Análise Instrumental Farmacêutica

Prof. Dr. Anderson de Jesus Gomes

Espectrofotometria UV-vis

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

2
 Propriedades da luz

Comprimento de onda (𝜆) - Distância medida ao longo da linha de propagação

entre dois pontos equivalentes que estão em fases adjacentes da onda.
Unidade: 𝜆 = nm

3
 Propriedades da luz

Frequência (𝝂 – É o número de oscilações completas que a onda faz a cada

segundo. Unidade 𝝂 = s-1 = Hertz (Hz)

4
Espectro Eletromagnético

5
 Propriedades da luz
Espectrofotometria de Absorção Molecular na Região do UV-Vis é um método
espectroscópico baseado na absorção da radiação nos comprimentos de onda (λ)
da região do Ultravioleta e do Visível
•Violeta: 400 - 420 nm

•Indigo: 420 - 440 nm

•Azul: 440 - 490 nm

•Verde: 490 - 570 nm

•Amarelo: 570 - 585 nm

•Laranja: 585 - 620 nm

•Vermelho: 620 - 780 nm

6
Energia x Comprimento de onda

E = mc2

7
 Absorção de luz

8
 Interação da radiação com a matéria

• A energia incidente pode ser:

§ Refletida

§ Transmitida

§ Absorvida

9
 Absorção de luz

Quando a luz é absorvida por uma amostra, a energia radiante do feixe diminui.

10
 Transmitância (T)

• Transmitância (T) - Razão entre a energia radiante transmitida por uma

substância e a energia radiante incidente nessa substância: T = I1/I0

• Portanto, T esta entre 0 e 1. A transmitância percentual é simplesmente 100T e

fica entre 0 e 100%.

11
 Absorvância

• Absorvância é definida como:

⎛ I0 ⎞
A = log10 ⎜ ⎟ = − log T
⎝ I ⎠
• Quando não é absorvida nenhuma luz, I = I0 e A = 0.
• Se 90% da luz são absorvidos, 10% são transmitidos e I = I0/10. Esta razão da
A = 1.
• Se apenas 1% da luz é transmitido, A = 2.

• A absorvância é muito importante porque ela é diretamente proporcional a

concentração, C, de espécies absorventes de luz na amostra.

12
 Exercícios

Expresse as seguintes absorbâncias em termos de porcentagem de

transmitância:
•0,038 (91,6%)
•0,958 (11,0%)
•0,399 (39,9%)

A = − log T
( − A)
T = 10 x100

13
 Exercícios

Converta os seguintes valores de transmitância para absorbância:

•15,8% (0,801)
•49,2% (0,308)
•39,4% (0,405)

A = − log T

14
 Lei de Beer

• Lei de Lambert-Beer ou Lei de Beer

A=εbc
• 𝜀 = coeficiente de absortividade molar (cm-1.mol-1.L)
• b = caminho ótico (cm)
• c = concentração da espécie absorvente (mol.L-1)
• A = adimensional

15
 Absortividade molar (𝜀)

• Absortividade molar (𝜀) - Relação descrita pela absorbância dividida pelo

produto da concentração C da substância (amostra) e o comprimento óptico (b)
percorrido pela radiação: 𝜀 = A/(C.b)

16
Relação entre absorbância e concentração

ÇConc. ➠ ÇA

Aumento da absorbância

17
 Exercício

Quais são as unidades da absortividade molar (𝜀) ?

18
 Exercício

Encontre a absorvância de uma solução 0,00240 M de uma substância com

coeficientes de absortividade molar 313,00 M-1cm-1 numa célula de caminho óptico
de 2,00cm.
A = − log T
A=ε bc
−1 −1
log T = − A
A = (313M cm )(2cm)(0,00240M )
T = 10− A
A = 1,50
T = 10−1,50
T = 0, 0316
T = 3,16%

Somente 3,16% da luz incidente emerge dessa solução

19
 Exercício

Uma solução que contém 6,23 ppm de KMnO4 apresenta uma transmitância de
0,195 uma célula de 1,00 cm a 520 nm. Calcule a absortividade molar do
KMnO4 em 520 nm. (K = 39; Mn = 55; O = 16).

ppm = parte por milhão = 1mg/1L = 1µg/1mL ... Para casa!!

𝐴 = 𝜀×𝑏×𝐶

20
 Exercício
A transmitância de uma solução que contém 5,24 mg/100 mL de A (335 g/mol) é
55,2% em uma célula de 1,50 cm a 425 nm. Calcule a absortividade molar de A
neste comprimento de onda.

Para casa !!

21
 Limitações da lei de Beer

• A lei de Beer se aplica a radiação monocromática e funciona muito bem para

soluções diluídas.

22
 Limitações da Lei de Beer
Altas concentrações = Interação entre as moléculas afeta a distribuição de
carga, alterando o coeficiente de absortividade molar

Índice de refração = O coeficiente de absortividade molar pode alterar com a

variação do índice de refração

23
 Desvios Químicos

Surgem quando um analito se dissocia, se associa ou reage com um solvente

para dar um produto que tem um espectro de absorção diferente.

Dissocia

Analito Associa

Reage

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 Desvios Instrumentais
Desvios Instrumentais: são desvios que ocorrem devido ao instrumento utilizado na
medição da absorbância.

§Largura da faixa espectral escolhida.

§Radiação estranha refletida dentro do equipamento que alcançou o detector.

§Variação da resposta do detector.

§Flutuação da fonte.

Como minimizar o desvio?

• Escolher região onde o ε é constante na banda selecionada

25
 Espectroscopia no Ultravioleta

• Limitação: apenas a sistemas conjugados.

• Banda de absorção: região de probabilidade de interação da luz e matéria
(absorção).

26
 Espectroscopia no Ultravioleta

O processo de absorção UV-vis envolve os elétrons de ligação:

• Elétrons π, σ e n
• Elétrons d e f
• Transferência de carga

As moléculas orgânicas possuem ligações covalentes.

Assim, possuem elétrons de valência que podem ser
excitados a níveis energéticos mais elevados

27
 Espectroscopia no Ultravioleta

Transições Eletrônicas em compostos orgânicos

•Absorção no UV-vis depende da presença de grupos funcionais com elétrons de
valência com energias de excitação menores ð grupos cromóforos.

•Cromóforo - A parte da molécula responsável pela absorção de luz

•C=C, C=O, N=N, NO2,

•Transições π ➛ π* e n ➛ π*

28
 Espectroscopia no Ultravioleta

Transições Eletrônicas em compostos orgânicos

29
Exemplo

30
 Deslocamentos Químicos

Aumento da Polaridade do Solvente

Transições n ➛𝝅
Deslocamento hipsocrômico (deslocamento para o azul). Do maior para o menor
comprimento de onda.

Polaridade
água> ACN

31
 Deslocamentos Químicos

Aumento da Polaridade do Solvente

•Transições 𝝅 ➛ 𝝅
•Deslocamento batocrômico (deslocamento para o vermelho). Do menor para
maior comprimento de onda

32
 Efeito Auxocrômico

• Auxocromo é grupo funcional não absorvente que desloca o máximo de

absorção do cromóforo para comprimentos de ondas maiores

33
 Efeito da Conjugação de Cromóforos

• Deslocalização de elétrons 𝝅
• Envolvem 4 ou mais centros atômicos

acetona Vinil metil cetona

34
 Requisitos na Análise Química

• Para um composto ser analisado por espectrofotometria, ele deve absorver luz, e
essa absorção deve ser distinguível daquela oriunda de outra substâncias
presente na amostra.

• Como a maioria dos compostos absorve a radiação ultravioleta, análises nesta

região tendem a ser não conclusivas.

35
Espectrofotometria UV-vis

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

36
 Espectrofotômetro

U-3900/3900H Double-Beam Single/Double-Monochromator

Research-Grade Spectrophotometers Specifications

Wavelength range 190 to 900 nm

Variable 0.1, 0.5, 1, 2, 4, and 5

Band pass
nm

1.5, 3, 15, 30, 60, 120, 300,

Scan speed
600, 1200, 1800, 2400 nm/min

Detector Single Photomultiplier

680 (W) x 692 (D) x 257 (H)

Dimensions mm
27 in (W) x 27 in (D) x 10 in (H)

Weight Approx. 45 Kg (100 lbs)

100, 120, 220, 230 or 240 V AC,

Power requirements
50/60 Hz, 300 VA

37
Espectrofotômetro de Feixe duplo

38
Fontes de radiação

39
 Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

40
Celas de medida

41
 Cubetas

Para espectroscopia ultravioleta e visível, a amostra líquida é geralmente

colocada numa célula chamada de cubeta.

42
Solvente

Solvent UV absorbance cutoff (nm)

Acetone 329

Benzene 278

Dimethylformamide (DMF) 267

Ethanol 205

Toluene 285

Water 180

TABLE 1: UV absorbance cutoffs of various common solvents.

43
 Preparo de amostra

1 -Preparar as soluções padrão

Diferentes concentrações

44
 Avaliação do espectro
• 2 -Escolher o comprimento de onda ideal

• a. Solução número 1 (branco) - Calibrar o equipamento

• b. Solução número 2 - Registrar espectro (200-800nm)

45
 Curva Analítica

• 3 Obtenção da curva analítica do complexo Ajustar o espectrofotômetro no

comprimento de onda e determinar absorção de cada uma das soluções padrão

Comprimento de onda (nm) Concentração

46
 Exemplo
Curva de calibração
0.6

0.5

0.4

Abs
0.6 0.3

Concentração Abs
0.2
0.005 0.026
0.5
0.010 0.054 0.1
0.025 0.106
0.4 0.050 0.265 0.0
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
0.100 0.539 Concentração mol/L
Abs

0.3
Inclinação = 5.448
0.2 Intercepto = 0.0090
0.1 r2 = 0.9967

0.0
300 400 500 600 700 800 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏
Comprimento de onda, nm
𝐴 = 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 × 𝐶 + 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜
47
 Linha de base

A relação sinal-ruído compara o nível de um sinal desejado com o nível do ruído

de fundo.

Quanto mais alto for a relação sinal-ruído, menor é o efeito do ruído de fundo
sobre a medição do sinal.

48
 Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

49
 Vantagem e desvantagens

Amostras com elevado grau de pureza

Eficaz em baixas
Métodos Rápido e não
concentrações da
espectroscópicos destrutivo
amostra [µg]

Elevado custo da instrumentação

50
 Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

51
 Aplicações

§Controle de Qualidade
§Determinação quantitativa de compostos
§Identificação de grupos funcionais
§Medida de pequenas quantidades de DNA
§Medida de transmitância de protetor solar
§Avaliação de transmitância de lentes
§Avaliação de cinéticas reacionais

52
 Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

53
 Exercícios

Na Figura abaixo, qual o lado que corresponde aos fótons de maior energia?
Considerando sua resposta, você diria que as transições de elétrons para
orbitais antiligantes são processos que requerem maior ou menor energia do que
as vibrações moleculares?

54
 Exercícios

Uma certa substância apresenta absortividade molar de 5248 L mol–1 cm–1 a 275
nm. Uma solução desta substância, de concentração desconhecida, apresentou
absorbância A = 0,63 neste comprimento de onda, com uma cela (cubeta) de
quartzo de 1,0 cm. Qual é a concentração molar da substância?

55
 Exercícios

O espectro de UV da acetona (0,05 mol/L em ciclo-hexano, cela de 1,0 cm)

mostra um pico de absorção 𝜆max a 279 nm com uma absorbância de 0,75. Qual é
a absortividade molar da acetona neste comprimento de onda?

56
 Exercícios
Um químico encontrou, em uma gaveta, um jogo de duas celas de quartzo
idênticas, com gargalo e tampa. Medidas externas indicam que a distância interna
entre as paredes da cela deve ser um pouco maior do que 1 cm, mas é muito difícil
medir corretamente porque o gargalo é estreito. O químico, no entanto, queria usar
as celas para medidas de espectroscopia no UV/visível, e precisava conhecer essa
distância com relativa exatidão. Ele preparou então uma solução 1,50´10–4 mol/L
de um corante e mediu a absorbância a 500 nm; a média de 4 medidas forneceu o
valor A = 1,71. Sabendo que o tal corante apresenta absortividade molar 𝜀 = 9500
L mol–1 cm–1 a 500 nm, qual é a distância interna entre as paredes da cela?

57
 Exercícios
Um químico deseja traçar o espectro de UV, na região 200 – 380 nm, de uma
substância conhecida; consultando a literatura, ele verifica que o espectro desta
substância deve apresentar dois máximos nesta região: um a 218 nm (𝜀 = 16000
L mol–1 cm–1) e outro a 320 nm (𝜀 = 900 L mol–1 cm–1). O químico deseja, na
medida do possível, ver ambas as absorções no mesmo espectro. Como uma das
absorções apresenta absortividade molar muito pequena, é desejável utilizar uma
concentração tão alta quanto possível. (a) Qual a maior concentração que ele
pode utilizar, com celas de 1,0 cm, para não exceder o limite de absorbância de
seu registrador (Amáximo = 2,0)? (b) Qual deve ser o valor da absorbância para o
menor pico, nesta concentração?

58
 Exercício
O hexano puro possui absorvância ultravioleta desprezível acima de um
comprimento de onda de 200 nm. Uma solução preparada dissolvendo-se 25,8 mg
de benzeno (C6H6, PM 78,114) em hexano e diluindo-se a 250 mL, tem um pico de
absorção em 256 nm e uma absorvância de 0,266 numa célula de caminho óptico
de 1,000 cm. Encontre a absortividade molar do benzeno neste comprimento de
onda.
• Solução: A concentração de benzeno é:

• Encontramos a absortividade molar a partir da lei de Beer

59
 Exercício
Uma amostra de hexano contaminada com benzeno apresentou uma absorbância
de 0,070 em 256 nm numa célula de 5,000 cm de espessura. Encontre a
concentração de benzeno em mg/L.

Solução: Usamos absortividade molar da parte (a) na lei de Beer:

60
 Exercício
• Calcule a concentração do composto abaixo (𝜀 =16000 mol-1cm-1L-1)

A242nm =0.8

61
Laboratório - Software

62
Parâmetros

63
Parâmetros

64
Parâmetros

65
Parâmetros

66
 Parâmetros

Terminação *.UDS

67
 Exemplo
Determinação Espectrofotométrica de ácido acetilsalicílico em formulações
farmacêutica

O CH3

O OH
Hidrólise
O Ácida O

OH OH
Ácido acetilsalicilico
H

OH O
3+ 3+
+ Fe Fe
O O

OH OH
Ácido o-salicilico
Complexo violeta 68
Ácido 2-hidroxibenzoico