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Capítulo 12

Enzimología diagnóstica de animales

domésticos.

Walter E.Hoffmann Philip F. Solter

Departamento de Patobiología Veterinaria Departamento de Patobiología Veterinaria
Facultad de Medicina Veterinaria Facultad de Medicina Veterinaria
Universidad de Illinois, Urbana, Illinois Universidad de Illinois, Urbana, Illinois

reactivos analíticos. Este capítulo explora primero los factores

I. INTRODUCCIÓN universales que afectan los cambios en el contenido de enzimas de los
II. HISTORIA DE LA ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
fluidos corporales y luego profundiza en detalles específicos relevantes
III. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DEL SUERO
para enzimas particulares. La discusión de conceptos básicos en
A. Masa de órganos y concentración de tejido enzimático
enzimología, como estructura enzimática, cinética o análisis, se limita a
B. Ubicación de la celda
aquellos que son de relevancia clínica o que aportan información para
C. Mecanismos de liberación de enzimas citoplásmicas u otros
interpretar los cambios en la actividad enzimática de los fluidos
biomarcadores proteicos de las células a la sangre
corporales. Se puede encontrar información adicional sobre la
D. Mecanismos de liberación de enzimas unidas a membranas
estructura y la cinética de las enzimas en numerosos textos de
E. Tasas de aclaramiento de la sangre de las enzimas
bioquímica, así como en textos clínicos comoTietz Fundamentos de
F. Inducción enzimática
Química Clínica (Burtis y Ashwood, 2001) y la edición anterior de este
IV. ENZIMAS ESPECÍFICAS
libro. Además, la metodología de los diversos ensayos enzimáticos se
A. Alanina aminotransferasa
puede encontrar en la literatura proporcionada por los proveedores de
B. Aspartato aminotransferasa
reactivos para ensayos enzimáticos.
C. Sorbitol deshidrogenasa
D. Glutamato Deshidrogenasa
E. Gamma glutamiltransferasa II. HISTORIA DE LA ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
F. Fosfatasa alcalina
Aunque la presencia de enzimas en células y plasma se
G. lipasa
reconoció por primera vez en el siglo XIX, el desarrollo de la
H. amilasa
enzimología clínica comenzó después de la introducción de
I. Tripsina y tripsinógeno
un ensayo para la amilasa sérica por Wohlgemuth en 1908
J. Creatina quinasa
y el informe de 1916 de que la actividad de la amilasa sérica
K. Otras enzimas
en sangre y orina era una prueba confiable para los
V. FUTURO DE LAS REFERENCIAS DE
trastornos pancreáticos (Rosenfeld, 1999). Este hallazgo fue
ENZIMOLOGÍA DEL SUERO
seguido en 1927 por el descubrimiento de la fosfatasa
alcalina (ALP) en el hueso y la descripción de la fosfatasa
I. INTRODUCCIÓN alcalina sérica como prueba de diagnóstico (Rosenfeld,
1999). El desarrollo y comercialización por parte de Sigma
La detección de proteínas en suero por su actividad catalítica como Chemical Company en St. Louis en la década de 1950 de
indicador de daño tisular es una piedra angular de los análisis de ensayos enzimáticos simplificados en forma de kit, como
laboratorio médico (Rej, 1998). aspartato y alanina aminotransferasas, y un ensayo de ALP
La enzimología clínica es la disciplina que estudia y prueba la que utilizaba p-nitrofenilfosfato como sustrato (Boletín
actividad enzimática en suero, plasma, orina u otros fluidos Técnico 104),et al., 1946; Reitman y Frankel, 1957). Además
corporales con el fin de ayudar a establecer el diagnóstico y del desarrollo de reactivos de ensayo, una contribución
pronóstico de enfermedades y detectar funciones anormales de los igualmente significativa al desarrollo de la enzimología
órganos. Aunque no es el tema de este capítulo, cabe señalar que clínica fue la invención por Leonard Skeggs de un
algunas enzimas también son de gran importancia como autoanalizador multicanal que era

Copyright © 2008, Elsevier Inc.

Bioquímica clínica de animales domésticos, sexta edición. 351 Reservados todos los derechos.
352
comercializado por Technicon en 1964 (Skeggs, 2000). El
autoanalizador aumentó la disponibilidad de análisis de enzimas
séricas de costo reducido, lo que finalmente condujo a su uso
rutinario en medicina de diagnóstico humano y veterinario.
El avance de la enzimología clínica incluyó el desarrollo y evaluación
de ensayos enzimáticos para su uso en especies animales no humanas,
algunos de los cuales han resultado útiles, mientras que otros se han
abandonado por diversas razones. En algunos casos, la decisión de
investigar una enzima para uso diagnóstico puede estar relacionada no
sólo con su posible relevancia clínica sino también con la eficiencia de
ofrecer la prueba. A pesar del reconocimiento de las diferencias entre
especies, la medicina veterinaria a menudo ha seguido a la medicina
humana en la elección de las pruebas de diagnóstico. El sesgo hacia los
ensayos enzimáticos utilizados en medicina humana se debe en parte a
su disponibilidad en analizadores automatizados, lo que hace que todas
las pruebas sean ensayos bajo demanda de bajo costo con un alto grado
de precisión y exactitud.
La automatización de los ensayos enzimáticos y la
popularidad del perfil de química sérica en la medicina
veterinaria han permitido realizar estudios
retrospectivos y han brindado al veterinario la
oportunidad de evaluar críticamente la función
diagnóstica de los ensayos comunes en un gran número
de animales en un gran número de animales.
regularmente, además de obtener una “sensación” de
los resultados, permitiendo así interpretaciones clínicas
más sutiles. Es probable que las pruebas de diagnóstico
que no están automatizadas se comprendan menos y se
interpreten de una manera más rígida, con menos
apreciación de los matices y la importancia del resultado
de la prueba. Curiosamente, durante los primeros 30
años aproximadamente de pruebas de enzimas séricas
en medicina veterinaria, estas pruebas a menudo se
consideraban pruebas de “diagnóstico”.
Aunque la actividad de las enzimas séricas se informa como parte
de numerosos estudios publicados en la literatura, el número de
estudios dirigidos principalmente a responder preguntas específicas
sobre las enzimas parece haber disminuido desde finales de los años
1990 desde lo que podría considerarse el apogeo de la enzimología
clínica en los años 1960. hasta mediados de los años 1990.
III. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DEL SUERO
A medida que se desarrolló el campo de la enzimología clínica, también
lo hizo nuestra comprensión de los factores fisiológicos responsables de
las alteraciones en la actividad de las enzimas séricas que ocurren con la
enfermedad, aunque quedan varias preguntas sin respuesta. La
especificidad de órganos, la ubicación subcelular de la enzima, el
mecanismo de liberación de enzimas de las células, la eliminación de la
sangre y la velocidad de inducción de la síntesis de enzimas afectan en
mayor o menor medida la precisión diagnóstica de los diversos ensayos
enzimáticos (Hoffmann y Solter). , 1989; Solter, 2005). Esta sección
analiza los aspectos fisiológicos,
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
Factores bioquímicos y anatómicos que afectan los cambios en la
actividad de las enzimas séricas.
A. Masa de órganos y concentración de
tejido enzimático
Las funciones que desempeñan la concentración de enzimas en los
tejidos y la masa de los órganos en la magnitud de la actividad
enzimática sanguínea son relativamente sencillas. Los órganos con una
alta concentración de una enzima tienen el potencial de provocar un
mayor aumento en la actividad de las enzimas séricas en caso de
enfermedad. Por ejemplo, el gradiente de concentración intracelular a
extracelular de alanina aminotransferasa hepatocelular (ALT) es
100.000:1. Por lo tanto, la lesión de los hepatocitos tiene el potencial de
causar un marcado aumento de la actividad sérica de ALT. Cuanto
mayor sea el gradiente de concentración de la enzima o marcador
proteico entre la célula y el espacio intersticial, más rápida será la
translocación de cantidades significativas de la enzima al espacio
intersticial y, en última instancia, a la sangre (Mair, 1999). Asimismo, el
hígado tiene una gran masa, lo que contribuye al posible aumento de la
actividad sérica de ALT.
B. Ubicación de la celda
La ubicación de las enzimas celulares en relación con la sangre, la orina
u otros líquidos es un determinante especialmente significativo de si se
producirá un aumento en la actividad enzimática con la liberación de
enzimas y en qué líquido se encontrará. Un ejemplo bien conocido es la
gamma glutamiltransferasa (GGT) tubular renal ubicada en la superficie
luminal de las células epiteliales tubulares renales. La lesión de estas
células provoca la liberación de gamma GT en la orina pero no en la
sangre. De manera similar, la fosfatasa alcalina (ALP) ubicada en la
superficie luminal de los enterocitos se pierde hacia la luz intestinal en
lugar de hacia la sangre con la lesión de los enterocitos. Sin embargo, la
FA hepatocelular, con actividad tanto en las superficies canaliculares
como sinusoidales de la bilis, puede aumentar tanto en la bilis como en
la sangre.
C. Mecanismos de liberación de enzimas
citoplásmicas u otros biomarcadores proteicos de
las células a la sangre
Las enzimas citoplasmáticas están contenidas dentro de las membranas
celulares. Se cree que las membranas plasmáticas sanas son
impermeables a macromoléculas como las enzimas. Por tanto, es
necesaria una alteración de la membrana celular para permitir que las
enzimas citoplasmáticas accedan a la sangre. En caso de necrosis
celular, las perforaciones y desgarros de la membrana celular permiten
la liberación del contenido citosólico en un proceso relativamente
sencillo. Sin embargo, los aumentos de las enzimas séricas no siempre
se correlacionan con el grado de evidencia histológica de necrosis
celular. Por lo tanto, se ha postulado durante mucho tiempo que, bajo
ciertas circunstancias, las enzimas citoplasmáticas pueden "fugarse" de
III.Factores que afectan la actividad enzimática sérica
células enfermas que permanecen viables, tal vez a través de poros o
desgarros de la membrana. Sin embargo, es difícil imaginar que una
célula pueda desarrollar un poro o un desgarro lo suficientemente
grande como para permitir la "fuga" de macromoléculas como enzimas,
manteniendo al mismo tiempo las proporciones de electrolitos
intracelulares y extracelulares necesarias para seguir siendo viable. Un
mecanismo alternativo por el cual una célula podría sufrir un daño del
cual sobrevive y aún así permite la liberación de enzimas citoplasmáticas
es la formación de ampollas de membrana (Coltranet al., 1999; goreset
al., 1990; Lemasterset al., 1983; Mair, 1999). Luego, estas ampollas se
rompen o se liberan como vesículas en la sangre, donde eventualmente
se descomponen y liberan su contenido, incluidas las enzimas
citoplasmáticas. El conjunto de conocimientos que respalda este
concepto ha ido creciendo desde la década de 1980 (Gore et al., 1990;
Kristensen, 1994; Mair, 1999; Solter, 2005).
Se ha reconocido la formación de ampollas en la membrana celular
después de ataques hipóxicos y probablemente refleja dos desarrollos
secuenciales. El agotamiento de las reservas de energía en forma de
ATP es seguido por varios eventos, incluido el ingreso de calcio a la
célula (Coltranet al., 1999). Esta entrada de calcio da como resultado la
activación de fosfolipasas, endonucleasas y proteasas intracelulares y,
en última instancia, una alteración del estado de fosforilación de las
proteínas citoesqueléticas y una alteración del contenido de la
membrana lipídica. Una combinación de las proteínas citoesqueléticas
alteradas, el contenido de la membrana lipídica y la inflamación
osmótica de la célula conducen a la formación de ampollas, su liberación
y el resellado de la membrana celular (fig. 12-1). La formación de
ampollas de hepatocitos, la proyección de estas ampollas a través de las
fenestraciones de las células endoteliales y la liberación de estas
ampollas durante la hipoxia se muestran claramente en las micrografías
electrónicas de barrido (Lemasterset al., 1983). La formación de
ampollas se ha descrito en muchas afecciones, incluidas isquemia,
shock, infecciones virales, toxemia y colestasis. La magnitud del
aumento de las enzimas séricas con lesión celular reversible y formación
de ampollas no se comprende claramente, pero es probable que la
magnitud de la liberación y el aumento resultante de la actividad en el
suero sean considerablemente menores de lo que podría observarse
con la necrosis celular. Por lo tanto, es razonable suponer que cuanto
mayor es la magnitud del aumento de las enzimas séricas, mayor es la
probabilidad de que se produzca una muerte celular irreversible,
mientras que los aumentos leves de la actividad de las enzimas séricas
pueden estar asociados con una lesión celular reversible.
Aunque las células pueden liberar enzimas citoplasmáticas a la
sangre debido a la formación de ampollas, las enzimas asociadas
con las mitocondrias no se liberan mediante este mecanismo
(Kamiikeet al., 1989). Para la liberación de la aminotransferasa
aspártica mitocondrial (mAST) de los hepatocitos es necesaria una
pérdida apreciable de la integridad de la membrana y,
presumiblemente, la muerte celular. El hígado isquémico no pierde
mAST hasta que se pierde casi toda la aminotransferasa aspártica
citoplasmática (cAST).
Independientemente del mecanismo de liberación de las
enzimas, existe evidencia de que las enzimas se liberan en el
espacio intersticial, donde la mayor parte es transportada por
los vasos linfáticos al conducto torácico y se vacía en la sangre.
353
ALTA
ALTA
AST
ALTA
ALTA
SDH
AST
Sinusoide
ALTA
SDH AST
AST
AST
ALTA
AST ALTA
SDH
AST
FIGURA 12-1 Formación de ampollas de membrana en lesiones reversibles, lo que permite
la liberación de enzimas citoplasmáticas directamente a la sangre o al espacio
intersticial donde pueden ser transportadas por los vasos linfáticos a la sangre.
(Bolter y Critz, 1976; Lindenaet al., 1986). Las proporciones linfáticos-
suero de la mayoría de las enzimas son superiores a 1:1, lo que favorece
el transporte de enzimas a la sangre a través de los linfáticos. Sin
embargo, no se puede descartar la liberación directa de la enzima desde
la célula lesionada a la sangre y está respaldada por las micrografías
electrónicas de ampollas celulares que se extienden a través de las
fenestraciones del endotelio, como se analizó anteriormente. Esta
entrega de la enzima desde la célula lesionada a la sangre, ya sea
directa o indirectamente a través de los linfáticos, probablemente afecta
el tiempo de máximo aumento sérico de la enzima después de la lesión
y la duración de la presencia del aumento de la enzima en la sangre,
como lo sugiere el período más prolongado. vida media de la CK cuando
se inyecta por vía intramuscular en lugar de la inyección intravenosa
(Aktaset al., 1995).
D. Mecanismos de liberación de enzimas
unidas a membranas
Las enzimas adheridas a la superficie externa de las membranas
celulares, como la fosfatasa alcalina (ALP), la gammaglutamil
transferasa (GGT) y la 5!nucleotidasa (5!N), se liberan de las células
a la sangre mediante mecanismos claramente diferentes a los de
las enzimas derivadas del citoplasma.
De interés histórico, quizás primero se pensó que los aumentos
de la actividad de la FA sérica eran resultado de una falla en la
excreción de FA ósea por el hígado. Este concepto fue abandonado
hace muchos años y seguido por el concepto de que las enzimas
coléfilas se eliminaban de la superficie canalicular biliar de los
hepatocitos o de las células epiteliales biliares hacia la bilis y luego
regurgitaban a la sangre a través de uniones estrechas. Apoyo para
354
Esta vía fue proporcionada por evidencia de cambios disruptivos en las
uniones estrechas en la colestasis y por observaciones experimentales
de peroxidasa de rábano picante infundida que se mueve a través de
uniones estrechas (Boyer, 1993; Loweet al., 1988). Sin embargo, se ha
demostrado que se producen aumentos de la actividad sérica de ALP y
GGT en ausencia de aumento de la presión biliar y cualquier evidencia
de alteraciones en las uniones estrechas, y es poco probable que esta
vía paracelular contribuya significativamente a la aparición de enzimas
coléfilas en el suero. en la mayoría de los casos (Debroeet al., 1985;
Putzki, 1989; toyotaet al., 1983). Se ha sugerido una vía alternativa de
movimiento de enzimas coléfilas a la sangre como un sistema de
transporte vesicular retrógrado tras la observación de que la infusión
retrógrada de ferritina y formas poliméricas y secretoras de IgA sufren
transcitosis inversa desde la superficie biliar o apical de los hepatocitos
hasta la superficie basolateral o apical. superficie sinusoidal durante la
colestasis (Carpinoet al., 1981; joneset al., 1984). Sin embargo, ninguna
de estas vías permite explicar la aparición de la actividad de ALP y GGT
en sangre en ausencia de colestasis. Los estudios que utilizan un
modelo de derivación coledococava muestran que dentro de las 12
horas posteriores a la derivación de bilis o ácido taurocólico a la sangre,
hay una marcada inducción de la síntesis de FA, aparición de FA en las
membranas basolaterales y un aumento paralelo en la actividad de FA
sérica (Ogawaet al., 1990). Esto ocurre en ausencia de aumento de la
presión biliar y cualquier evidencia de alteraciones en las uniones
estrechas (Toyotaet al., 1983). Estas observaciones, junto con otras,
condujeron a un tercer y más probable mecanismo de aparición de
enzimas coléfilas, especialmente ALP, en la sangre. La apariencia
basolateral de las enzimas que normalmente se consideran en la
membrana apical o en la superficie canalicular biliar no es inesperada,
ya que después de la síntesis se cree que todas las proteínas de la
membrana apical se transportan primero a las superficies basolaterales
antes del transporte vesicular a su sitio final en la membrana canalicular
biliar. bartleset al., 1987; Mauricioet al., 1994; Schellet al., 1992). Por lo
tanto, estas denominadas enzimas o proteínas biliares tienen un breve
período de residencia en la superficie sinusoidal de los hepatocitos con
la enzima en la superficie externa en el espacio de Disse, de modo que
potencialmente pueden liberarse en la sangre si se produce una
liberación adecuada. mecanismo existe. Además, la cantidad de enzima
disponible en la membrana basolateral y accesible para su liberación a
la sangre aumenta en cualquier momento en que hay una mayor
síntesis de la enzima como se describió anteriormente con el modelo de
derivación coledococava, como ocurre con la colestasis y como puede
ocurrir durante el proceso hormonal o inducción de la síntesis de
enzimas impulsada por fármacos (Ogawaet al., 1990; Putzkiet al., 1989;
Solter y Hoffmann, 1999; solteret al., 1997). Aunque posicionado sobre
la membrana basolateral frente al espacio de Disse por un breve
período permite la posibilidad de liberación a la sangre, esto no ocurre
sin las condiciones apropiadas para escindir el anclaje hidrofóbico. La
fosfatasa alcalina y la 5!nucleotidasa están ancladas a la membrana
mediante un anclaje de fosfatidilinositol glicano hidrófobo, mientras que
la GGT está anclada mediante un péptido transmembrana, por lo que
requiere
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
diferentes mecanismos de liberación. Estos mecanismos de liberación se
discutirán específicamente en las secciones que tratan de cada una de
estas enzimas.
E. Tasas de aclaramiento de la sangre de las enzimas
La cantidad de actividad enzimática en la sangre depende en
gran medida de la tasa de eliminación de la enzima de la
sangre después de su liberación de las células. La vida media
de diversas enzimas varía desde minutos hasta horas y días, y
los mecanismos o factores que determinan la vida media de las
distintas enzimas varían.
Los mecanismos reales de eliminación de enzimas de la sangre no
están bien establecidos, pero probablemente sean variados. Algunas
enzimas de pequeño peso molecular, como la amilasa y la lipasa, se
filtran, en parte, a través del glomérulo. Es probable que las enzimas
que son glicoproteínas sean endocitadas por los receptores de
galactosa en los hepatocitos, ya sea directamente a través de moléculas
de galactosa expuestas o después de la pérdida de moléculas
terminales de ácido siálico que resultan en residuos de galactosa
expuestos, o son endocitadas por receptores de manosa en las células
de Kupffer. Otras enzimas pueden ser degradadas por proteasas o son
lábiles y se pierde actividad mientras la proteína continúa circulando. La
tasa de eliminación de enzimas de la sangre puede verse afectada por
una enfermedad y puede complicar la interpretación correcta de los
resultados de las pruebas de diagnóstico. Por ejemplo, la actividad de la
amilasa pancreática, que normalmente es eliminada por los riñones,
aumentará en pacientes con insuficiencia renal debido a la disminución
de la tasa de filtración glomerular. Podría producirse un resultado falso
positivo de la prueba de pancreatitis.
F. Inducción enzimática
En algunos casos, los cambios en la actividad de las enzimas séricas
pueden reflejar cambios en la producción de enzimas por parte de las
células, en lugar de una lesión celular. Aunque ciertamente hay
evidencia de concentraciones variables de enzimas citoplasmáticas en
las células, éstas generalmente no producen cambios dramáticos en la
actividad sérica de estas enzimas. Los aumentos marcados de las
enzimas séricas como resultado de la inducción se asocian con mayor
frecuencia con enzimas unidas a la membrana, donde pueden liberarse
fácilmente desde la membrana hacia los linfáticos o la sangre o ser
secretadas por la célula. Esta inducción puede ser el resultado de
cambios hormonales, eventos fisiopatológicos como la colestasis o
puede ser inducida por fármacos.
IV. ENZIMAS ESPECÍFICAS
A. Alanina aminotransferasa
La alanina aminotransferasa (EC2.6.1.2) (ALT), anteriormente
conocida como piruvato transaminasa glutámico, cataliza la
transaminación reversible de L-alanina y 2-oxoglutarato a
piruvato y L-glutamato. ALT, junto con otras transaminasas,
IV.Enzimas Específicas
Desempeña un papel en el catabolismo de los aminoácidos y el
transporte de nitrógeno entre órganos. El piridoxal 5!-fosfato (PP)
es el cofactor de ALT, formando así la holoenzima activa. El PP
generalmente está presente en el suero en cantidades suficientes
para proporcionar una actividad casi máxima de ALT, con sólo un
11% y un 7% de apoenzima inactiva en el suero de perros y gatos,
respectivamente (Stokol y Erb, 1998). No se encontraron diferencias
entre el porcentaje de apoenzima inactiva en el suero de animales
normales y aquellos con enfermedad hepática. Sin embargo, se
identificaron dos perros con un 14,225 % y un 336 % más de
actividad sérica de ALT cuando se añadió PP (Mesheret al., 1998).
Aproximadamente la mitad de la ALT en el suero de un grupo de
caballos pura sangre en ejercicio estaba en forma de apoenzima
inactiva (Rejet al., 1990). Por lo tanto, debido a que hay casos en los
que el PP parece limitar la actividad de ALT medida, algunos, pero
no todos, los ensayos comerciales para ALT ahora contienen
reactivo de PP agregado.
La actividad de ALT se encuentra en varios órganos del cuerpo, pero
la magnitud de la actividad varía dramáticamente según la especie. En
los perros, la actividad de ALT por gramo de hígado es al menos cuatro
veces mayor que en otros órganos, aunque se encuentra una actividad
considerable tanto en el corazón como en el músculo esquelético
(Clampitt y Hart, 1978; Keller, 1981; Zinklet al., 1971). Hallazgos similares
son válidos para los gatos, pero en los caballos, el ganado vacuno y los
cerdos, la actividad de ALT por gramo de tejido difiere poco en el hígado
en comparación con el músculo. Por lo tanto, basándose en las
concentraciones tisulares de ALT, el aumento de la actividad sérica de
ALT es algo específico para la lesión hepática en perros y gatos, pero no
ofrece especificidad para la detección de lesión hepática en caballos y
ganado.
La ALT, que se encuentra en el citoplasma de los hepatocitos,
también se encuentra en las mitocondrias, pero generalmente en
concentraciones considerablemente más bajas, según la especie y
el tejido. Aunque se ha sugerido que la enzima mitocondrial puede
liberarse a la sangre más lentamente después de una lesión
hepatocelular, esta actividad aún no se comprende bien y no se ha
utilizado como herramienta de diagnóstico.
La vida media de ALT en sangre no está claramente definida,
aunque el tiempo de circulación es obviamente lo suficientemente
largo para evaluar la lesión de órganos y la liberación de ALT a la
sangre durante horas o días después del evento. En perros, los
informes han sugerido vidas medias de 3, 20, 45 y 60 h (Fleisher y
Wakim, 1963; Reichard, 1959; Zinklet al., 1971). Gráficos
semilogarítmicos de la disminución de la actividad de ALT sérica
después de la actividad máxima inducida por CCl agudo4La
exposición sugiere una vida media de entre 45 y 60 h en perros,
aunque esto puede ser una ligera sobreestimación, ya que es
probable que todavía haya tejido lesionado que contribuya a la
acumulación de sangre (datos no publicados). La vida media de la
ALT procedente de extractos de hígado felino, administrada por vía
intravenosa a gatos, se estimó en 3 a 4 h (Nilkumuhaug y Thornton,
1979). Esto es consistente con la vida media de 6 h para la actividad
de ALP en la sangre de gatos (Hoffmanet al., 1977).
La ALT sérica ha sido reconocida como un marcador de lesión
hepatocelular desde la década de 1950 (Chimskyet al., 1956;
355
Cornelio, 1958). El uso de ALT como herramienta de diagnóstico se
aceleró con el desarrollo a mediados de la década de 1950 de un ensayo
acoplado simple para la actividad de ALT en suero que eliminó el
problema de la inhibición del producto (Reitman y Frankel, 1957).
Numerosos estudios que utilizan tetracloruro de carbono han
demostrado claramente el valor de la ALT sérica como indicador de
necrosis hepatocelular, especialmente en perros y gatos, pero en mucha
menor medida en caballos, bovinos, porcinos, ovinos y caprinos
(Corneliuset al., 1958; Everettet al., 1977; Noona, 1981; Noonan y Meyer,
1979; españolet al., 1983; turgut et al., 1997; Zinklet al., 1971). El período
de tiempo durante el cual aumenta la actividad sérica de ALT varía de 9
a 23 días en perros, lo que sugiere una lesión hepática prolongada pero
también respalda la vida media más larga sugerida anteriormente
(Guelfi et al., mil novecientos ochenta y dos; Noona, 1981; turgutet al.,
1997). Se producen aumentos relativamente leves en la actividad de ALT
sérica en perros y gatos con enfermedades obstructivas biliares que
causan que la actividad de ALP sérica aumente notablemente (Everettet
al., 1977; españolet al., 1983). Por lo tanto, la relación entre la actividad
sérica de ALT y ALP es mucho mayor en los casos de necrosis hepática
que en los de colestasis, lo que sugiere que se pueden sacar
conclusiones interpretativas muy generales comparando la magnitud
del aumento de la actividad sérica de estas dos enzimas. El aumento de
la actividad sérica de ALT se produce con una amplia gama de otros
trastornos que incluyen hipoxia secundaria a anemia, enfermedades
metabólicas como la lipidosis, trastornos nutricionales como la toxicosis
por cobre, enfermedades inflamatorias o infecciosas, enfermedades
neoplásicas y lesión hepática traumática. El aumento de la actividad
sérica de ALT también se ha asociado con numerosos fármacos; en
muchos casos, es probable que se trate de reacciones idiosincrásicas
que causan toxicidad hepatocelular. La exposición al tetracloruro de
carbono, a los alcaloides de los hongos o al paracetamol es claramente
un evento hepatotóxico.
También se observan aumentos leves a moderados en la
actividad sérica de ALT en perros y gatos con enfermedades
endocrinas como diabetes mellitus, hipertiroidismo,
hiperadrenocorticismo e hipotiroidismo. Por ejemplo, 163 (78%)
perros con diabetes mellitus tienen una actividad sérica de ALT
aumentada (Hesset al., 2000). Los gatos con cetoacidosis diabética
comúnmente tienen una mayor actividad sérica de ALT (Bruskiewicz
et al., 1997). El aumento de la actividad sérica de ALT es común en
perros con hiperadrenocorticismo o perros tratados con
glucocorticoides (DeNova y Prasse, 1983; Dillonet al., 1980; solteret
al., 1994). Se ha demostrado en ratas que los glucocorticoides
pueden inducir la síntesis de ALT para aumentar la función de las
vías gluconeogénicas. Sin embargo, el tratamiento experimental de
perros sanos con glucocorticoides no produjo un aumento en la
concentración de la actividad de ALT en el tejido hepático, lo que
sugiere que el aumento de la masa hepática desempeña un papel
más importante que el aumento de la inducción de enzimas
hepatocelulares para un aumento observado de la actividad de ALT
en suero (Solteret al., 1994).
Aunque los primeros estudios sobre el aumento de la actividad sérica de
ALT después de una lesión hepatocelular inducida experimentalmente y los
estudios que demuestran una actividad de ALT mucho mayor
356
en el hígado que en otros órganos llevó a la conclusión temprana de
que los aumentos de la actividad de ALT en suero son específicos de la
lesión hepatocelular, existe evidencia clara de que la actividad de ALT en
suero también puede aumentar como resultado de una lesión de los
miocitos. Los perros en una colonia con distrofia muscular canina ligada
al cromosoma X y necrosis muscular continua tenían niveles séricos
elevados de CK y AST y un aumento de hasta 25 veces en la actividad de
ALT, pero una actividad normal de SDH, lo que sugiere que la
mionecrosis contribuyó al aumento de la actividad sérica de ALT.
Enamorado et al., 1988). Esto es consistente con la presencia de cierta
actividad de ALT en el músculo cardíaco y esquelético de los perros. En
el informe de un caso de un gato con mioquimia y neuromiotonía, la
actividad de CK fue de 28.380, mientras que la actividad de ALT fue de
sólo 195 U/l; En un estudio de rabdomiolisis en tres gatos con
deficiencia de distrofina, la actividad de CK osciló hasta 2040 veces el
límite superior del rango de referencia, mientras que la actividad de ALT
sólo aumentó hasta 19 veces el límite superior del rango de referencia,
lo que sugiere sólo un aumento mínimo. Se debe esperar una
disminución de la actividad sérica de ALT con lesión muscular en esta
especie (Galanoet al., 2005; Gaschenet al., 1998).
Aunque al menos un estudio inicial en perros
mostró una correlación entre la magnitud de la
actividad de ALT sérica y la evidencia histológica de
necrosis, otros estudios han informado poca
correlación (VanVleet y Albert, 1968). De manera
similar, la ligadura del conducto biliar de perros
provocó un aumento de 25 veces en la actividad
sérica de ALT con evidencia mínima de necrosis
hepatocelular. Como se analizó en la introducción, el
reconocimiento de la formación de ampollas de
membrana en los hepatocitos y la ruptura de estas
ampollas durante diversas condiciones como el shock
endotóxico, la lesión inducida por tetracloruro de
carbono, la colestasis y la hipoxia inducida
experimentalmente han llevado a comprender que
puede haber una aumento de enzimas séricas
derivadas del citoplasma de la célula en casos de
lesión celular reversible. En resumen,
B. Aspartato aminotransferasa
La aspartato aminotransferasa (AST: EC 2.6.1.1) (anteriormente
transaminasa glutámico oxalacética; GOT) cataliza la
transaminación de L-aspartato y 2-oxoglutatarato a oxaloacetato y
glutamato. Al igual que con la ALT, se requiere piridoxal-5!-fosfato
(PP) como cofactor. Aunque la ALT sérica estaba poco saturada con
PP en un estudio posterior al ejercicio en caballos, el 94% de la AST
estaba saturada y presente como holoenzima (Rejet al., 1990).
Proporcionar PP en el reactivo del ensayo puede ser menos
preocupante al determinar la actividad de AST en suero que al
determinar la actividad de ALT en suero.
La actividad de AST es relativamente alta y en cantidades
similares en el hígado y en el músculo esquelético y cardíaco, pero
varía entre especies (Boyd, 1983; Keller, 1981). es rutinariamente
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
Se utiliza en medicina equina y animal de alimentación como prueba de
detección de lesiones en ambos órganos. La actividad de la AST sérica
está fácilmente disponible en el perfil bioquímico, tiene una vida media
en sangre más larga que la sorbitol deshidrogenasa y la creatina
quinasa y es estable durante días en suero a temperatura ambiente,
refrigerada o congelada. La AST se encuentra en los eritrocitos y la
adición de lisado de eritrocitos al suero aumenta la actividad aparente
de la AST (datos no publicados).
La AST se encuentra en el citosol pero se encuentra en
concentraciones más altas en las mitocondrias. Sólo existe una
homología de secuencia de aminoácidos del 48,1% entre la AST
citosólica (cAST) y la AST mitocondrial (mAST) del corazón de caballo
(Doonan et al., 1986). Asimismo, las secuencias de nucleótidos del
ADNc de mAST y cAST bovinos también son claramente diferentes
(Aurilaet al., 1993; palmisanoet al., 1995). Aunque se han realizado
algunos esfuerzos para demostrar una mayor capacidad para
identificar lesiones específicas de órganos mediante ensayos de
mAST y cAST, se ha demostrado que esto no tiene valor diagnóstico
(Jones y Blackmore, 1982). En teoría, puede ser posible estimar la
magnitud de la lesión celular reversible versus irreversible
determinando mAST y cAST por separado; sin embargo, esto no se
ha estudiado empíricamente.
Aunque se ha informado que la vida media de la AST es de 7 a 8
días en caballos y tan corta como 163 minutos en perros, ninguno
de estos parece razonable según los datos obtenidos después de la
toxicidad del tetracloruro de carbono (Fleisher y Wakim, 1963; Zinkl
et al., 1971). Disminución de la actividad sérica de AST en caballos
que se recuperan de CCl4La hepatotoxicidad inducida, así como los
estudios de mioglobinuria equina, sugieren una vida media de 3 a 4
días (Bernard y Divers, 1989; Cardinetet al., 1967; Noona, 1981). En
bovinos con CCl leve4hepatotoxicidad inducida, la actividad sérica
de AST durante la recuperación sugiere una vida media de
aproximadamente 1 día (Yonezawaet al., 2005). La AST sérica tiene
una vida media más larga que la creatina quinasa y, por lo tanto, se
esperaría que tuviera una mayor sensibilidad diagnóstica durante
la recuperación de una lesión de miocitos o hepatocitos.
Se observa un aumento de la actividad sérica de AST con lesión
reversible e irreversible de los hepatocitos y puede observarse después
de lesión hepatocelular y colestasis, similar a la actividad sérica de ALT
en perros y gatos. Asimismo, la AST sérica aumenta después de una
lesión de miocitos. En cualquier caso, no se puede identificar el proceso
definitivo de la enfermedad, sólo que se ha producido una lesión celular
en el músculo o el hígado. Debido a que la actividad de AST sérica no
puede diferenciar entre lesión hepatocelular o de miocitos, a menudo se
requieren pruebas adicionales utilizando enzimas específicas de
órganos como la sorbitol deshidrogenasa o la creatina quinasa. Un
marcado aumento de la actividad sérica de AST y sorbitol
deshidrogenasa sugiere lesión hepatocelular aguda o activa. y un
aumento notable de AST sérica con actividad de sorbitol
deshidrogenasa de moderada a moderada sugiere lesión hepática
crónica o recuperación de una lesión hepática aguda. Se pueden sacar
conclusiones similares utilizando la AST sérica y la actividad de la
creatina quinasa. Como ocurre con otras enzimas citosólicas, la
actividad de la AST sérica no puede distinguir entre
IV.Enzimas Específicas
Lesión celular reversible e irreversible, ya que la cAST puede liberarse
mediante mecanismos que implican la formación de ampollas no letales en la
membrana celular. Sin embargo, debido a que una porción importante de AST
es de origen mitocondrial, se espera que la magnitud del aumento durante
una lesión celular reversible sea menor que en una lesión irreversible, pero
esto aún no se ha demostrado claramente.
Se ha informado que la sensibilidad diagnóstica de la actividad de
AST sérica en caballos es del 72% para la necrosis hepática y del 100%
para la lipidosis hepática (West, 1989). La especificidad de la actividad de
la AST sérica fue variable y disminuyó con afecciones gastrointestinales
primarias y ortopédicas secundarias a efectos en el hígado y el músculo
esquelético, respectivamente. En el ganado bovino, se ha informado que
la sensibilidad es del 94% para la lipidosis hepática, del 100% para la
leptospirosis, pero sólo del 53% para la absceso hepática y del 46% para
la fascioliasis (West, 1991). La especificidad nuevamente fue variable
dependiendo de la condición primaria.
En resumen, las determinaciones de AST sérica todavía son parte de
muchos perfiles bioquímicos debido a su sensibilidad relativamente alta
para la detección de lesión de hepatocitos y miocitos y su estabilidad en
suero. Sin embargo, la actividad de la AST sérica claramente carece de
especificidad en comparación con las enzimas específicas de tejido,
como la sorbitol deshidrogenasa y la glutamato deshidrogenasa para la
detección de lesión de hepatocitos y la creatina quinasa para la
detección de lesión de miocitos.
C. Sorbitol deshidrogenasa
La sorbitol deshidrogenasa (SDH; EC 1.1.1.14), también conocida
como iditol deshidrogenasa, cataliza la siguiente reacción:
sorbitol "NAD"↔fructosa " NADH
Los sitios activos de SDH contienen Zn.2". Por lo tanto, cuando se utilizan
tubos de extracción de sangre con EDTA, se inhibe la actividad de SDH.
Para el análisis se puede utilizar suero o plasma heparinizado. La
estabilidad de la muestra también ha sido motivo de preocupación para
el uso de SDH en medicina de diagnóstico, ya que la actividad de SDH en
suero bovino es estable durante al menos 5 h a temperatura ambiente,
24 h refrigerada y 72 h congelada, mientras que en suero equino la SDH
permanece estable durante 5 h a temperatura ambiente, 5 h.
refrigerado y congelado 48h (Horneyet al., 1993). En otro estudio, la
actividad de la SDH bovina se mantuvo estable durante 1 mes a #20°C
(West, 1991).
La SDH no está unida a la membrana y se encuentra en el citoplasma de
las células. La mayor concentración de actividad SDH se encuentra en el
hígado, seguida del riñón, pero también se encuentra en la mayoría de los
demás tejidos en cantidades mucho menores (Boyd, 1983; Keller, 1981;
Nilkumang y Thornton, 1979). La actividad de la SDH se considera específica
del hígado en todas las especies y no ha habido informes de nefrotoxicidad
que cause un aumento de la actividad de la SDH en suero.
La t1/2Es probable que la cantidad de SDH en sangre sea relativamente
corta en todas las especies. Su reportado T1/2, basado en la administración
intravenosa de extractos de hígado de perro o gato, es de 3 a 4 h para gatos y
de 5 h para perros (Nilkumhang y Thornton, 1979; Zinklet al., 1971). La t1/2de
SDH en cerdos se informa como 1,6 h. en perros
357
y caballos tratados con CCl4, una rápida disminución en la actividad SDH
después de la actividad máxima, respalda una T1/2de menos de 12h. La
corta vida media circulatoria puede deberse en parte a la naturaleza
lábil de la enzima, similar a la observada en muestras de suero.in vitro.
Esta T corta1/2limita hasta cierto punto la utilidad de la prueba, ya que es
fácil pasar por alto la actividad máxima después de una lesión hepática,
y la actividad sérica de SDH puede estar dentro de los intervalos de
referencia en la enfermedad hepática crónica.
Debido a su corta vida media y la naturaleza lábil de la actividad
de SDH en suero, la actividad de SDH es menos favorecida para la
detección de enfermedades hepáticas en perros que la actividad de
ALT en suero. Sin embargo, hay dos ocasiones en las que el análisis
de SDH puede resultar útil en perros. En primer lugar, en perros
con lesión muscular traumática, donde hay un aumento de la
actividad sérica de ALT y CK, una determinación de la actividad de
SDH descartará rápidamente si hay una lesión hepática
concurrente. Un segundo uso de la determinación de la actividad
SDH en perros podría ser junto con la actividad ALT para
determinar si existe una lesión hepatocelular persistente. Si la
actividad de ALT aumenta notablemente y la actividad de SDH no,
es probable la recuperación, pero si ambas están marcadamente
elevadas, es probable que haya un daño continuo al hígado. Este
tipo de interpretación, sin embargo,
La actividad sérica de SDH es de mayor valor que la actividad sérica
de AST en animales grandes debido a su mayor especificidad por la
lesión hepatocelular. Se producen marcados aumentos de la actividad
de la SDH sérica a las pocas horas de la necrosis hepática inducida
experimentalmente en caballos y ganado (Noonan, 1981). Se ha
informado que la actividad sérica de SDH es un valor para la detección
de lipidosis hepática, necrosis hepática, leptospirosis, fascioliasis y
abscesos hepáticos en bovinos, y para la detección de necrosis hepática,
lipidosis y cirrosis en caballos (Cebraet al., 1997; Lechtenberg y
Nagaraja, 1991; Oeste, 1989, 1991). Mientras que la especificidad de la
actividad sérica de SDH tanto en bovinos como en caballos con
enfermedad no hepática es del 100%, la sensibilidad para detectar
lipidosis hepática, abscesos hepáticos y leptospirosis en bovinos fue
inferior al 50%; para la detección de cirrosis hepática y lipidosis en
caballos fue inferior al 50%; y para detectar necrosis hepática en
caballos fue del 76% (West, 1989, 1991). Básicamente, en todas las
condiciones evaluadas en estas dos especies, la actividad sérica de AST y
glutamato deshidrogenasa (GDH) fue más sensible que la actividad de
SDH. Sin embargo, la especificidad de la AST y la GDH séricas fue
generalmente menor que la especificidad de la actividad de la SDH. La
menor sensibilidad puede deberse en parte a la corta vida media de la
enzima en circulación; especialmente en condiciones crónicas de bajo
grado donde una gran cantidad de células no resultan dañadas en un
momento dado, la actividad de SDH no puede exceder el rango de
referencia.
D. Glutamato Deshidrogenasa
La glutamato deshidrogenasa (GDH) (EC 1.4.1.3) es una enzima
mitocondrial que cataliza la eliminación de hidrógeno del L-
glutamato para formar el correspondiente ácido cetimínico que
luego sufre una hidrólisis espontánea para
358
2-osoglutarato. El hígado tiene, con diferencia, la mayor concentración
de actividad de GDH (Boyd, 1983; Keller, 1981). Se encuentran
cantidades menores en el riñón y el intestino delgado, donde la
actividad de la GDH se localiza en las células epiteliales de los túbulos
proximales y distales y en las células epiteliales de la mucosa,
respectivamente. La actividad de la GDH de los tejidos no hepáticos es
relativamente pequeña en comparación con la que se encuentra en el
hígado, donde la GDH se concentra en las áreas centrales del lóbulo. En
todas las especies, los aumentos en la actividad de la GDH sérica se
consideran específicos del hígado. Como resultado, ha habido poco o
ningún interés en investigar las isoenzimas de GDH en suero con fines
de diagnóstico. La GDH es una enzima que contiene zinc cuya actividad
puede ser inhibida por el EDTA.
La actividad de GDH en suero bovino se informó como
estable durante más de 1 mes a #20°C y se consideró más
estable que la SDH (West, 1991). Elen vivoLa vida media en seis
vacas fue de 14 h (Colliset al., 1979). Este valor es consistente
con los datos de ganado que se recupera de una lesión
hepática y sugiere que la vida media de la GDH sérica es mayor
que la de la SDH pero ligeramente menor que la vida media de
la AST (Braunet al., 1995). La vida media de la GDH circulante
en perros es de 8 h, según la inyección intravenosa de extracto
de hígado (Zinklet al., 1971).
La actividad sérica de GDH se utiliza más comúnmente en animales
destinados a la alimentación y en caballos. Debido a su ubicación dentro
de las mitocondrias, la GDH debe liberarse sólo en caso de lesión celular
irreversible. Después de la necrosis hepática inducida por tetracloruro
de carbono en terneros y ovejas, la actividad de la GDH aumenta pero
alcanza su punto máximo aproximadamente un día después que la
actividad de la AST sérica (Boyd, 1962). Esto puede deberse a la
ubicación intramitocondrial de la GDH. Sin embargo, se demostró que la
actividad sérica de GDH aumenta significativamente en la enfermedad
de las gramíneas aguda, subaguda y crónica en caballos (Marrset al.,
2001). Sin embargo, se encontró que la actividad sérica de GDH era muy
variable en ponis expuestos a alcaloides de pirrolizidina, lo que sugiere
que la actividad de GDH sólo puede ser útil desde el punto de vista
diagnóstico en las etapas agudas de la lesión hepática (Craiget al., 1991).
Este estudio encontró que la actividad sérica de GDH aumentaba con la
necrosis de hepatocitos de la zona 1, pero volvía a los intervalos de
referencia normales una vez que se destruyeban todas las células de
esta región. Estos hallazgos son consistentes con la ubicación hepática
informada de la GDH en humanos (Burtis y Ashwood, 1994). Se
observaron aumentos en la actividad de GDH de aproximadamente 12
veces y la actividad de AST al doble 24 h después de la anestesia con
halotano en caballos, lo que también puede reflejar la ubicación
centrolobulillar de la actividad de GDH (Durongphongtomet al., 2006).
Como se sugirió anteriormente, la sensibilidad de la actividad de la
GDH varía según la naturaleza de la enfermedad. Por ejemplo, en un
estudio de terneros con enfermedad hepática, la actividad de GDH
aumentó sólo en el 60% de los animales (Pearsonet al., 1995). De
manera similar, en el ganado vacuno, la sensibilidad de la actividad de la
GDH para la detección de lipidosis hepática, abscesos hepáticos,
leptospirosis y fascioliasis fue sólo del 28%, 53%, 71% y 72%,
respectivamente (West, 1991). Sin embargo, con todas las categorías de
enfermedad hepática descritas, la sensibilidad de la actividad de GDH
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
fue mayor que la actividad SDH. La especificidad para GDH fue
ligeramente menor que la de SDH. En un estudio diseñado de
manera similar en caballos, la sensibilidad de la actividad de la GDH
para la detección de necrosis hepática, lipidosis hepática y cirrosis
hepática fue del 78%, 86% y 44%, respectivamente (West, 1989). La
sensibilidad fue mayor que la de la SDH y comparable a la
observada con la actividad de AST sérica. La especificidad de la GDH
en este estudio fue casi del 100%, comparable a la especificidad de
la SDH y superior a la de la actividad de la AST. En un estudio más
reciente sobre la sensibilidad del aumento de las enzimas hepáticas
para el diagnóstico de enfermedad hepática, la GDH mostró una
sensibilidad del 63% (Durhamet al., 2003). La determinación de la
actividad de GDH se realiza mejor junto con la determinación de
otras enzimas hepáticas y otros indicadores de lesión o
enfermedad hepática.
Las determinaciones de GDH sérica para el diagnóstico de
enfermedades hepáticas en animales domésticos han recibido menos
atención en Estados Unidos que en otros países. Sin embargo, la mayor
estabilidad de la enzima, su vida media más larga y su aparente mayor
sensibilidad discutida anteriormente sugieren que puede ser una
prueba más útil para caballos y animales productores de alimentos que
la determinación de la actividad de SDH.
E. Gamma glutamiltransferasa
La gamma glutamiltransferasa (GGT) (EC 2.3.2.2) funciona en el
ciclo del gamma glutamil, donde cataliza la transferencia de grupos
gamma glutamil de los péptidos gamma glutamil, como el
tripéptido glutatión, a otros péptidos, aminoácidos y agua. Junto
con una peptidasa, la GGT desempeña un papel importante en la
regulación del glutatión intracelular mediante la hidrólisis del
tripéptido glutatión fuera de la célula en sus tres componentes, que
pueden ser absorbidos fácilmente por las células y estar
disponibles para la síntesis de glutatión según sea necesario dentro
de la célula. . La GGT también funciona en la vía GSH transferasa/
GGT que escinde restos gamma glutamil de los conjugados de GSH,
lo que ayuda en la desintoxicación de xenobióticos y carcinógenos
al hacerlos más solubles en agua y fácilmente excretados
(Liebermanet al., 1995). Esta vía también desempeña un papel en el
metabolismo de mediadores como los leucotrienos, las hepoxilinas
y las prostaglandinas.
La distribución tisular de GGT se ha estudiado en numerosas
especies domésticas, encontrándose la mayor concentración en los
riñones, el páncreas, los intestinos y las glándulas mamarias de
perros, vacas, cabras y ovejas, pero en concentraciones mucho más
bajas en las glándulas mamarias de los caballos. Se encuentra
menos actividad de GGT en el hígado, el bazo, el intestino, los
pulmones y las vesículas seminales. La actividad de GGT por gramo
de tejido hepático es consistentemente menor que en el riñón,
pero varía entre especies, siendo la actividad de GGT hepática más
alta en bovinos, equinos, ovinos y caprinos. En consecuencia, los
valores de referencia séricos de GGT son más altos en esas
especies que en perros y gatos (Braunet al., 1983, 1987; Milne y
Doxey, 1985; rico et al., 1977a, 1977b; Shull y Hornbuckle, 1979).
IV.Enzimas Específicas
La GGT es una enzima unida a la membrana en la superficie externa
de las células y está unida a la membrana celular a través de un péptido
transmembrana hidrofóbico. La ubicación celular de la GGT es de interés
ya que afecta la especificidad del órgano cuando se utiliza como prueba
de diagnóstico en suero. La GGT se encuentra en la superficie luminal de
las células tubulares proximales del riñón, donde se elimina a la orina
durante la lesión tubular. En el páncreas, la GGT se encuentra en la
superficie luminal de las células que recubren los acinos y los conductos
pancreáticos. Los aumentos de la actividad sérica de GGT generalmente
no se asocian con lesión del páncreas o del riñón. La ubicación de la GGT
en el hígado es de considerable interés porque el hígado
probablemente contribuye con la mayor parte, si no toda, de la actividad
sérica de la GGT. En el hígado, la actividad de la GGT se asocia
principalmente con las células epiteliales biliares. Los primeros informes
sugirieron que la GGT no estaba presente en las membranas de los
hepatocitos; sin embargo, cuando se usó GSH en la solución fijadora
para prevenir la inhibición de la actividad de GGT inducida por la
fijación, se identificó actividad de GGT tanto en las superficies
canaliculares como sinusoidales de los hepatocitos de ratas, aunque en
un grado considerablemente menor que en las células epiteliales
biliares (Lanca y Israel, 1991). Se ha detectado ARNm de GGT en
hepatocitos de ratas normales y ratas sin glutatión, lo que respalda la
presencia de GGT en los hepatocitos (Moriyaet al., 1994). Hasta donde
sabemos, no está documentado si hay actividad de GGT en las
membranas de los hepatocitos de los animales domésticos.
Se han realizado esfuerzos para determinar la presencia de
isoenzimas de GGT en animales de laboratorio y humanos, pero es
probable que sólo exista una forma de GGT. Se han informado
variaciones en el contenido de ácido siálico y probablemente
expliquen la capacidad de separar diferentes fracciones de GGT por
diversos medios, como el enfoque isoeléctrico (Mortensen y
Huseby, 1997). Sólo se encontró una banda de actividad de GGT
con electroforesis de acetato de celulosa en suero de perros (Milne
y Doxey, 1985).
La eliminación de la actividad de GGT de la sangre probablemente
implica endocitosis por la asialoglucoproteína o receptor de galactosa, ya que
la GGT de hígado humano purificada que ha sido fraccionada mediante
cromatografía de intercambio iónico e infundida en ratas ha demostrado que
la tasa más lenta de eliminación se asocia con las formas más sialadas
(Morensen y Huseby, 1997). La eliminación puede bloquearse con
asialofetuina, lo que también sugiere que la eliminación de GGT se produce a
través de la asialoglicoproteína o del receptor de galactosa en los hepatocitos.
Aparentemente, la GGT se elimina de la sangre sin desialilación previa
mediante unidades de galactosa expuestas que se unen con baja afinidad al
receptor. La velocidad de eliminación de cada molécula puede estar
relacionada con la cantidad de moléculas de galactosa disponibles no
bloqueadas por el ácido siálico.
Se desconoce la vida media de la actividad de la GGT en la sangre,
ya que, hasta donde sabemos, no se han realizado estudios definitivos
en animales domésticos. Sin embargo, en perros, la actividad sérica de
GGT y ALP aumenta y disminuye en paralelo durante la colestasis, lo que
sugiere que en perros la vida media de GGT puede ser similar a la vida
media de aproximadamente 3 días de la FA hepática. También se
sugiere una vida media de 3 días para la actividad de la GGT en caballos
(Barton y Morris, 1998). En cualquier caso, el
359
La vida media de la actividad de la GGT hepática es lo suficientemente larga
como para que los aumentos se mantengan durante todo el proceso de la
enfermedad y la sensibilidad diagnóstica no se pierda debido a un rápido
retorno de la actividad de la GGT a los rangos de referencia.
Condiciones como necrosis hepática y lesión hepatocelular
reversible inducida por CCl4, el dibromobenceno, la toxicidad del
cloroformo y los traumatismos producen cambios mínimos o nulos en la
actividad de la GGT sérica en perros (Barakat y Ford, 1988; Guelfi et al.,
mil novecientos ochenta y dos; Noonan y Meyer, 1979). Sin embargo, se
observa cierto aumento en la actividad de la GGT sérica con la toxicidad
del cloroformo en caballos, aunque no se observa ningún aumento en
terneros y ovejas (Barakat y Ford, 1988). Después de la administración
de CCl4en ponis, se observó un aumento de cuatro veces en la actividad
de GGT en suero, que persistió hasta 10 días sin aumento en la actividad
de ALP en suero (Hoffmannet al., 1987). El aumento mínimo de la
actividad de la GGT en el suero después de una lesión hepatocelular
probablemente se deba al hecho de que la GGT en el hígado se asocia
principalmente con las células epiteliales biliares y a la ausencia de un
aumento significativo de los ácidos biliares para liberar la unión
transmembrana hidrófoba a la membrana celular. Los aumentos de la
GGT sérica se observan con mayor frecuencia en la colestasis y en
afecciones que dan lugar a hiperplasia biliar en todas las especies, como
se observa en la colestasis inducida experimentalmente (DeNovo y
Prasse, 1983; Hoffmannet al., 1987; Shull y Hornbuckle, 1979; españolet
al., 1983).
La actividad sérica de GGT es un indicador clínico especialmente útil
de colestasis en caballos y bovinos debido a la actividad relativamente
alta de GGT hepática en comparación con perros y gatos. La actividad
sérica de GGT en caballos y bovinos tiene una sensibilidad relativamente
mayor para la identificación de trastornos colestásicos que la actividad
sérica de ALP. Sólo se observó un aumento del doble de la actividad de
la ALP sérica en la colestasis, mientras que la actividad de la GGT sérica
aumentó nueve veces en los caballos (Hoffmannet al., 1987). Aunque la
magnitud del aumento es mayor en la colestasis, la actividad sérica de
GGT también se puede utilizar en animales grandes como prueba de
detección de enfermedad hepática generalizada. En un estudio
retrospectivo de 50 casos de enfermedad hepática en caballos, de los
parámetros químicos séricos evaluados sólo la actividad sérica de GGT
aumentó en todos los casos (McGorumet al., 1999). De manera similar,
la actividad sérica de GGT mostró una sensibilidad del 75% y una
especificidad del 90% para detectar enfermedad hepática subclínica en
caballos expuestos a alcaloides de pirrolizidina, mientras que la
actividad sérica de ALP mostró sólo una sensibilidad del 58% (Curranet
al., 1996). Se demostró que la actividad sérica de GGT es la enzima sérica
más sensible para la detección de lesión hepática secundaria a enteritis
proximal en caballos (Daviset al., 2003). También se han informado
aumentos en la actividad sérica de GGT en numerosos casos de
hepatotoxicidad relacionada con plantas tanto en ganado vacuno como
en caballos (Craig et al., 1991; curranet al., 1996; Mendelet al., 1988).
La actividad sérica de GGT en perros y gatos a menudo se interpreta
junto con la actividad sérica de ALP. La ventaja sugerida de la
determinación de la actividad de la GGT sérica sobre la actividad de la
ALP sérica en perros es una mayor especificidad, ya que la actividad de
la GGT se deriva únicamente del hígado, mientras que la actividad de la
ALP sérica se deriva del hueso y del hígado, así como del
360
Isoenzima de ALP inducida por corticosteroides caninos. En un estudio
de 270 perros con sospecha de enfermedad hepática se compararon los
resultados de las biopsias hepáticas con los resultados de las enzimas
hepáticas en suero (Centroet al., 1992). La enfermedad hepática fue
confirmada mediante histología en 207 de los 270 casos. La sensibilidad
de la actividad sérica de ALP y GGT para detectar enfermedad hepática
confirmada histológicamente fue del 85% y 46%, respectivamente. Sin
embargo, la especificidad de la FA sérica fue sólo del 51 %, mientras que
la especificidad de la GGT sérica fue del 87 %. En un estudio de 69 gatos
con sospecha de enfermedad hepática, de los cuales 54 tenían evidencia
histológica de enfermedad hepática, la sensibilidad general de la
actividad sérica de ALP y GGT fue del 48% y 83%, respectivamente
(Centroet al., 1886). La actividad sérica de GGT fue más sensible que la
actividad sérica de ALP para la detección de colestasis extrahepática,
colangiohepatitis y cirrosis. Por el contrario, el aumento porcentual de la
actividad de ALP sérica fue mayor que la actividad de GGT sérica en 11
de 15 gatos con lipidosis hepática. Es probable que esto se deba a que la
lipidosis hepática es una forma de colestasis intracelular, la FA se asocia
principalmente con los hepatocitos y la GGT se asocia principalmente
con las células epiteliales biliares.
Se han utilizado varios modelos de animales de laboratorio para estudiar el mecanismo de
aumento de la actividad de la GGT sérica. Estos incluyen la ligadura del conducto biliar, el tratamiento
de los animales con isotiocianato de alfa naftilo (ANIT) para causar necrosis de las células epiteliales
biliares y un modelo de derivación coledococava (CCS) que desvía la bilis del conducto biliar común
directamente a la vena cava anterior (Bulleet al., 1990; Hardison et al., 1983; Kryszewskiet al., 1973;
leonardoet al., 1984; Putzkiet al., 1989). En el modelo de ligadura de conductos biliares, hay un
aumento inicial de la actividad de GGT en suero y una disminución en la actividad de GGT en el tejido
hepático. El aumento de la actividad de la GGT sérica se asocia con un aumento paralelo de los ácidos
biliares séricos, y es casi seguro que los ácidos biliares solos o junto con una enzima hidrolítica
facilitan la solubilización o liberación de GGT de la membrana. Con la persistencia de la colestasis,
hay una proliferación de células epiteliales biliares y un aumento del volumen de los conductos
biliares en el hígado, que va acompañado de un aumento de la actividad de la GGT en el hígado y una
segunda fase de aumento de la actividad de la GGT sérica. En el modelo ANIT, el tratamiento crónico
con ANIT produce necrosis repetida de las células epiteliales biliares y proliferación de los conductos
biliares. A medida que aumenta la masa del conducto biliar, hay un aumento persistente en la
actividad de GGT sérica. Ambos modelos respaldan el concepto de que existe una liberación inicial de
actividad de GGT por lesión de las células epiteliales biliares y retención de bilis, cuya magnitud está
determinada en parte por si la especie tiene actividad de GGT tisular baja o alta. El aumento
persistente de la actividad sérica de GGT puede indicar hiperplasia biliar que proporciona una mayor
fuente de GGT para su liberación. Aunque no se han confirmado experimentalmente, las
observaciones clínicas sugieren que los animales domésticos con una actividad sérica de GGT
notablemente aumentada a menudo tienen hiperplasia biliar. cuya magnitud está determinada en
parte por si la especie tiene actividad tisular baja o alta de GGT. El aumento persistente de la
actividad sérica de GGT puede indicar hiperplasia biliar que proporciona una mayor fuente de GGT
para su liberación. Aunque no se han confirmado experimentalmente, las observaciones clínicas
sugieren que los animales domésticos con una actividad sérica de GGT notablemente aumentada a
menudo tienen hiperplasia biliar. cuya magnitud está determinada en parte por si la especie tiene
actividad tisular baja o alta de GGT. El aumento persistente de la actividad sérica de GGT puede
indicar hiperplasia biliar que proporciona una mayor fuente de GGT para su liberación. Aunque no se
han confirmado experimentalmente, las observaciones clínicas sugieren que los animales
domésticos con una actividad sérica de GGT notablemente aumentada a menudo tienen hiperplasia
biliar.
El modelo CCS en ratas es único porque proporciona un aumento
persistente de los ácidos biliares en el hígado y la sangre y un aumento
del flujo de bilis, pero sin un aumento de la presión biliar.
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
(hardisonet al., 1983). En este modelo, en 24 h, la actividad de la
GGT en suero es casi igual a la observada con la ligadura
experimental de los conductos biliares, lo que sugiere que los
ácidos biliares u otros constituyentes de la bilis median la liberación
de GGT en el suero. Además, el aumento de la presión biliar y la
regurgitación de GGT a través de uniones estrechas no son
necesarios para observar un aumento de la actividad sérica de GGT
(Putzkiet al., 1989). La vía real recorrida por la GGT desde las células
epiteliales biliares hasta la sangre no está clara. Tampoco está claro
si la cantidad de GGT en las superficies sinusoidales de los
hepatocitos es adecuada para explicar la magnitud del aumento de
la actividad sérica de GGT observada en cualquiera de los tres
modelos descritos anteriormente. Podría considerarse un
mecanismo de liberación de los hepatocitos análogo al descrito
para la FA, pero con una enzima hidrolítica diferente.
El aumento de la actividad de GGT en suero en terneros llevó al
reconocimiento de que las especies que producen grandes cantidades de
actividad de GGT en las glándulas mamarias pueden excretar o liberar GGT en
el calostro. La GGT calostral se capta mediante transferencia pasiva en el
recién nacido y sirve como una prueba fácil, económica y automatizada para
una transferencia pasiva exitosa (Braunet al., mil novecientos ochenta y dos;
Perinoet al., 1993; wilsonet al., 1999; Zanker et al., 2001). La diferencia entre la
actividad sérica de GGT antes y después de la lactancia puede ser de más de
100 veces en terneros (Braunet al., mil novecientos ochenta y dos). Este
aumento se correlaciona lo suficientemente bien con el aumento de la
inmunoglobulina sérica como para permitir que la actividad de la GGT sérica
sustituya como prueba de transferencia adecuada de inmunoglobulina
(Perinoet al., 1993). Sin embargo, la actividad de GGT disminuye
constantemente durante los primeros 18 a 20 días, por lo que la capacidad de
la actividad de GGT sérica para concluir con precisión el fracaso de la
transferencia pasiva se reduce después de aproximadamente 8 días (Wilsonet
al., 1999). En una revisión del fracaso de la transferencia pasiva en terneros,
los autores concluyeron que la pérdida de correlación entre la actividad sérica
de GGT y las concentraciones de inmunoglobulinas después de los primeros
días de lactancia anula el valor de la prueba, y se debe desalentar su uso en
ganado (Weaveret al., 2000). La actividad sérica de GGT también indica
transferencia pasiva de inmunoglobulinas en cabras, pero en potros no hay
diferencia en la actividad sérica de GGT antes y después de la lactancia (Braun
et al., 1984; Patterson y Brown, 1986). En cachorros caninos, la actividad de
GGT sérica post-mamantamiento puede alcanzar hasta 100 veces el intervalo
superior debido a la alta actividad de GGT en el calostro (Centroet al., 1991).
Aunque el tejido renal tiene la mayor concentración de actividad de GGT
por gramo de tejido en todas las especies estudiadas, no hay evidencia que
respalde la presencia de GGT tubular renal en la sangre. Es probable que esto
sea el resultado de la ubicación de la GGT en la superficie luminal de las
células epiteliales tubulares y posiblemente de su rápida eliminación de la
sangre por el receptor de galactosa en los hepatocitos. Sin embargo, la
ubicación de la GGT en las células epiteliales tubulares significa que la enzima
se elimina fácilmente en la orina y puede indicar lesión de las células
tubulares renales. Debido a la variabilidad del volumen de orina, la actividad
de GGT en orina debe normalizarse a la concentración de creatinina en orina
utilizando una relación actividad de GGT:creatinina. Numerosos informes
muestran que la relación actividad GGT en orina:creatinina en perros es un
factor sensible
IV.Enzimas Específicas
e indicador temprano de nefrotoxicidad inducida por productos
químicos con varios compuestos, incluidos ácido maleico,
aminoglucósidos y ciclosporina (Clemo, 1998; Grauret al., 1995;
Nahas et al., 1997; ríoset al., 1996). Además, tanto la excreción de
GGT en 24 horas como la relación actividad de GGT:creatinina de
muestras únicas de orina han demostrado ser útiles para detectar
lesiones tubulares en perros (Gossetet al., 1987; ríoset al., 1996).
Aunque no hay variación circadiana aparente (Uechi et al., 1994), se
ha sugerido que la variación intradía de la relación actividad
GGT:creatinina limita su utilidad (Gossetet al., 1987). Al igual que en
los perros, la relación actividad GGT en orina:creatinina en caballos
y ganado ha demostrado ser valiosa para detectar nefrotoxicidad
(Meyeret al., 2005; Rossieret al., 1995; Ulutas y Sahal, 2005). La
magnitud en todas las especies es mayor en la fase aguda de la
lesión, después de lo cual la actividad de GGT en la orina cae
rápidamente durante la etapa crónica. Estos estudios respaldan el
uso de la actividad de GGT en orina como prueba de detección de
exposición a fármacos potencialmente nefrotóxicos. Se requiere la
evaluación de más de una enzima y en múltiples momentos para
evaluar adecuadamente la nefrotoxicidad. También cabe señalar
que el cociente actividad GGT:creatinina urinaria es
extremadamente sensible y se pueden observar aumentos sin
signos clínicos de nefrotoxicidad o azotemia (van der Harstet al.,
2005). Por ejemplo, los caballos normales y los caballos con
neumonía tratados con gentamicina muestran aumentos
significativos en la relación actividad GGT:creatinina en orina, pero
conservan concentraciones normales de creatinina sérica (Rossieret
al., 1995).
Los perros tratados con glucocorticoides o perros con
hiperadrenocorticismo generalmente tienen una mayor actividad sérica
de GGT (Abrahamet al., 2005; DeNovo y Prasse, 1983; solter et al., 1994).
Sin embargo, la relación entre la actividad de GGT en suero y la actividad
de GGT en el tejido hepático en perros tratados con glucocorticoides es
similar a la de los controles no tratados, lo que sugiere que el aumento
de la actividad de la GGT en suero es el resultado de un aumento de la
GGT en el tejido hepático y de una mayor síntesis de la enzima (Solteret
al., 1994).
F. Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas (ALP) (EC 3.1.3.1) han sido relativamente
bien estudiadas. Se ha demostrado que hidrolizan una variedad de
monofosfatos o pirofosfatos a pH alcalino, así como a pH
fisiológico, aunque a un ritmo menor. Es probable que haya varios
en vivoFunciones de la FA. Desde la década de 1920 se había
especulado sobre el papel de la ALP en la mineralización ósea y se
comprobó por primera vez en seres humanos que padecían
hipofosfatasemia, que resulta de varias mutaciones diferentes que
conducen a una ALP inactiva y a una mineralización ósea
marcadamente defectuosa en los niños (Mumm et al., 2002; porqué
et al., 1996). El papel de la ALP en la mineralización ósea se ha
confirmado posteriormente en numerosos estudios utilizando
ratones con genes knockout para la ALP ósea para crear
hipofosfatasemia, lo que da como resultado una mineralización
alterada del hueso (Andersonet al., 2004). Una función específica
361
de la FA en el hueso es la hidrólisis del pirofosfato, que es un
potente inhibidor de la mineralización, permitiendo así que la
mineralización continúe. Otras funciones sugeridas de ALP son
laen vivodesfosforilación de la endotoxina bacteriana, lo que
disminuye sus efectos tóxicos (Poelstraet al., 1997; Van Veenet
al., 2005; Xuet al., 2002), y como paso limitante de la velocidad
de absorción de grasa intestinal (Narisawaet al., 2003).
Aunque muchos tejidos o tipos de células tienen cierta actividad de
ALP, las células del hígado, los huesos, los riñones, la mucosa intestinal
y la placenta tienen la mayor actividad de ALP por gramo de tejido,
siendo la mucosa intestinal la que tiene la mayor actividad (Clampitt y
Hart, 1978; Nagodeet al., 1969). Sin embargo, la actividad sérica de ALP
generalmente no es un reflejo de la concentración tisular. En la mayoría
de las especies domésticas, la FA intestinal (IALP) no se encuentra en el
suero, y el hígado, que tiene una actividad de FA relativamente baja,
contribuye con más de la mitad de la actividad sérica.
Las fosfatasas alcalinas son ectoenzimas unidas a la membrana
celular mediante un anclaje hidrofóbico de fosfatidilinositolglicano
(PIG). La extracción de ALP del tejido requiere butanol, sales biliares
o detergente en presencia de un tampón ácido para permitir que la
actividad hidrolítica de la fosfolipasa D endógena específica de
fosfatidilinositol (PIPLD) escinda el anclaje de ALP PIG (Low, 1987;
Solter y Hoffmann, 1995; Solteret al., 1997). En el intestino,
especialmente en el intestino delgado, la FA se localiza en las
puntas de las vellosidades de los enterocitos (Watanabe y Fishman,
1964), mientras que en el riñón la FA se localiza en la superficie
luminal de las células epiteliales del túbulo proximal (Wachstein y
Bradshaw, 1965). ). Aunque se reconoce que la FA en el hueso se
localiza en los osteoblastos y las vesículas de matriz derivadas de
los osteoblastos, la tinción del hígado para detectar la actividad de
la FA revela que la mayor parte de la FA se encuentra en la
superficie canalicular biliar de los hepatocitos en animales
normales, aunque esto puede variar con el paciente. especies.
Durante condiciones en las que la FA hepática aumenta, las
superficies sinusoidales y laterales de los hepatocitos también
muestran una actividad sustancial de FA (Ogawaet al., 1990; sanecki
et al., 1987; solteret al., 1997). Debido a que muchas proteínas de la
membrana canalicular biliar (apical) recién sintetizadas viajan
desde el Golgi a la membrana sinusoidal (basolateral) antes de su
transcitosis a la superficie canalicular biliar de los hepatocitos, la
presencia de ALP en la membrana sinusoidal durante las
condiciones de la enfermedad probablemente represente una
mayor síntesis de ALP en lugar de que una diferencia en el tráfico
de enzimas (Kipp y Arias, 2000; Mauriceet al., 1994; Zegers y
Hoekstra, 1998). La actividad de ALP presumiblemente está
presente en la membrana sinusoidal en todo momento, pero
debido al corto tiempo de residencia antes de la transcitosis a la
membrana canalicular y a la cantidad relativamente pequeña de
ALP, la insensibilidad de la tinción enzimática y la microscopía
óptica hacen que sea difícil visualizar la pequeña fracción. de ALP
presente.
En el ser humano, el chimpancé y el orangután, al menos tres
genes expresan ALP y reciben el nombre del órgano primario de su
expresión. Estas son la FA intestinal, la FA placentaria y la FA tisular
no específica o FA de hueso/hígado/riñón (Goldsteinet al., mil
novecientos ochenta y dos). En los humanos, un cuarto gen es
362
expresada en la célula germinal que es similar a la isoenzima
placentaria (Millan y Manes, 1988). En las especies domésticas, hay
dos genes, a saber, el gen intestinal y el gen ALP no específico de
tejido que se expresa en huesos, hígado, riñones y placenta y, en
menor medida, en algunos otros tejidos. Aunque las verdaderas
isoenzimas ALP resultan de genes específicos, la modificación
postraduccional (principalmente glicosilación variada) es
generalmente específica de un órgano y da como resultado
isoformas adicionales. Por ejemplo, la FA del hígado y la FA de los
huesos son productos del mismo gen pero están glicosiladas de
manera diferente, lo que da como resultado isoformas o
isoenzimas que pueden diferenciarse mediante varias técnicas. Las
verdaderas isoenzimas ALP expresadas por diferentes genes
difieren enzimática, bioquímica y antigénicamente. y responden de
forma diferente a inhibidores como la L-fenilalanina y el levamisol;
Las isoformas de ALP tienden a comportarse enzimática y
antigénicamente de manera similar y son igualmente inhibidas por
la L-fenilalanina y el levamisol, aunque existen algunas
excepciones. Aunque estas isoformas no son verdaderas
isoenzimas, los precedentes históricos y clínicos han dado como
resultado que estas isoformas también se denominen isoenzimas.
La FA hepática está altamente glicosilada con residuos
terminales de ácido siálico, lo que da como resultado una marcada
migración anódica en la electroforesis. Generalmente se inhibe en
más del 95% con levamisol, pero es relativamente insensible a la
inhibición de la Lfenilalanina. LALP es sólo moderadamente
sensible a la inhibición por calor a 56°C.
La FA ósea es un producto del gen TNS ALP, al igual que la FA
hepática, pero tiene una migración electroforética anódica
ligeramente más lenta y es más sensible a la inhibición por calor
(Hoffmann y Dorner, 1975). La isoforma ósea ALP es más
susceptible a la precipitación por la lectina de germen de trigo
(WGL) que la LALP como resultado de una glicosilación diferente
(Hank et al., 1993; Riñón y Jackson, 1988; saneckiet al., 1993). Los
anticuerpos producidos contra la ALP hepática o la ALP ósea
generalmente reaccionan de forma cruzada con las otras isoformas
del mismo gen. Sin embargo, existen inmunoensayos disponibles
comercialmente para BALP humano que han sido validados para su
uso en análisis de BALP canino, felino y equino (Allenet al., 2000;
Delaurieret al., 2002; jacksonet al., 1996).
La ALP intestinal (IALP) es un producto del gen ALP
intestinal y es claramente diferente de BALP y LALP. IALP es
más estable al calor y se inhibe más fácilmente con L-
fenilalanina, pero muestra menos del 10% de inhibición con
levamisol en concentraciones adecuadas para inhibir más del
95% de BALP y LALP (Eckersalet al., 1986; Hoffmanet al., 1987;
Nagodeet al., 1969). Generalmente se piensa que la IALP es
una asialoglicoproteína; sin embargo, algo de ácido siálico
identificable está presente en IALP canino (Sanecki et al., 1990).
El número reducido de residuos de ácido siálico es responsable
del hecho de que IALP tenga una migración anódica mínima en
la electroforesis en agarosa o acetato de celulosa.
Normalmente, IALP produce una banda ancha en lugar de una
banda estrecha y marcada en comparación con LALP y BALP.
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
Las fosfatasas alcalinas en otros órganos, como el riñón y la
placenta, suelen ser producto del gen TNS. Estas fosfatasas
alcalinas no están completamente sialadas y tienen menos
migración anódica en la electroforesis que BALP y LALP. Sin
embargo, la ALP extraída del riñón de caballo es probablemente un
producto del gen intestinal, ya que es similar a la IALP en la
inhibición del levamisol y el reconocimiento antigénico por los
anticuerpos antiIALP equinos (Hoffmannet al., 1983a).
La llamada isoenzima de ALP inducida por corticosteroides
(CALP) se ha identificado en perros tratados con corticosteroides,
perros con hiperadrenocorticismo o en algunos perros mayores
con enfermedades crónicas o posiblemente estrés crónico (Sanecki
et al., 1990; solteret al., 1993; Bien hombreet al., mil novecientos
ochenta y dos). Esta enzima no ha sido identificada en ninguna otra
especie; sin embargo, es similar a una de las dos formas de ALP
expresada en el hígado de conejos (Noguchiet al., 1987). CALP es
una isoforma altamente glicosilada de IALP, producida en el hígado
a partir del gen intestinal. Tiene una migración anódica
notablemente mayor que la IALP en la electroforesis con acetato de
celulosa, pero es antigénicamente similar a la IALP con anticuerpos
monoclonales y policlonales y responde a la inhibición de levamisol
y L-fenilalanina de manera similar. También tiene la secuencia de
aminoácidos N-terminal idéntica a la IALP, pero tiene
concentraciones notablemente más altas de N-acetilglucosamina,
manosa, galactosa y ácido siálico. Por tanto, CALP se diferencia de
IALP sólo en la glicosilación. El análisis de transferencia Northern
con un segmento clonado de 1338 pb del gen CALP, que es idéntico
a la secuencia IALP, ha confirmado que el hígado es el origen de la
producción de CALP (Wiedmeyeret al., 2002a, 2002b).
El epitelio epididimario y tubular seminífero del perro es
rico en actividad ALP. Esta ALP es un producto del gen TNS,
pero está glicosilada de manera diferente que BALP o LALP
según la migración electroforética (Kutzleret al., 2003). La
actividad ALP también está presente en el líquido
epididimario de los caballos (Gobellaet al., 2002).
Se han realizado análisis de isoenzimas de fosfatasa
alcalina sérica en muchas especies y numerosas publicaciones
describen las técnicas y el valor diagnóstico de los análisis. Las
técnicas descritas incluyen electroforesis en varios medios,
enfoque isoeléctrico, inhibición por calor, inhibición química,
inmunoquímica y unión selectiva de lectinas. Aunque la
electroforesis todavía se utiliza, una combinación de inhibición
con levamisol y precipitación selectiva de BALP con lectina de
germen de trigo es un medio eficaz para evaluar
cuantitativamente BALP, LALP y CALP en suero de perro; BALP,
LALP e IALP en suero de rata; y BALP y LALP en suero de
caballo, gato y vaca (Hanket al., 1993; Hoffmannet al., 1988;
Hoffmanet al., 1994; saneckiet al., 1993). Es muy probable que
la combinación de inhibición del levamisol y precipitación de
lectinas de germen de trigo sea compatible con muchas otras
especies que aún no se han probado. También se han utilizado
inmunoensayos para BALP en suero canino, felino y equino
(Allenet al., 2000; Delaurieret al., 2002; Delaurieret al., 2004;
jackson et al., 1996; Precioet al., 1995).
IV.Enzimas Específicas
Los estudios de las vidas medias en sangre de las diversas
isoenzimas de fosfatasa alcalina son interesantes porque ayudan a
explicar la magnitud y el tiempo de aumento de la actividad de ALP
sérica después de una agresión a un órgano. A diferencia de la mayoría
de las especies, la IALP siempre se identifica en el suero de rata y, a
menudo, en el suero humano. No se ha observado en suero de perros,
gatos, caballos y ganado (Hoffmann y Dorner, 1975; Hoffmannet al.,
1983b). El aclaramiento de la IALP inyectada por vía intravenosa en
perros tiene una vida media inferior a 5,4 minutos, mientras que la vida
media de la fase 2 de la IALP en ratas es de 54,1 a 68,3 minutos
(Hoffmann y Dorner, 1977; Younget al., 1984). La tasa de eliminación de
IALP de la sangre de perro puede inhibirse mediante la inyección
simultánea de albúmina sérica bovina terminada en galactosa, lo que
respalda la teoría de que la IALP se elimina mediante la
asialoglicoproteína de los hepatocitos o los receptores de galactosa
(Kuhlenschmidtet al., 1991). Sin embargo, la eliminación de IALP de la
sangre de ratas no es bloqueada por la asialofetuina, sino por la
albúmina sérica bovina terminada en glucosamina, lo que sugiere que la
IALP en ratas es eliminada por receptores específicos de manosa/N-
acetilglucosamina en las células reticuloendoteliales hepáticas (Younget
al., 1984). La presencia de IALP en suero de rata y no en suero de perro
puede explicarse en parte por las diferencias en las vidas medias séricas
de IALP entre las dos especies. Sin embargo, la descripción en ratas de
una partícula secretora similar a un surfactante que contiene ALP puede
ofrecer un segundo mecanismo para el aumento de IALP en la sangre
de ratas (Eliakim et al., 1991).
La vida media de IALP en gatos después de una inyección
intravenosa es de aproximadamente 4 min, y en caballos es de
aproximadamente 8 min, lo que probablemente explica en parte la
ausencia de IALP en el suero de estas dos especies (Hoffmannet al.,
1977, 1983b).
La vida media de LALP y CALP inyectadas por vía intravenosa en
perros es de aproximadamente 3 días (Hoffmann y Dorner, 1977).
Se desconoce la eliminación de la FA en condiciones normales, pero
puede implicar la hidrólisis lenta del ácido siálico de la porción de
carbohidratos de la molécula, lo que permite el reconocimiento y la
captación por el receptor de galactosa en los hepatocitos. La vida
media del LALP para gatos inyectado por vía intravenosa es de
aproximadamente 5,8 h (Hoffmannet al., 1977). Asimismo, el LALP
canino inyectado por vía intravenosa en gatos tiene una vida media
de aproximadamente 5 h. Por lo tanto, la diferencia en la vida
media de LALP de perro y de gato (3 días frente a 5 h) es
probablemente una diferencia de especie en la eliminación de la
enzima y no una diferencia en la enzima. Se desconoce el
mecanismo de eliminación de ALP de la sangre de los gatos.
Se desconoce la vida media en sangre de BALP, pero tiene una
migración electroforética cercana a la de LALP en perros, gatos y
caballos, lo que sugiere que está presente una dosis completa de ácido
siálico, lo que da como resultado una vida media similar a la de LALP.
La vida media de la FA renal y placentaria en perros es inferior
a 6 minutos (Hoffmann y Dorner, 1977). Tienen una migración
anódica mínima en la electroforesis, lo que sugiere que tienen poco
o ningún ácido siálico y probablemente son eliminados por la
asialoglicoproteína o el receptor de galactosa en los hepatocitos.
363
Los porcentajes aproximados de BALP y LALP en perros adultos
son 30% y 70%, respectivamente, con un porcentaje creciente de
LALP en edades más avanzadas, mientras que en caballos adultos,
hay aproximadamente 20% BALP y 80% LALP (Allen et al., 2000;
Madejaet al., 1993).
La colestasis es la causa más común de aumentos significativos
del LALP sérico en la mayoría de las especies. La colestasis inducida
experimentalmente en perros, generalmente mediante ligadura de
conductos biliares, produce aumentos marcados en la actividad
sérica de LALP que comienza después de aproximadamente 24 h y
alcanza un máximo de 30 a 40 veces la actividad sérica normal de
ALP a los 4 a 7 días (Guelfiet al., mil novecientos ochenta y dos;
Shull y Hornbuckle, 1979). Se observó un tiempo de respuesta
similar del aumento de FA en dos gatos después de la ligadura del
conducto biliar, pero la magnitud del aumento fue
aproximadamente el 10% del observado en el perro (Hoffmann et
al., 1978). Esta marcada diferencia en la magnitud del aumento
entre las dos especies se debe en parte a la vida media sérica de
LALP 12 veces más corta en gatos que en perros. El marcado
aumento de LALP sérico en la colestasis va acompañado también
de un marcado aumento de la actividad de LALP en el hígado.
Numerosos estudios en ratas han demostrado que este aumento
es el resultado de una mayor síntesis, regulada a nivel de
transcripción o traducción (Kaplan et al., 1983; Schlaeger, 1975).
Durante muchos años, se pensó que el mecanismo del
aumento de LALP en la sangre implicaba la regurgitación de la bilis
a través de uniones estrechas hacia la sangre. Aunque hay
evidencia de cambios disruptivos dentro de las uniones estrechas
durante la colestasis (Boyer, 1983), es dudoso que estas
alteraciones permitan el paso de macromoléculas del tamaño de
ALP (Debroeet al., 1985). Los estudios que utilizan un modelo de
derivación cloledococava muestran que dentro de las 12 horas
posteriores a la derivación de bilis o ácido taurocólico a la sangre,
hay una marcada inducción de la síntesis de FA y la aparición de FA
en las membranas basolaterales y un aumento paralelo de la FA
sérica (Ogawa et al., 1990). Esto ocurre en ausencia de aumento de
la presión biliar y cualquier evidencia de alteraciones en las uniones
estrechas (Toyotaet al., 1983). Los ácidos biliares parecen participar
tanto en la inducción como en la liberación de FA al suero.
Un segundo modelo para estudiar el mecanismo de liberación de
ALP del hígado al suero utiliza la observación de que los perros tratados
de forma aguda con altas dosis de prednisona inducen primero la
síntesis de LALP en ausencia de colestasis, como lo demuestra la falta de
aumento de la bilis en suero o tejido hepático. ácidos (Solteret al., 1994,
1997). Este modelo da como resultado la aparición de actividad LALP
fácilmente identificable en la superficie basolateral y aumentos
marcados de la actividad LALP sérica. La aparición de actividad LALP en
la membrana basolateral es probablemente una aparición transitoria de
la proteína antes de que se separe a la membrana canalicular apical o
biliar como parte del tráfico normal de proteínas de la membrana
canalicular biliar (Bartleset al., 1987; Mauricioet al., 1994). La FA de la
membrana sinusoidal o basolateral es susceptible de liberarse a la
sangre o a la linfa hepática. Sin embargo, a diferencia del modelo de
derivación coledococava, donde las concentraciones de ácidos biliares
364
MONTAÑA
etanolamina glicano Inositol
GPI-PLD + Ácidos biliares
correos4
Membrana de plasma
FIGURA 12-2 El ancla de membrana de glicosilfosfatidilinositol de
fosfatasa alcalina y el sitio de liberación de ALP desde el anclaje de la membrana
mediante la fosfolipasa D específica de fosfatidil inositol, que es facilitada por los
ácidos biliares.
aumentan tanto en la sangre como en el tejido hepático y facilitan la
liberación de FA desde su unión a la membrana, los ácidos biliares
séricos y tisulares no aumentan en el modelo tratado con prednisona.
Sin embargo, dentro de las 2 a 4 horas posteriores a la administración
de colecistoquinina (CCK) para iniciar la circulación enterohepática y un
flujo de ácidos biliares a través de la vena porta y el hígado, hay un
aumento significativo en la actividad sérica de LALP (Solteret al., 1997).
Esto proporciona apoyo para una liberación de ALP facilitada por los
ácidos biliares desde las membranas sinusoidales de los hepatocitos,
muy probablemente mediante la activación de PIPLD y la escisión del
anclaje de fosfatidilinositol (fig. 12-2). No está claro si los ácidos biliares
realmente activan el PIPLD o simplemente permiten el acceso al anclaje
PI de ALP.
El marcado aumento de CALP sérica y la presencia de
CALP en la membrana sinusoidal de perros con
hiperadrenocorticismo espontáneo o tratados
crónicamente con glucocorticoides y ausencia de colestasis
proporciona apoyo adicional a la conclusión de que el
mecanismo de aumento de ALP sérica desde el hígado no
requiere regurgitación. Debido a que CALP está unida a la
membrana mediante el mismo anclaje PI que LALP, PIPLD
la libera durante el flujo de ácidos biliares a través del
hígado (Solter y Hoffmann, 1995).
Aunque la colestasis es la causa más reconocida de aumento de la
actividad de LALP, también se observan aumentos en la actividad sérica
de LALP en la hepatopatía por esteroides en perros, especialmente en
las primeras etapas de la enfermedad (Solteret al., 1994, 1997;
Syakalima et al., 1997). También se observan aumentos leves a
moderados en la LALP sérica en perros con otras enfermedades
hepáticas y afecciones secundarias a primarias que van desde enteritis
hasta pancreatitis. En los gatos, el aumento de la actividad sérica de
LALP se asocia más comúnmente con colestasis, colangiohepatitis,
lipidosis hepática e hipertiroidismo. El aumento de la actividad sérica de
LALP es la primera anomalía de laboratorio observada en gatos con
insuficiencia hepática inducida experimentalmente.
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
lipidosis, que ocurre antes del inicio de la hiperbilirrubinemia
(Biourgeet al., 1994). Aunque el aumento de la actividad sérica de
ALP en gatos hipertiroideos se atribuye tanto a la actividad de LALP
como a la de BALP, la actividad de LALP es la isoenzima que
aumenta más consistentemente y constituye la mayor parte de la
actividad de ALP (Archer y Taylor, 1996; Foster y Thoday, 2000).
Un aumento en la actividad BALP sérica generalmente se asocia con
una mayor actividad osteoblástica y se ha evaluado cada vez más como
un marcador de formación ósea en varias especies domésticas (Allenet
al., 1998; DeLaurier et al., 2002; Precioet al., 2001). Se observa un
aumento de la actividad BALP sérica en todos los animales jóvenes y es
hasta 10 veces mayor en los cachorros que en los perros adultos (Allenet
al., 2000; saneckiet al., 1993). En potros recién nacidos, la actividad
sérica de BALP es casi 100 veces mayor que en el suero de adultos, pero
cae precipitadamente durante las primeras 3 semanas después del
nacimiento y luego de manera más gradual durante los siguientes 2 a 4
años (Hank et al., 1993; Precioet al., 1995). Se puede observar un
aumento de la actividad sérica de BALP en perros con
hiperparatiroidismo, enfermedad renal y durante la curación de
fracturas. Se ha informado que la actividad sérica total máxima de FA
(presumiblemente BALP) ocurre en perros aproximadamente 10 días
después de la fijación quirúrgica de fracturas de huesos largos y vuelve
a la normalidad dentro de 2 meses con una curación normal, pero
puede permanecer aumentada de 3 a 5 meses con un retraso en la
consolidación (Komneuouet al., 2005). Este estudio no informó ningún
aumento en la actividad de ALP sérica en perros que tenían
pseudoartrosis y sugirió que monitorear la actividad de ALP sérica
puede ser una herramienta útil para identificar perros en riesgo de
progresar a una pseudoartrosis. Se ha informado de hiperfosfatasemia
familiar con aumento de la actividad BALP en una familia de perros
esquimales siberianos (Lawleret al., 1996).
Con diferencia, los valores más altos de BALP sérico se han observado en
casos seleccionados de osteosarcoma canino, pero esto no se observa de
manera consistente. Por lo tanto, la actividad del BALP sérico tiene una
sensibilidad diagnóstica deficiente para el osteosarcoma. Sin embargo, el
BALP sérico tiene valor pronóstico ya que el aumento de la actividad del BALP
sérico preoperatorio se asocia con un tiempo de supervivencia más corto e
intervalos libres de enfermedad (metástasis) después de la cirugía y la
quimioterapia (Ehrhartet al., 1998; Garzotto et al., 2000; Kirpensteijnet al.,
2002). Además, mientras que a menudo se observa una caída en la actividad
de BALP en suero después de la extirpación quirúrgica del tumor primario, la
persistencia de un aumento de la actividad de BALP en suero después de la
cirugía se asocia con un tiempo de supervivencia más corto. Los perros con
actividad sérica total de FA aumentada no se beneficiaron de la quimioterapia
adicional; sin embargo, los perros con actividad sérica de ALP en el rango
normal sí se beneficiaron (Kirpensteijnet al., 2002). La ausencia de una mayor
actividad sérica de BALP en la mayoría de los perros con osteosarcoma
presenta una pregunta intrigante. Las células obtenidas mediante aspirados
con aguja fina de todos los osteosarcomas caninos se tiñen positivamente
para la actividad ALP (Bargeret al., 2005). El mecanismo que permite que
algunos de estos pacientes tengan una mayor actividad sérica de BALP pero
no otros no está claro, pero no parece estar relacionado con la masa tumoral
(Ehrhartet al., 1998).
IV.Enzimas Específicas
La actividad CALP sérica es una buena prueba de detección del
hiperadrenocorticismo debido a su alta sensibilidad para detectar un
aumento de la secreción de cortisol con el tiempo. No es una prueba
diagnóstica debido a su baja especificidad para el diagnóstico de
hiperadrenocorticismo (Solteret al., 1993; teské et al., 1989). El aumento
de la actividad de CALP en suero observado en animales con procesos
patológicos distintos del hiperadrenocorticismo es consistente con un
presunto aumento en la secreción de cortisol como lo indican las
pruebas de supresión de dexametasona en dosis bajas supuestamente
anormales o las pruebas de estimulación de ACTH en perros con
enfermedad no suprarrenal (Kaplanet al., 1995).
La hipofosfatasemia es poco común en especies
domésticas, aunque se observa en humanos con mutaciones
genéticas en el gen TNS ALP. Hasta donde sabemos, no se han
informado mutaciones genéticas similares en especies
domésticas, pero la actividad reducida de la fosfatasa alcalina
se ha asociado con la deficiencia de zinc en el ganado (Machen
et al., 1996; Sharma y Joshi, 2005).
Se han encontrado cantidades significativas de actividad
ALP en el plasma seminal de numerosas especies. Se ha
propuesto una baja actividad de ALP seminal como medio para
diferenciar el bloqueo parcial o completo de los conductos
epidídimo y deferente de la azoospermia y la oligospermia
testicular (Stornelliet al., 2003; Turner y McDonnell, 2003).
La actividad sérica de varias enzimas diagnósticas parece ser
inducida por diversos agentes farmacéuticos. Como anécdota, la FA
sérica es la enzima que aumenta con mayor frecuencia en los ensayos
de seguridad de los medicamentos. Es probable que existan muchos
fármacos que estimulen cierto aumento en la actividad de la FA del
hígado; sin embargo, una comprensión incompleta de los factores que
regulan la síntesis de ALP en muchos casos hace difícil determinar si el
aumento de la actividad de ALP se debe a la inducción primaria de la
síntesis, a una respuesta secundaria del hígado a las citocinas mediadas
por fármacos o a una lesión hepática inducida por fármacos.
Los glucocorticoides son inductores bien reconocidos de la
actividad de ALP en perros. La respuesta inicial al tratamiento
de perros con dosis altas de glucocorticoides es un aumento de
la actividad LALP en el hígado y suero (Solteret al., 1994). A esto
le sigue aproximadamente 5 a 7 días con la aparición de la
isoenzima CALP. Curiosamente, nunca se ha demostrado que la
magnitud del aumento de la actividad CALP en el tratamiento
experimental de perros normales alcance la magnitud de la
actividad CALP en muchos pacientes clínicos. Esto sugiere que
la inducción de la síntesis de CALP puede resultar de la acción
de los glucocorticoides de manera sinérgica con otras
citoquinas que aumentan en diversas condiciones patológicas.
Los glucocorticoides no tienen la misma capacidad para inducir
la actividad de ALP en gatos y caballos (Ellison y Jacobs, 1990;
Hoffmannet al., 1978).
También se ha observado un marcado aumento de la actividad
sérica de CALP en la hepatopatía vacuolar de los terriers escoceses
(Twedt, 2004). Aunque la hepatopatía es similar a la hepatopatía
por esteroides y todos los perros tienen una actividad CALP
aumentada, tienen actividad sérica de GGT, actividad de ALT y
concentración de bilirrubina normales, junto con ACTH normal.
365
pruebas de estimulación y supresión con dosis bajas de dexametasona.
La evidencia preliminar indica que estos perros tienen concentraciones
séricas elevadas de 17-hidroxiprogesterona o progesterona, lo que
sugiere que otras hormonas suprarrenales pueden provocar un
aumento de la actividad CALP y hepatopatía vacuolar.
El fenobarbital es otro fármaco que habitualmente se asocia
con un aumento de la actividad sérica de ALP. No se sabe si esto
ocurre como resultado de inducción enzimática o hepatotoxicidad.
Sin embargo, el aumento de la actividad sérica de ALP se considera
una observación frecuente en perros epilépticos tratados con
fenobarbital, mientras que la hepatotoxicidad es una observación
poco frecuente (Fosteret al., 2000; Mülleret al., 2000). En un estudio
retrospectivo de 78 perros tratados con fenobarbital para la
epilepsia, 19 tenían una actividad de ALP sérica superior al doble
del límite superior del intervalo de referencia, 11 tenían
predominantemente actividad de CALP y 7 tenían
predominantemente actividad de LALP (Gaskillet al., 2004). Sin
embargo, no se informó la actividad de ALP sérica antes del
tratamiento. En un estudio prospectivo de 23 perros epilépticos
sanos tratados con fenobarbital, 8 tenían una actividad de ALP
mayor que el rango de referencia y 3 tenían una actividad de ALP
dos veces mayor que el límite superior del rango de referencia
(Gaskillet al., 2004). Dos de estos 3 perros tenían
predominantemente la isoenzima CALP y 1 la isoenzima LALP. En
un estudio posterior de 11 perros tratados con fenobarbital con
actividad sérica aumentada de ALP, la isoenzima predominante en
6 de los perros fue CALP y en 5 fue LALP (Gaskillet al., 2005). La
evaluación histopatológica de las biopsias hepáticas de estos 11
perros reveló anomalías más graves y frecuentes que en los
controles, pero ningún aumento de la actividad de ALP en el tejido
hepático. Las áreas focales de lesión pueden haber aumentado la
liberación de FA de las membranas y un aumento de FA sérica. Sin
embargo, estos estudios no explican por qué CALP está presente
en algunos perros tratados con fenobarbital pero no en otros, con
o sin evidencia de enfermedad hepática.
G. lipasa
La lipasa (EC 3.1.1.3) de interés en el diagnóstico de la
enfermedad pancreática es una proteína de bajo peso
molecular de aproximadamente 42 kDa que hidroliza los
triglicéridos en las posiciones 1 y 3, dejando un
monoglicérido. La lipasa pancreática se une a la interfaz
lípido-agua emulsionada en presencia de sales biliares,
colipasa y calcio. El ensayo de lipasa pancreática original
descrito utilizó un medio de incubación que consistía en
una emulsión de triglicéridos de cadena larga en un
tampón que contenía ácido glicocólico y colipasa. Tales
ensayos minimizan la actividad de la lipasa y esterasa no
pancreáticas, pero no las inhiben por completo, lo que
tiende a ampliar los intervalos de referencia para el
diagnóstico. Esto disminuye la sensibilidad de la
actividad de la lipasa sérica total para detectar
enfermedad pancreática y disminuye la especificidad
debido a una mayor tasa de falsos positivos.
366
se prevé que sea bajo o inexistente. En primer lugar, la actividad de la
lipasa sérica de los perros pancreatectomizados permanece cerca del
50% de la actividad previa a la cirugía, lo que apunta a la presencia de
lipasa no pancreática y sugiere fuertemente que el intervalo de
referencia de la actividad de la lipasa sérica se amplía con fuentes no
pancreáticas (Simpsonet al., 1991). En segundo lugar, en un estudio de
perros con insuficiencia pancreática exocrina (EPI), no hubo diferencias
en la actividad media de la lipasa sérica entre los perros con EPI y los
perros control, lo que sugiere nuevamente que una porción significativa
de la lipasa sérica normal es de origen no pancreático. Steineret al.,
2006). Los ensayos de lipasa que probablemente sean específicos para
la lipasa pancreática incluyen un ensayo de lipasa pancreática
inmunorreactiva canina (cPLI) (Steiner et al., 2003). Mediante
inmunohistoquímica se demostró que el anticuerpo de prueba reconoce
la lipasa en las células acinares pancreáticas y no en otros tejidos
(Steineret al., 2002).
Aunque hay lipasas y esterasas no pancreáticas en el suero,
aparentemente sólo existe un gen para la lipasa pancreática canina
(Mickelet al., 1989). Del mismo modo, sólo se recuperó una
proteína con un peso molecular de aproximadamente 50,7 kDa del
páncreas de perro mediante purificación por afinidad de la lipasa
tisular (Steiner y Williams, 2002), lo que sugiere que no existen
isoenzimas de la lipasa pancreática.
La vida media en sangre de la actividad de la lipasa del jugo o
extractos pancreáticos en perros es de 1 a 3 horas (Hayakawaet al.,
1992; Hudson y Strombeck, 1978). Se encontró que la vida media
aumenta de 2 a 11 horas después de la nefrectomía, lo que sugiere
que hay eliminación renal o inactivación de la lipasa (Hudson y
Strombeck, 1978). Sólo se identifica una pequeña cantidad de
actividad lipasa en la orina y se supone que las células tubulares
renales metabolizan la lipasa filtrada.
Los ensayos de actividad de la lipasa sérica se han utilizado clásicamente
para el diagnóstico de pancreatitis aguda en perros. Normalmente, se
observa un aumento de aproximadamente 25 veces en la actividad de la
lipasa sérica dentro de los 2 a 5 días posteriores a la pancreatitis inducida
experimentalmente (Brobstet al., 1970; Desaparecido en combateet al., 1978;
simpsonet al., 1989). Este aumento tiende a ser paralelo al aumento de la
actividad de la amilasa sérica, pero puede persistir unos días más. La
sensibilidad de la lipasa sérica para el diagnóstico de pancreatitis oscila
aproximadamente entre el 60% y el 75% (Cooket al., 1993; Graçaet al., 2005;
Mansfield y Jones, 2000). La baja sensibilidad de algunos ensayos
probablemente esté asociada con el amplio rango de referencia que
generalmente se observa para la lipasa sérica (influenciada por la actividad de
la lipasa no pancreática) y posiblemente influenciada por la vida media
relativamente corta de la enzima en la sangre. Sin embargo, en un estudio
que utilizó éster de ácido 1,2-odilaril-rac-glicero-3-glutárico-(6!-
metilresorufina) como sustrato, se logró una sensibilidad del 93%, lo que
sugiere que este sustrato puede ser más apropiado para identificar la lipasa
pancreática ( Graçaet al., 2005). La especificidad de la lipasa sérica es
generalmente baja y oscila entre aproximadamente el 50% y el 75%. Estos
informes señalan los resultados variables asociados con la metodología del
ensayo. La baja especificidad puede deberse a la amplia gama de condiciones
que pueden conducir a un aumento de la actividad de la lipasa sérica, así
como a la liberación de enzimas no pancreáticas.
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
lipasa en suero (cocinaret al., 1993; Polzinet al., 1983; ralliset al.,
1996; Strombecket al., 1981). La insuficiencia renal, la enteritis y la
gastroenteritis, algunos trastornos hepáticos, el carcinoma de las
vías biliares y el linfosarcoma del tracto gastrointestinal, entre
otros, son ejemplos de enfermedades no pancreáticas que se han
asociado con un aumento de la actividad de la lipasa sérica.
Además, el tratamiento con glucocorticoides se asocia
habitualmente con un aumento de la actividad de la lipasa sérica.
Los perros tratados con dexametasona tuvieron un aumento de la
lipasa sérica cuatro veces desde la actividad inicial sin evidencia
histológica de pancreatitis (Fittscen y Bellamy, 1984; Parent, 1982).
No se ha determinado si este aumento en la actividad de la lipasa
sérica es verdaderamente lipasa pancreática.
La actividad de la lipasa sérica también puede ser útil para
diferenciar la pancreatitis grave de la leve, con valores
superiores a 4010 U/l que tienen una sensibilidad del 64% pero
una especificidad del 100% (Mansfieldet al., 2003). Algunos de
los aumentos más dramáticos de la lipasa sérica en perros se
han asociado con neoplasia pancreática o hepática. En tres
carcinomas de páncreas, dos carcinomas endocrinos que
afectan al hígado y un carcinoma hepático de origen
desconocido, la actividad de la lipasa sérica aumentó de 11 a 93
veces el límite superior del intervalo de referencia, mientras
que la amilasa sérica permaneció normal (Quigleyet al., 2001).
Seis gatos con pancreatitis aguda inducida experimentalmente
tuvieron aumentos en la actividad de la lipasa sérica de dos a seis veces
en 4 días (Kitchelet al., 1986). Sin embargo, no se encontraron
diferencias en la actividad de la lipasa sérica entre 12 gatos con
pancreatitis grave de origen natural y 43 gatos sanos o 31 gatos con
otras enfermedades (Parentet al., 1995). Por tanto, los ensayos de
actividad de la lipasa sérica tienen poca utilidad en el diagnóstico de
pancreatitis en gatos. Sin embargo, en un estudio que utilizó un
radioinmunoensayo para determinar la inmunorreactividad de la lipasa
pancreática felina (fPLI), se demostró una sensibilidad del 100 % para
gatos con pancreatitis moderada a grave y una sensibilidad del 54 %
para gatos con pancreatitis leve, lo que resultó en una sensibilidad
general de 67% (formaet al., 2004). En este estudio, se observó una
especificidad del 100% para gatos sanos.
La actividad de la lipasa sérica ha sido de poca utilidad en el
diagnóstico de la insuficiencia pancreática exocrina, probablemente
debido a la presencia de lipasa no pancreática que enmascara la pérdida
de actividad de la lipasa pancreática en el suero. En un estudio de perros
con EPI y perros sanos, el rango de actividad de la lipasa sérica fue
esencialmente el mismo en los dos grupos (Steiner et al., 2006). Sin
embargo, al utilizar un ensayo de cPLI, los 25 perros con EPI en el
estudio tenían valores de cPLI por debajo del rango de referencia, lo que
permitió una sensibilidad diagnóstica del 100 %. Hubo cierta
superposición de los valores más bajos de cPLI en perros sanos y los
valores más altos en perros EPI, lo que generó la posibilidad de
resultados falsos positivos en las pruebas.
H. amilasa
La alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) es una enzima de bajo peso molecular
(aproximadamente 45 kDa) que escinde la alfa-D-(1–4)
IV.Enzimas Específicas
enlace glicano del almidón y el glucógeno. Se ha utilizado como
enzima de diagnóstico durante más tiempo que cualquiera de las
otras enzimas. Se encuentra en concentraciones muy altas en el
páncreas de perros y gatos. Los seres humanos y las ratas tienen
cantidades sustanciales de actividad de amilasa salival, pero en la
mayoría de las especies hay muy poca. La amilasa también se
produce en el intestino delgado y el hígado, los cuales pueden
contribuir a la actividad normal de la amilasa sérica (Murtaugh y
Jacobs, 1985; Nothan y Callow, 1971). El hígado secreta su amilasa
de forma similar a la albúmina. El ARNm de amilasa se ha
identificado mediante RT-PCR en hígado, intestino, trompas de
Falopio y páncreas de perros (Mocharlaet al., 1990). La
pancreatectomía produce una disminución de hasta el 50% de la
amilasa sérica, lo que coincide con la suposición de fuentes no
pancreáticas de cierta amilasa sérica (Simpsonet al., 1991). Ha
habido varios intentos de identificar isoenzimas de amilasa en
suero y tejido, y los resultados dependen de la técnica utilizada. Se
han identificado cuatro isoenzimas o isoformas de amilasa
mediante electroforesis en gel de agarosa y acetato de celulosa
(Jacobset al., 1988; Murtaugh y Jacobs, 1985; simpsonet al., 1989).
Aunque la fracción tres aumentó en mayor medida con la
pancreatitis inducida experimentalmente, lo que sugiere que se
trata de la verdadera amilasa pancreática, la pancreatectomía no
produjo una disminución en esta fracción (Murtaugh y Jacobs,
1985). El análisis de las isoenzimas de amilasa no ha encontrado
cabida en el diagnóstico veterinario.
Las estimaciones de la vida media de la amilasa sérica en
perros normales oscilan entre 1 y 5 horas (Hayakawaet al., 1992;
Hudson y Strombeck, 1978; Yacubet al., 1969). Después de la
nefrectomía, la vida media aumenta a 14 h (Hudson y Strombeck,
1978; Nakashimaet al., 1980). Aunque la nefrectomía aumenta su
vida media sérica, menos del 1% de la amilasa pancreática
infundida en perros normales se encuentra en la orina, lo que
sugiere que la amilasa es catabolizada por el riñón. El hecho de que
la amilasa pancreática infundida en perros nefrectomizados todavía
se elimine sugiere que existen medios adicionales para eliminar la
amilasa de la sangre además de los riñones. Esto está respaldado
por un aumento de la amilasa en el hígado, que podría prevenirse
bloqueando el sistema reticuloendotelial después de la infusión de
amilasa pancreática (Hiatt y Bonorris, 1966).
La amilasa sérica se utiliza habitualmente como prueba de
detección de pancreatitis aguda. En la pancreatitis inducida
experimentalmente en perros, se observaron aumentos de ocho a doce
veces y hasta 29 veces entre 1 y 3 días, y volvieron a la normalidad entre
3 y 5 en un estudio, y 8 días en otro estudio (Brobst et al., 1970;
Desaparecido en combateet al., 1978; simpsonet al., 1989). Un aumento
de la actividad de la amilasa sérica de dos veces o más por encima del
intervalo de referencia, en ausencia de enfermedad renal, generalmente
se considera sugestivo de pancreatitis. Sin embargo, la sensibilidad de la
actividad de la amilasa sérica en el diagnóstico de pancreatitis en perros
es baja, con informes del 63% y el 78% (Cooket al., 1993; Jacobset al.,
1988). Se ha informado que la especificidad de la actividad de la amilasa
sérica es del 77%. Se ha observado un aumento de la actividad de la
amilasa sérica en perros.
367
observado en enfermedad renal, diabetes mellitus, linfosarcoma y
hemangiosarcoma (Strombecket al., 1981). Se observa
comúnmente un aumento de la actividad de la amilasa sérica en la
enfermedad renal en perros. La ligadura del vaso renal produce un
aumento del 60% en la actividad de la amilasa sérica en 48 h
(Hudson y Strombeck, 1978). Se observó un aumento de 2,5 veces
por encima del intervalo de referencia en perros con enfermedad
renal tanto inducida como espontánea (Polzin et al., 1983). Los
perros con insuficiencia renal pueden tener un aumento tanto de la
amilasa sérica como de la amilasa urinaria (Corazza et al., 1994). El
aumento de la amilasa sérica puede deberse en parte a una
disminución de la tasa de filtración glomerular, pero los autores
también detectaron una macroamilasa en el 77% de los perros con
proteinuria. El aumento de la amilasa urinaria probablemente se
deba a una reducción de la absorción tubular renal.
La actividad de amilasa sérica para el diagnóstico de
pancreatitis aguda en gatos se considera de poco valor y se ha
demostrado que en realidad disminuye en la pancreatitis inducida
experimentalmente (Kitchellet al., 1986).
El tratamiento de perros normales con dosis bajas o altas
de dexametasona da como resultado una disminución
estadísticamente significativa en la actividad de la amilasa
sérica (Parent, 1982). Se han hecho observaciones similares en
perros tratados con prednisona (Fittscen y Bellamy, 1984). Sin
embargo, el estrés asociado con la cirugía no afecta la actividad
normal de la amilasa sérica (Bellah y Bell, 1989; Finco y Stevens,
1969), aunque hubo un aumento transitorio en la actividad de
la amilasa sérica después de la pancreatografía retrógrada
endoscópica (Spillmannet al., 2004).
I. Tripsina y tripsinógeno
La tripsina (EC 3.4.21.4) es una enzima serina proteinasa
producida por el páncreas en forma de proenzima
tripsinógeno. El páncreas secreta tripsinógeno en el intestino,
donde la enteroquinasa lo convierte en tripsina, la enzima
proteolítica activa. Los primeros intentos de evaluar la función
pancreática mediante ensayos de actividad tríptico en suero no
tuvieron éxito. Es probable que esto se deba a que la enzima
liberada en el espacio vascular es tripsinógeno y no tripsina y,
por lo tanto, no tiene actividad tríptico (Steiner y Williams,
1999). Por lo tanto, el desarrollo de inmunoensayos específicos
de especie para la tripsina denominados inmunorreactividad
similar a la tripsina (TLI) (Steineret al., 1996; Williams y Batt,
1983). Estos inmunoensayos detectan tanto tripsina como
tripsinógeno.
Se cree que el tripsinógeno sérico deriva principalmente del
páncreas. Esto está respaldado por la observación de que la
pancreatectomía en perros sanos redujo el TLI sérico canino (cTLI)
de una media de 6,2µg/l a 1,2µg/l (Simpson et al., 1991). No se
informa la vida media sanguínea de TLI, pero es probable que sea
relativamente corta, ya que estas enzimas son rápidamente
eliminadas por endopeptidasas cuya función es inactivar las
enzimas liberadas por el páncreas (Zoran, 2006). cTLI
368
ha sido de gran utilidad para la detección de la insuficiencia pancreática
exocrina canina (EPI). En un grupo de 25 perros con EPI, las
concentraciones séricas de cTLI fueron todas inferiores a 1,9µg/l
(intervalo de referencia $ 5,2–34µg/l), lo que da como resultado una
sensibilidad de la prueba del 100% (Williams y Batt, 1988). En 50 perros
con enfermedad del intestino delgado, no hubo diferencias en los
valores de cTLI con respecto a los perros normales, lo que sugiere una
especificidad del 100%. El alto grado de sensibilidad y especificidad de
cTLI para el diagnóstico de EPI está respaldado por un estudio más
reciente (Steiner et al., 2006). Por lo tanto, cTLI se ha convertido en el
estándar de oro para el diagnóstico de EPI en perros. El cTLI sérico
también puede aumentar en la pancreatitis aguda, como lo demuestra
la observación en un estudio de que, después de la ligadura del
conducto pancreático de ocho perros, el cTLI aumentó dentro de las 24
horas y permaneció elevado por encima de los valores de control en seis
de los ocho durante 5 días (Simpsonet al., 1989). El cTLI sérico también
disminuyó más rápidamente que la actividad de amilasa y lipasa. En la
pancreatitis espontánea, sólo 6 de 10 perros con pancreatitis grave y 2
de 5 perros con pancreatitis leve tenían cTLI sérico mayor que el rango
de referencia (Mansfieldet al., 2003). Debido a que los riñones eliminan
el tripsinógeno, la disminución de la tasa de filtración glomerular puede
provocar un aumento de cTLI (Geokaset al., mil novecientos ochenta y
dos). La relativa falta de sensibilidad y el tiempo de respuesta
históricamente más largo para la determinación de cTLI en comparación
con la lipasa y amilasa séricas han hecho que el cTLI sea de poco valor
para la determinación de pancreatitis en perros.
Cuando se evaluó el fTLI sérico para el diagnóstico de
pancreatitis en gatos, los resultados han sido variables según el
estudio. Los rangos de referencia informados han sido variables, lo
que da como resultado sensibilidades informadas que van desde el
33 % cuando el límite es 100µg/l al 86% cuando el límite es 49µg/l
(Gerhardtet al., 2001). Aunque no se informó especificidad en este
estudio, se reporta una superposición en los valores de TLI en
gatos con pancreatitis confirmada y gatos sin pancreatitis (Forman
et al., 2004; Rápidoet al., 2000). El aumento de la concentración
sérica de fTLI puede estar asociado con azotemia, enfermedad
inflamatoria intestinal y linfoma gastrointestinal (Simpson, 2001;
Swiftet al., 2000). Para mejorar la especificidad, se deben utilizar
valores de corte más altos, lo que reduce la sensibilidad. Incluso
con una sensibilidad más baja, la concentración de fTLI se
consideró una prueba de diagnóstico útil en gatos porque los
signos clínicos en los gatos son menos específicos y otras pruebas
mínimamente invasivas como la amilasa y lipasa séricas, la
ecografía y la tomografía computarizada con contraste fueron
insensibles o carentes de valor. (gerhardt et al., 2001; Simpson,
2001; Steiner, 2003). Sin embargo, un estudio más reciente ha
demostrado una mayor sensibilidad de fPLI (67%) en el diagnóstico
de pancreatitis felina junto con una mayor especificidad, lo que
sugiere que fPLI puede suplantar la determinación de fTLI en el
diagnóstico de pancreatitis en gatos (Formanet al., 2004).
Aunque hay menos datos disponibles en comparación con los
de los perros, existe evidencia de que la determinación de la
concentración de fTLI también es útil para el diagnóstico de EPI en
gatos. De 20 gatos con f TLI de %8µg/l (controles $ 17–49µg/l),
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
17 tenían pruebas convincentes de EPI (Steiner y Williams,
2000).
J. Creatina quinasa
La creatina quinasa (CK) (EC 2.7.3.2) cataliza el intercambio de una
fracción fosfato entre fosfato de creatina y ATP. En el miocardio y el
músculo esquelético, la CK permite el almacenamiento de energía
en forma de fosfato de creatina cuando la demanda es baja, pero
cuando se necesita energía para la contracción muscular, la CK
cataliza la transferencia del fosfato de alta energía del fosfato de
creatina al ADP para formar ATP. Una pequeña cantidad de
actividad de CK está asociada con las mitocondrias, donde es
responsable de la transferencia de fosfato de alta energía a la
creatina, el transportador citosólico.
La mayor cantidad de datos sobre CK en especies domésticas está
disponible para perros, ya que esta especie se ha utilizado a menudo
como modelo experimental para enfermedades del miocardio en
humanos. Canine CK se revisa en profundidad en otro lugar (Aktaset al.,
1993).
La actividad de CK se concentra mayormente en el músculo
esquelético, seguido por el músculo cardíaco, el diafragma y el músculo
liso, y luego el cerebro (Keller, 1981). En la mayoría de las especies, la
cantidad de actividad es de dos a cuatro veces mayor en el músculo
esquelético que en el músculo cardíaco, aunque en los gatos es casi
igual (Boyd, 1983). La actividad de CK en el tejido cerebral es
aproximadamente el 10% de la del músculo esquelético. La CK se
encuentra principalmente en el citoplasma; sin embargo, existe una
forma mitocondrial que constituye un pequeño porcentaje de la
actividad total de CK de la célula. Hay evidencia de diferencias raciales,
con una mayor actividad de CK en el músculo esquelético en los galgos
que en los mestizos y más actividad de CK en los músculos de acción
rápida que en los de contracción lenta (Guy y Snow, 1981; Lindenaet al.,
mil novecientos ochenta y dos).
Hay dos subunidades distintas de CK, denominadas
subunidades M (músculo) y B (cerebro). Estos se combinan
aleatoriamente para formar tres isoenzimas de CK: CK-MM, CK-BB y
CK-MB. El músculo esquelético de la mayoría de las especies tiene
casi 100% CK-MM (Aktaset al., 1993; Boyd, 1983). El músculo
cardíaco tiene principalmente CK-MM y una cantidad variable de
CK-MB; los perros y los caballos tienen aproximadamente 3% y 10%
de CK-MB, respectivamente. El cerebro tiene principalmente CK-BB
con un pequeño porcentaje de CK-MB y CK-MM. En los perros, el
intestino y el bazo tienen predominantemente CK-BB, seguida de
CK-MB y luego CK-MM. La distribución normal de las isoenzimas
séricas de CK en perros es aproximadamente 50% CK-MM y 40%
CK-BB, siendo el resto CK-MB (Aktaset al., 1993). Aunque el análisis
de la isoenzima CK es de gran importancia en la medicina humana
como indicador de infarto de miocardio, no se ha demostrado la
necesidad del análisis de la isoenzima CK en especies veterinarias.
Sin embargo, la hipertrofia ventricular izquierda inducida
experimentalmente en perros resultó en una reducción del 50% en
CK-MM y un aumento de 10 veces en CK-MB (Yeet al., 2001).
IV.Enzimas Específicas
También se ha demostrado que la CK-MB sérica, presumiblemente
debido a una lesión miocárdica, aumenta en potros con sepsis,
pero no hay diferencias entre los supervivientes y los no
supervivientes, lo que sugiere que el análisis de isoenzimas de CK
no tiene valor pronóstico (Slacket al., 2005). La forma mitocondrial
de CK (MtCK) existe en dos isoenzimas codificadas por genes
separados (Payne y Strauss, 1994). Estos no tienen valor
diagnóstico aparente en este momento.
La vida media de la actividad de la CK en sangre es relativamente
corta en todas las especies. La vida media de la CK procedente de
extractos de miocardio es de 2 a 3 h en perros (Cairns y Klassen, 1977;
Sobelet al., 1977). La vida media media de la solución de CK
administrada a partir de músculo esquelético de perros, ovejas, caballos
y ganado vacuno es de 2,61, 2,07, 2,05 y 8,67 h, respectivamente (Aktas
et al., 1995; Houpertet al., 1995; Lefebvreet al., 1994; Volfingeret al.,
1994; ver también Lefebvreet al.[1996] para revisión). La vida media
después de la inyección intramuscular de homogeneizado muscular en
perros fue de aproximadamente 6,5 h, siendo el paso limitante la
absorción desde el lugar de la inyección a la sangre a través de los
linfáticos (Aktaset al., 1995). Esta vida media puede ser más relevante
clínicamente ya que refleja mejor la fuente de CK en la sangre después
de una lesión muscular. Se desconoce el mecanismo por el cual la CK se
elimina de la sangre, pero puede implicar la inactivación de los grupos
tiol de la enzima. La actividad de CK no se pierde a través de los riñones
y la creación de una derivación portocava con detención del flujo
sanguíneo hepático no tuvo ningún efecto sobre la tasa de eliminación
de la actividad de CK en perros (Oostenbroeket al., 1985).
Los valores de referencia para la actividad de CK sérica son más
altos en perros menores de 1 mes de edad y disminuyen hasta el año de
edad (Aktaset al., 1994). El valor de referencia es casi dos veces mayor
en perros pequeños que en perros grandes. Sin embargo, no es
probable que estas diferencias tengan un impacto significativo en el
valor diagnóstico de la actividad de CK.
En especies domésticas, la actividad de CK se utiliza principalmente
como marcador de lesión del músculo esquelético asociada con
traumatismos, miopatías nutricionales, lesión muscular inducida por el
ejercicio o miopatías congénitas. Se observa un aumento de la actividad
de CK en el suero del perro como consecuencia de enfermedades del
miocardio como la dirofilariasis y la infección por parvovirus, pero no
cambia en la hipertrofia del miocardio (Jacobset al., 1980; Kitagawaet al.,
1991). Se ha informado un marcado aumento de la actividad sérica de
CK en miopatías congénitas como la miotonía y la miopatía ligada al
cromosoma X de los golden retrievers (Cooperet al., 1988; joneset al.,
1977; Enamoradoet al., 1988). Sólo se observaron aumentos modestos a
moderados en la actividad de CK sérica en miopatías adquiridas de
perros, como hipertermia maligna, hiperadrenocorticismo,
hipotiroidismo y deficiencia de vitamina E-selenio (Greenet al., 1979;
kaelinet al., 1986; O'Brien et al., 1990; Van Vleet, 1975). Se puede esperar
que la CK sérica aumente después de la cirugía. La actividad de CK sérica
a menudo aumenta en los trastornos neurológicos, pero por lo general
se debe a un aumento de CK-MM más que de CK-BB (Hoffmann, 1994).
Por lo tanto, el aumento de la actividad sérica de CK es probablemente
el resultado de contracciones involuntarias del músculo esquelético. Sin
embargo,
369
Se observó un aumento de CK-BB en un Yorkshire terrier con encefalitis
necrotizante (Sawashimaet al., 1996). Se ha evaluado en perros la
sensibilidad y especificidad de la actividad de CK sérica para el
diagnóstico de enfermedades del músculo esquelético, del miocardio y
neurológicas (Aktaset al., 1994). Los resultados falsos positivos, que
provocaron una disminución en la especificidad de la prueba, se
atribuyeron a la alta concentración de CK en el músculo, la gran masa
muscular y la liberación de enzimas por razones inespecíficas. También
se produjeron varios falsos negativos, lo que redujo la sensibilidad, y se
atribuyeron a la corta vida media de la actividad de la CK en sangre.
En los gatos, el aumento de la actividad sérica de CK puede estar
asociado con traumatismos, cirugía e inyecciones intramusculares.
También se ha informado de un aumento (actividad media de CK de
2529 U/l) observado en gatos anoréxicos (Fascettiet al., 1997), lo que
sugiere que la actividad de CK sérica podría servir como marcador del
estado nutricional en gatos. Se cree que el aumento de la actividad de la
CK en la anorexia en gatos se debe al catabolismo muscular secundario
a la disminución de la ingesta calórica. La actividad sérica de CK
disminuye significativamente dentro de las 48 horas posteriores a la
suplementación nutricional.
La actividad sérica de CK aumenta en caballos en una variedad de
condiciones que causan lesiones musculares. Ya en 1967, y en
numerosos informes desde entonces, el aumento de la actividad sérica
de CK se ha asociado con mioglobinuria paralítica (Cardinetet al., 1967).
Se ha observado un marcado aumento de la actividad sérica de CK en
cuatro caballos con rabdomiolisis grave asociada conEstreptococo equi
infección (Patrocinadoret al., 2005). También se ha descrito un aumento
de la actividad sérica de CK en caballos con rabdomiólisis por esfuerzo
asociada con miopatía hereditaria por almacenamiento de polisacáridos
(Ribeiroet al., 2004). El ganado también presenta aumentos en la
actividad de CK sérica con una variedad de lesiones y enfermedades
musculares. El aumento de la actividad sérica de CK es común con la
deficiencia de selenio y vitamina E (Arthur, 1988; Zustet al., 1996). Las
especies de animales grandes también suelen tener una mayor
actividad de CK sérica debido a la decúbito prolongado o a la necrosis
por presión del músculo.
Existen numerosos informes de aumentos en la actividad de CK
sérica asociados con la inyección intramuscular de fármacos. Se ha
propuesto una técnica no invasiva que utiliza el área bajo la curva y
la eliminación plasmática total de la actividad de CK para
determinar el daño muscular posterior a la inyección en perros,
caballos, ovejas y ganado vacuno (Aktaset al., 1995; Houpertet al.,
1995; Lefebvreet al., 1994; Toutainet al., 1995; ver Lefebvre et al.[
1996] para revisión). Por ejemplo, la cantidad de tejido muscular
dañado después de una inyección IM de imidocarb en un beagle de
10 kg es de 2,5 g (Aktaset al., 1995). Esta técnica cuantitativa tiene
un uso potencial en la evaluación de la tolerancia local de la
administración intramuscular de nuevos fármacos para satisfacer
los requisitos reglamentarios.
Ha habido cierto interés en los aumentos de la actividad de CK
inducidos por el ejercicio en caballos y perros. Se han observado
aumentos en perros de trineo después de carreras de larga distancia y
en caballos en diversos programas de entrenamiento (Harriset al., 1998;
Hinchcliffet al., 1993, 1998; Vnolfingeret al., 1994).
370
En las carreras de trineos tirados por perros de larga distancia, existen
marcadas variaciones interindividuales, con una actividad que va desde
sin cambios hasta un aumento de más de 13 veces. Sin embargo, existe
un aumento mínimo en la actividad de CK sérica después del ejercicio en
perros beagle no entrenados (Chanoitet al., 2002). En caballos, se ha
concluido mediante estudios cinéticos que la cantidad, en gramos, de
músculo estriado dañado es insignificante después del ejercicio
(Volfingeret al., 1994). Se ha informado que los aumentos tienden a
ocurrir con mayor frecuencia en potras, animales más jóvenes y caballos
no entrenados (Harriset al., 1998).
En todas las especies, la CK tiene la ventaja sobre la aspartato
aminotransferasa sérica de ser específica para la lesión muscular y
no verse afectada por la lesión hepatocelular. La corta vida media
de la enzima puede tender a reducir la sensibilidad diagnóstica de
la prueba, pero también ofrece un medio eficaz para controlar la
respuesta al tratamiento.
K. Otras enzimas
Como se mencionó en la introducción, se han investigado muchas otras enzimas para su uso en el diagnóstico y
pronóstico de enfermedades y disfunción de órganos en animales no humanos. Algunos de ellos se han
abandonado por completo o reciben un uso limitado, como la deshidrogenasa del ácido láctico, la 5!
nucleotidasa, la glutatión S-transferasa, la leucina aminopeptidasa, la arginasa, la aldolasa y la fosfatasa ácida,
entre otras. Las razones de su uso limitado varían, pero incluyen una precisión diagnóstica relativamente pobre,
redundancia de diagnóstico con pruebas ya establecidas y falta de kits de prueba fácilmente disponibles. Por
ejemplo, la actividad sérica del ácido láctico deshidrogenasa (LDH) se origina en varios tejidos, incluidos el
hígado, el músculo esquelético, el músculo cardíaco y los eritrocitos. Esta disminución resultante de la
sensibilidad y especificidad de la prueba limita la precisión diagnóstica de la actividad de la LDH sérica. Aunque
el análisis de la isoenzima LDH puede mejorar la especificidad del tejido, las pruebas consumen relativamente
tiempo, son costosas y aún así sólo proporcionan una evaluación subjetiva de la contribución de cada órgano a
la actividad sérica total. Además, la prueba no ofrece una mejora sustancial con respecto a los ensayos de otras
enzimas como la alanina aminotransferasa o la creatina quinasa. Algunos laboratorios todavía ofrecen 5!
nucleotidasa, pero proporciona gran parte de la misma información que la ALP y, como resultado, tal vez haya
perdido popularidad. La arginasa es muy específica para dañar los hepatocitos, pero tiene una vida media corta
y no está disponible para los autoanalizadores. y aún así sólo proporcionan una evaluación subjetiva de la
contribución de cada órgano a la actividad sérica total. Además, la prueba no ofrece una mejora sustancial con
respecto a los ensayos de otras enzimas como la alanina aminotransferasa o la creatina quinasa. Algunos
laboratorios todavía ofrecen 5!nucleotidasa, pero proporciona gran parte de la misma información que la ALP y,
como resultado, tal vez haya perdido popularidad. La arginasa es muy específica para dañar los hepatocitos,
pero tiene una vida media corta y no está disponible para los autoanalizadores. y aún así sólo proporcionan una
evaluación subjetiva de la contribución de cada órgano a la actividad sérica total. Además, la prueba no ofrece
una mejora sustancial con respecto a los ensayos de otras enzimas como la alanina aminotransferasa o la
creatina quinasa. Algunos laboratorios todavía ofrecen 5!nucleotidasa, pero proporciona gran parte de la misma
información que la ALP y, como resultado, tal vez haya perdido popularidad. La arginasa es muy específica para
dañar los hepatocitos, pero tiene una vida media corta y no está disponible para los autoanalizadores.
V. FUTURO DE LA ENZIMOLOGÍA DEL SUERO
Aunque el número de estudios que investigan ensayos de actividad
enzimática con fines de diagnóstico ha disminuido desde la década
de 1990, todavía son de inmensa importancia para la medicina de
diagnóstico. El creciente interés actual en identificar marcadores
proteicos y peptídicos de lesión o disfunción orgánica requerirá
inmunoensayos para determinar sus concentraciones.
Capítulo | 12Enzimología diagnóstica de animales domésticos.
en suero. Esto suele ser problemático para los veterinarios, ya que a
menudo no se dispone de anticuerpos adecuados para estos
marcadores en los animales domésticos. La divergencia entre la
investigación de biomarcadores humanos y la enzimología sérica clásica
tiene la consecuencia no deseada de limitar la universalidad de la
aplicación de nuevos biomarcadores entre especies. Aunque esto sigue
siendo un factor disuasivo, existe un creciente interés en el desarrollo y
utilización de inmunoensayos en medicina veterinaria, como lo
demuestran los ensayos de inmunorreactividad similar a la tripsina y la
inmunorreactividad de la lipasa pancreática en perros y gatos, así como
los inmunoensayos para proteínas no enzimáticas, como como los
péptidos natruréticos y las troponinas. Cada vez se abordan más los
problemas relacionados con la disponibilidad de inmunoensayos y el
largo tiempo transcurrido desde la presentación hasta la obtención de
los resultados de laboratorio. Por ejemplo, el desarrollo de analizadores
automatizados para inmunoensayos ha permitido que los resultados de
las pruebas estén disponibles el mismo día en que se envían las
muestras. Canine TLI está disponible en el sistema Immulite de
Diagnostic Products Corporation y se esperan más en el futuro. Los
campos de la enzimología sérica y los marcadores de proteínas séricas
se han fusionado en la medicina humana, como lo demuestra la sección
temática "Proteómica y marcadores de proteínas" en el índice de la
revista.Química Clínica.Es casi seguro que se producirá el desarrollo de
esta fusión en la medicina animal no humana.
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