones de baja concentración
de oxígeno. Para obtener el máximo de energía en forma de ATP a partir de la
Glucosa es necesario metabolizar completamente mediante la Glucólisis, Ciclo de
Krebs y Cadena de Transporte de Electrones, y que se requiere Oxígeno molecular
que funcionará como aceptor final de electrones, sabemos que durante un ejercicio
repentino y extenuante el Oxígeno se termina rápidamente y el músculo realiza una
Glucólisis anaerobia para producir, al menos, un poco de ATP, esta actividad de
emergencia genera como residuo al ácido láctico, que debe ser expulsado de la
célula ya que es capaz de disociarse a lactato y un protón que disminuirá el pH. Por
supuesto, al expulsar el ácido láctico a torrente sanguíneo se corre el riesgo de
acidificar la sangre ocasionando la acidosis láctica.
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En el ciclo de Cori intervienen al menos dos rutas metabólicas, la Glucólisis (en

músculos) y la Gluconeogénesis (en hígado), e involucra también a la
Glucogenólisis (en músculo) para obtener la glucosa necesaria
para el ejercicio repentino y la Gluconeogénesis en hígado a partir
de la Glucosa sintetizada.

Para tener un contexto más amplio, daremos el típico ejemplo del

perro que te corretean, “vas caminando por la calle y al dar la
vuelta en la esquina resulta que hay un enorme perro que piensa
que has traspasado su territorio así que decide dejarte un
mensaje que vas a recordar mucho tiempo y te mete la corretiza
de tu vida”. ¿Qué es lo que ocurre en tu organismo?

Tus músculos consumen rápidamente la glucosa libre en citoplasma y la quemarán

completamente hasta CO2 y agua (mediante Glucólisis, Ciclo de Krebs y Cadena
de Transporte de Electrones) con el consumo de Oxígeno correspondiente.
Posteriormente hidrolizan al glucógeno para obtener más glucosa y con ello más
energía, con más consumo de Oxígeno. Si no eres un atleta o no sueles hacer
ejercicio frecuentemente, tu organismo no está adaptado para abastecer del
Oxígeno necesario a tu cuerpo, por lo que se genera una "escasez de Oxígeno" y
cómo “el perro te sigue correteando”, pues debes seguir corriendo, así que tus
músculos comienzan a producir ATP de manera anaerobia, generando ácido láctico.
El hígado mandará al torrente sanguíneo su Glucosa para que el
músculo también pueda usarla y además comienza a degradar
parte del glucógeno que tiene almacenado para mantener este
aporte constante.

Afortunadamente, “el perro solo te corretea unos doscientos metros”, poquito, diría
yo. Ahora estás a salvo, pero cansadísimo.

Tus músculos producen mucho ácido láctico que está en tu sistema, ahora el hígado
incorpora estas moléculas y las usa para sintetizar la Glucosa que gastó, ya que
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hay células como las neuronas del cerebro que dependen casi por completo de esta
molécula, y en poco tiempo regresas a la normalidad, como si ningún perro enorme
te hubiera correteado.

A todo esto, el ciclo de Cori corresponde a más de 2 rutas metabólicas (Glucólisis,

Ciclo de Krebs, Gluconeogénesis, Glucogenólisis).

2. ¿De dónde obtiene energía el hígado para la síntesis de glucosa a partir del
lactato?
Resultante de la oxidación de acetil-coA es necesaria para que funcione la
gluconeogénesis y se transforme todo el lactato en glucosa. No obstante, no todo el
lactato que entra al hígado se transforma en glucosa de nuevo.
3. Explique el fundamento químico de la reacción entre el azul de metileno y
el NAD.
El azul de metileno es aceptor de equivalentes reducidos y se decolora en presencia
de estos. En la reacción de oxidación de lactado a piruvato ocurre la reducción de
la coenzima NAD+ a NADH+ produciendo la decoloración de azul de metileno.
4. En qué otra parte del organismo, a parte del músculo, se realiza la
conversión
De piruvato en lactato y cuál es el fin metabólico de la reacción en este tejido.
La conversión de piruvato a lactato también ocurre en los glóbulos rojos. En este
caso, la conversión tiene un fin metabólico muy importante: los glóbulos rojos
carecen de mitocondrias, lo que significa que no pueden obtener energía a través
del proceso de la fosforilación oxidativa en la cadena respiratoria. En lugar de esto,
los glóbulos rojos generan ATP a través de la glicólisis anaerobia, que convierte la
glucosa en piruvato y luego en lactato. El lactato generado en los glóbulos rojos se
libera al plasma sanguíneo y es llevado al hígado para su conversión de nuevo a
glucosa a través del proceso de la gluconeogénesis, que luego puede ser utilizada
por otros tejidos como fuente de energía. Este proceso es crucial para el suministro
de energía de los glóbulos rojos y el mantenimiento de la homeostasis en el cuerpo.
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CONCLUSIONES.
La deshidrogenasa láctica (LDH) es una enzima que facilita el proceso de
transformación de glucosa en energía para que las células puedan utilizar esa
energía. La LDH se encuentra en muchos órganos y tejidos del cuerpo, incluidos el
hígado, el corazón, el páncreas, los riñones, los músculos esqueléticos, el cerebro
y las células sanguíneas. Los niveles elevados de LDH indican algún tipo de daño
en los tejidos; los niveles elevados en más de una isoenzima pueden representar
más de una causa vinculada con el daño en los tejidos.
En muchas ocasiones nuestro cuerpo necesita energía en forma de glucosa en
grandes cantidades y no siempre se tiene o se cuenta con dicha cantidad de glucosa
por lo cual nuestro cuerpo recurre a las reservas de glucosa que poseemos en forma
de glucógeno, no obstante en ayunos prolongados no se puede obtener la energía
de esta forma debido a que no se cuenta con ella por lo que nuestro cuerpo buscará
conseguirla de otra manera, en este caso se usarán otras vía como es la
gluconeogénesis que uno de sus precursores es el lactato o el ciclo de cori que
utiliza el ácido láctico para producir glucosa y de esta forma obtener energía.
El ciclo de cori es un proceso que inicia nivel del músculo esquelético como
precursor del lactato para viajar por el torrente sanguíneo y llegar al hígado; en el m
músculo ocurre un proceso de transaminación del piruvato para producir alanina,
que viaja al torrente sanguíneo hasta llegar al hígado donde el lactato se oxida a
piruvato y luego a glucosa.
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BIBLIOGRAFÍA.

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 Maestre, R. (2004). Expresión y determinación de la actividad enzimática de
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desarrollo embrionario [Tesis de licenciatura, Pontificiaca Universidad
Javeriana].https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8590/t
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 Temas selectos de ciencias, la biología explicada de manera fácil, Ciclo de
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Lactohormona - Molecula señalizadora - Fisiología - Glut4 Science.
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https://glut4science.com/publicaciones/fisiologia-del-ejercicio/lactato-mucho-
mas-metabolito-glucolisis-lactohormona-fisiologia/69