Ф.Ж.Ібатулліна, Г.В. Козловська, М.В.

Мельник,
В.Г. Скибіцький

ПРАКТИКУМ
З МІКРОБІОЛОГІЇ

За редакцією проф. Скибіцького В.Г.

Київ-2016
 Ф.Ж.Ібатулліна, Г.В. Козловська, М.В.Мельник,
В.Г.Скибіцький

ПРАКТИКУМ
З МІКРОБІОЛОГІЇ

За редакцією професора В.Г. Скибіцького

Рекомендовано Вченою радою Національного університету

біоресурсів і природокористування України як посібник для підготовки
фахівців в аграрних вищих навчальних закладах ІІІ – ІV рівнів
акредитації напряму «Технологія виробництва і переробки продукції
тваринництва»

Київ – 2016

2
 УДК 619:579.62 (075.8)

РЕЦЕНЗЕНТИ:

Івченко В.М., доктор ветеринарних наук, професор (Білоцерківський

національний аграрний університет).
Вовк Н.І., доктор сільськогосподарських наук, професор НУБіП України;
Уховський В.В. доктор ветеринарних наук, провідний науковий співробітник
ІВМ УААН

Ф.Ж. Ібатулліна, Г.В. Козловська, М.В. Мельник, В.Г. Скибіцький, В.В.

М Мікробіологія: Практикум / За ред. В.Г.Скибіцького.- К.: , 2016.- 306 с.

У практикумі представлені матеріали з загальної та спеціальної

мікробіології. У першому розділі описано принципи облаштування
мікробіологічних лабораторій, правилах роботи у них; охарактеризовано
лабораторне обладнання, предствлено методики дослідження
морфології і фізіології мікроорганізмів, методи їх ідентифікації.
У розділі 2 ”Спеціальна мікробіологія” представлені методики
мікробіологічного дослідження об’єктів довкілля і харчових продуктів, а
також лабораторна діагностика деяких інфекційних хвороб тварин. В
кінці кожної теми пропонуються запитання, які допоможуть студенту
проконтролювати самостійно ступінь засвоєння матеріалу.
Для студентів, що навчаються у Вузах ІІІ – ІV рівнів акредитації з
напряму «Технологія виробництва і переробки продукції тваринництва».

ББК

© Ф.Ж. Ібатулліна, Г.В. Козловська,

М.В. Мельник В.Г. Скибіцький

ISBN

3
 ПЕРЕДМОВА

Мікроорганізми надзвичайно поширені в природі. Переважна

більшість мікроорганізмів, зокрема і тих, що перебувають в організмі
людини і тварин, корисні, або ж індеферентні. Проте немало видів є
збудниками захворювань людини і тварин, рослин, можуть викликати
псування сировини і харчових продуктів, або ж різноманітних
матеріалів іншої природи.
Пізнання біологічних властивостей корисних і шкідливих
мікроорганізмів дозволить майбутньому фахівцю свідомо та
раціонально використовувати позитивні властивості перших та
попереджувати негативну дію останніх. Оволодіння програмним
матеріалом з мікробіології дозволить їм глибоко зрозуміти
різноманітні явища у природі та виробництві, які відбуваються за
участю мікроорганізмів, уявляти патогенез та імуногенез при
інфекційних хворобах людини і тварин, визначати та впроваджувати
ефективні засоби профілактики останніх. Пізнання мікроорганізмів, що
використовуються в процесі різноманітних технологій отримання
харчових продуктів, дозволить майбутнім фахівцям налагоджувати їх
виробництво, яке забезпечить належну якість та безпечність
тваринницької продукції.
Знання, одержані в процесі вивчення курсу мікробіології,
матимуть важливе значення при формуванні професійних навичок
майбутнього технолога з виробництва і переробки продукції
тваринництва, дозволять мати чітке уявлення про організацію і
функціонування численних лабораторій, котрі мають відношення до
технологій виробництва і переробки тваринницької продукції,
діагностики інфекційних хвороб.

4
 Реалізація запропоованих практичних завдань дозволить
студентам оволодіти бактеріологічною технікою, відпрацювати
найбільш поширені в мікробіології класичні (бактеріологічне
дослідження, постановка імунологічних (серологічних) реакцій) та
сучасний молекулярно-генетичний метод детекції мікроорганізмів
(ПЛР).
Наприкінці кожної теми подаються запитання, які допоможуть
студенту самостійно оцінити ступінь засвоєння необхідних елементів,
що її стосуються.

5
 РОЗДІЛ 1

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

МОРФОЛОГІЯ І ФІЗІОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Тема 1. ОБЛАШТУВАННЯ МІКРОБІОЛОГІЧНИХ

ЛАБОРАТОРІЙ, ТЕХНІКА МІКРОСКОПІЧНОГО
ДОСЛІДЖЕННЯ

Мета заняття. Ознайомитись з організацією мікробіологічних

лабораторій, облаштуванням бактеріологічних лабораторій, правилами
безпечної роботи, мікроскопічними методами дослідження,
морфології, рухливості та розміру мікроорганізмів.

Матеріали і обладнання: термостати, мікроанаеростати,

холодильники, сушильні шафи, автоклави, центрифуги, водяні бані, рН-
метри, фільтри, посуд, мікроскопи, імерсійна олія, мазки крові з
бактеріями (виготовлені і пофарбовані).

Методичні вказівки: Мікробіологічна лабораторія – це заклад у

якому здійснюються маніпуляції з мікроорганізмами. Нині існує ціла
низка мікробіологічних лабораторій, які вирішують завдання, що
стосуються відповідних напрямів діяльності людини. Немало
лабораторій розташовані безпосередньо на виробництві, зокрема на
крупних тваринницьких комплексах, підприємствах харчової
промисловості й ін. Є лабораторії державні та приватні. Найбільш
розгалуженою є низка державних лабораторій ветеринарної медицини.
Загалом в Україні їх близько 500. Вони підпорядковані Державній
ветеринарній та фітосанітарній службі України, яка функціонує при
Міністерстві АП України. Функція їх спрямована на забезпечення умов
отримання якісної і безпечної для здоров’я людини тваринницької
продукції, попередження і ліквідацію інфекційних хвороб тварин,
охорону населення від антропозоонозів.

6
 Ветеринарна державна лабораторія функціонує у тісній співпраці з
іншими державними і не державними структурами, функції яких близькі
або співпадають з її функціями, незалежно від їх відомчого
підпорядкування. Нині існують районні, міжрайонні, обласні
(регіональні), зональні, міські лабораторії ветеринарної медицини.
Функціонує також Науково-дослідний інститут з лабораторної
діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи – головний
методичний центр, відповідальний за впровадження нових та реалізацію
традиційних методів роботи у інших лабораторіях, що функціонують на
території держави. Крім названих, в Україні також функціонують
мікробіологічні лабораторії при науково-дослідних інститутах.
Ветеринарні (районна, міжрайонна, обласна та ін.) лабораторії –
це, перш за все, діагностичні заклади Державної ветеринарної служби,
основними завданнями яких є:
- організація й проведення лабораторної діагностичної роботи;
виявлення причин поширення захворювань; моніторинг за актуальними
інфекціями (інвазіями);
- забезпечення профілактики, ліквідація захворювань тварин,
здійснення ветеринарно-санітарного контролю продукції й сировини
тваринного походження, запобігання виникненню захворювань,
загальних для людини і тварин.
В процесі реалізації перелічених завдань ветеринарна лабораторія:
- здійснює патологоанатомічні, мікроскопічні, бактеріологічні,
вірусологічні, імунологічні (серологічні), біохімічні, токсикологічні,
гельмінтологічні та радіологічні дослідження відповідних матеріалів,
доставлених з ветеринарних закладів, господарств;
- повідомляє відповідно до встановленого порядку
сільськогосподарські підприємства, заклади та організації, громадян,

7
звідки надійшли матеріали для дослідження, про результати досліджень
і висновки щодо них, а також дає відповідні рекомендації .
При Вузах також можуть бути створені лабораторії з ідентичними
чи подібними функціями. Основною функцією останніх є, як правило,
проведення наукових досліджень у певному напряму, включаючи,
зокрема розробку та впровадження у практику ветеринарної медицини
засобів і методів діагностики і профілактики інфекційних хвороб тварин.
За погодженням з Державною ветеринарною та фітосанітарною
службою Мін. АП України таким лабораторіям може бути надано право
офіційної діагностики певних хвороб тварин. При Національному
аграрному університеті, що підпорядковується Міністерству освіти і
науки України, ефективно функціонує Українська лабораторія якості і
безпеки продукції АПК.
При Вузах функціонують також навчальні лабораторії з
ветеринарної мікробіології, ветеринарної вірусології та ін. Завданнями
останніх є організація та проведення навчання студентів, підвищення
кваліфікації фахівців з ветеринарної медицини, підготовка кандидатів і
докторів ветеринарних наук та ін. В залежності від напряму роботи
конкретної лабораторії, характер досліджень, що реалізуються, зокрема
ступеня небезпечності патогенів, з якими вона маніпулює, здійснюється
як її організація (облаштування) так і розробляються обов’язкові для
виконання Правила роботи у лабораторії. Регламентуючими
документами з цього приводу є внутрішньодержавні та міжнародні
правила щодо сертифікації таких закладів (Належна лабораторна
практика - GLP та ін.).
У зв’язку з інтеграцією України у міжнародні структури, що
регламентують, зокрема, виробництво та контроль тваринницької
продукції, ветеринарний і санітарно-гігієнічний контроль її якості і
безпеки, існують певні нормативи з приводу облаштування і організації

8
функціонування ветеринарних лабораторій. У загальному вони
мінімізують можливість виникнення та розповсюдження інфекційних
хвороб тварин, зокрема антропозоонозів, забезпечують оперативну
діагностику, спостереження (контроль) за потенційним резервуаром
небезпечних хвороб.

ПРАВИЛА РОБОТИ Й ТЕХНІКА БЕЗПЕКИ

В МІКРОБІОЛОГІЧНИХ ЛАБОРАТОРІЯХ

Ще під час проектування приміщень для мікробіологічної

лабораторії, враховуються існуючі вимоги до її облаштування. У
залежності від того з якими мікроорганізмами (патогенами) планується
маніпулювати у такому закладі вимоги до її розташування,
облаштування можуть бути різними. Останні повинні забезпечувати
можливість якісного проведення відповідних діагностичних робіт,
належну безпеку персоналу від зараження, нерозповсюдження патогенів
у довкіллі.
Існують розроблені вимоги до облаштування ветеринарних
лабораторій. Зокрема територія, де буде розміщена ветеринарна
лабораторія, повинна відповідати нормативам технологічного
проектування для об’єктів ветеринарної медицини, бути огородженою.
Проїзди, пішохідні переходи повинні бути зробленими з щільних
вологонепроникних матеріалів. Ветеринарні лабораторії розміщають
частіше в окремих приміщеннях. Розміщення на території лабораторії
інших непрофільних закладів та організацій забороняється. За дозволу
органів нагляду ветеринарної медицини допускається розміщення
лабораторії у одному корпусі з лікувально-профілактичним
підприємством ветеринарної медицини. Віварій для утримання

9
лабораторних тварин та ізолятор (для утримання піддослідних тварин)
облаштовується у окремому приміщенні, краще у окремій будівлі.
Проектуючи лабораторію необхідно врахувати, зокрема ізоляцію:
- приміщення для прийому патологічного матеріалу, секційної та
різних відділів (бактеріологічного, вірусологічного тощо);
- приміщення для приготування лабораторного посуду,
живильних середовищ;
- приміщенням для знезараження (утилізації) мікробних культур,
патологічних матеріалів, посуду, інструментів;
- приміщень для кормокухні, ізолятору і карантину від інших
приміщень віварію.
Бактеріологічна лабораторія (відділ) повинні бути облаштовані
кімнатами-боксами, обов’язково з передбоксником. Важливо мати також
настільні бокси з індивідуальною системою знезараження (УФЛ).
Підлоги та стіни повинні бути непроникними для вологи, придатними до
застосування миючих засобів, дезінфектантів. Всі приміщення
лабораторії забезпечуються централізованим опаленням, природним та
штучним освітленням, приточно-витяжною системою вентиляції згідно з
вимогами нормативів санітарії. Умивальники у виробничих
приміщеннях лабораторії повинні бути обладнані змішувачами холодної
і гарячої води. Безпосередньо біля раковини необхідно мати бутель з
дезрозчином, обладнаний тубусом для зручного користування.
Дозвіл для маніпуляцій з тими чи іншими (щодо ступеня
патогенності) об’єктами надається відповідною регіональною
санітарною службою. Для цього створені режимні комісії, які аналізують
умови облаштування лабораторії, її завдання, кваліфікацію
лабораторного персоналу та ін. Після ретельного вивчення згаданих
обставин режимна комісія видає дозвіл на маніпуляцію з тими чи
іншими мікроорганізмами (перелік останніх вказується). Відповідно до

10
небезпечності об’єктів, з якими здійснюються певні маніпуляції у
конкретній лабораторії, розробляються правила роботи у лабораторії.
Щодо правил роботи у мікробіологічних навчальних лабораторіях,
котрі функціонують при ВУЗах, основними є такі:
- заходити в лабораторію і працювати в ній дозволяється лише у
спецодязі ( халат та шапочка чи хустинка);
- забороняється вносити в лабораторію сторонні речі, палити,
їсти й пити в приміщенні лабораторії;
- за кожним працівником (студентом) повинні бути закріплені
робоче місце, мікроскоп та інше обладнання;
- на робочому місці розміщують лише обладнання та реактиви,
необхідні для виконання конкретної роботи (насамперед, це набір фарб,
бутель з водою, чашки для зливання рідини, ємкості з обробленими
предметними стеклами, бактеріологічна петля, штатив, посуд з
дезрозчином).
- робоче місце та обладнання утримувати у чистоті.
- любий, доставлений у лабораторію для дослідження матеріал,
слід розцінювати як небезпечний;
- банки з доставленим для дослідження матеріалом обробляють
дезрозчином, поміщають у кювети чи ставлять на підноси.
- при дослідженні матеріалу, а також під час роботи з
бактеріальними культурами дотримуються загальноприйнятих
технічних прийомів, які виключають можливість зараження та
контамінацію досліджуваного матеріалу;
- розтин лабораторних тварин здійснюють на спеціально
обладнаному столі. Інструменти після розтину знешкоджують фізичним
чи хімічним методом (нижче будуть охарактеризовані).
- якщо в процесі маніпуляцій патологічний матеріал випадково
потрапив на робочий стіл, його терміново видаляють тампоном,

11
змоченим у дезрозчині. При потраплянні зараженого матеріалу на шкіру,
кон'юнктиву очей, в ротову порожнину терміново здійснюють заходи
щодо знезараження.
- після закінчення роботи патологічний матеріал, використані
культури мікроорганізмів, інструменти і поверхню робочого столу
знезаражують, обладнання впорядковують; знімають спецодяг, руки
миють з милом, при необхідності обробляють їх дезрозчином;
- забороняється виносити з лабораторії пробірки з культурами,
препарати тощо;
- потрібно дотримуватись правил безпеки при роботі з газовими
приладами, не запалювати одну спиртівку безпосередньо від іншої,
електрообладнання вмикати Вимикати) лише з дозволу викладача.
Кожний студент (співробітник) на першому занятті зобов’язаний
ознайомитись з правилами роботи в лабораторії та розписатись у
спеціальному журналі.
Об’єктами дослідження мікробіологічних лабораторій є
бактерії (у широкому розумінні цього поняття) та гриби (якщо у
лабораторії не існує відповідного відділу).
Основними методами дослідження є мікроскопічний – виявлення
та описання морфології об’єкту за допомогою мікроскопічної техніки,
бактеріологічний (мікологічний) – ізоляція мікроорганізму на
живильному середовищі та його ідентифікація. Останнє здійснюють
частіше на основі вивчення цілого ряду згаданих вище властивостей,
інколи додатково користуються імунологічними (серологічними)
методами.
На основі мікроскопічного дослідження інколи можна ставити
попередній діагноз та пропонувати здійснювати необхідні заходи у
господарстві, з якого надійшов матеріал (наприклад при сибірці). Проте
частіше мікроскопія дозволяє лише виявити мікроорганізм,

12
зорієнтуватись певною мірою у напряму подальшого дослідження (посів
на відповідні живильні середовища, зараження лабораторних тварин
тощо) та застосовується як перший етап бактеріологічного методу.
Виділення, ідентифікація та визначення патогенних властивостей
збудника є класичним варіантом бактеріологічного дослідження і
застосовується протягом тривалого часу і, очевидно, залишиться
визначальним діагностичним методом. Проте її недоліком є досить
недостатня оперативність, затрата різних матеріалів, небезпека
зараження тощо.
Здійснюючи пошуки більш оперативної діагностики
(ідентифікації) захворювань були запропоновані методи виявлення
збудників (антигенів) безпосередньо у нативному матеріалі за
допомогою імунофлуоресцентного методу, гістохімічного варіанту
імуноферментного аналізу, а також розроблені молекулярно-генетичні
методи їх індикації шляхом «розпізнавання» видоспецифічних
нуклеотидних послідовностей у генетичному матеріалі патогенна. Серед
останніх слід згадати перш за все метод полімеразної ланцюгової
реакції (ПЛР), який поки-що малодоступний для багатьох лабораторій
та має поряд з іншими методами ще й певні недоліки (у більшості
випадків, на відміну від класичного бактеріологічного методу, не
характеризує ступінь патогенності – вірулентність збудника).
Детальніше про молекулярно-генетичні методи студент дізнається при
вивченні матеріалу інших розділів. Останнім часом певного значення
набувають різноманітні експрес-методи індикації патогенів, створені на
основі імунохроматографічного аналізу.

Мікроскопічні методи виявлення мікроорганізмів

Мікроскопія – найбільш древній і ефективний метод виявлення
мікроорганізмів, який і сьогодні дозволяє мікробіологу оперативно

13
виявляти багатьох збудників захворювань, контролювати мікробну
забрудненість продуктів та ін. Для проведення мікроскопічного
дослідження використовують мікроскопи. Серед світлових мікроскопів
найбільш поширені прилади типів МБД (мікроскоп біологічний
дослідницький), МБР (мікроскоп біологічний робочий) (рис. 1.1.).

Рис. 1. 1. Будова світлового мікроскопа МБР-1: 1 – окуляр, 2 – тубус,

3 – головка тубусотримача, 4 – тубусотримач (колонка штатива),
5 – револьвер з гніздами для об’єктивів, 6 – макрометричний гвинт грубої
наводки, 7 – мікрометричний гвинт тонкої наводки, 8 – підставка,
9 – об’єктив малого збільшення, 10 – об’єктиви великого збільшення,
11 – предметний столик, 12 – конденсор, 13 – діафрагма, 14 – гвинт для
регулювання конденсора, 15 – дзеркало, 16 – ручка для регулювання
чіткості і яскравості зображення.

Принципово конструкція світлових мікроскопів різних типів

подібна (рис.1.2. - 1.3).

14
 В мікроскопі розрізняють механічну та оптичну частини. До
механічної належать штатив, предметний столик, тубус, револьвер,
мікро- та макрогвинти. Штатив складається з масивної нижньої частини
— ніжки та верхньої — колонки.

Рис. 1.2. Мікроскоп серії Рис. 1.3. Мікроскоп бінокулярний

МТ4000 XSP-138ВР

Предметний столик може бути нерухомим («Біолам»-С1, -С2, - та

ін.) або рухомим (переміщується у двох взаємно перпендикулярних
напрямках горизонтальної площини «Біолам»-Р5, Рб). У деяких
мікроскопах («Біолам»-Рь Р2, та ін.) предметний столик може обертатись
навколо вертикальної осі.
Оптична частина світлових мікроскопів включає об'єктив, окуляр
та освітлювальне пристосування.
Об'єктив – це система скляних лінз, вмонтованих у металевий
циліндр. Передня лінза називається фронтальною. Вона збільшує
зображення досліджуваного об'єкта. Решту лінз називають

15
корегуючими. Вони виправляють зображення, одержане за допомогою
фронтальної лінзи.
Всі лінзи мають дефекти сферичної та хроматичної аберацій.
Сферична аберація пов'язана з властивістю лінз нерівномірно
переломлювати центральні та периферійні світлові промені. Останні, як
правило, відхиляються у значній мірі, тому перетинаються ближче до
лінзи. При зображенні точка поширюється між місцями перетину
периферійних та центральних променів й набуває вигляду розпливчастої
плями.
Явище хроматичної аберації виникає при проходженні через лінзу
пучка променів, що мають неоднакову довжину хвилі. По-різному
переломлюючись, промені перетинаються у різних місцях. Ті, що мають
меншу довжину хвилі, переломлюються сильніше. В результаті
відбувається розклад білого світла на спектри.
Щоб ліквідувати дефекти, пов'язані із сферичною та хроматичною
абераціями, застосовують коригувальні об'єктиви: ахромати, апохромати
та планхромати.
Ахромати – це об'єктиви, у яких неповністю виправлені сферична
й хроматична аберації. Вони мають шість лінз. Чітке зображення об'єкта
дослідження спостерігається у центрі поля зору. Краї поля зору досить
часто мають різні кольори спектра. Ахромати (найдешевші та
конструктивно прості) застосовуються дуже часто. Більш складні у
технічному відношенні апохромати. Вони мають 10 – 12 лінз, і в них
повністю відсутні аберації.
Об'єктиви підрозділяють на сухі та імерсійні (заглиблені, олійні).
Між фронтальною лінзою сухого об'єктива й об'єктом дослідження є
прошарок повітря, а між фронтальною лінзою імерсійного об'єктива й
об'єктом дослідження – шар імерсійної олії. Порівняно з сухими
імерсійні об'єктиви характеризуються кращою роздільною та

16
збільшуючою здатністю. Підвищення збільшуючої здатності
поєднується із наростанням кривизни фронтальної лінзи і зменшенням
«корисної площі», що призводить до послаблення освітлення поля зору.
В результаті зображення об'єкта дослідження стає нечітким.
Поліпшити освітленість поля зору у такій ситуації можна,
запобігши втратам світлових променів в межах між об'єктом
дослідження і фронтальною лінзою об'єктива. Для цього потрібно
створити оптично гомогенне середовище. Цього можна досягти за
допомогою імерсійної олії, зокрема кедрової. Остання має коефіцієнт
відхилення світлових променів майже такий, як і скло (п=1,51 у кедрової
олії і я =1,52 у скла).
Світловий пучок,
проходячи крізь шар
олії, не розсіюється й
забезпечує достатню
освітленість поля зору.
При відсутності
імерсійної олії багато
променів на межі скло –
повітря відхиляються, і
освітленість поля зору
мікроскопа різко
Рис. 1.4. Хід променів у сухій та імерсійній
системах світлового мікроскопа знижується (рис. 1.4).
Якщо кедрової олії немає, можна використати її замінники: персикову
(п=1,49) чи рицинову (п=1,47) олію.
Імерсійні об'єктиви легко розпізнати. Вони мають спеціальні
символи — 01 (об'єктив імерсійний), 01 (олійна імерсія; у російській
транскрипції — МИ маслянная иммерсия).

17
 Окуляр складається з двох лінз, вмонтованих у металевий циліндр.
Лінза, що повернута в бік дослідника, називається очною, а та, що у бік
об'єктива — збираючою. Збільшуюча характеристика окулярів
порівняно з об'єктивами значно менша: 8х> 10х> 20х.
Освітлювальний апарат має дзеркало та конденсор з діафрагмою.
З одного боку дзеркало плоске, з іншого – увігнуте. Плоским дзеркалом
користуються при денному освітленні, увігнутим – при штучному.
Конденсор має
дві скляні лінзи та
ірисову діафрагму. Він
концентрує промені
світла на об'єкті
дослідження.
Опускаючи конденсор
можна зменшити, а
піднімаючи —
збільшити освітленість
Рис. 1.5. Конденсор та ірисова діафрагма поля зору мікроскопа.
Ірисова діафрагма складається з напівкруглих металевих пластин,
змінюючи положення яких можна регулювати діаметр отвору для
світлових променів (рис. 1.5).
На рис. 1.6. наведено схему зображення об'єкта у світловому
мікроскопі. Об'єктив О утворює у площині V перевернене зображення
(А1) об'єкта А. Точка 2 знаходиться у фокусі окуляра Е, так що дослідник
спостерігає збільшене уявне зображення А2 у площині X, яке
знаходиться на відстані 25 см від ока.
Основні функціональні характеристики мікроскопа –
збільшуюча та роздільна його здатність. Збільшуюча здатність
відповідає збільшенню об'єктива, помноженому на збільшення окуляра.

18
Наприклад, використовують об'єктив 90х й окуляр 7х. У цьому випадку
загальне збільшення становитиме 630 (90х7).

О Е

А Z

А1

Х
А2

Рис. 1.6. Схема утворення зображення за допомогою мікроскопа:

А — об'єкт; О — об'єктив; Е — окуляр; А1— зображення об'єкта
дослідження, створене об'єктивом; А2 - зображення об'єкта дослідження
в окулярі; X — площина розміщення А2; Z — площина розміщення А1

Зображення об'єкта може бути чітким або розпливчатим,

незважаючи на достатнє фокусування тощо. Це залежить від роздільної
здатності мікроскопа — найменшої відстані між двома поруч
розташованими точками, коли останні ще не зливаються (дослідник
бачить кожну з них окремо). Роздільна здатність ока людини становить
близько 0,2 мм. Максимальна роздільність світлового мікроскопа - 150-
200 нм (0,15-0,2 мкм).
Роздільну здатність мікроскопа визначають за формулою:
λ
d = -------------
Ах + А2 '
d— мінімальна відстань між двома точками;
А1 — цифрова апертура об'єктива;
А2 — цифрова апертура конденсора ,

19
 λ — довжина світлової хвилі (при денному освітленні беруть
середній показник 0,55).
Таким чином, роздільна здатність мікроскопа прямо пропорційна
сумі цифрових апертур об'єктива й конденсоpa і обернено пропорційна
довжині хвилі світла, що використовується при мікроскопії. Отже,
роздільну здатність приладу можна підвищити збільшенням цифрової
апертури або зменшенням довжини світлової хвилі. Оскільки у
звичайних мікроскопах використовують денне світло (γ = 0,55 мкм),
роздільна здатність їх може бути підвищена лише шляхом збільшення
цифрової апертури.
Цифрову апертуру (А) визначають множенням синуса половини
(а) кута а на показник заломлення (п) середовища, що межує з лінзою:
А = sin u . п.
З формули випливає, що цифрова апертура збільшується при
зростанні показника заломлення променів (n). Відомо, що для повітря п
дорівнює 1. При використанні імерсійної олії (n =1,51) цифрова апертура
збільшується, що зумовлює підвищення роздільної здатності мікроскопа.
Цифрова апертура кожного об'єктива вказується на його оправі.
Сухі системи мікроскопів серії «Біолам» 8х та 40х мають апертури
відповідно 0,2 і 0,65, імерсійний об'єктив – 1,25.
Наведемо приклади розрахунку роздільної здатності мікроскопа
«Біолам».
1. При використанні об'єктива 90х (A1 = 1,25)

0,55
d == ----------------- = 0,25 мкм.
1,25 + 1

2. При використанні об'єктива 40х (A1=0,65)

0,55
d= --------------------------- = 0,34
0,65 + 1

20
 3. При використанні об'єктива 8х (A1=0,20)

0,55
d= ----------------------------- = 0,46 мкм.
0,2 + 1

Техніка мікроскопування. Якщо мікроскоп не обладнаний

власним джерелом світла, його установлюють напроти джерела світла
(вікно, освітлювальний пристрій тощо). Конденсор піднімають у верхнє
положення. Діафрагму відкривають.
Об'єктив малого збільшення встановлюють на відстані 1,5 – 2 см
від предметного столика й, маніпулюючи дзеркалом, добиваються
яскравого рівномірного освітлення поля зору.
Об'єкт дослідження (препарат) фіксують клемами. При малому
збільшенні уточнюють розміщення необхідної ділянки препарату і
наносять краплю імерсійної олії. Поворотом револьвера встановлюють
імерсійний об'єктив і за допомогою макрогвинта занурюють його у
краплю олії до слабкого дотику фронтальної лінзи до предметного скла.
При цьому дослідник повинен дивитись не в окуляр, а збоку. Після
занурення об'єктив повільно піднімають, повертаючи макрогвинт «на
себе» (дослідник дивиться в окуляр). При появі зображення, за
допомогою мікрогвинта, конденсора, діафрагми встановлюють
оптимальну його контрастність. Препарат можна рухати по
горизонтальній площині. Крапля імерсійної олії при цьому «повзе» і
забезпечує оптично гомогенне середовище у необхідному місці.
Після закінчення мікроскопування піднімають тубус мікроскопа,
марлевою чи фланелевою серветкою видаляють імерсійну олію з лінзи
об'єктива. Іноді користуються серветкою, змоченою у бензині чи
ксилолі. В останньому випадку лінзу відразу протирають сухою
серветкою.

21
 Мікроскоп зберігають у спеціальному футлярі або під скляним
ковпаком, щоб захистити його від пилу. При цьому револьвер повинен
бути переведений на малий об'єктив. Останній спускають на серветку,
яку кладуть на предметний столик.
Окуляр, конденсор, дзеркала, предметний столик й інші деталі
мікроскопа періодично протирають сухою чистою серветкою.
У більшості сучасних мікроскопів використовують штучне
освітлення. При цьому освітлювач може бути елементом самого
приладу, або ж елементом освітлювального пристрою. В останньому
випадку освітлювальний пристрій встановлюють перед мікроскопом,
вмикають в електромережу і за допомогою реостата, діафрагми та
напрямку світлових променів освітлювача, а також дзеркала діафрагми
та конденсора мікроскопа знаходять оптимальний рівень освітленості
поля зору.
Мікроскопія у темному полі зору. Темнопольна мікроскопія дає
змогу досліджувати об'єкти, не видимі у світлому полі мікроскопа,
оскільки роздільна здатність при ній значно зростає (до 0,06 – 0,02 мкм).
При темнопольній мікроскопії об'єкт дослідження освітлюється
косими променями. Такого освітлення досягають за допомогою
спеціального конденсора – конденсора темного поля 0І-13 чи ін.
(рис.1.7.).
Темнопольний конденсор має затемнену середню частину, що
запобігає проходженню центральних променів. В результаті поле зору
мікроскопа залишається темним. Наявні в препараті бактерії чи інші
об'єкти освітлюються косими променями. Переломлені мікроскопічними
структурами промені потрапляють в об'єктив (рис.1.8). В результаті на
фоні темного поля дослідник спостерігає об'єкти, що яскраво світяться.

22
Рис. 1.7. Конденсор темного Рис.1.8. Хід променів при мікроскопії в темному
поля полі: об – об’єктив; п – препарат; мі – масляна
імерсія; лк – лінза конденсора; дт – діафрагма
темного поля; пс – предметне скло.

Техніка мікроскопування. Темнопольна мікроскопія досить зручна

при визначенні рухливості бактерій. З цією метою використовують
молоду бульйонну культуру мікроорганізму, з якої роблять препарат
«роздавлена крапля». Предметне скло повинно бути чистим,
знежиреним, тонким (товщиною не більше 1 – 2 мм).
Препарат кладуть на предметний столик мікроскопа й фокусують з
об'єктивом 8х. Потім послідовно виконують такі операції:
- звичайний конденсор змінюють на конденсор темного поля;
- відкривають (повністю) діафрагму і добиваються максимального
освітлення вмиканням реостата;
- на верхню лінзу трохи опущеного конденсора наносять краплю
імерсійної олії (допускається також нанесення дистильованої води);
- встановлюють препарат, зроблений за методом «роздавлена
крапля»;

23
 - обережно піднімають конденсор до тих пір, поки імерсійна
рідина пошириться по нижній поверхні предметного скла;
- встановлюють мале збільшення й фокусують мікроскоп на
препараті.
У полі зору повинна спостерігатись світла пляма (інколи з темним
центром).
Регулювальними гвинтами конденсора центрують світлу пляму на
середину поля зору, а інтенсивність її зображення регулюють підняттям
чи опусканням конденсора. Після цього встановлюють об'єктив
необхідного збільшення (найчастіше 40х) і фокусують.
Фазово-контрастна мікроскопія. За допомогою звичайного
світлового мікроскопа можна досліджувати лише висококонтрастні
об'єкти, тобто ті, які порівняно з фоном інтенсивніше поглинають
світлові хвилі, що йдуть від конденсора. Щоб підсилити цей ефект,
об'єкти дослідження, як правило, фарбують. Такі об'єкти називають
амплітудними. Іноді виникає необхідність досліджувати малоконтрастні
об'єкти, тобто ті, що майже не змінюють, порівняно з фоном, потік
світлових променів (у звичайному мікроскопі дослідник їх не бачить або
лише відмічає ледь помітне зображення). Неконтрастними є
непофарбовані біологічні об'єкти (бактерії, клітини тощо). Вони не
змінюють амплітуду світлових променів, що проходять крізь них, а
здатні змінити лише фазу останніх (світлові промені, що проходять крізь
щільніші ділянки препарату, дещо відстають за фазою від променів, які
проходять поряд). Однак відомо, що людське око не в змозі помітити
різницю між променями, які різняться лише за фазою.
З метою «перетворення» фазових об'єктів в амплітудні
голландський вчений Церніке (1934) запропонував спеціальну фазово-
контрастну мікроскопію.

24
 Існують спеціальні – фазово-контрасні мікроскопи та спецальні
фазово-контрастні пристрої, зокрема К.Ф-4, яким можна обладнати
звичайний світловий мікроскоп й застосовувати фазово-контрастну
мікроскопію (рис.1.9). Він включає фазово-контрастний об'єктив,
револьверний конденсор з діафрагмою, допоміжний мікроскоп. До
оптичної системи фазово-контрастного пристрою входять фазова
пластинка та кільцева діафрагма конденсора.

Рис. 1.9. Фазово-контрастний мікроскоп XS-3320 MICROmed і

фазово-контрастний пристрій КФ-4

Фазова пластинка – це кружечок на одній із лінз об'єктива,

напилений солями рідких металів. Пластинка напівпрозора, змінює фазу
світлової хвилі на 1/4. Це й призводить до перетворення фазової різниці
в амплітудну. Кільцева діафрагма — непрозора пластинка, яка має лише
кільце, проникне для світлових променів.

25
 З метою одержання фазово-контрастного ефекту необхідно, щоб
кільце фазової пластинки точно збігалось з кільцевою діафрагмою
конденсора (рис. 1.10).

Рис. 1.10. Схема проходження світлових променів у фазово-

контратному мікроскопі

Техніка користування фазово-контрастним пристроєм така.

1. Звичайний конденсор у світловому мікроскопі замінюють на
фазово-контрастний. Диск револьвера мікроскопа повертають так, щоб у
віконці з'явилась цифра «0».
2. Замінюють об'єктив 40х на об'єктив 40хФ (фазовий).
3. На предметний столик кладуть препарат (наприклад,
«роздавлена крапля» при дослідженні живих бактерій). Установлюють
світло за Келером, користуючись об'єктивом 8х.

26
 4. Встановлюють об'єктив 40хФ.
5. Замінюють окуляр на допоміжний мікроскоп. Переміщуючи
тубус мікроскопа, домагаються чіткого фокусування фазової пластинки
об'єктива (має вигляд темного кільця).
6. Повернувши диск револьвера, вмикають кільцеву діафрагму, яка
відповідає об'єктиву 40хФ. При цьому з'являється не лише фазове
кільце, а й кільце-щілина діафрагми.
7. За допомогою гвинтів для центрування зміщують кільцеву
діафрагму таким чином, щоб вона збіглась з фазовим кільцем.
8. Допоміжний мікроскоп замінюють на окуляр й фокусують
препарат.
Якщо мікроскопію здійснюють з використанням інших об'єктів,
встановлюють відповідні кільцеві діафрагми і щоразу проводять
центрування, користуючись допоміжним мікроскопом.

Люмінесцентна мікроскопія. Люмінесценцією (від лат. lumen —

світло) називають світіння об'єкта (речовина, жива істота), обумовлене
наявністю надмірної енергії.
Люмінесценція може бути обумовлена багатьма джерелами
енергії, зокрема короткими світловими хвилями ультрафіолетового
(невидимий) або синього (видимий) спектра.
Розрізняють первинну і вторинну люмінесценцію. Первинна
безпосередньо пов'язана з об'єктом спостереження, тобто речовинами,
що входять до його складу. Вторинна зумовлена речовинами —
люмінофорами, якими фарбують (флуорохромують) об'єкт дослідження.
Як люмінофори широко використовують акридин оранжевий, акридин
жовтий, примулин, флуоресцеїн, родамін та ін.
Залежно від тривалості люмінесцентного ефекту розрізняють
флуоресценцію та фосфоресценцію. Флуоресценцією називають

27
люмінесценцію, тривалість якої після усунення фактора, що її викликав,
не перевищує 10-9 – 10-7 с. Більш тривалу люмінесценцію називають
фосфоресценцією.
У практиці мікробіологічних досліджень явище люмінесценції
використовується досить широко. За допомогою спеціальних приладів
— люмінесцентних мікроскопів або люмінесцентних приставок до
звичайних мікроскопів – можна спостерігати і вивчати бактерії, що
світяться (люмінесценція). Оскільки останні мають незначну первинну
люмінесценцію, їх спочатку обробляють (фарбують) люмінофорами.
Методика флуорохромування банктерій.
1. Готують мазок з бульйонної чи агарової культури бактерій, який
висушують на повітрі й фіксують (ацетон, етиловий спирт-ефір)
протягом 10 – 15 кв.
2. Наносять розчин флуорохрому (наприклад, акридин оранжевий
1 : 10 000) на 1 – 5 хв.
3. Розчин флуорохрому зливають, мазок промивають
дистильованою водою, висушують фільтрувальним папером,
досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопа.
Люмінесцентний мікроскоп вперше було сконструйовано у 1908 р.
А. Келером і Т. Зідентопфом. Нині існує багато різних його модифікацій.
Вітчизняна промисловість, зокрема, випускає люмінесцентні мікроскопи
типу МЛ (1, 2, 3), «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3, Д1, Д2, Д3) та ін.
Практикується також випуск спеціальних пристроїв 01-17, 01-28, 01-30,
які у поєднанні із звичайними світловими мікроскопами дають
можливість вивчати люмінесціюючі об'єкти.
Прилади люмінесцентної мікроскопії включають:
- люмінесціюючий пристрій, основними елементами якого є
джерело збуджуючої енергії (наприклад, лампа надвисокого тиску –
джерело короткохвильових синіх та ультрафіолетових променів);

28
 - освітлювальний пристрій (система, яка дозволяє позбавитись
теплових променів та здійснити селекцію короткохвильових променів,
збуджуючих явище люмінесценції);
- світловий мікроскоп, оснащений замикаючим фільтром, який дає
змогу збільшити об'єкт дослідження, «відсікти» шкідливі для зору

Рис. 1.11. Схема будови люмінесцентного

мікроскопу МЛ-2:
1 – гвинти для центрування польової
діафрагми; 2 – препаратоводій; 3 – ручка
вмикання ахроматичної лінзи; 4 –
револьверний диск із „запираючими”
світлофільтрами; 5 – ручка для пере-
микання освітлення; 6 – гвинти для
центрування польової діафрагми; 7 – ручка
польової діафрагми; 8 – ручка для
переміщення колектора; 9 – гвинти для
центрування лампи; 10 – оправа колектора;
11 – захисна втулка; 12 – корпус ртутної
лампи;13 – ручка ірисової польової
діафрагми; 14 – к’ювета з дистильованою
водою; 15 – світлофільтри в оправі; 16 –
рукоятка для перемикання освітлення.

дослідника ультрафіолетові та короткохвильові сині промені й

забезпечити спостереження люмінесціюючого об'єкта (рис. 1.11).
На рис. 1.12 зображено оптичну схему люмінесцентного
мікроскопа типу МЛ.
Як функціонує люмінесцентний мікроскоп? Джерело енергії
(лампа надвисокого тиску) випромінює потік світлових хвиль, який за
допомогою кварцевого колектора концентрується у щільний пучок й
спрямовується в напрямку досліджуваного об'єкта. На шляху до нього з
пучка світлових хвиль вилучаються теплові (кювета з рідиною,
теплозахисні світлофільтри) і селекціонуються короткохвильові промені
(збуджуючий фільтр). Останні падають на об'єкт дослідження і

29
зумовлюють його люмінесценцію. Об’єкт, що світиться, випромінює
промені з більшою довжиною хвиль, ніж довжина хвиль збуджуючих
променів (правило Стокса). За допомогою розділювальної пластини та
замикаючого фільтра «відсікаються» шкідливі для людського ока
короткохвильові промені, і, дослідник має змогу спостерігати власну
люмінесценцію об'єкта.

Рис. 1.12. Оптична схема люмінесцентного мікроскопа:

1 - ртутно кварцева лампа; 2 - колектор; З- кювета; 4 - світлофільтри;
5 - апертурна діафрагма; 6 - збираюча лінза; 7 - польова діафрагма;
в -збираюча лінза, 9 -світлороздільна пластина; 10 – об'єктив;
11 – об'єкт; 12 – замикаючий світлофільтр, 13 – дзеркало, 14 – окуляр;
15 - фотоокуляр; 16 – фотоплівка, П – теплові промені лампи;
18 – УФ-промені; 19 – синьо-фіолетові промені, 20 – промені люмінесценції

Правила роботи з люмінесцентним мікроскопом.

1. Люмінесцентний мікроскоп встановити у затемненій кімнаті
або у кутку кімнати, де немає яскравого денного світла. Прилад повинен
бути обов'язково заземленим.
2. Після вмикання мікроскопа необхідно почекати 10 – 15 хв, щоб
джерело енергії набуло оптимального режиму функціонування.

30
 3. Розмістити на предметному столику препарат, затиснути його
клемами.
4. Нанести спеціальну нефлуоресціюючу олію, опустити в неї
об'єктив.
Решта маніпуляцій ті ж самі, що й при звичайній світловій
мікроскопії. Після закінчення дослідження об'єкта мікроскоп вимикають
з електричної мережі й після охолодження накривають футляром.
Електронна мікроскопія. У 1928 – 1931 pp. M. Кноллем і Є.
Рускою було сконструйовано мікроскоп, що за принципом дії
відрізнявся від запропонованих раніше. Замість пучка світла у ньому
використовувався потік електронів, скляні лінзи було замінено на
електромагнітні. Завдяки тому, що довжина хвилі електронного променя
майже у мільйон разів менша за довжину хвилі світлового променя,
роздільна здатність електронних мікроскопів значно вища й становить
близько 0,3 – 0,5 нм (3 – 5 ), що дозволяє спостерігати об'єкти,
невидимі у світловому мікроскопі.
Промисловість випускає ряд модифікацій електронних
мікроскопів.
1. Просвічуючий електронний мікроскоп - прилад, в якому
електронний пучок просвічує предмет наскрізь.
2. Скануючий електронний мікроскоп - метод дослідження
поверхневої структури мікрооб’єкта шляхом аналізу відбитого
«електронного зображення».
3. Скануючий просвічуючий електронний мікроскоп дозволяє вивчати
окремі ділянки об'єкта.
4. Рефлекторний електронний мікроскоп використовує пружно-
розсіяні електрони.
Серед них найпоширенішими є просвічуючі та растрові. Сучасні
лабораторії укомплектовано вітчизняними електронними мікроскопами:

31
ЕМВ-100, Л, ЕМВ-100 ЛМ; ЕМВ-100 АК, ЕМВ-100 Б, ПЕМ-100* або
приладами зарубіжних фірм ІЕМ-100 В (Японія), BS-500 (Чехо-
Словаччина) тощо.
Електронний мікроскоп має такі основні системи: оптичну,
вакуумну, енергопостачання. Крім того, мається ряд додаткових
пристосувань: системи охолодження лінз та нагріву пароолійних
насосів, прилад для фотографування зображення та ін. Кожна із систем
досить складної конструкції. Так, оптична система включає джерело
електронів, електронно-оптичні лінзи, пристосування для корекції
електронного мікроскопа просвічуючого типу (ЭМВ-100 Л). Джерелом
електронів є катод (тоненька вольфрамова нитка, розігріта електричним
струмом до 2500 °С (рис. 1. 13). Потік електронів рухається у напрямку
анода. При цьому частина їх потрапляє в отвір анода й формує пучок.
Цей вузол приладу прийнято називати електронною гарматою.
Електрони рухаються лише в умовах вакууму. Для цього за допомогою
спеціальних насосів (спочатку формвакуумних, а потім пароолійного) з
колонки мікроскопа відкачують повітря. Рівень вакууму при цьому
повинен досягати 10-4 Па.
Потік електронів спочатку проходить через конденсорну лінзу, яка
концентрує їх на об'єкті дослідження. Проходячи через останній, одна
частина електронів поглинається або відхиляється, а інша, що
залишилась, рухаючись в бік екрана, несе певну інформацію про
досліджуваний об'єкт. При цьому пучок електронів послідовно
проходить через об'єктивну, проміжну та проекційну лінзи, що сприяє
збільшенню зображення.
Збільшувальна здатність мікроскопа залежить від швидкості руху
електронів. З прискоренням останнього вона зростає. Швидкість
електронів залежить від напруги, що подається на катод. У більшості

32
сучасних мікроскопів використовується прискорювальна напруга 50, 75
та 100 кВ. Збільшення досліджуваного об'єкта досягає 100 000 разів.

К
}Електронна
гармата

КЛ

СЛ

ПЗ

ПЛ

ЕЛ

ФП
Рис. 1.13. Хід променів в електронному мікроскопі: А — анод; К —
катод; КЛ — конденсорна лінза; О — об'єкт; OJI — об'єктивна лінза;
ПЗ — первинне зображення; ПЛ — проекційна лінза; ЕЛ — екран
люмінесцентний; ФП — фотопластина

Зображення можна розглядати на флуоресціюючому екрані, а

також можна сфотографувати, піднявши екран і забезпечивши доступ
електронного пучка на фотографічну пластину.
Об'єкти, які досліджують за допомогою електронного мікроскопа
(бактерії, віруси тощо), наносять на спеціальні металеві сітки, отвори
яких закрито тоненькою плівкою з колодію чи формвару. Для

33
збільшення контрастності зображення об'єкти обробляють спеціальними
розчинами (уранілацетат, фосфорно-вольфрамова кислота).
При дослідженні біологічних об'єктів надзвичайно зручними є
препарати у вигляді ультратонких зрізів. Бактерії, віруси або уражені
ними тканини тваринного організму просочують спеціальними
речовинами, які, полімеризуючись, починають твердіти, що дає змогу за
допомогою спеціального приладу ультрамікротому одержати понадтонкі
зрізи 10 – 20 нм (100 – 200 А). Останні досліджують за допомогою
електронного мікроскопа.
Методичні вказівки Викладач знайомить студентів з
облаштуванням мікробіологічних лабораторій, правилами роботи та
особистої гігієни і безпеки. Розповідає про принцип роботи світлового
мікроскопу, навчає студентів здійснювати мікроскопічне
досдлідженння, користуючись сухими та імерсійними об’єктивами.
Студенти розписуються у журналі щодо ознайомлення з
правилами роботи та безпеки у мікробіологічній лабораторії,
отримують завдання для самостійної роботи (ознайомитись з
особливостями принципових конструкцій темно-польного, фазово-
контрасного, люмінесцентного та електронного мікроскопу ,з
основними формами бактерій).

Самостійна робота студентів Студенти здійснюють

мікроскопічне дослідження препарату (використовуючи імерсійну
систему) та зарисувують мікроскопічну картину (наприклад мазок
крові курки, що містить відносно крупні бактерії (готуються та
фарбуються лаборантом).

Питання для самоконтролю

1.Правила безпеки у мікробіологіцчній лабораторії.

2. Основні типи світлових мікроскопів.
3. Роздільна здатність мікроскопа.
4. Техніка мікроскопування
5. Принципова схема конструкції люмінесцентного мікроскопа.
6. Оптична схема електронного мікроскопа.

Тема 2. МОРФОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

34
 Мета: Ознайомити студентів з основними формами бактерій,
особливостями будови різних груп мікроорганізмів, методами
дослідження їх морфології, виявлення ендоспор, капсул, а також з
методикою визначення їх розміру.

Матеріалиі і обладнання. Таблиці (слайди), світлові мікроскопи,

препарати-мазки (попередньо виготовлені та пофарбовані).

Бактерії в широкому розумінні слова — це живі, переважно

одноклітинні істоти, що мають просту форму (палички або кулі),
розмножуються поперечним поділом і не містять хлорофілу.
За формою бактерії поділяють на три групи: кулясті (коки),
паличкоподібні та звивисті (рис. 1.14).
Серед коків (Coccus, від грец. kokkus – зерно) розрізняють:
- монококи (Micrococcus, від грец. micros – малий) – поодиноко
розміщені кулясті клітини;
- диплококи (від грец. diplo – подвійний ) – клітини, розміщені
парами, які виникають в результаті поділу клітини в одній площині;
- стрептококи (від лат. strepto – ланцюг) – різної довжини
ланцюжки, які виникають внаслідок поділу клітини в одній площині з
наступним збереженням зв'язків між клітинами, що розділились;
- тетракоки (від грец. tetra – чотири) – клітини, розміщені по
чотири, як наслідок поділу материнської клітини в двох взаємно
перпендикулярних площинах;
- сарцини (від лат. sarcio – зв'язую) – пакети (тюки) по 8-16 і
більше клітин;
- стафілококи (від грец. staphylos – виноградне гроно) – різні за
величиною скупчення коків у вигляді виноградного грона, яке
утворюється в результаті поділу клітин в різних площинах.

35
 Діаметр кока становить в середньому 1 мкм. Коки можуть бути

Рис. 1.14. Основні форми бактерій:

1 – стафілококи; 2 — диплококи (гонококи); 3 —диплококи (пневмококи);
4 — стрептококи; 5 — тетракоки; б — сарцини; 7 —неспороутворюючі;
8 — бацили; 9 —клостридії, 10 —вібріони; 11 —спірили; 12 — спірохети

також овальної, ланцетоподібної чи бобовидної форми.

Паличкоподібної форми мікроорганізми найбільш численні.

Розрізняють власне бактерії (від грец. bacteria — паличка) та бацили.
Останні на відміну від попередніх утворюють спори (наприклад Вас.
anthracis). Якщо діаметр спори перебільшує ширину мікробної клітини,
надаючи їй форму веретена, гантелі, груші тощо, то такі бацили
називають клостридіями ( наприклад, Сl. botulinum).
Паличкоподібні форми можуть розміщуватись поодинці, парами
(Diplobacterium або Diplobacillus), ланцюжками (Streptobacterium або
Streptobacillus), різними за величиною скупченнями, іноді під кутом у
вигляді літери Y чи римської цифри V. Кінці у паличкоподібних форм
можуть бути прямокутними, загостреними, потовщеними чи
заокругленими. За певних умов деякі види паличкоподібних бактерій
(збудники бешихи, туберкульозу) набувають розгалуженої форми або
розміщуються у вигляді переплетених ниток.

36
 Звивисті форми бактерій поділяють на три групи:
- вібріони (від лат. Vibrio – згинаюсь) – зігнуті палички, які частіше
нагадують кому;
- спірили (від лат. spira – завиток) - бактерії, які мають декілька
великих завитків.
- спірохети (від лат. - spiro - штопор) мають більше 10 завитків.
Серед згаданих трьох морфологічних груп мікроорганізмів більшість
належать до сапрофітів, проте значна їх кількість є збудниками
інфекційних хвороб тварин і людини.
Проміжне місце в морфології та класифікації бактерій займають
мікоплазми, рикетсії і хламідії.

МОРФОЛОГІЯ МІКОПЛАЗМ
Мікоплазми – бактерії, які не мають клітинної стінки й належать
до класу Mollicutes. Це дрібні мікроорганізми, величина яких
коливається в межах 0,3-0,9 мкм. Відрізняються надзвичайним
поліморфізмом, який пояснюється відсутністю в складі оболонки такої
жорсткої структури, як клітинна стінка і її основного компоненту —
пептидоглікану. Крім кулястих, мікоплазми бувають серпоподібними,
нитчастими, розгалуженими, химерними.
Мікоплазми досить поширені у природі. Крім сапрофітів,
зустрічаються також патогенні, які уражають практично всі види
сільськогосподарських тварин, викликаючи пневмонію, кон'юнктивіт,
артрит, мастит, ендометрит, аборт.

МОРФОЛОГІЯ РИКЕТСІЙ ТА ХЛАМІДІИ

Рикетсії – облігатні внутрішньоклітинні паразити кокоподібної,
паличкоподібної або ниткоподібної форми величиною 0,2-0,3 х 0,3-1,0
мкм. Вони не утворюють спор і капсул, в переважній більшості

37
нерухливі, аероби, розмножуються поперечним поділом або
дробленням.
В циклі розвитку рикетсій особливе місце займають членистоногі
(воші, клопи, блохи).
Хламідії – близькі до рикетсій внутрішньоклітинні облігатні
паразити, зріла форма яких має вигляд сферичних чи овальних
елементарних тілець величиною 0,25-0,3 мкм. В процесі розвитку
з'являються проміжні ініціальні або ретикулярні тільця овальної форми
величиною 0,5-1,0 мкм і гігантські структури діаметром до 3 мкм.
Проміжні форми дробляться внутрішньою фрагментацією або
брунькуються. Типовим для хламідій є поперечний поділ.

Методичні вказівки до проведення заняття. Викладач виясняє

ступінь підготовленості до заняття студентів ( розуміння, що таке
бактерії у широкому та вузькому плані, основні форми бактерій та ін ),
демонструє основні форми бактерій на таблиці (слайді), показує
методику визначення розміру бактерій та пропонує здійснити
дослідження препаратів-мазків ,розпізнати і зарисувати основні форми
бактерій, дає завдання відносно позаурочної роботи студентів6
ознайомитись з особливостями морфології мікоплазм, рикетсій,
хламідій).
Самостійна робота студентів. Студенти мікроскопують
мазки,визначають розмір бактерій , здійснюють зарисовки у альбомі.

Питання для самоконтролю

1. Дати визначення поняття «бактерії».

2. Назвати основні морфологічні групи бактерій.
3. Які існують різновиди коків?
4. Чим відрізняються бактерії від бацил?
5. Назвати основних представників звивистих бактерій.

38
 6. Охарактеризувати морфологічні особливості мікоплазм,
рикетсій і хламідій.
7. Завдяки чому бактерії активно рухаються?
8. Як поділяють бактерії залежно від кількості джгутиків?
9. Які методи застосовують для спостереження за бактеріями у
живому стані?
10. Як визначають розмір мікроорганізмів?

Тема 3. ПРИГОТУВАННЯ ПРЕПАРАТІВ ДЛЯ

МІКРОСКОПІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Мета роботи: Навчити студентів виготовляти препарати-

мазки, препарати-відбитки, фарбувати їх.
Реактиви та обладнання. Матеріал для виготовлення мазків
(суспензія бактерій, шматочки м’яса), знежирені предметні скельця,
бактеріологічні петлі, пінцети, спиртівка, набір бактеріологічних фарб,
фломастери чи ін.), зливні чашки, спиртівки (газові горілки), засоби для
хімічної фіксації мазків, мікроскопи, таблиці (слайди) з методиками
виготовлення препаратів, фіксації, пофарбування та ін).

Лабораторне заняття №1.

Приготування фіксованих препаратів

При вивченні морфології бактерій найчастіше застосовують метод

виготовлення препаратів (мазків) з наступним їх забарвленням. Цей
прийом дозволяє виявити бактерії у досліджуваному матеріалі й
диференціювати їх за формою.
Препарати готують, як правило, на предметних скельцях, товщина
яких не повинна перевищувати 1,2…1,4 мм. Використання предметних
скелець більшої товщини не дозволяє повністю використати числову
апертуру системи мікроскопа.
При роботі з покривними скельцями, їх товщина не повинна
перевищувати 0,15...0,17 мм. Більш товсті скельця погіршують якість
зображення.

39
 Для отримання чистих знежирених скелець їх попередньо
кип’ятять в 1 %-му розчині соди, промивають водою, споліскують
слабким розчином соляної кислоти, потім знову водою, висушують і
зберігають у банці з притертою пробкою в суміші етилового спирту та
ефіру (порівну). При повторному використанні скельця, на 2 год
занурюють у концентровану
сірчану кислоту або краще у цю ж
кислоту, насичену
двохромовокислим калієм, після
чого кип'ятять у лужному розчині,
ретельно промивають водою,
споліскують дистильованою
водою, висушують і зберігають у
пакетах;
Бактеріологічну петлю
виготовляють із спеціальних
Рис. 1.15 . Бактеріологічні сплавів, які при стерилізації вогнем
петлі: 1, 2, 3 - виготовлені
неправильно; 4 - виготовлена швидко розжарюються і порівняно
правильно швидко остигають (рис.1.15).
Кращим матеріалом для їх виготовлення є платина. Остання швидко
нагрівається (під час стерилізації над полум’ям та швидко
остуджується). Останнім часом з’явились бактеріологічні петлі для
разового користування (вони стерильні).
Пастерівські піпетки, виготовлені із скляних трубок,
простерилізовані шляхом автоклавування, разового користування. Після
закінчення роботи їх кладуть у посуд з дезінфікуючим розчином.
Процес виготовлення мазків здійснюють, дотримуючись правил
бактеріологічної техніки (асептики, антисептики). Він включає кілька
послідовних етапів (рис. 1.16).

40
 1. Нанесення досліджуваного матеріалу на предметне скло.
Краплю культури, вирощеної на рідкому живильному середовищі, за
допомогою стерильної бактеріологічної петлі або пастерівської піпетки
наносять на середину предметного скла та розміщають (розмазують)
тонким шаром площею близько 2 см2,, таким чином, щоб не виходити до
країв скла.
Якщо культуру вирощено на щільному живильному середовищі,
то на предметне скло спочатку наносять краплю стерильного
фізіологічного розчину або стерильної води, в якій розтирають частину
бактеріальної маси, решту якої спалюють. Після остигання петлі
мікробну суспензію рівномірно розміщують на склі, як сказано було
вище, та стерилізують петлю фламбуванням.
При виготовленні мазків із паренхіматозних органів, лімфатичних
вузлів та уражених тканин невеличкий шматок матеріалу відрізають
стерильними ножицями й поверхнею зрізу обережно проводять по
предметному склу. Поширеними є так звані мазки-відбитки «кляч-
препарати». При цьому поверхнею зрізу матеріалу доторкаються до
предметного скла і злегка притискують.
Рідкий матеріал (гній, ексудат, мокрота) наносять на середину
предметного скла, щільно накривають другим предметним склом так,
щоб вільною залишилась половина кожного з них. При розтягуванні
стекол в протилежні боки одержують два мазки.
Краплю досліджуваної крові наносять біля правого краю
предметного скла. Спеціальним шліфованим склом, яке утримують під
кутом 45°, доторкуються до краплі й рівномірним рухом розподіляють її
по предметному склу у вигляді тонкого мазка.
2. Висушування мазків. Це краще робити на повітрі, під скляним
ковпаком. Якщо виникає необхідність виготовити препарат швидше,
його можна висушити над полум'ям спиртівки (в теплому потоці

41
 повітря). Слід зауважити, що мазок повинен бути висушеним повністю,
бо залишки вологи негативно впливають на його якість.

Рис. 1.16. Схема послідовності виготовлення мікроскопічного препарату

3. Фіксація мазків фізичними та хімічними методами. Суть

фізичного методу полягає в тому, що предметне скло мазком догори
проводять над полум'ям спиртівки двічі-тричі, утримуючи препарат над
полум'ям 2-3 с. Цей метод досить простий, дешевий, доступний, але
порівняно «грубий». У зв'язку з цим мазки з деяких матеріалів
(наприклад, крові) фіксують хімічним методом. При цьому на них
наносять одну із фіксуючих рідин: метиловий спирт (до 3 хв), суміш
Никифорова (етиловий спирт і етиловий ефір порівну, на 10 – 15 хв),
етиловий спирт (на 10 – 15 хв), ацетон (на 5-10 хв).

42
 Якісні результати одержують після фіксації мазків парою
формальдегіду в бактеріологічних чашках. Використовують й інші
фіксатори.
Основна мета фіксації — прикріплення шару досліджуваного
матеріалу до скла. Разом з тим, мікроорганізми більшості видів при
фіксації гинуть, що сприяє безпеці роботи у випадку наявності в
матеріалі патогенних, а також зумовлює рівномірніше проникнення
фарби в елементи мазка.
4. Фарбування мазків здійснюють барвниками анілінового ряду,
які промисловість випускає у вигляді порошків або кристалів. За
здатністю зв'язуватись зі складовими частинами мікробної клітини
барвники поділяють на основні, або ядерні, які найчастіше застосовують
у мікробіології, та кислі (цитоплазматичні). Останні недостатньо чітко
забарвлюють нуклеоїд і в цілому мембрану, клітину, тому їх
використовують рідко.
Широко застосовують фіолетові (генціановий, метиловий і
кристалічний фіолетовий), червоні (сафранін, фуксин основний), зелені
(малахітовий зелений), сині (метиленовий синій) та інші барвники.
Готують водні, спиртові й спиртово-водні розчини барвників, робоча
концентрація яких, як правило, становить 1–2, інколи – 3-5 %. Рецепти
найчастіше вживаних барвників наведено в додатку.
Мазки фарбують простими та складними методами. Суть
простого зводиться до того, що фіксовані мазки кладуть на спеціальний
місток і наносять робочий розчин одного з барвників (фуксин основний,
сафранін, метиловий фіолетовий) на 1-2 хв, а метиленовий синій — на 3-
5 хв. Після цього залишки барвника змивають водою й обережно
просушують препарати двома смужками фільтрувального паперу.
Просушування повинно бути повним, бо навіть сліди вологи з

43
імерсійною рідиною утворюють непрозору емульсію, яка погіршує
зображення.
Простим методом бактерії фарбуються в один колір рівномірно,
деякі види – зернисто. Інколи спостерігається розщеплення тону
кольору. Це явище одержало назву метахромазії.

Методичні вказівки до проведення занять. Викладач виясняє

рівень підготовки студентів відносно питань, що стосуються теми,
демонструє процес приготування мазків з бульйонної та агарових
мікробних культур, методику приготування кляч-препарату, техніку
фіксації та методику пофарбування, окреслює напрями позаурочної
роботи (знайомство з методиками приготування розчинів фарб,
фіксуючих розчинів.
Самостійна робота студентів. Студенти готують мазки з
бульйонної і агарової мікробної культури (сапрофіт), фіксують
фізичним та хімічним методами, фарбують простим методом,
мікроскопують, зарисовують у альбом.

Питання для самоконтролю

1. Що необхідно мати при виготовленні мазків?

2. Основні етапи виготовлення мазків.
3. Якими методами користуються при фіксації мазків?
4. Основні типи барвників, які використовують для фарбування
мазків.

Лабораторне заняття 2.
Складні методи фарбування препаратів

Мета та ж, що й у занятті 1.
Матеріальне забезпечення: крім аналогічного - набір фарб для
пофарбуванням мазків за методом Грама.

На відміну від простого складні методи фарбування включають не

менше двох барвників та інших реактивів. Застосування не менше двох
контрастних за кольором барвників, дає можливість детально вивчити
тинкторіальні особливості конкретного виду мікроорганізмів, сприяє

44
диференціації видів, дозволяє виявити окремі структури бактеріальної
клітини.
Найбільш поширеним універсальним методом фарбування мазків
у бактеріологічній практиці є метод Грама.

Методика фарбування мазків за Грамом.

1. На фіксований на полум'ї мазок кладуть смужку
фільтрувального паперу (розміром меншу від предметного скла),
попередньо оброблену розчином основного карболового фіолетового
або генціанового фіолетового і наносять дистильовану воду до повного
розчинення барвника. Готовий розчин барвника можна наносити на
звичайну смужку фільтрувального паперу.
2. Через 2-3 хв папір знімають, залишки барвника зливають і на 1-
2 хв наносять розчин Люголя (водний розчин йоду).
3. Розчин Люголя зливають й відразу на 30-60 с наносять 96о-
градусний етиловий спирт. Препарат рекомендують легенько
струшувати, додаючи 2-3 порції спирту до закінчення відділення
фіолетових фракцій розчину.
4. Препарат ретельно промивають водою.
5. На 1-2 хв наносять робочий розчин основного фуксину.
6. Препарат промивають водою, висушують фільтрувальним
папером й досліджують під імерсійною системою мікроскопа.

Бактерії можуть фарбуватись за Грамом у синій, або ж червоний

кольори з різними відтінками, що залежить від їх виду (інколи і від віку).
Представники першої групи міцно утримують комплексну сполуку, що
утворюється між барвниками трифенілметанової групи й йодом розчину
Люголя, зберігають темно-фіолетовий колір і називаються
грампозитивними. Інші бактерії легко знебарвлюються спиртом, на

45
заключному етапі фарбуються в червоний колір і називаються
грамнегативними.
Здатність фарбуватись позитивно за Грамом залежить,
насамперед, від структури клітинної стінки, яка у грампозитивних
бактерій на 90% складається з пептидоглікану. Мікрофібрили
останнього формують густу сітку, яка сприяє фіксації названої вище
сполуки темно-фіолетового кольору. У клітинній стінці грамнегативних
бактерій товщина шару пептидоглікану у 10-20 разів тонша, ніж у
грампозитивних. Його мікрофібрили мають слабкіший зв'язок й
утворюють значно більші пори. Тому грамнегативні мікроорганізми
легко знебарвлюються спиртом.
Грампозитивність пояснюється також більш низькою
ізоелектричною точкою, яка у грампозитивних бактерій становить 2,0-
3,0 (у грамнегативних - відповідно 5,0). Споріднені зв'язки основних
барвників з мікробною клітиною знаходяться в прямій залежності від
цього показника: чим він нижчий, тим сильніші зв'язки.

Фарбування кислотостійких бактерій. У природі як серед

патогенних, так і сапрофітів існують види бактерій, які після фарбування
карболовим фуксином проявляють стійкість до дії мінеральних кислот,
лугів, спиртів, антиформіну тощо. їх називають кислотостійкими.
Звичайними розчинами барвників вони фарбуються погано, тому що
мають гідрофобні властивості за рахунок наявності у клітинах
підвищеного вмісту жирових і жировоскових речовин. Серед патогенних
кислотостійкими є збудники туберкульозу, паратуберкульозу, прокази
людини.
При фарбуванні кислотостійких бактерій користуються
спеціальними методами, серед яких найбільшого поширення набув
метод Ціля-Нільсена.

46
 1. Мазок фіксують на полум'ї і через смужку фільтрувального
паперу на його поверхню наносять карболовий фуксин Ціля (див.
додаток). Розчин барвника підігрівають на полум'ї спиртівки, не
допускаючи закипання, й витримують на препараті до 5 хв у гарячому
стані.
2. Після остигання фільтрувальний папір знімають, залишок
барвника зливають, препарат промивають водою.
3. Мазок знебарвлюють 5%-ю сірчаною кислотою протягом 3-5 с
(до появи жовтого відтінку) й ретельно промивають водою.
4. Додатково препарат фарбують метиленовим синім Леффлера
(див. додаток) протягом 3-5 хв.
5. Препарат промивають водою, висушують і досліджують з
використанням імерсійної системи мікроскопа.
Мікроскопічна картина: кислотостійкі бактерії рубіново-
червоного кольору. Інші види бактерій, клітини патологічного
матеріалу, фон мазка — сині.

Методичні вказівки. Викладач виясняє ступінь підготовки

студентів до роботи за темою заняття, пояснює суть пофарбування
за методикою Грама, демонструє техніку пофарбування (фарбує
виготовлений і зафіксований мазок з культури бактерій), визначає
позаурочну тематику – ознайомитись з суттю пофарбування
кислотостійких мікроорганізмів.

Самостійна робота студентів.

Студенти готують мазки з культури кишкової палички та
молочно-кислих бактерій, фарбують за методом Грама,
мікроскопують, зарисовують мікроскопічну картину.

47
 Лабораторне заняття 3.
Фарбування препаратів з метою виявлення спор бацил

Мета: оволодіти методикою виявлення спор у бацил (клостридій.

Матеріальне забезпечення Мікроскопи світлові, бактеріологічні
петлі,спиртівка, газова горілка), бульйонна культура бацил (сапрофіт),
предметні скельця, набір фарб для пофарбування за методом
Мюзареллі.

За певних умов, найчастіше при нестачі поживних речовин і

нагромадженні продуктів обміну, бацили утворюють спори – сферичні
або овальні структури, розміщені в центрі клітини, ближче до одного з
країв або на самому її кінці (центральне, субтермінальне й термінальне
розміщення).
У представників роду Bacillus діаметр спори не перебільшує
ширини клітини (рис. 1.17, а, б) на відміну від представників роду
Clostridium, у яких спора завжди ширша від поперечника вегетативної
клітини (рис. 1.17, в, г, д).
За рахунок різкого зменшення вмісту води і переходу її у зв'язаний
стан спори набувають стійкості до високої температури, а наявність у
них двох щільних оболонок (екзин та інтин), просякнутих смолистими
речовинами, надає стійкості проти інших фізико-хімічних та
біологічних факторів. Зокрема, спори стійкі проти багатьох
дезинфікуючих розчинів, тривалий час переносять висушування, не
чутливі до бактеріофагів та антибіотиків, можуть витримувати
кип'ятіння від 15 хв до 3 год і більше.
В одній вегетативній клітині бацил утворюється одна спора, на
формування якої потрібно 18 -20 год. За сприятливих умов спора
проростає (протягом 4-5 год) і перетворюється в одну вегетативну
форму бацили. Спори утворюють частіше паличкоподібні бактерії. У
коків і звивистих бактерій цей процес спостерігається досить рідко.

48
 а б в г д

Рис. 1.17. Типи розташування спор у бактерій:

а – центральний (бацилярний); б – субтермінальний (бацилярний);
в, г, д – термінальний, центральний, субтермінальний
(клостридіальний)

Завдяки наявності щільних оболонок спори не фарбуються

простими методами і за Грамом. Для їх виявлення запропоновано
спеціальні методи, основані на жорсткій дії на екзин гарячих розчинів
барвників з вмістом спеціальних протрав, які розпушують оболонки
спори й сприяють проникненню в неї барвника. Запропоновано кілька
методів фарбування спор.
Метод Мюзареллі.
1. На мазок, фіксований над полум'ям спиртівки, наносять
метиленовий синій з бурою (до 100 мл 5 %-го водного розчину бури
додають 3,3 г метиленового синього). Фарбують протягом 2 хв з
підігріванням до пароутворення.
2. Залишок фарби зливають, препарат знебарвлюють 10 %-м
водним розчином азотної кислоти протягом 10-20 с, потім ретельно
промивають водою.
3. На завершальному етапі його обробляють 1 %-м водним
розчином сафраніту або еозину протягом 1 хв, промивають водою й

49
висушують. Мікроскопічна картина: спори синього, тіла бацил —
червоного кольору.
Метод Ожешко.
1. На кінці предметного скла готують товстий мазок, просушують
і не фіксують.
2. Наносять 0,5 %-й розчин соляної кислоти (як протраву),
підігрівають протягом 2 хв до пароутворення.
3. Залишок кислоти зливають, препарат обережно промивають
водою, підсушують й фіксують над полум'ям.
4. Препарат фарбують карболовим фуксином Циля (див. додаток) з
підігріванням до пароутворення.
5. Препарат знебарвлюють 5 %-м розчином сірчаної кислоти
протягом кількох секунд, промивають водою.
6. Мазок дофарбовують метиленовим синім або малахітовим
зеленим протягом 3-5 хв.
Мікроскопічна картина: спори після фарбування карболовим
фуксином витримують короткочасний вплив сірчаної кислоти і
зберігають червоний колір, тоді як тіла бацил знебарвлюються цією
кислотою і дофарбовуються в синій або зелений колір.

Методичні вказівки. Викладач виясняє ступінь засвоєння

матеріалу з попереднього заняття та позаурочної роботи, демонструє
методику пофарбування бацил за методом Мюзареллі, дає завдання
щодо позаурочної роботи – ознайомитись з суттю методом Ожешко
та ін.
Самостійна робота студентів Студенти готують препарати з
культури бацил та фарбують за методом Мюзареллі; мікроскопують і
зарисовують.

50
 Лабораторне заняття 4. Фарбування капсул

Мета: Оволодіти методикою виявлення капсул у бактерій.

Матеріальне забезпечення. Світловий мікроскоп, спиртівка
(газова горілка) предметні скельця, бактеріологічні петлі, мікробна
культура (капсулоутворюючий вид, сапрофіт), набір фарб для
фарбування за Міхіним, Лефлера чи ін.

Бактерії деяких видів відкладають навколо своїх клітин шар

слизоподібних речовин, які утворюють капсулу. До складу останньої
входять полісахариди, поліпептиди або мукополісахариди, які
виконують захисну функцію. У патогенних бактерій капсула є фактором
вірулентності, оскільки частіше утворюється в організмі уражених
тварин. У сапрофітів ця структура, як додаткова оболонка, виконує роль
захисника від впливу несприятливих умов зовнішнього середовища.
Наявність капсули полегшує диференціацію деяких видів бактерій.
Зокрема, з усіх представників роду Bacillus капсулу утворює лише Вас.
anthracis, а серед клостридій – СІ. perfringens.
У зв'язку з особливостями хімічної структури, високою
гідрофільністю капсули погано сприймають звичайні розчини барвників,
тому для їх вияву розроблено спеціальні методи.
Метод Романовського-Гімзи. Барвник Романовського-Гімзи
виробляють у вигляді концентрату, до складу якого входить суміш
азуру, еозину й метиленового синього (див. додаток). Для приготування
робочого розчину на 1 мл дистильованої води (рН 7,0-7,2) додають 1-2
краплі концентрату і відразу використовують.
Мазки краще фіксувати хімічним способом (метиловий спирт або
суміш Никифорова). Після фіксації і висушування на мазок наносять
робочий розчин фарби або вмішують препарати вертикально у склянку,
наповнену цим розчином, де витримують в середньому годину, потім
промивають дистильованою водою і висушують.

51
 Мікроскопічна картина: мікробні клітини темно-синього кольору з
фіолетовим відтінком, капсули блідо-рожеві, ци-топлаама клітин
патологічного матеріалу блакитно-синього кольору, ядра фіолетово-
червоні.
Метод Міхіна. Мазки обережно фіксують над полум'ям. Наносять
лужний розчин метиленового синього за Леффером (див. додаток),
нагрівають до пароутворення. Підтримують барвник гарячим протягом
5-7 хв. Мазки промивають, висушують фільтрувальним папером.
Мікробні клітини набувають синього, а капсули — рожево-червоного
кольору.
Метод Ольта. На фіксований мазок через фільтрувальний папір
наносять гарячий 2 %-й розчин сафраніну й витримують 5-7 хв.
Обережно промивають водою й висушують. Бактеріальні клітини
фарбуються у червоно-коричневий, а кадсули – у жовто-оранжевий
колір.
Методичні вказівки до проведення заняття. Викладач аналізує
підготовленість студентів з теми. Демонструє одну з методик
пофарбування препарату з метою виявлення капсул, визначає
позаурочне завдання.
Самостійна робота студентів. Студенти роблять мазки та
фіксують їх і фарбують за запропонованим методом, мікроскопують і
роблять відповідні зарисовки.
Питання для самоконтролю
1. Чим відрізняються складні метода фарбування мазків від
простих?
2. Основні етапи фарбування мазків за Грамом.
З Чому бактерії фарбуються за Грамом диференційовано?
4. Чому спори бацил не фарбуються простими методами і за
Грамом?
5. Основні етапи фарбування спор за Мюзареллі та Ожешко.
6. Значення капсул для бактерій.
7. Чому для фарбування капсул бактерій необхідно застосовувати
спеціальні методи?

52
 Тема 4. ДОСЛІДЖЕННЯ БАКТЕРІЙ У
НЕПОФАРБОВАНОМУ ВИГЛЯДІ

Мета: оволодіти методикою мікроскопічного дослідження

бактерій у нативному (непофарбованому) вигляді, визначення
рухливості у бактерій.
Матеріальне забезпечення: мікроскопи світлові, спиртівки чи
газові горілки, знежирені предметні та покривні скельця ,
бактеріологічні петлі
( при можливості мікроскоп, обладнаний конденсором темного поля,
фазово-контрастний мікроскоп).

Мікроскопічне дослідження нативних (нефіксованих,

непофарбованих) бактерій дозволяє охарактеризувати їх морфологічні
особливості, не модифіковані під час фіксації (що інколи трапляється) та
визначити здатність їх рухатись.
Значна кількість бактерій здатна активно рухатись завдяки
наявності у них джгутиків – особливих циліндричних ниткоподібних
структур, що відходять від базальних тілець цитоплазматичної
мембрани. Довжина джгутиків значно перевищує величину мікробної
клітини. Джгутики досить тонкі (0,02 – 0,06 мкм) і їх не видно у
звичайному світловому мікроскопі, роздільна здатність якого становить
0,2 мкм. До складу джгутиків входить особливий білок флагелін, який є
повноцінним антигеном і відрізняється від соматичних антигенів
клітини.
Залежно від кількості джгутиків бактерії поділяють на:
- монотрихи – мають один джгутик на полюсі клітини;
- лофотрихи – мають пучок джгутиків на одному з кінців клітини;
- амфітрихи - являють собою перехідну форму і містять по
одному джгутику або їх пучку на кожному полюсі;

53
 - перитрихи – джгутики розміщено по всій поверхні мікробної
клітини (рис. 1. 18).
Джгутики погано
сприймають барвники,
тому в лабораторних
умовах використовують
спеціальні методи
пофарбування
(серебрінння за
Морозовим чи ін). Проте з
метою визначення
рухливості частіше
мікроскопують нативні
Рис. 1.18. Рухливі бактерії: непофарбовані препарати.
1 – монотрихи; 2 – амфітрихи; 3 – лофотрихи;
4 - перитрихи
Для цього готують
препарат «роздавлена
крапля» або ж препарат «висяча крапля».
Для дослідження на рухливість придатні молоді (18-20 год)
бульйонні культури або конденсат агарових культур. Як виняток, можна
обережно суспендувати у фізіологічному розчині бактеріальну масу,
вирощену на щільному середовищі, а одержану суспензію використати
для дослідження бактерій на рухливість. Слід мати на увазі те, що
вирощені на щільному середовищі деякі, здатні до руху, бактерії можуть
її тимчасово втрачати та поновлювати при культивуванні на рідкому
середовищі. На інтенсивність руху бактерій може впливати
температура. Тому, бажано предметне скло перед отриманням
препарату злегка підігріти.

54
 Методика приготування препарату « роздавлена крапля».
Для приготування препарату “роздавлена крапля” краплю
культури наносять на предметне скло, накривають покрівним скельцем
так, що рідина “не вийшла” за його межі.
Методика приготування препарату «висяча крапля». Краплю
досліджуваної культури
наносять на покрівне скельце.
Беруть спеціальне предметне
скло з лункою. Краї лунки
змащують вазеліном, а скло
спрямовують лункою донизу, в
Рис. 1.19. Препарат «висяча
крапля»: а) вид зверху; б) вид збоку напрямку краплі (орієнтуючись
таким чином, щоб крапля
«розмістилась» у центрі лунки, злегка притискують та зрузу ж
перевертають. (рис.1.19)

Порядок дослідження препаратів обох типів у світловому

мікроскопі.

1.Встановлюють об'єктив малого збільшення і рівномірно

освітлюють поле зору.
2 Опускають наполовину конденсор і злегенька прикривають
діафрагму.
3. Знаходять край краплі (має вигляд ламаної лінії) й зміщують її
до центру поля зору.
4. Встановлюють об'єктив середнього збільшення (40х), знаходять
бактерії, які розміщуються на світлішій половині і переконуються в їх
активній рухливості. При цьому видно, що бактерії рухаються в різних
напрямках з різною швидкістю.

55
 Справжній рух слід відрізняти від броунівського, зумовленого
переміщеннями молекул рідини. В цьому випадку бактерії немов би
«товчуться» на місці. Якщо столик мікроскопа стоїть нерівно, то всі
бактерії рухаються в одному напрямку з одинаковою швидкістю.
Рухливість бактерій краще спостерігається при використанні
темнопольної та фазово-контрастної мікроскопії.
З допоміжних методів при дослідженні бактерій на рухливість
застосовують посів культур уколом у напіврідкий агар. У позитивних
випадках спостерігають дифузний ріст культури від лінії уколу. Один з
методів передбачає посів культури в конденсатну рідину щільного
середовища. Нерухливі бактерії розмножуються тільки в рідині, тоді як
рухливі види заселяють всю поверхню середовища. Якісні результати
при дослідженні бактерій на рухливість одержують при використанні
методу «темного поля».
Методичні вказівки: викладач демонструє методику
приготування препаратів типу «висяча крапля”, «роздавлена крапля»,
техніку мікроскопіювання препаратів, пропонує завдання для
позаурочного вивчення.

Самостійна робота студентів. Студенти роблять мазки типу

«висяча крапля”, «роздавлена крапля», відпрацьовують техніку
мікроскопіювання препаратів, роблять відповідні зарисовки.

Питання для самоконтролю

1. Як поділяються бактерії залежно від кількості джгутиків ?
2.Назвіть основні методи приготування препаратів для
дослідження рухливості бактерій.
3. Який порядок дослідження препаратів типу «висяча крапля”,
«роздавлена крапля»?

56
 Тема 5. МОРФОЛОГІЯ ГРИБІВ ТА АКТИНОМІЦЕТІВ

Мета: ознайомити студентів з морфологією грибів,

актиноміцетів.

Обладнання і матеріали. Мікроскопи світлові, предметні

скельця, бактеріологічні петлі, пастерівські піпетки, культури грибів і
актиноміцет (вирощені завчасно на живильних середовищах), спиртівки
(газові горілки).

Гриби (Mycetes, Fungi) – велика група нижчих безхлорофільних

рослин, які відрізняються від бактерій більш досконалою будовою і
складнішими методами розмноження. Вегетативне тіло (міцелій гриба)
складається з окремих тонких переплетених ниток — гіф, які можуть
бути одно- і багатоклітинними. Якщо гіфи не мають перетинок (септи),
то такі гриби належать до нижчих. У вищих грибів гіфи, як правило, з
перетинками, багатоклітинні.
Розмножуються гриби вегетативним, статевим і безстатевим
способами.
Серед нижчих грибів виділяють два класи: хітрідіоміцети
(Chytridiomycetes) – характеризуються слабкорозвиненим міцелієм,
одноклітинні; зігоміцети (Zygomycetes) – вегетативне тіло їх
представлене однією гігантською багатоядерною клітиною. Типовим
представником є мукорова, або головчаста, цвіль. Від субстратного
міцелію у мукорових цвілей відходять плодонесучі гіфи –
спорангієносці, які закінчуються плодовими тілами – спорангіями,
заповненими спорангієспорами (ендоспори). При розпаді спорангія
спори виходять у зовнішнє середовище і за наявності сприятливих умов
проростають (рис. 1.20). У нижчих грибів можливе статеве
розмноження.

57
Рис. 1.20. Mucor: А -загальний вигляд міцелію з поодинокими спорангієно-сцями;
Б - група спорангіїв на міцелії; В - будова спорангія; Г - звільнення спорангіоспор.
1 - спорангій; 2 - колонка; 3 - спорангієносець; 4 - спорангіоспори; 5 - залишки
перидію спорангія (комірець)

До вищих грибів належать представники трьох класів, серед яких

досить поширені аскоміцети (Ascomycetes), або сумчасті гриби.
Типовим представником цього класу є дріжджі, які не мають міцелію і
на стадії вегетативного розмноження можуть формувати псевдоміцелій
(рис. 1. 21, А).
Дріжджові клітини частіше мають овальну форму величиною
близько 10 мкм, є типовими еукаріотами із сформованим ядром і
рештою структур, характерних для вищих клітин. У цитоплазмі
дріжджів відкладаються у вигляді включень краплі жиру, глікогену,
волютину тощо (рис.1.21, Б).
Дріжджі можна виявити на дозрілих плодах і листях дерев,
рослинах. Сапрофітні види дріжджів використовують у спиртовій,
винокурній, хлібопекарській промисловості. Деякі види здатні
викликати у тварин хвороби (мікози, зокрема бластомікози).

58
 А
Б

Рис. 1.21. А - форми дріжджів; Б – схема будови дріжджової клітини:

1 - оболонка; 2 — ядро в стадії ділення; 3 — яглікоген; 4 —
цитоплазма; 5 – валютин; 6 – вакуоль; 7 – мітохондрія

Найчастіше дріжджі розмножуються брунькуванням, в результаті

чого від материнської клітини поступово відмежовується одна чи
декілька дочірніх. Типовим є також розмноження дріжджів шляхом
простого поділу. При недостатньому живленні й посиленні аерації у
дріжджів відбувається статеве розмноження, механізм якого зводиться
до копуляції (злиття) двох клітин з утворенням однієї сумки (аска). В
останній формуються чотири або вісім аскоспор, здатних витримувати
дію несприятливих умов зовнішнього середовища.
Клас дейтероміцетів (Deuteromycetes) об'єднує типові гіфоміцети,
що мають септований міцелій і розмножуються лише спорами (оідії та
конідії). Статевого розмноження у цих грибів не виявлено, на підставі
чого їх відносять до незавершених (Fungi imperfecti). Це Penicillium,
Aspergillus, Fusarium, Trichophyton та ін.
У представників роду Penicillum субстратний і повітряний міцелій
септовані. Плодоносні гіфи (конідієносці) розгалужені, кожна гілка
закінчується пучком стеригм у вигляді китички, на яких ланцюжками
розміщено конідії (екзоспори). Така структура певною мірою нагадує

59
кисть руки, у зв'язку з чим пеніцилові гриби одержали назву
кистеподібних цвілей (рис.1.22.).
Пеніцили досить поширені у природі, зумовлюють псування
(цвілість) кормів і продуктів харчування, деякі з них здагні
нагромаджувати токсин й викликати кормові отруєння у тварин
(пеніціліотоксикози). Окремі — P. crustosum, P. notatum — продуценти
антибіотика пеніциліну.
У грибів роду Aspergillus перетинки є лише в субстратному
міцелії. Конідієносці септ не мають, закінчуються потовщенням у
вигляді кулі чи груші, навколо якого радіально розміщено стеригми з
ланцюжками конідій, що нагадують струмені води, які виливаються з
лійки. Тому аспергілові гриби одержали назву лійкові цвілі (рис. 1.23).

Рис. 1. 22. Penicillium: Рис. 1.23. Aspergillus: 1 - конідіофор

1 - гіфа; 2 - конідієносець; 3 - 2 – конідії; 3 - стеригми;
cтepигми; 4 - конідіоспори 4 – вегетативні гіфи (конідієносець);
5 – субстратний міцелій
Деякі види аспергілів викликають у тварин аспергіло-токсикози та
аспергільоз. Окремі аспергіли корисні й використовуються для
одержання органічних кислот, зокрема лимонної та щавлевої. Як
звичайні цвілі аспергіли псують корми і продукти харчування.

60
 Міцелій грибів роду Fusarium також має перетинки і за рахунок
утворення пігментів набуває рожевого, фіолетового, білого чи іншого
кольору. Плодоносні гіфи (звичайні або розгалужені конідієносці)
закінчуються серпоподібними конідіями.
Гриби ведуть сапрофітний, або паразитичний спосіб життя на
рослинах і їхніх рештках. Досить часто уражають зерно, при
згодовуванні якого у тварин виникає фузарп-токсикоз. У людей також
може розвиватись інтоксикація у випадку вживання хліба з ураженого
фузаріями зерна. Народна назва цієї хвороби — «п'яний хліб».
Променеві гриби, або актиноміцети, отримали таку назву у
зв'язку з утворенням в уражених тканинах організму тварин особливих
колоній — променевих друз. Останні, роздавлені між двома
предметними стеклами, під мікроскопом мають своєрідний вигляд:
центр – у стадії розпаду, від якого як промені радіально відходять
морфологічно змінені колбоподібні гіфи (рис.1.24).
Актиноміцети займають
проміжне місце між бактеріями і
грибами. Подібно бактеріям, вони
фарбуються позитивно за
Грамом, мають неоформлене
ядро, тонкий, що нагадує
нитчасті бактерії, міцелій.
Подібно грибам мають
одноклітинний міцелій і
Рис. 1.24. Друзи актиноміцетів
розмножуються спорами.
Актиноміцети досить
поширені у природі, зустрічаються переважно в грунті, на рослинних
рештках. Позитивне значення їх полягає у тому, що вони беруть активну
участь у ґрунтоутворенні, є активними продуцентами багатьох

61
антибіотиків, (стрептоміцин, тетрациклін та ін..) Патогенні види
актиноміцетів зумовлюють виникнення у тварин і людини актиномікозу.

Методичні вказівки: викладач пояснює особливості структури

грибів та актиноміцетів, порівнюючи її з будовою бактерій,
демонструє культури грибів та актиноміцет, вирощених на щільному
середовищі, методику приготування препаратів для дослідження
структури елементів грибів та актиноміцетів за допомогою
світлового мікроскопу, дає завдання для позаурочного вивчення окремих
питань за темою.

Самостійна робота студентів. Студенти роздивляються колонії

різних видів грибів, актиноміцеті,готують препарати, мікроскопують
їх та зарисовують основні структурні елементи грибів у альбом.

Питання для самоконтролю

1. За якими ознаками гриби відрізняють від бактерій?
2. Основні класи грибів.
3. Морфологія дріжджів, аспергілових та пеніцилових цвілей,
представників роду Fusariumm.
4. Морфологія актиноміцетів, їх поширення і значення у природі.

Тема 6. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ

Мета: ознайомити студентів з основними методами стерилізації,

з методиками підготовки посуду та інших матеріалів до стерилізації в
автоклаві, сушильній шафі та ін.
Матеріали і обладнання. Стерилізатори , набір інструментів
(скальпелі, пінцети, ножиці та ін), водяна баня, сушильна шафа,
автоклав, спиртівки (газові горілки) бактерицидні лампи, скляні колби,
градуйовані піпетки, пастерівські піпетки, пробірки, бікси, ватяно-
марлеві пробки тампони та ін., бактеріологічні чашки з МПА, суспензія
мікробної культури (сапрофіт), бактеріологічні петлі, «трафарет» .

Однією з найважливіших умов, які забезпечують успішну роботу в

мікробіологічних лабораторіях, є необхідність маніпулювання
стерильними інструментами, реактивами, живильними середовищами
тощо.

62
 Стерилізація (від лат. sterilis — неплідність, знепліднювання) —
знищення всього живого у будь-якому середовищі чи на поверхні
предмета. В мікробіологічних лабораторіях стерилізують посуд
(пробірки, колби та ін.), інструменти (ножиці, скальпелі, бактеріологічні
петлі, пастерівські піпетки), живильні середовища, ватні та марлеві
тампони.
Існує багато різних способів стерилізації. їх поділяють на фізичні
та хімічні. В основі фізичних способів лежать згубна дія на
мікроорганізми високої температури, ультрафіолетових променів,
ультразвуку, а також здатність бактеріальних фільтрів затримувати
бактерії:
- фламбування (стерилізація полум'ям). Найчастіше ним
стерилізують бактеріологічні петлі, піпетки;
- стерилізація гарячим повітрям (сухий жар). У спеціальних
шафах (піч Пастера) стерилізують скляний посуд, бактеріологічні
чашки, пастерівські піпетки, пробірки. Перед стерилізацією попередньо
вимиті й висушені предмети закривають ватно-марлевими пробками
(пробірки, колби), обгортають пергаментним папером.
Промисловість випускає сушильні шафи різних модифікацій, які
відрізняються за формою та об'ємом, проте конструктивно майже
однотипові. Шафа являє собою металевий ящик, зовні вкритий
теплоізоляційним матеріалом. Шафи обладнано електропідігрівом та
автоматизованою системою контролю температури в камері.
При вмиканні шафи в електромережу повітря в ній нагрівається.
Початком стерилізації вважають час, коли температура досягне
необхідного рівня. При температурі 155— 160 °С стерилізація триває
протягом 2 год, при 165-170 – 1-1,5, при 180 °С - 1 год. По закінченні
стерилізації шафу вимикають. Відкривають її тоді, коли температура в
камері знизиться до

63
35 °С.
Стерилізація кип'ятінням. Цим методом стерилізують
інструменти (шприці, ножиці, скальпелі та ін.) у спеціальних металевих
ємкостях — стерилізаторах. Останні поділяють на звичайні та
електричні (з електропідігрівом). Дно стерилізатора вкрито металевою
сіткою, на поверхню якої кладуть тонкий шар марлі або гігроскопічної
вати. Ріжучі інструменти (леза, скальпелі, ножиці) обгортають марлею.
Шприці розбирають. У голки вставляють мандрени.
Перед роботою у стерилізатор наливають дистильовану або
переварену воду і додають 2 %-й гідрокарбонат натрію. Вода повинна
повністю покривати предмети. Стерилізатор закривають кришкою й
стерилізують предмети протягом 20-30 хв, відраховуючи час від
моменту закипання води. Після закінчення стерилізації воду зливають.
Стерилізація парою. Є два методи стерилізації парою: потоковою
парою без тиску (в апаратах Коха, Турнера) та насиченою парою під
тиском (в автоклаві).
Стерилізацію потоковою парою без тиску здійснюють в апараті
Коха (рис. 1.25). Існує кілька модифікацій цього апарата. Найпростіші з
них представляють собою металевий
циліндр, покритий теплоізоляційним
матеріалом, зверху — конусоподібна
кришка з отворами (паровідвід),
всередині — підставка для предметів,
що стерилізуються.
Перед роботою в апарат
наливають воду. Рівень її повинен
бути нижчим від рівня згаданої
підставки. Воду в апараті
Рис. 1.25.Апарат Коха

64
підігрівають з використанням зовнішнього джерела підігріву
(найчастіше це газовий пальник). Сучасні апарати мають автономну
систему нагрівання води, обладнані автоматичним контролем заданого
рівня температури.
Потоковою парою найчастіше стерилізують речовини, які
руйнуються при нагріванні до температури понад 100 °С. Це – живильні
середовища або їх компоненти.
Пробірки, колби з відповідним вмістом ретельно закривають
ватно-марлевими пробками, потім — пергаментним папером.
Стерилізація триває три дні підряд (метод роздрібненої стерилізації,
запропонований Тиндалем, 1877). Вміст нагрівають до температури 100
°С й витримують протягом 30-40 хв. Так роблять тричі. Між
нагріваннями матеріал не охолоджують, підтримуючи температуру 23-
25 °С. За таких умов спори мікроорганізмів проростають у вегетативні
клітини. Останні при наступному прогріванні гинуть. Триразове
прогрівання дає змогу повністю позбавитись не лише вегетативних, а й
спорових форм.
Модифікація роздрібненої стерилізації – тиндалізація. Принцип
той же, однак температура нижче 100 °С (від 56 до 80 °С), що залежить
від термостійкості речовин, які стерилізують). Як правило, це
білковмісні живильні середовища чи їх компоненти. Тиндалізацію
здійснюють у водяній бані Температурний режим, кількість нагрівань
можуть бути різними.
При температурі 70-80 °С середовища прогрівають три дні підряд,
при 60-65 °С — п'ять, 56-58 °С — шість-сім днів. У перший день
тиндалізації прогрівання триває 2 год, решту днів — по 1 год.
Стерилізацію парою під тиском здійснюють у спеціальних
апаратах — автоклавах (рис.1.26). Пара під тиском, що перевищує
атмосферний, конденсується на об'єкті й сприяє підвищенню

65
температури. Вона обов'язково повинна бути насиченою При
підвищенні тиску пари відповідно підвищується і температура:

0,505- 105 Па (0,5 атм) –температура 110 -112 °С;

1,01 • 105 Па (1,0 атм) 120 -121 °С;
1,515-105Па (1,5 атм) 124 -126 °С;
2,02-105Па (2,0 атм) 132 -133 °С. '

В автоклаві стерилізують скляний посуд, інструменти, халати,

рушники, живильні середовища тощо. Перед стерилізацією пробірки,
колби закривають ватно-марлевими пробками, при потребі обгортають
(по кілька штук) папером або поміщають у паперові пакети. Живильне
середовище (у пробірках, флаконах, колбах) наливають з таким
розрахунком, щоб під час кипіння пробки не змочувались. Режим
стерилізації залежить від виду матеріалів, які стерилізують. Так,

А Б В

Рис. 1.26. Автоклави:

А — вертикальний АВ-1; Б — горизонтальний АГ-1; В — автоматичний
АШ-250

66
більшість живильних середовищ стерилізують при температурі 110-112
°С протягом 20-30 хв, скляний посуд — при 124 -126 °С протягом 40-60
хв. Вітчизняна промисловість випускає електричні автоклави двох типів:
вертикальні та горизонтальні. В умовах мікробіологічної лабораторії
зручніші горизонтальні.
Автоклав горизонтальний (АГ-1). Основними частинами
автоклава є стерилізаційна та парова камери, кришка з центральним
запором, ємкість з електронагрівними елементами, електрощит та
постамент.
Стерилізаційна камера розміщена всередині парової, у днищі має
отвір для надходження пари. Парова камера обладнана спускним краном
для випуску повітря на початку розігрівання автоклава та випуску пари
після закінчення стерилізації, манометром з триходовим краном,
сифонною трубкою. Пара надходить у парову камеру з казанка по
патрубку. При роботі автоклава конденсат, утворюваний під час
стерилізації, зливається через той же патрубок у ємкість.
На патрубку є вентиль, за допомогою якого після закінчення
стерилізації припиняють надходження пари з ємкості у парову камеру.
Ємкість має колонку з поділкою для визначення рівня води і
лійкою для наливання води, манометр з триходовим краном і сифонною
трубкою, запобіжний клапан У кришку казанка вмонтовано
електронагрівні елементи. Парова камера і казанок мають металеві
кожухи, які зменшують втрати тепла та запобігають опікам при роботі з
ними.
На циферблатах манометрів відмітка 2 атм (2,02 х105 Па )
відповідає максимальному тиску, що допускається в автоклаві.
Запобіжний клапан відрегульовано на тиск пари 2 атм ( 2,02 х105 Па ).

67
 Експлуатація автоклава. Автоклав встановлюють з урахуванням
діючих правил техніки безпеки. Встановлений і випробуваний автоклав
експлуатують у такому порядку:
● відкривають випускний кран і вентиль;
● ємкість наповнюють водою до верхньої відмітки на кожусі
водомірного скла. Для цього відкривають верхній кран водовказівної
колонки. Воду наливають через лійку. Після наповнення нею ємкості
кран закривають;
● відкривають кришку автоклава, для чого повертають штурвал
проти годинникової стрілки;
● заповнюють стерилізаційну камеру матеріалом;
● закривають кришку автоклава і поворотом штурвала за
годинниковою стрілкою міцно її затискають;
● повертають ручку вмикача у положення «Ввімкнено» (при
цьому загоряється сигнальна лампа) і ручку перемикача у положення
«Нагрівання»;
● після того, як пара витисне повітря та конденсат з парової
камери, закривають випускний кран. Ознакою повного витиснення
повітря з камери є те, що пара виходить рівномірно, струменем;
● коли у паровій камері тиск досягне заданого рівня, ручку
перемикача повертають у положення «Стерилізація» й відмічають час
початку стерилізації;
● після закінчення стерилізації ручку перемикача ставлять у
положення «0» (горизонтально), закривають вентиль і випускають пару з
парової камери через шланг спускного крана;
● коли тиск у паровій камері по манометру знизиться до поділки 0
і з шланга перестане виходити пара, автоклав відкривають і вміст його
виймають.

68
 Забороняється:
● доливати воду в казанок при стерилізації і нагріванні, тобто при
наявності тиску в камері; залишати автоклав у робочому стані без
нагляду; вмикати автоклав при відсутності чи недостатній кількості води
в казанку;
● користуватись автоклавом після того, коли вийшов останній
строк чергового огляду інспекцією технагляду.
Деякі сучасні моделі автоклавів (ГК-100-2 та ін.) оснащено
автоматичною системою регуляції режиму роботи, що значно спрощує
їх експлуатацію.
Стерилізація фільтруванням застосовується у тих випадках,
коли субстрати (сироватка крові, антибіотики, вітаміни тощо)
руйнуються при високій температурі. Полягає у фільтруванні рідини
через спеціальні фільтри, які називають бактеріальними.
Мікроорганізми затримуються на поверхні фільтрів та у їхніх порах
(рис.1.27) .
Розрізняють такі різновиди бактеріальних фільтрів: керамічні
(фільтрувальні свічки), азбестові та мембранні.
Керамічні фільтри (Беркефельда, Шамберляна і т. д.)
виготовляють з різних сумішей: каоліну," кварцового піску та ін. їх
можна використовувати багаторазово.
Азбестові фільтри (Зейтця) бувають різного розміру й мають
різні характеристики. Виготовляють їх з азбесту та целюлози. Вітчизняні
фільтри бувають двох типів: Ф та СФ. Для стерилізації, як правило,
використовують СФ.
Мембранні фільтри (колодієві мембрани) виготовляють з ацетату,
целюлози, колодію та інших матеріалів. Це досить тоненькі диски
різного діаметра. Вони можуть мати пори різної величини, що

69
вказується у відповідному паспорті. Мембранні фільтри використовують
для фільтрації різних рідин та очищення вірусів.

Рис.1.27. Прилад для фільтрування із застосуванням свічки

Шамберлана: 1- рідина, що фільтрується; 2- свічки Шамберлана; 3- гумова пробка;
4- колби Бунзена.
Прилад Зейтца (а) і схема роботи мембранних (поверхневих) фільтрів (б);
1- великопориста скляна або металева пластинка; 2 і 3- верхня н нижня частини
апарату Зейтца; 4- розрідження; 5- гумова пробка; 6- колби Бунзена; 7- мікробні
клітки; 8- мембранний фільтр; 9-фільтрат.

Стерилізацію ультрафіолетовим промінням застосовують для

стерилізації приміщень (кімнати-бокси, операційні). Інколи
стерилізують предмети, що руйнуються під впливом високої
температури (наприклад, плексигласові пластини з лунками). Джерелом
УФ-променів можуть бути бактерицидні лампи різних типів. Суттєве
значення для результатів стерилізації мають інтенсивність
випромінювання лампою УФ-променів, відстань від джерела
випромінювання до поверхні предметів, експоцизія.

70
 Стерилізація ультразвуком. Ультразвук згубно діє на
мікроорганізми. Він викликає утворення у цитоплазмі бактерій
кавітаційних пухирців, наповнених парою під тиском близько 101,3-104
кПа, що призводить до руйнування внутрішніх структур мікробної
клітини.
Ультразвуком можна стерилізувати воду, молоко.
Стерилізація за допомогою хімічних речовин. Хімічні речовини
найчастіше застосовують для дезинфекції приміщень, предметів, проте в
мікробіологічних лабораторіях ними користуються при стерилізації. Так,
з метою консервування діагностичних сироваток використовують борну
кислоту, толуол, гліцерин тощо.
Іноді застосовують біологічну стерилізацію. В її основу покладено
дію антибіотиків на мікроорганізми. Цей метод застосовують при
культивуванні вірусів.

ПАСТЕРИЗАЦІЯ
Метод запропоновано Л.Пастером. Застосовується для
знезараження сільськогосподарських продуктів (молоко, м'ясні, рибні та
овочеві консерви), забезпечує зберігання необхідних смакових,
поживних та вітамінних якостей.
Суть методу полягає в одноразовому прогріванні продукту з
наступним швидким його охолодженням (до 4 – 8 °С). При цьому
вегетативні форми бактерій гинуть, спорові — не проростають, тому
пастеризацію не слід розглядати як метод стерилізації.
На практиці застосовують тривалу (30 хв при температурі 65 °С),
короткочасну (15-20 с при 72-78 °С) та миттєву (при температурі 85-90
°С без витримки) пастеризацію.

71
 Методичні вказівки до заняття. Викладач знайомить студентів
з суттю та основними методами стерилізації, демонструє методики
підготовки посуду, піпеток, живильних середовищ та ін до стерилізації
в автоклаві, визначає напрями позаурочної підготовки студентів за
темою.
Самостійна робота студентів. Студенти готують посуд до
стерилізації у автоклаві, стерилізують металеві інструменти у
стерилізаторі, здійснюють посів бактерій-сапрофітів на живильне
середовище у бактеріологічних чашках, та стерилізують УФП
(використовують трафарет), щоб переконатись у бактерицидній дії
променів.

Питання для самоконтролю

1 Що таке стерилізація?
2. Методи стерилізації.
3. Характеристика основних фізичних методів стерилізації.
4. Принципова схема конструкції автоклава.
5. Правила експлуатації автоклавів
6. Принципи хімічної та біологічної стерилізації.
7. Що таке пастеризація?

Тема 7. КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Лабораторне заняття №1.

ПРИГОТУВАННЯ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ,
ЗНАЙОМСТВО З МЕТОДАМИ КУЛЬТИВУВАННЯ РІЗНИХ ГРУП
МІКРООРГАНІЗМІВ

Мета: ознайомити студентів з методиками культивування

різних мікроорганізмів в умовах лабораторі та приготування живильних
середовищ.
Матеріали та обладнання. Компоненти для приготування
живильних середовищ: агар-агар, желатин, пептон, м’ясна вода, х.ч.
NaCL, 8-10%-ний розчин КОН, лійки, гігроскопічна вата, марля,
градуйовані піпетки, дистильована вода, стерильні пробірки з ватяними

72
пробкам, середивища промислового виробництва, (прості, складні,
спеціальні , рН-метр.

Культивування (вирощування) мікроорганізмів в умовах

лабораторій здійснюють з метою вивчення їх властивостей, необхідних
для визначення виду (ідентифікація), одержання вакцинного матеріалу
(антиген) та штамів із слабкою вірулентністю й достатньою
імуногенністю. У спеціалізованих мікробіологічних лабораторіях
культивують продуценти антибіотиків, вітамінів та інших корисних
речовин.
Щоб культивувати мікроорганізми, необхідно знати умови, які б
забезпечили їх ріст і розмноження: реакцію на дію, атмосферного
кисню, температурний оптимум, рН, потребу у поживних речовинах,
вітамінах тощо; слід знати будову обладнання, що використовується у
процесі культивування, зокрема конструкцію термостатів, анаеростата,
рН-метрів; потрібно уміти користуватись бактеріологічною петлею і
пастерівськими піпетками, володіти технікою посіву мікроорганізмів на
живильні середовища і т. д.
Характеристика основних приладів, які використовують при
культивуванні мікроорганізмів. Термостати — апарати, у яких
підтримується оптимальна для росту мікроорганізмів, постійна
температура. Існують різноманітні за конструкцією термостати.
Вітчизняна промисловість випускає сухоповітряні та водяні (з водяною
сорочкою).
Термостат має корпус, робочу камеру, електронагрівальний блок,
терморегулятор. У сухоповітряному термостаті теплоізоляційним
матеріалом є повітря, яке знаходиться між зовнішньою та внутрішньою
стінками корпусу, у водяних – вода.
У нижній частині корпусу вмонтовано електронагрівник.
Вмикання його в електромережу та вимикання з неї здійснюється

73
автоматично, за допомогою терморегулятора. Конструкція останнього
може бути різною. До цього часу широко використовували так звані
«біметалеві терморегулятори», нині – контактні термометри.
Сучасні термостати автоматизовані, мають панель з високою
інформацією: покажчик температури у робочій камері, покажчик
температурного режиму, заданого на терморегуляторі, і т. д.
Термостат встановлюють відповідно до паспортних даних,
обов'язково заземлюють. Робоча камера термостата повинна бути
чистою і сухою.
Термостат відкривають лише на період розміщення в робочій
камері необхідних матеріалів чи при потребі їх забрати.
Анаеростат – металевий, циліндричної форми апарат з
герметичною кришкою, обладнаний вакуум-манометром та кранами,
через які при необхідності всередину подають СО2 та інші гази (рис.
1.28). Анаеростат призначений для вирощування анаеробів та
мікроаерофілів.
Посіви мікроорганізмів (в пробірках, бактеріологічних чашках
тощо) розміщують у камері анаеростата,
закривають покришкою і насосом з
робочої камери відкачують повітря.
Ступінь розрідження останнього
визначають за допомогою вмонтованого
манометра. Коли покажчик вакууму
досягне необхідної величини,
загвинчують кран, насос вимикають й
анаеростат ставлять у термостат.
Рис. 1.28. Анаеростат
Живильні середовища
Мікроорганізми культивують на живильних середовищах. Останні
розрізняють за походженням — природні й штучні, консистенцією –

74
рідкі, тверді, напівтверді, призначенням — звичайні (прості та
універсальні) і спеціальні (табл.1.1) .
Таблиця 1.1.
Характеристика основних живильних середовищ
Диференціація Диференціація за
за походенням Диференціація за консистенцією
призначенням
Природні Звичайні (універсальні), Рідкі
прості
Штучні Спеціальні: Тверді
для вирощування окремих видів Напівтверді
бактерій
диференційно-діагностичні
селективні
для визначення біохімічних та
інших властивостей мікроорганізмів
збагачувальні (середовища
нагромадження)

До звичайних середовищ належать м'ясо-пептонний бульйон

(МПБ), м'ясо-пептонний агар (МЛА) та ін. Звичайними середовища
називають тому, що на них можна вирощувати більшість
мікроорганізмів. Ні одна мікробіологічна лабораторія, у т. ч. й
ветеринарна, не обходиться без МПА, МПБ. Основою для приготування
звичайних живильних середовищ є м'ясна вода. Приготування останньої
включає такі етапи. Беруть яловичину чи конину. Видаляють кістки,
сухожилля, фасції, жир. М'ясо подрібнюють на м'ясорубці, зважують і
заливають подвійною кількістю водопровідної води. Залишають у
прохолодному місці на 13 – 24 год Фарш віджимають, а м'ясний
екстракт кип'ятять на слабкому вогні протягом 1,5 – 2 год, фільтрують
(спочатку через ватно-марлевий, потім – через паперовий фільтри),
доводять до попереднього об'єму водопровідною водою, розливають у
колби й стерилізують 30 хв при температурі 120 °С. Зберігають у
сухому, темному прохолодному місці і використовують в міру потреби.

75
 Приготування м'ясо-пептонного бульйону (МПБ). До м'ясної води
додають 1% пептону (продукт неповного гідролізу білка, який
виготовляють на м'ясокомбінатах з дешевої сировини), 0,5 % хлориду
натрію і кип'ятять, постійно помішуючи, до повного розчинення
пептону. Визначають рН колориметричним методом чи за допомогою
потенціометра. Оскільки м'ясна вода має слабкокисле середовище, МПБ,
виготовлений з неї, також слабкокислий. Для нормалізації рН вносять
10-15 %-й розчин КОН або NaOH, кип'ятять 2-3 хв і знову визначають
рН. Реакція МПБ повинна бути лужною (рН 7,2-7,6).
Залежно від потреби МПБ розливають у колби чи пробірки (в
останні – по 5-8 мл), закривають ватно-марлевими пробками і
стерилізують в автоклаві.
Приготування м'ясо-пептонного агару (МПА). До МПБ додають
2-3 % подрібненого і замоченого у холодній воді агар-агару (безазотиста
речовина, одержувана з морських водоростей; забезпечує твердість
середовища), кип'ятять до повного розчинення агар-агару, визначають
рН. При необхідності додають розчин КОН або NaOH, гарячим
фільтрують через ватно-марлевий фільтр. Розливають у колби чи
пробірки й стерилізують в автоклаві (20-30 хв при 1,01-105 Па).
Зберігають у сухому, прохолодному місці. Перед використанням
розплавляють при температурі 100 °С (у водяній бані), при необхідності
розливають у стерильні пробірки, дотримуючи умов стерильності. Іноді
розплавлений агар розливають у стерильні бактеріологічні чашки (по 8-
10 мл) і залишають на 15-20 хв при кімнатній температурі, МПА
затвердіває при температурі 35-40 °С.
МПА у пробірках найчастіше використовують у вигляді «косяків»,
що значно збільшує поверхню середовища для вирощування
мікроорганізмів. Для цього пробірки з розплавленим агаром кладуть під
кутом 5-6° й тримають доти, поки агар не затвердіє (рис. 1.29).

76
 Спеціальні живильні середовища. Залежно від призначення
спеціальні живильні середовища поділяють на:
- середовища для вирощування певних мікроорганізмів
(Петраньяні – для збудника туберкульозу);
- середовища для диференціації окремих груп мікроорганізмів
(Ендо – для диференціації сальмонел і кишкових паличок);
- середовища для
визначення біохімічних та
інших властивостей у
бактерій (Гіса – для
визначення цукролітичних
властивостей).
До спеціальних
живильних середовищ
належать також селектині
Рис. 1.29. Пробірки зі скошеним
живильні середовища,
агаром
призначені для виділення
певного виду бактерій з матерілів, які мають інші мікроорганізми. Ця
група включає збагачувальні (середовища нагромадження, призначені
для попереднього збільшення концентрації бактерій у процесі виділення
їх з досліджуваних матеріалів).
Приготування окремих спеціальних живильних середовищ.
Сироватковий МПБ і сироватковий МПА. До розплавленого, а потім
остудженого до 50-45 °С МПА додають 5-10 % стерильної сироватки
крові коня (вівці, кролика), ретельно змішують, струшуючи колбу,
розливають у бактеріологічні чашки чи пробірки й залишають на 20-30
хв при кімнатній температурі для затвердіння МПА.

77
 Щоб одержати сироватковий МПБ, до звичайного МПБ у
стерильних умовах додають кров'яну сироватку у такій же кількості, як і
для приготування сироваткового МПА.
Кров'яний МПА готують так, як і сироватковий, проте замість
сироватки вносять 5-10 % дефібринованої крові.
Цукровий МПБ і цукровий МПА. До МПБ чи МПА (розплавленого)
додають 1-2 % глюкози, ретельно змішують й стерилізують проточною
парою або у автоклаві при 0,5 атм протягом 20 хв.
М'ясо-пептонна желатина (МПЖ). До МПБ додають 10-20 %
желатини, варять до повного її розчинення, визначають рН, фільтрують
через ватно-марлевий фільтр, розливають у стерильні пробірки й
стерилізують проточною парою.
Середовище Ендо. До 100 мл МПА додають 1 мл 10 %-го водного
розчину кристалічного вуглекислого натрію й нагрівають протягом 10 хв
при температурі 100°С (водяна баня або апарат Коха). Охолоджують до
60 °С, вносять 1 г хімічно чистої лактози та суміш фуксину з безводним
сульфітом натрію. Для приготування цієї суміші 0,5 г сульфіту натрію
розчиняють у 5 мл стерильної води. До 1 мл насиченого спиртового
розчину основного кристалічного фуксину додають свіжоприготовлений
розчин сульфіту, доки рідина не знебарвиться або не зробиться злегка
рожевою. При внесенні знебарвленої суміші фуксину з сульфітом
розплавлений агар набуває червонуватого кольору. Після ретельного
перемішування середовище розливають у бактеоіологічні чашки.
Середовище готують перед посівом, його рН повинно становити 7,5.
Сучасна промисловість виробляє багато середовищ, які й постачає
у лабораторії. Використання їх значно полегшує процес культивування
мікроорганізмів.
Незалежно від характеру живильні середовища повинні
відповідати загальним вимогам: бути стерильними, мати оптимальний

78
показник рН (у більшості випадків 7,2—7,4) й осмотичного тиску,
містити необхідні поживні речовини (джерела азотистого, вуглецевого
живлення, мінеральні елементи тощо), достатню кількість води.
Прилади для визначення рН живильних середовищ. рН
живильного середовища (співвідношення іонів Н та ОН) має велике
значення для росту і розмноження мікроорганізмів. Для визначення його
застосовують колориметричний метод або спеціальний прилад (рН-
метр).
Визначення рН колориметричним методом. В основу методу
покладено зміну кольору індикатора залежно від наявності у розчині Н+-
та ОН-іонів. Іони Н+ зумовлюють кислу, ОН- — лужну реакцію.
Нейтральна реакція (рН 7,2) свідчить про те, що кількість Н+- і ОН-іонів
однакова.
Як індикатори використовують мета-нітрофенол, пара-нітрофенол,
гамма-нітрофенол та альфанітрофенол.
Кислотність визначають за допомогою приладів – макро- та мікро-
Міхаеліса, обладнаних компаратором Уольполя, набором згаданих вище
індикаторів та шкали стандартів рН.
Методику визначення рН згаданим методом викладено у
відповідних інструкціях.
рН-метри досить широко використовують у лабораторіях для
визначення рН розчинів та живильних середовищ. Промисловість
випускає кілька моделей цих приладів. Найбільш поширені рН-метри
типу ЛПУ-01.
У сучасних приладах для визначення рН використовується
електродна система із скляним електродом, електрорушійна сила (ЕРС)
якого, залежить від активності іонів водню у розчині.
Скляний електрод – це трубка з напаяною на конус порожньою
кулькою з літієвого скла. Якщо електрод занурити у розчин, між

79
поверхнею кульки і розчином відбувається обмін іонами, в результаті
чого іони літію у поверхневих шарах скла замінюються на іони водню, і
скляний електрод набуває властивостей водневого електроду.
Між поверхнею скла і досліджуваним розчином виникає різниця
потенціалів Ех, величина якої визначається активністю водню у розчині.
Для того, щоб створити електричний ланцюг при визначенні рН,
використовують контактні електроди: внутрішній контактний, що
забезпечує електричний контакт з розчином, яким наповнено внутрішню
частину скляного електроду, та зовнішній контактний (допоміжний),
який забезпечує електричний контакт з досліджуваним розчином.
Щоб захистити від дії високої температури (при визначенні рН
гарячих розчинів), допоміжний електрод залишають поза досліджуваним
розчином і з'єднують його з трубкою, наповненою насиченим розчином
хлориду калію. Закінчується трубка пористою перетинкою. Розчин
хлориду калію постійно просочується крізь пористу перетинку, чим
запобігає проникненню з досліджуваного розчину у систему електроду
побічних іонів, які б могли змінити величину ЕРС електроду. ЕРС
електродної системи залежить від рН розчину.
Вимірюючи ЕРС електродної системи за допомогою електронного
мікровольтметра, шкала якого градуйована в одиницях рН, визначають
рН досліджуваного розчину.

Методичні вказівки. Викладач розповідає про суть приготування

живильних середовищ, демонструє МПА, МПБ, МПЖ, інгредієнти для
приготування простих живильних середовищ, живильні середовища
промислового приготування, знайомить з обладнанням, що
використовується під час приготування живильних середовищ,
орієнтує відносно аспектів з позаурочного знайомства інших
матеріалів відповідної теми.

Самостійна робота студентів. Студенти готують МПБ, МПА

та МПЖ (представлені на таблицях, слайдах, схемах).

80
 Питання щодо самоконтролю

1. Для чого потрібні живильні середовища?

2. Класифікація живильних середовищ.
3. Методика приготування простих живильних середовищ.
4. Середовище Ендо, призначення та методика приготування?
5. Яким чином визначається та регулюється рН середовищ?.

Лабораторне заняття №2.

ТЕХНІКА ПОСІВУ МІКРООРГАНІЗМІВ НА ЖИВИЛЬНІ

СЕРЕДОВИЩА, ВИДІЛЕННЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР

Мета: навчити студентів техніці посіву на живильні

середовища, методикам виділення чистої культури.
Матеріали та обладнання. Живильні середовища у пробірках
та чашках Петрі (МПБ, МПА, МПЖ ), суспензія мікроорганізмів-
сапрофітів (у пробірках), змішана мікробна культура (стафілокок-
сапрофіт та непатогенна кишкова паличка), бактеріологічні петлі,
пастерівські піпетки, скліні шпателі, спиртівки.

У мікробіології відпрацьовано систему маніпуляцій

(мікробіологічна техніка, бактеріологічна техніка), яка дає змогу
здійснювати посіви, пересіви мікроорганізмів без їх «забруднення»,
запобігає контамінації ними зовнішнього середовища.
Техніка посіву буває різною, проте незалежно від її модифікації
слід завжди дотримувати загальних правил. Перш за все посів роблять
біля факела горілки (спиртівки), попередньо ретельно стерилізуючи
бактеріологічну петлю, обробляючи краї пробірок (під час їх
відкривання та закривання), пробки. Пробірки утримують майже
горизонтально, не змочуючи при цьому пробок. Бактеріологічні чашки
відкривають трохи, лише для здійснення посіву.
Посів патологічного матеріалу або мікробної культури здійснюють
за допомогою бактеріологічної (мікробіологічна) петлі, голки чи

81
пастерівської піпетки. Інколи використовують шпателі (рис. 1.30).
Бактеріологічну петлю, голку
стерилізують фламбуванням під
час посіву, пастерівську піпетку
та шпатель – завчасно в
автоклаві.
Посів мікроорганізмів
на тверде живильне
середовище. Посів на косий
агар у пробірці. Пробірки з

Рис. 1.30. Інструменти для посіву посівним матеріалом та

мікроорганізмів: а- бактеріологічна скошеним агаром беруть у ліву
петля; б-бактеріологічна голка; в-шпатель;
г-пастерівська піпетка руку так, щоб скошена поверхня
агару була зверху. Тримаючи у
правій руці бактеріологічну петлю, ретельно її фламбують. Потім
мізинцем правої руки відкривають пробірку (пробку утримують
мізинцем), знезаражують полум'ям її краї, простерилізованою петлею
беруть посівний матеріал й переносять у пробірку із стерильним
живильним середовищем. Матеріал, легенько рухаючи петлею, вносять
у конденсаційну рідину, суспензують його й плавним рухом (краще
зигзагоподібним) висівають по всій поверхні. Петлю виймають, краї
пробірки знезаражують полум'ям горілки і закривають пробкою. Петлю
стерилізують фламбуванням.
Посів на МПА у бактеріологічній чашці. Бактеріологічну чашку
кладуть біля горілки, фіксують лівою рукою. Покришку піднімають
великим, середнім та вказівним пальцями настільки, щоб у щілину
можна було ввести бактеріологічну петлю, пастерівську піпетку, а при
потребі і шпатель.

82
 Посів у рідке живильне середовище. Маніпулюють в основному
таким же чином, як і при посіві матеріалу на скошений МПА. Якщо
сіють бактеріологічною петлею, то матеріал злегка занурюють у
живильне середовище і розтирають на стінці пробірки. При
використанні пастерівської піпетки кінець її, занурюють у живильне
середовище, а матеріал видувають. Використані пастерівські піпетки
знезаражують у дезрозчині.
Посів уколом у стовпчик живильного середовища. Пробірку з
живильним середовищем беруть у ліву руку, мізинцем правої руки
знімають пробку і перевертають пробірку догори. Петлю або голку з
досліджуваним матеріалом по центру живильного середовища
занурюють до самого дна пробірки й потім виймають. Пробірку
закривають, петлю стерилізують Засіяні пробірки та чашки підписують
(№ експертизи, дата) і поміщають у термостат для вирощування.
Особливості культивування анаеробів. Анаеробні
мікроорганізми вирощують на спеціальних живильних середовищах або
створюють для них анаеробні умови іншим способом.
Вирощування анаеробів на середовищі Кітт-Тароцці. Середовище
Кітт-Тароцці — м'ясо-пептонний печінковий бульйон (див. додаток).
Перед посівом середовище регенерують. Для цього пробірки з ним
кип'ятять у водяній бані, потім швидко охолоджують під струменем
холодної води.
При кип'ятінні зв'язаний з середовищем кисень виділяється, а
вазелінове масло, яке знаходиться на його поверхні, запобігає
проникненню кисню в середовище.
Посів здійснюють бактеріологічною петлею або пастерівською
піпеткою. Матеріал вносять через шар масла у бульйон так, щоб не
допустити проникнення в нього повітря.

83
 Методи створення анаеробних умов. Анаеробіоз створюють
фізичним, хімічним та біологічним методами.
Фізичний метод. За допомогою вакуумного насоса відкачують
повітря з анаеростата чи спеціального ексикатора.
Хімічний метод. На дно ексикатора (звичайний, у покришці немає
отвору) ставлять бактеріологічну чашку з хімічними речовинами, які,
взаємодіючи між собою, поглинають кисень (наприклад, 10 %-й розчин
пірогалолу і їдкий натр або суміш гідросульфіту натрію та вуглекислої
соди). Пробірки або бактеріологічні чашки, засіяні анаеробами,
поміщають на стандартну фарфорову підставку і щільно закривають
покришкою, краї якої попередньо обробляють вазеліновим маслом.
Після цього ексикатор ставлять у термостат.
Біологічний метод. Беруть бактеріологічну чашку з твердим
живильним середовищем. Дотримуючи умов стерильності, по діаметру
вирізають і видаляють вузеньку смужку живильного середовища. Таким
чином одержують дві, ізольовані одна від іншої, частини середовища. На
поверхню однієї висівають анаероби, другої – аероби. Чашку
накривають покришкою. Стерильною ватою закривають щілину й
заклеюють пластирем або запарафінованою смужкою паперу. Після
цього чашки ставлять у термостат. Спочатку ростуть аероби. Вони
використовують кисень і створюють необхідні умови для росту
анаеробів. Пробірки ставлять у штативи, бактеріологічні чашки кладуть
на полиці термостата кришкою донизу.

Методика отримання (виділення) чистої культури

Вирощені на живильних середовищах мікроорганізми називають
мікробною культурою. Вона може бути чистою, якщо ростуть
мікроорганізми одного виду, і змішаною, якщо ростуть два і більше
видів.

84
 Матеріали, які надсилають у лабораторію для бактеріологічного
досліпження, досить часто містять кілька видів мікроорганізмів. Для
того, щоб їх вивчити (перш за все з метою визначення виду), спочатку
необхідно одержати чисту культуру.
Є кілька методів одержання чистої культури. Найбільш поширені
метод розведень, Дригальського та біологічний.
Метод розведень запропоновано Пастером, пізніше –
модифіковано. Беруть 7-10 пробірок із стерильним ізотонічним
розчином хлориду натрію або МПБ (по 9-10 мл). У першу пробірку
вносять невелику кількість досліджуваного матеріалу (0,1 мл),
перемішують. Таку ж кількість вмісту першої пробірки переносять у
другу, а після перемішування – у третю, четверту і т. д.
Із збільшенням кількості розведень концентрація мікроорганізмів
знижується, що забезпечує ріст ізольованих колоній. Для цього з кількох
пробірок (як правило, останніх) роблять посів на тверде живильне
середовище у бактеріологічних чашках. Після інкубації у термостаті
утворені колонії вивчають і роблять відсіви з ізольованих колоній на
стерильне живильне середовище. На останньому мікроорганізми ростуть
у вигляді чистої культури.
Суть методу Дригальського – одержання на першому етапі
ізольованих колоній. Беруть кілька (3-5) бактеріологічних чашок з МПА
або іншим середовищем. У першу вносять краплю досліджуваного
матеріалу. Стерильним шпателем рівномірно розподіляють його по
поверхні середовища, а потім, не фламбуючи, шпатель відразу
переносять у другу чашку, і матеріал, що залишився на шпателі,
розподіляють по поверхні середовища. Це ж саме роблять з третьою,
четвертою і п'ятою чашками. Після цього чашки ставлять у термостат і,
якщо виростуть ізольовані колонії, з них роблять відсів на стерильне
живильне середовище.

85
 Існують інші методи отримання чистих культур. Вони основані на
такому ж принципі - одержання ізольованих колоній: посів штрихами,
посів по секторах у бактеріологічні чашки.
Біологічний метод виділення чистої культури застосовують для
одержання чистої культури патогенних видів. Досліджуваний матеріал
вводять сприйнятливій до певного захворювання тварині.
Мікроорганізми, швидко розмножуючись, викликають захворювання й
смерть тварини. Із крові або внутрішніх органів, інколи — мозку
роблять посіви і, як правило, одержують чисту культуру.
Бацили (клостридії) від бактерій, що не утворюють спор,
відділяють шляхом одноразового прогрівання матеріалу у водяній бані
при температурі 80 °С протягом 30-40 хв. Вегетативні форми
мікроорганізмів гинуть, а спори залишаються.
Одержання чистої культури рухливих видів. Методика розроблена
Шукевичем (посів по Шукевичу). Посів досліджуваного матеріалу
здійснюють лише у конденсаційну рідину скошеного МПА у пробірці.
Пробірки ставлять у термостат. Рухливі бактерії порівняно з
нерухливими на поверхні агару ростуть швидше. З верхнього краю
культури, яка виросла, легеньким доторканням бактеріологічною петлею
беруть мікробну масу й засівають її на стерильне живильне середовище.

Методичні вказівки. Викладач знайомить студентів з

обладнанням, що застосовується під час культивування
мікроорганізмів, пояснює методики виділення чистих культур ,
демонструє техніку посіву на різні середовища.

Самостійна робота студентів. Студенти здійснюють посіви на

рідкі, напіврідкі та щільні живильні середовища, вивчають методику
посіву за Дригальським.

Питання для самоконтролю.

1. Принципова схема конструкції термостата.
2. Принцип конструкції рН-метрів.

86
 3. Основні живильні середовища. Методика приготування МПБ,
МПА та МПЖ.
4. Загальні вимоги до живильних середовищ«
5. Техніка посіву мікроорганізмів на рідкі й тверді живильні
середовища.
6. Характеристика ознак росту мікроорганізмів на живильних
середовищах.
7. Поняття про чисту культуру. Методи одержання чистих
культур мікроорганізмів.

Лабораторне заняття №3

КУЛЬТУРАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ

Мета заняття: Ознайомити студентів з методикою описання

культуральних властивостей у різних мікроорганізмів.
Матеріали та обладнання. Мікробні культури, вирощені на
рідких та щільних живильних середовищах, мікроскоп стереоскопічний,
лупи.

Під культуральними властивостями мікроорганізмів розуміють

характеристику їх росту на живильних середовищах.
Ознаки росту бактерій часто використовують у процесі їх
ідентифікації. У зв'язку з тим, що ознаки росту мікроорганізмів з часом
можуть змінюватись, прийнято характеризувати їх у 16-18 та 24-28-
годинних культурах.
Ріст мікроорганізмів на рідких живильних середовищах.
Основні ознаки мікробної культури у бульйоні – це помутніння
середовища, поверхневий ріст та осад.
Ступінь помутніння може бути різним: інтенсивним, помірним,
слабким, у вигляді опалесценції. Деякі види бактерій помутніння не
викликають.
Поверхневий ріст буває у вигляді плівки і кільця при стінці (осад).
Розрізняють тоненьку, грубу, сітчасту, білу, сіру, жовтувату, складчасту,
пухнасту, крихку, слизьку плівки.

87
 Осад може бути значним, незначним, зернистим, пилоподібним, у
вигляді шматочків вати, пластівців, за кольором — сіруватим, білим,
жовтим, зеленуватим. При струшуванні він може набувати вигляду
рівномірного помутніння або утворює пластівці (маленькі, великі),
крихти. Слизоподібний осад піднімається угору у вигляді «косички».
У різних видів бактерій ознаки росту можуть бути неоднаковими.

Ріст мікроорганізмів на твердих живильних середовищах

(МПА). На твердих живильних середовищах мікроорганізми
утворюють колонії. Останні у
бактерій різних видів різняться між
собою (рис. 1.31, 1.32).
Вивчають їх неозброєним
оком, а також за допомогою лупи
чи під мікроскопом (об'єктив 8х).
Спочатку відмічають
характер росту. Він може бути
пишним, помірним та бідним.
Потім вивчають окремі
Рис. 1.31. Колонії колонії. При цьому звертають
мікроорганізмів на МПА
увагу на:
▪ колір (сірувато-білий, білий, оранжевий, голубий, золотистий,
зелений, червоний та ін.; зустрічаються також безбарвні колонії);▪
консистенцію (тверда, крихка, слизувата, тістоподібна, масляниста);
▪ розмір колоній. Вони бувають середніми (2-4 мм), дрібними (1-2
мм), великими (діаметр перебільшує 4 мм) і мізерними (колонії-росинки
діаметром менше 1 мм);
▪ форму (округла, овальна, зіркоподібна, коренеподібна); краї (рівні,
хвилясті, зубчасті, кучероподібні) ;

88
Рис. 1. 32. Характеристика колоній мікроорганізмів
Форма: 1 — округла; 2 — округла з фестончастим краем; 3 — округла з
валиком; 4, 5 — ризоїдна; 6 — з ризоїдним краем; 7 — амебоподібна;
8 — ниткоподібна; 9 — складчаста; 10 — неправильна;
11 — концентрична; 12 — складна.
Профиль: 1 — зігнугий; 2 — кратероподібний; 3 — горбкуватий; 4 —
врослий у субстрат; 5 — плескатий; 6 — опуклий; 7 — краплеподібний; 8
— конусоподібний.
Край: 1 — гладенький; 2 — хвилястий; 3 — зубчастий; 4 — лопатевий; 5
— неправильний; 6 — війчастий; 7 — нитчастий; 8 — ворсинчастий; 9 —
галузистий.
Структура: 1 — однорідна; 2 — дрібнозерниста; 3 — крупнозерниста; 4
— струминчаста; 5 — волокниста

89
 ▪ поверхню (гладенька, блискуча, горбиста, борошниста,
зморшкувата, складчаста);
▪ рельєф (профіль - плоский, опуклий, кратероподібний, фігурний;
▪ прозорість (прозорі, непрозорі, каламутні, флуоресціюючі);
▪ структуру (однорідна, волокниста, плівчаста, зерниста).Колонії,
що мають рівні краї та гладку поверхню, відносять до- S-форми, а
колонії з нерівними краями і шорсткою поверхнею — до R-форми.

Характеристика росту мікроорганізмів на напіврідкому м'ясо-

пептонному агарі та МПЖ. При посіві методом уколу більшість
мікроорганізмів утворюють білуватий стержень. Рухливі зумовлюють
помутніння середовища різної інтенсивності у вигляді хмаринок. Аероби
ростуть ближче до поверхні середовища, анаероби — на дні,
факультативні анаероби — по всій товщі стовпчика. Мікроорганізми, які
мають протеолітичні ферменти, розріджують желатину (рис. 1.33).
Інтенсивність та форми розрідження можуть бути різними, що залежить
від виду мікроорганізмів й інших факторів.

Рис. 1.33. Варіанти розрідження желатини

Методичні вказівки. Викладач виясняє ступінь засвоєння

теоретичного матеріалу з приводу умов та фізіологічних потреб для

90
росту та розмноження різних мікроорганізмів, демонструє приклади
описування мікробних культур на МПБ, МПА, МПЖ, орієнтує відносно
позакласних завдань .
Самостійна робота студентів. Студенти враховують та
описують кільтуральні властивості різних видів мікроорганізмів,
вирощениж Х на рідких та щільних живильних середовищаїх.

Питання для самоконтролю

1. Принципова схема конструкції термостата.
2. Принцип конструкції рН-метрів.
3. Основні живильні середовища. Методика приготування МПБ,
МПА та МПЖ.
4. Загальні вимоги до живильних середовищ.
5. Техніка посіву мікроорганізмів на рідкі й тверді живильні
середовища.
6. Характеристика ознак росту мікроорганізмів на живильних
середовищах.
7. Поняття про чисту культуру. Методи одержання чистих
культур мікроорганізмів.

Лабораторне заняття № 4

ВИВЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ

МІКРООРГАНІЗМІВ

Мета: ознайомити студентів з методиками визначення

ферментативних властивостей у мікроорганізмів.
Обладнання та реактиви. Мікроскопи, набори середовищ та
реактивів для визначення цукролітичних, протеолітичних та
редукуючих властивостей мікроргінізмів. Мікробні культури (кишкової
палички, сальмонели та ін.), бактеріологічні петлі, пастерівські
піпетки, спиртівки (газові горілки)

Мікроби певного виду продукують ферменти, набір яких в

оптимальних умовах вирощування стабільний. Останнє і дає змогу
використати результати вивчення ферментативних (біохімічних)
властивостей мікроорганізмів з метою визначення їх видової належності.

91
 Біохімічна активність мікроорганізмів різноманітна. Ферменти
беруть участь в усіх реакціях, що забезпечують існування та
розмноження мікроорганізмів: живлення, дихання, рух тощо.
У мікробіологічних лабораторіях визначають цукролітичні,
протеолітичні та редукуючі властивості мікроорганізмів.
Визначення цукролітичних властивостей. Цукролітичні
властивості — це здатність мікроорганізмів ферментувати цукри
(вуглеводи та багатоатомні спирти). їх визначають за допомогою
спеціальних середовищ, зокрема середовища Гіса. Останнє готують на
основі лептонної води, цукру (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза,
маніт, дульцит, сорбіт та ін.) й індикатора Андреде.
Набір середовищ з вуглеводами разом з деякими середовищами,
призначений для вивчення протеолітичних та редукуючих властивостей,
називають строкатим рядом.
Середовище Гіса буває рідким та напівтвердим. У останньому
випадку воно містить 0,25-0,30 % агар-агару.
Для визначення цукролітичних властивостей бульйонну чи
агарову культуру досліджуваного мікроорганізму висівають на
середовище Гіса з різними цукрами. Результати враховують після 18-24-
годинного інкубування в умовах термостата. Якщо мікроорганізм не
ферментує цукру, який входить до складу середовища Гіса, то останнє
не змінює свого кольору. Якщо колір середовища змінюється (у
червоний при індикаторі Андреде), це означає, що цукор розкладається з
утворенням кислоти. Якщо при цьому утворюється й газ, його
спостерігають у поплавку (витісняє середовище) або у вигляді
бульбашок у товщі напівтвердого середовища.
З метою визначення цукролітичних властивостей мікроорганізмів
інколи застосовують тверді середовища. Наприклад, агар Ендо,
Плоскірєва, Левіна та ін.

92
 Останнім часом у практику лабораторій впроваджено систему
індикаторного паперу (СІП). Це – диски чи смужки хроматографічного
паперу, просочені певним субстратом (глюкоза, манніт тощо) та
відповідним індикатором. СІП рекомендують використовувати для
диференціації мікроорганізмів сімейства ентеробактерій.
Визначення ферментативних властивостей бактерій щодо
вуглеводів та багатоатомних спиртів. У пробірці з 0,3 мл стерильного
0,85 %-го розчину натрію хлориду (рН 7,3+0) суспензують повну петлю
добової агарової культури й занурюють диск, просочений відповідним
вуглеводом чи багатоатомним спиртом та індикатором. Позитивний
результат характеризується тим, що вміст пробірки набуває червоного
кольору.
Для визначення газоутворення у пробірку кладуть маленькі
шматочки стерильної гігроскопічної вати і ставлять у термостат на 5-18
год. Газ у вигляді маленьких кульок осідає на шматочку вати.
Визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів.
Протеолітичними властивостями вважають здатність мікроорганізмів
ферментувати білки. Для їх визначення досліджувану культуру
висівають на МПЖ, молоко. Ступінь протеолізу білка визначають за
наявністю індолу, сірководню та ін.
Посів на МПЖ здійснюють уколом за допомогою бактеріологічної
голки. Інкубують при температурі 20-22 °С або у термостаті, що
залежить від здатності досліджуваного мікроорганізму розмножуватись
при кімнатній температурі. Якщо інкубацію здійснювали у термостаті
(38 °С), перед оцінкою результату пробірки охолоджують під струменем
води.
Про наявність протеолітичного ферменту свідчить розрідження
желатини. Воно може відрізнятись як за інтенсивністю, так і за формою,
що залежить, перш за все, від виду мікроорганізму.

93
 При посіві на молоко протеоліз характеризується розпушуванням
згустка казеїну, молоко стає прозорим.
Розщеплення білків частіше супроводжується виділенням індолу,
сірководню, деяких інших газів, наявність яких свідчить про
протеолітичну активність мікробних культур.
Є кілька методів визначення індолу. Найчастіше застосовують
метод індикаторного паперу (МІП).
Фільтрувальний папір просочують гарячим насиченим водним 12
%-ним розчином щавлевої кислоти, висушують на повітрі і нарізають
смужками (10X0,5 см). Зберігають у скляних банках з притертими
пробками. Щоб виявити наявність індолу, досліджувану культуру
висівають на МПБ у пробірку, вставляють індикаторний папір так, щоб
нижній його кінець не доторкався до поверхні середовища. Верхній
кінець паперу закріплюють ватною пробкою. Інкубують 24-72 год в
умовах термостата. Якщо нижній край паперу набуває рожевого
кольору, це свідчить про те, що протеоліз супроводжується утворенням
індолу.
Інколи вміст індолу визначають за допомогою реактиву Ерліха
(парадиметиламідобензальдегіди – 1г, спирт етиловий 96 %-й – 100 мл,
соляна кислота кваліфікації «х.ч.» - 20 мл). Досліджуваний
мікроорганізм висівають на МПБ й інкубують протягом 48-72 год. Потім
вносять (до 5 мл бульйонної культури) 2 мл ефіру. Вміст змішують
струшуванням пробірки й відстоюють. Коли ефір утворить на поверхні
суцільний шар, під нього пастерівською піпеткою вносять 0,5-1 мл
реактиву Ерліха. При наявності індолу на межі між -ефіром та
бульйонною культурою протягом 3—5 хв утвориться рожеве або
червоне кільце.
Визначення сірководню. Існує метод індикаторного паперу.
Різниця полягає у тому, що його просочують не щавлевою кислотою, а

94
10 %-м розчином оцтовокислого свинцю. При наявності сірководню
нижній кінець паперу чорніє (утворюється PbS).
Наявність сірководню можна визначити також за допомогою
спеціального середовища такого складу: до стерильного 1,7-2 %-го МПА
додають 0,2 % сірчанокислого заліза, 0,3 гіпосульфіту натрію, 1 г
глюкози, 12 мл 0,3 %-го водного розчину фенолроту. Середовище
розливають у стерильні пробірки (по 5-6 мл), стерилізують проточною
парою 20 хв. Перед використанням його розплавляють і у пробірках
готують косяки. Висівають спочатку на поверхню агару, потім – уколом
у нижню частину стовпчика. При наявності сірководню середовище
червоніє, а нижня його частина чорніє.
Визначення редукуючих властивостей. Методи основані на
зміні кольору органічних фарб (малахітовий зелений, метиленовий
синій, нейтральний червоний тощо) під дією мікробного ферменту
редуктази. Фарби вносять у живильне середовище.
Середовище Омелянського. До 100 мл МПА (рН 7,4-7,6) додають
10 крапель 10 %-го розчину метиленового синього. Досліджувану
культуру висівають. Інкубують у термостаті протягом 24 год. При рості
мікроорганізмів, які утворюють редуктазу, середовище знебарвлюється.
Молоко з метиленовим синім. До 100 мл знежиреного молока (рН
7,1) додають 2 мл 1 %-го водного розчину метиленового синього.
Розливають (по 5 мл) у пробірки й стерилізують проточною парою три
дні підряд по ЗО хв. Середовище має голубий колір. Досліджуваний
мікроорганізм висівають й інкубують у термостаті протягом 24 год. При
наявності редуктази молоко знебарвлюється.
Визначення каталази. Є кілька методів, основаних на застосуванні
перекису водню (Н2О2).

95
 1. Культуру досліджуваного мікроорганізму вирощують на МПБ.
До 1 мл добової культури додають 1 мл 10 %-го розчину перекису
водню. При наявності каталази утворюються пухирці газу.
2. У краплю 3-10 %-го розчину каталази на предметному склі
вносять петлю бактеріальної агарової культури досліджуваного
мікроорганізму. Утворення газових пухирців свідчить про наявність
ферменту каталази.
Якщо на поверхню агарової культури нанести тоненький шар 1.%-
го розчину перекису водню, по утворенню пухирців можна також
визначити наявність каталази.
Визначення гемолітичних властивостей. Здатність
мікроорганізмів руйнувати еритроцити крові називають гемолітичною
активністю. Щоб визначити її, необхідно мікроорганізм посіяти на
живильне середовище, яке містить еритроцити крові (наприклад,
кров'яний агар).
Навколо колоній мікроорганізмів з гемолітичними властивостями
утворюється прозора (β-гемоліз) або жовто-зелена (а-гемоліз) зона.
При наявності гемолізинів у висіяних бактерій рідке живильне
середовище (МПБ з кров'ю) після інкубації робиться прозорим.

Методичні вказівки. Викладач виясняє ступінь розуміння

студентами ферментативних властивостей у мікроорганізмів,
демонструє набори середовищ та реактивів (при можливості і
сучасних , виробництва відповідних фірм), результати визначення
ферментативних та гемолітичних властивостей, дає завдання щодо
позаурочного оволодіння окремими питаннями з теми.

Самостійна робота студентів. Студенти здійснюють посів на

«строкатий ряд» для вивчення сахар олітичних властивостй ,
засівають на молоко та МПЖ для визначення протеолітичних
властивостей, визначають здатність індукувати утворення індолу,
сірководню.

96
 Питання для самоконтролю.

1. Які властивості мікроорганізмів називають біохімічними?

2. Методика визначення цукролітичних властивостей
мікроорганізмів.
3. Визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів.
4. Принципи визначення редуктазноі активності мікроорганізмів.

Тема 8. ВИЗНАЧЕННЯ ВИДУ МІКРООРГАНІЗМІВ

Мета: ознайомити студентів з методикою визначення виду

(ідентифікації) мікроорганізмів.
Матеріальне забезпечення заняття: Методичні вказівки щодо
визначення виду мікроорганізмів та відповідні посібники (Визначник
бактерій Берджі та ін.). Попередньо складені завдання ( умовні
результати досліджень різноманітних властивостей мікроорганізму,
необхідних для їх ідентифікації).

Важливим для мікробіолога є питання видової належності об'єкта

дослідження. Так, щоб поставити бактеріологічний діагноз інфекційного
захворювання, слід ідентифікувати збудника.
Сучасна мікробіологія має достатній арсенал методів, щоб уже
протягом кількох годин розпізнати значну кількість збудників
інфекційних захворювань тварин і людини (експрес-методи діагностики:
РІФ, ПЛР та ін). У той же час у нинішній ситуації ідентифікацію
мікроорганізмів здійснюють переважно шляхом детального вивчення
фенотипових його властивостей, зокрема: морфології, рухливості,
ферментативних, антигенних та ін. З метою визначення
мікроорганізмами були запропоновані ряд посібників –
визначників(Ціон, 1948, Красильников, 1949, Bergey, 1923, 1936, 1974,
1984) Нині загальноприйнятим вважається останній. Це послідовно
доповнений, змінений визначник американського мікробіолога Bergey,
перше видання якого вийшло у 1923 р.

97
 Дев’яте видання (1984 р.) – це результат праці понад 200
спеціалістів-мікробіологів з різних країн світу, викладене у 4-х томах
«Bergeys Manual of systematic Bacteriology» та коротке його видання
«Bergeys Manual of deternative Bacteriology». Останнє перекладено на
російську мову та видане масовим тиражем видавництвом «Мир» у
1997 р. (2 томи). Визначник Бергі призначений для ідентифікації
бактерій за фенотиповими ознаками і містить концентровані дані щодо
видів бактерій, переважно у формі таблиць визначення. Визначник Бергі
містить лише незначну найбільш актуальну для практики частину
циркулюючих у природі мікроорганізмів. Визначник не побудований за
філогенетичним принципом класифікації бактерій, яка поки-що
неможлива. Він слугує лише для ідентифікації бактерій.
Як користуватись визначником? Перш за все, слід уважно
ознайомитись з Передумовою, щоб збагнути суть і принцип, які автори
видання взяли за основу при складанні визначника. Потім у главі 1
детально ознайомитись з методикою використання визначника.
Звернути увагу на послідовність дій (6 етапів) мікробіолога, який
збирається визначити вид виділеного мікроорганізму.
На першому етапі пропонується ознайомитись з схемами
ідентифікації бактерій (гл.2), на 2-му етапі визначитись мікроорганізм
належить до прокаріот чи еукаріот (гл.3), на третьому – визначається до
якої із 4-х запропонованих категорій належить мікроорганізм (1-
грамнегативні еубактерії, що мають клітинну стінку, 2-га –
грампозитивні еубактерії, що мають клітинну стінку, 3-тя – еубактерій,
що не мають клітинної стінки та 4-та - архебактерії. (необхідні для цього
ознаки дослідник знайде у гл.4).
На 4-му етапі досліднику слід звернутись до гл 5 з тим, щоб
уточнити до якої групи належить мікроорганізм, що ідентифікується.
На 5-му етапі визначається родова належність, а на 6-му - вид бактерії.

98
Визначник містить велику кількість таблиць з диференційними
ознаками, що робить його зручним під час ідентифікації мікроорганізму.
У зв’язку з сучасними досягненнями молекулярної генетики
з’явилась змога ідентифікувати мікроорганізми без громіздкого
вивчення їх фенотипових ознак, а шляхом визначення специфічних для
певного виду нуклеотидних послідовностей у їх геномі, зокрема шляхом
визначення нуклеотидних послідовностей 16 S RНК. Користуючись
останнім підходом вдається достовірно визначати родову приналежність
мікроорганізму. При визначенні їх виду прийнято додатково визначати
гомологію ДНК, використовуючи для цього типові штами.

Методичні вказівки. Викладач з’ясовує обізнаність студентів

щодо класифікації живих істот, мікроорганізмів, характеризує окремі
положення відносно значимості запропонованих раніше та сучасних
визначників мікроорганізмів, детальніше характеризує визначник
Берджі (структуру, зміст, принцип користування). За допомогою
слайду (таблиці) пояснює послідовність визначення виду.
Бажано, щоб студенти вже мали певні дані і були знайомі з
видом (наприклад E.coli, S. еpidermicus чи ін.) і разом з викладачем
«визначили» його за допомогою Визначника бактерій Берджі. Потім
студенти отримують умовні дані щодо визначення фенотипових ознак
у бактерій (завдання завчасно готує викладач) та самостійно
визначають вид.

Питання для самоконтролю

1. Які існують визначники мікроорганізмів? Назвати.

2. Структура визначника бактерій Берджі та принципи
ідентифікації мікроорганізмів за його допомогою.

99
 Тема 9. ВПЛИВ БІОЛОГІЧНИХ ФАКТОРІВ НА БАКТЕРІЇ

БАКТЕРІОФАГИ

Мета Ознайомити студентів з біологічними факторами що

впливають на мікроорганізми – бактеріофагами, антибіотичними
речовинами.
Обладнання і реактиви. Бактеріологічні чашки з МПА, шпателі,
пастерівські піпетки, набір дисків з різними антибіотиками, суспензія
бактеріофагу (коліфаг чи ін.).

Бактеріофаги (фаги) — це віруси, що паразитують у бактеріях,

зумовлюють їх лізис, який називають бактеріофагією. Форма фагів
переважно булавоподібна. У них розрізнюють гексагональну голівку
діаметром близько 100 нм й хвостовий відросток, який закінчується
особливими шипами, або виростами. В середині голівки знаходиться
велика молекула ДНК й лише у деяких фагів — РНК.
Явище бактеріофагії високоспецифічне, тобто конкретний фаг
здатний зумовити літичну дію відносно певного виду бактерій.
Наприклад, сибірковий фаг паразитує лише в клітинах збудника сибірки
і не може проникнути у клітини будь-якого іншого мікроба.
У природі фаги виявляють скрізь, де є відповідні бактерії, тому
вони є індикатором їх присутності в досліджуваному середовищі. Фаги
використовують у ветеринарії і медицині при лікуванні деяких хвороб
(колібактеріоз, сальмонельоз телят і поросят, пуллороз і тиф курей,
дизентерія, холера, черевний тиф людини).
Враховуючи високу специфічність явища бактеріофагії, фаги
використовують з метою визначення виду мікробних культур,
діагностики ряду інфекційних хвороб, як санітарно-показові об'єкти.
Наприклад, виявлення коліфага у питній воді свідчить про наявність в
ній кишкової палички.

100
 Виділення бактеріофагів. Декілька грамів (чи мілілітрів)
досліджуваного матеріалу вносять у колбу з МПБ або іншим живильним
середовищем й поміщають на 12-24 год у термостат, який регулюють на
оптимальну температуру росту мікроба того виду, проти якого
передбачається виділити фаг. В живильному середовищі інтенсивно
розмножуються бактерії, а в їхніх клітинах – фаги. Суміш фільтрують
через бактеріальні фільтри. Одержаний фільтрат досліджують на
наявність у ньому фага двома методами.
1. У кілька пробірок з МПБ висівають тест-культуру, після чого в
них вносять фільтрат у різних кількостях (0,1; 0,5 та 1,0 мл). В
контрольну пробірку фільтрат не вносять. Посіви поміщають у
термостат і через 6-12-24 год враховують результат досліду. Якщо у
фільтраті знаходиться відповідний фаг, то в пробірках ознаки росту
культури будуть відсутні. В контрольній пробірці спостерігатиметься
помутніння й інші ознаки росту культури.
2. Тест-культуру засівають суцільним газоном на МПА у
бактеріологічній чашці. На край чашки наносять велику краплю
фільтрату й дають змогу їй стекти по поверхні МПА. Після 18-24 –
годинної інкубації у термостаті чашку розглядають проти джерела
світла. При наявності у фільтраті фага утворюється так звана «фагова
доріжка» (за ходом краплі ріст культури відсутній.
Титрування бактеріофагів. 1. Беруть десять пробірок, які містять
по 4,5 мл МПБ. В першу пробірку вносять 0,5 мл досліджуваного
препарату фага. Після ретельного перемішування 0,5 мл суміші
переносять у другу пробірку, з другої — в третю і т. д. При цьому
одержують розведення фагу в концентрації від 1(Н до 10-10 ступеня. В
кожну пробірку вносять молоду тест-культуру мікроба (0,1 мл). Для
одержання контролю дану культуру висівають в середовище без фага.
Пробірки витримують у термостаті протягом 12—18 год. Результат

101
досліду враховують за відсутністю ознак росту бактерій в певній
кількості пробірок, починаючи з першої. Титром фага називають те його
розведення, яке затримує ріст бактеріальної культури. Фаг вважають
активним при титрі не нижче 10-5 ступеня.
2. При використанні щільних живильних середовищ мікробну
тест-культуру змішують з певним розведенням фага. Одержану суміш
дозовано рівномірно наносять шпателем на поверхню підсушеного
МПА. Через 18—24 год після інкубування у термостаті на агарових
газонах утворюються прозорі «стерильні» зони, які одержали назву
негативних колоній фага. Саме в цих місцях відбувається лізис бактерій
за рахунок розмноження фага. Титр останнього визначають
вирахуванням кількості його активних часток в 1 мл за формулою:

Y
x  ,
V  n
де:
X — титр фага, що визначається;
Y—кількість негативних колоній у бактеріологічній чашці;
V — об'єм висіяного фага;
п — ступінь розведення фагопрепарату.

АНТИБІОТИКИ

Антибіотики — це хімічні речовини біологічного походження,

спроможні пригнічувати розвиток мікроорганізмів, іншими словами —
речовини з бактерицидною чи бактеріостатичною активністю.
Продуцентами антибіотиків є мікроорганізми, тварини й рослини,
існують і синтезовані у штучних умовах.
Найбільш детально вивчено антибіотики мікробного походження.
Виділяючись за межі мікробної клітини, вони виконують захисну роль в
умовах антагоністичної взаємодії мікроорганізмів.

102
 Надзвичайно активними продуцентами антибіотиків є окремі види
грибів, актиноміцетів та бактерій. Зокрема, Penicillium notatum (Флемінг,
1929) та Penicillium crusto-sum (Єрмольєва, 1942) продукують пеніцилін,
Actinomуces streptomycini — стрептоміцин, Streptomyces rimosus —
окситетрациклін, Streptomyces fradiae — неоміцин, Streptomyces
aurofacins — біоміцин, Streptomyces noursei — ністатин, Bacillus
polimyxa —поліміксин, Bacillus brevis— граміцидин тощо.
Вітчизняна промисловість виробляє кілька десятків антибіотиків,
які широко застосовують у медицині та ветеринарії. Серед них є
препарати з вузьким (пеніцилін, стрептоміцин) та широким
(тетрацикліни) спектром дії.
Механізм згубної дії різних антибіотиків на мікроорганізми
різноманітний. Так, пеніцилін пригнічує синтез поліпептидів, що
входять до складу стінки мікробної клітини, змінює обмін білків і
нуклеопротеїдів; стрептоміцин порушує проникність клітинної
мембрани, процес транскрипції та ін.
Контроль активності антибіотиків здійснюють шляхом визначення
одиниці дії (ОД) в 1 мл розчину (ОД/мл) або 1 мг препарату (ОД/мг).
Одна одиниця – це мінімальна кількість антибіотика, яка пригнічує ріст
стандартного тест-мікроорганізму у певній кількості живильного
середовища. Для кожного антибіотика підібрано чутливий об'єкт —
«тест-мікроорганізм». Так, тест-мікроорганізмом при визначенні
активності пеніциліну є золотистий стафілокок (штам 209-Р),
левоміцетину – Е. соlі, стрептоміцину та тетрацикліну – В. subtilis.
Одиниця біологічної активності різних антибіотиків неоднакова.
Так, 1 ОД пеніциліну відповідає 0,6 мкг, стрептоміцину – 1, неоміцину
— 3,3 мкг чистої речовини. Кількість антибіотика, еквівалентну 1 ОД,
прийнято за Міжнародну одиницю (1 МО) дії.

103
 Існують біологічний та хімічний методи визначення активності
антибіотиків. Біологічний оснований на визначенні інтенсивності дії
препарату на мікроорганізми. У ветеринарній практиці антибіотики
широко застосовують для лікування інфекційних захворювань.
Чутливість різних штамів до антибіотиків неоднакова.
Зустрічаються чутливі та антибіотикорезистентні штами
мікроорганізмів. Безконтрольне застосування антибіотиків може
призвести до збільшення кількості останніх. Це зумовлює необхідність
вибору найбільш ефективного антибіотика та визначення його
оптимальної концентрації.
Чутливість збудника до антибіотиків визначають методом дифузії
в агар (метод дисків) та методом серійних розведень у рідкому або
щільному живильному середовищі. Більш зручним і поширеним є метод
дифузії в агар (рис. 1.34).
У стерильні бактеріологічні чашки наливають по 15—20 мл
живильного середовища (найчастіше МПА). Після його затвердіння
вносять 1 мл (2 млрд/мл) змиву агарової дво-добової мікробної культури
досліджуваного
мікроорганізму. Обережно
нахиляючи чашку, рідину
рівномірно розподіляють на
її поверхні. Надлишок
відсмоктують піпеткою.
Зона затримки
росту бактерій Після підсушування чашок
з вмістом у термостаті
протягом 15-20 хв на
Рис. 1.34. Диско-дифузійний метод
визначення чутливості бактерій до поверхні агару розкладають
антибіотиків
стандартні, просочені
антибіотиками диски. При цьому користуються стерильним пінцетом.

104
Диски кладуть на відстані 2 см від краю чашки і 1 см — один від одного.
Чашки на 16-18 год ставлять догори дном у термостат і враховують
результат. Для цього за допомогою міліметрового паперу вимірюють
діаметр зон пригнічення росту мікробної культури.

Оцінку чутливості мікроорганізму до антибіотика роблять залежно

від розміру зони пригнічення (табл. 1.2).
Таблиця 1.2.
Оцінка чутливості мікроорганізмів до антибіотиків
Діаметр зони пригнічення, мм Чутливість

До 15 Слабкочутливий
15—24 Чутливий
25 і більше Високочутливий
Зона пригнічення відсутня Нечутливий

Метод серійних розведень. У десять пробірок наливають ло 2 мл

МПБ або бульйону Хотінгера. Антибіотик розводять до концентрації
100 ОД/мл і 2 мл його вносять у першу пробірку. Після ретельного
змішування стерильною піпеткою відбирають 2 мл вмісту першої
пробірки й переносять у другу, потім — у третю і т. д. 2 мл вмісту
останньої пробірки видаляють. Десята пробірка, що не містить
антибіотика, є контролем на ріст мікроорганізму.
Добову культуру досліджуваного мікроорганізму на агарі
змивають фізіологічним розчином, доводять до густини 1 млрд за
стандартом каламутності й потім розводять так, щоб концентрація його
становила 20 тис. мл. По 0,2 мл мікробної суспензії вносять в усі
пробірки ряду, починаючи з контрольної.

105
 Пробірки ставлять у термостат на 18-20 год і враховують
результат. При цьому визначають найменшу дозу антибіотика, яка
зумовлює повну відсутність ознак росту мікроорганізму (вміст пробірки
повністю прозорий) при наявності інтенсивного росту у контрольній
пробірці.
Методичні вказівки Викладач з’ясовує обізнаність студентів
щодо різномаїття факторів, котрі впливають на мікроорганізми,
підкреслює практичне їх значення, знайомить з методиками виділення
бактеріофагів та визначення їх активності (кількості), демонструє
антибіотики та методику визначення «чутливості» до них у
мікроорганізмів.
Самостійна робота студентів. Студенти здійснюють визначення
коліфагу, визначають чутливість до різних антибіотиків у грам
негативного та грам позитивного сапрофіта.

Питання для самоконтролю

1 Визначення і природи бактеріофагів

2 Яку форму і величину мають фаги?
3. Яке явище називають бактеріофагією'
4 Де у природі можна виявити фаги?
5 Як виділяють фаги з досліджуваного матеріалу?
6. Які існують методи титрування фагів?
7. Природа антибіотиків.
8. Продуценти антибіотиків.
9. Методика оцінки активності антибіотиків.
10. З якою метою визначають чутливість мікроорганізмів до
антибіотиків? Методи її визначення.

Тема 10. БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

МАТЕРІАЛІВ У ЛАБОРАТОРІЇ

Бактеріологічний метод є класичним методом дослідження,

спрямованого на виявлення (ідентифікацію) збудника. У більшості
випадків він включає мікроскопію мазків (препаратів), зроблених
безпосередньо з патологічного матеріалу, виділення мікроорганізму та

106
його ідентифікацію. Ідентифікація збудника хвороби може
здійснюватись шляхом вивчення описаних вище властивостей
(морфологічних, культуральних, ферментативних та ін.).
Бактеріологічне дослідження може включати також визначення
вірулентності збудника захворювання на лабораторних тваринах, інколи
використовувати серологічні реакції (визначати антигенний тип (групу),
фактор и патогенності).

Лабораторне заняття № 1
ЛАБОРАТОРНІ ТВАРИНИ ТА МЕТОДИ ЇХ ЗАРАЖЕННЯ

Мета: ознайомитись з лабораторними тваринами, умовами їх

утримання в лабораторії, способами введення досліджуваного
матеріалу (зараження), утриманням дослідних (заражених) тварин ,
спостереженням за ними та розтином трупів і відбором матеріалів для
р ізоляції збудника.
Обладнання, матеріали. Лабораторні тварин, клітки для їх
перенесення( утримання), суспензії мікробних культур (краще імітація у
вигляді стерильної рідини), шприци, ін»акційні голки (одноразові чи
простерилізовані багаторазового користування), набори інструментів
для розтину (скальпелі, ножиці, пінцети), предметні скельця, стерильні
флакони, пробірки, МПБ та МПА (у пробірках)

Основні відомості. У ветеринарній практиці і лабораторних

тварин (морські свинки, білі миші та щури, голуби, кролі, коти та ін.)
заражають з метою: встановлення діагнозу, виділення чистої культури
збудника захворювання, визначення його вірулентності, антигенних
властивостей тощо. Лабораторних тварин широко використовують
також у практиці серологічних досліджень: морських свинок — для
одержання комплементу, кролів — для приготування гемолізину,
одержання гіперімунної сироватки та ін. Тварин утримують у
спеціальних приміщеннях – віваріях, постійно слідкують за тим, щоб

107
годівля і санітарний стан відповідали існуючим нормативам.
Використовують лабораторних тварин з метою виділення патогенного
мікроорганізму, визначення його вірулентності (постановка біопроби).
Вибираючи для експериментального зараження тварину,
орієнтуються, перш за все, на сприйнятливість її до мікроорганізму,
який слід вивчити, доступність, зручність при маніпуляціях. Відбирають
клінічно здорових тварин середньої вгодованості. Перед зараженням їх
зважують і мітять.
Мишей беруть за хвіст, опускають на робочий стіл, тулуб швидко
притискують до столу двома пальцями і, пересовуючи їх вздовж спини,
захоплюють шкіру над головою (рис. 1.35).

Рис. 1.35. Способи зараження мишей:

а — фіксація білої миші перед зараженням;
б — зараження миші в черевну порожнину

Щурів фіксують двома

корнцапгами: одним біля
основи хвоста, другим — за
складку шкіри на потилиці.
Морських свинок фіксують,
обхопивши їх тулуб і кінцівки
Рис. 1.36. Внутрішньошкірне двома руками (рис.1.36).
зараження морської свинки

108
 Кролів можна фіксувати кількома способами: а) лівою рукою
тримати за шкіру спини (в ділянці потилиці), правою — за задні
кінцівки; б) за допомогою спеціального ящика (рис. 1.37); в) за
допомогою рушника чи шматка міцної тканини, якими обгортають
тулуб та кінцівки тварини.

Рис. 1.37. Фіксація кроля: а) лівою рукою утримується за шкіру

спини (в ділянці потилиці), правою — за задні кінцівки;
б) за допомогою спеціального ящика

Кішок фіксують надзвичайно обережно. Плавним рухом правою

рукою тварину міцно беруть за шкіру в ділянці потилиці, а лівою — за
шкіру в ділянці попереку й легенька притискують до столу. Надійним
методом фіксації кішок є «сповивання» їх голови та кінцівок рушником
чи шматком міцної тканини.
Маркірують (мітять) тварин аніліновими фарбами (миші, щури),
ампутацією пальців (мишенята), татуюванням вух (кролі), закріпленням
бирок на вухах (кролі, морські свинки) та кілець на кінцівках (кури,
голуби).

109
 Залежно від конкретного дослідження тварин заражають різними
методами. Матеріал вводять за допомогою шприца. Суспензію мікробної
культури чи одержану з патологічного матеріалу набирають у шприц.
Кінець голки прикривають шматочком вати, змоченим у дезрозчині, й
обережно випускають пухирці повітря.
Місце ін'єкції вистригають, голять або вищипують, шкіру
дезинфікують 70 %-м розчином спирту чи 3 %-м настоєм йоду.
Внутрішньошкірний метод. Голку вводять в товщу шкіри під
гострим кутом до її поверхні Введений матеріал на місці ін'єкції
утворює невелику випуклість епідермісу у вигляді горошини.
Нашкірний метод. Матеріал скляною паличкою наносять на шкіру
(попередньо поголену) чи слизову оболонку й ретельно його втирають.
Інколи перед нанесенням матеріалу здійснюють легку скарифікацію
шкіри тупим кінцем скальпеля.
Підшкірний метод. Голкою проколюють складку шкіри на спині
або біля кореня хвоста і вводять вакцину підшкірно, після чого голку
виймають, прикривши місце ін'єкції шматочком вати, змоченим у
спирті.
Внутрішньом'язовий метод. Матеріал вводять кролям, морським
свинкам, щурам, мишам у товщу м'язів стегна.
Внутрішньочеревний метод. Тварину фіксують головою вниз.
Голку вводять поряд з білою лінією черева на рівні клубів, орієнтуючи її
дорсокаудально.
Інтерцеребральний метод. Ним, як правило, заражають білих
мишей, щурів та кролів. У останніх спочатку здійснюють трепанацію
черепа у ділянці поміж надбрівним кутом й черепним гребенем. На місці
трепанації видаляють шерсть, дезинфікують. Пальцями лівої руки шкіру
злегенька розтягують паралельно черепному гребеню. Спочатку
розсікають її, потім — надкісницю. За допомогою малого трепану

110
проколюють кістку черепа й у зроблений отвір вводять досліджуваний
матеріал. Після цього краї надкісниці з'єднують. Рану прикривають
тампоном і заливають колоїдом.
При зараженні мишей та щурів попередньої трепанації не роблять.
Прокол здійснюють ін'єкційною голкою і вводять матеріал.
Внутрішньовенний метод. Кролям матеріал вводять у крайню
вену вуха (рис.1.38). Для цього пальцями натискують біля кореня вуха,
вена наповнюється кров'ю, після чого під вухо підводять вказівний
палець лівої руки, обережно вводять голку у напрямку потоку крові й
повільно ін'єктують матеріал.

Рис. 1.38. Внутрішньовенний метод зараження:

а) кролю матеріал вводять у крайню вену вуха.;
б) миші - у вену хвоста

Після введення матеріалу до місця уколу прикладають шматочок

вати, змочений у спирті або хлораміні.
Мишам і щурам матеріал вводять дуже тонкими голками у вену
хвоста, птиці — у вену крила.
Внутрішньочеревний метод. Тварину фіксують головою вниз, щоб
кишечник змістився в бік діафрагми. У лівій нижній третині черева
роблять прокол шкіри, утримуючи голку під гострим кутом. Потім

111
шприц переводять у положення, перпендикулярне до стінки черева,
проколюють очеревину і повільно вводять матеріал.
Зараження через травний тракт. Досліджуваний матеріал
змішують з кормом і згодовують піддослідній тварині. Матеріал можна
ввести також за допомогою шприца, по краплях, перорально або за
допомогою еластичного зонда безпосередньо у шлунок (рис. 1.39).

Рис. 1. 39. Зараження через травний

тракт (пероральне зараження):
А – кролика за допомогою еластичного
Б і

За зараженими тваринами ведуть спостереження: відмічають зміни

у їх поведінці, появу клінічних ознак захворювання. Дози матеріалу,
який можна ввести тваринам при різних способах їх зараження, подано в
табл. 1.3.
Таблиця 1.3.
Допустимі дози введення матеріалу при найчастіше вживаних
методах зараження деяких видів лабораторних тварин

Тварини Метод зараження

підшкір- внутрі- внутрі- інтерце- внутрі-
ний шньо- шньо- ребраль- шньо-
м’язовий венний ний черевний
Кролі 2,0-3,0 2,0-3,0 3,0-5,0 0,1-0,3 5,0-8,0

Морські свинки 1,0-2,0 1,0-2,0 0,5-2,0 1,0 1,0-3,0

Білі миші 0,2-0,5 0,25-0,5 0,5-1,0 0,02-0,03 0,5

112
 Методичні вказівки. Викладач визначає ступінь обізнаності
студентів з лабораторними тваринами, (при необхідності доповнює їх
знання поясняючи окремі елементи),демонструє методики фіксації
тварин, основні методи зараження (обо’язково внутрішньовенний
(кроля), внутрішньом»бязевий(голуба), інтраперітонеальний( морської
свинки).
Самостійна робота студентів. Студенти вчаться правильно
фіксувати тварин (кролів, білих мишей, морських свинок, кролів та ін.),
«заражають» кролів (внутрішньовенно), білих мишей (підшкірно),
морських свинок (інтраперитонально).

Питання для самоконтролю

1. Перелічити основні види лабораторних тварин.

2.За яким принципом відбирають лабораторних тварин при
постановці біопроби?
3. 3 якою метою заражають лабораторних тварин?
4. Методи фіксації лабораторних тварин та методики їх
зараження.

Лабораторне заняття №2

ПАТОЛОГІЧНИЙ МАТЕРІАЛ, ПРАВИЛА ВІДБОРУ

ПАТОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ, КОНСЕРВУВАННЯ ТА
ТРАНСПОРТУВАННЯ В ЛАБОРАТОРІЮ; РОЗТИН ТРУПІВ

Мета роботи: ознайомитись з правилами розтину трупів (на

прикладі лабораторних тварин), методикою відбору, консервування та
транспортування патологічних матеріалів у лабораторію.
Матеріали та обладнання: трупи білих мишей, морських свинок
та ін., набори інструментів (скальпель, ножиці, пінцети, пробірки,
флакони, 5%-й розчин фенолу, предметні скельця, пастерівські піпетки,
бактеріологічні петлі, спиртівки, пристосування для фіксації дрібних
тварин, кювети, термос з льодом, 50%-й гліцерин та ін.

113
 Правила розтину трупа тварин. Лабораторних тварин, що
загинули в результаті постановки біологічної проби підлягають розтину.
Розтин трупів тварин роблять для того. щоб з'ясувати
патологоанатомічні ознаки, виділити (реізолювати) збудника.
Трупи розтинають відразу після загибелі тварин, оскільки бактерії
з травного тракту швидко проникають у внутрішні органи й тканини.
Розтин трупів здійснюють на спеціально обладнаному столі. Трупи
дрібних тварин черевом догори приколюють до дошки за витягнуті
кінцівки й разом з дошкою кладуть на емальований піднос. Ділянку
грудей та черева протирають ватним тампоном, змоченим у 5 %-му
розчині карболової кислоти або у 75 %-му етиловому спирті. Волосяний
покрив на цій ділянці спалюють.
Під час розтину трупів дотримують таких загальноприйнятих
правил. Розтин починають з дослідження зовнішніх покривів,
підшкірної клітковини. Спочатку розтинають грудну клітку, оглядають
внутрішні органи, відбирають необхідний матеріал. Потім розтинають
черевну порожнину й роблять те ж саме.
Як правило, розпочинають розтин поздовжнім розрізом шкіри по
білій лінії (від шиї до лобка) з подальшим відшаруванням шкіри по
боках. Розрізають м'язовий шар "черевної стінки. Грудну клітку
розтинають ножицями (спочатку діафрагму, потім ребра з обох боків у
ділянці хрящів), грудну кістку видаляють. При розтині звертають увагу
на наявність інфільтратів, крововиливів, випотів тощо. Після огляду
грудної й черевної порожнини роблять посіви на живильні середовища з
крові серця, лімфатичних вузлів і паренхіматозних органів (селезінка,
печінка, нирки та ін.). З наявних у грудній чи черевній порожнині
ексудатів також роблять посіви на живильні середовища. Сіють
пастерівською піпеткою або бактеріологічною петлею одним із
описаних нижче способів.

114
 1. У стерильної пастерівської піпетки обламують кінчик,
проводять її через полум'я горілки. Капіляром піпетки проколюють
припалену ділянку досліджуваного органу і насмоктують у неї рідину з
тканини, яку висівають на живильне середовище. Використані піпетки
занурюють у дезрозчин.
2. Припалену ділянку органу надрізають стерильним скальпелем, з
глибини надрізу бактеріологічною петлею відбирають матеріал і
висівають на живильне середовище.
Мазки роблять з крові серця, різних ексудатів, а мазки-відбитки —
з усіх паренхіматозних органів та лімфатичних вузлів. Для приготування
мазків-відбитків вирізають з печінки, селезінки, нирок невеликі
шматочки тканини, беруть їх пінцетом і поверхнею з боку розрізу
легенько притискують до скла.
Після закінчення розтину інструменти стерилізують, трупи тварин
і підстилку, а також залишки корму й води знищують.
Правила відбору і консервування патологічного матеріалу, що
доставляється у лабораторію з інших господарств (установ,
громадян) для бактеріологічної діагностики.
Патологічним називають будь-який матеріал, що доставляється
(надсилається) у лабораторію з метою діагностики інфекційної хвороби.
Відбираючи патологічний матеріал для бактеріологічного дослідження,
потрібно дотримувати таких правил:
▪ матеріал повинен бути свіжим;
▪ відбирають матеріал так, щоб не заразити людей і тварин, не
забруднити навколишнє середовище;
▪ відібраний матеріал кладуть у скляний посуд, дотримуючись
правил асептики;
▪ транспортують матеріал обережно, у герметично закритому
посуді, вміщеному в спеціальні ящики та ін.;

115
 ▪ відбирають матеріал з урахуванням тропизму збудника і
тільки від свіжих трупів тварин (не пізніше 2-3 годин після
смерті).
▪ у лабораторію матеріал доставляють у найкоротший строк. У
літній період його консервують холодом (термос з льодом) або 30-40 %-
м водним розчином стерильного гліцерину;
▪невеликі трупи тварин (птиця, поросята) можна доставляти
цілком, помістивши їх у тару, непроникну для рідини (целофановий
мішок, потім у ящик з тирсою);
▪ трубчасту кістку надсилають цілою. її ретельно очищають від
м'язів та сухожиль, загортають у марлю (полотно), змочену у дезрозчині
(5%-й розчин карболової кислоти);
▪ кишечник перед доставкою у лабораторію звільняють від вмісту,
кінці зв'язують. Кладуть його у банку з 30 - 40 %-м водним розчином
гліцерину або насиченим розчином NaCl. Об'єм консервуючої рідини
повинен перевищувати об'єм відібраного матеріалу у 5 -7 разів;
▪ кал для дослідження відбирають у стерильні пробірки або банки,
які закривають пергаментним папером чи целофаном, його можна
надсилати разом з відрізком кишки, попередньо перев'язавши її з обох
кінців. Доставляють кал у лабораторію не пізніше 24 год після взяття;
▪ надсилаючи у лабораторію шкіру, відбирають невеликі її
шматочки (10х10 см) і кладуть у скляний посуд;
▪ кров, гній, слиз, ексудат, сечу, жовч та інші рідини для
бактеріологічного дослідження надсилають у пробірках (флаконах),
запаяних пастерівських піпетках, стерильних пробірках або у флаконах з
щільними гумовими пробками.
Упакований матеріал слід опечатувати. До матеріалу додають
супровідну записку, в якій зазначають назву господарства, вид і вік
тварини, від якої взятий матеріал, дата захворювання і смерті,

116
основні клінічні знаки, перелік матеріалу, що направляється для
дослідження, на збудника якого захворювання слід вести дослідження
та інше.
Матеріал повинен бути доставлений посильним.
В лабораторії матеріал, що надійшов, звільняють від упаковки,
звіряють із супровідною і реєструють у журналі прийому під черговим
порядковим номером експертизи.
В журналі реєстрації матеріалу, що надійшов, записують:
1.Порядковий номер експертизи.
2.Назву господарства, з якого надісланий матеріал.
3. Назву матеріалу і вид тварини, від якої він взятий.
4. Дату надходження матеріалу.
5. Свіжий чи несвіжий отриманий матеріал.
6. Кому і коли повідомлено про результати дослідження.
При виявленні невідповідності між надісланим матеріалом і
записами в супровідній записці лабораторія складає акт, копію якого
надсилає: лікареві, який направив його.
Матеріал, що відібрали при розтині трупів тварин, досліджують за
схемою:
1. Готують мазки і фарбують їх.
2. Проводять посів на щільні живильні середовища і поміщають
у термостат.
3. Через добу вивчають характер росту.
4. Відсівають колонії для отримання чистих культур.
5. Із колоній роблять мазки, фарбують їх і вивчають під
мікроскопом.
6.Культуру вивчають на рухомість і спороутворення.
7.Вивчають біохімічні й антигенні властивості виділеної культури.

117
 Всі дані, отримані при дослідженні мікроорганізмів, необхідно
занести у спеціальний журнал.

Методичні вказівки. Викладач коротко пояснює правила розтину

трупів та демонструє розтин трупу лабораторної тварини,
ознайомлює студентів з засобами відбору і упаковки матеріалів,
способами консервування, оформленням супровідного документую
Самостійна робота студентів. Студенти розтинають трупи
лабораторних тварин, здійснюють посів на живильні середовища з
крові серця, селезінки, роблять мазки відбитки з внутрішніх органів,
різних тканин, відбирають внутрішні органи(пат. матеріал) у
стерильний скляний посуд (флакони з під антибіотиків), кладуть у
термос з льодом, «запечатують» та пишуть супровідну в
лабораторію.

Тема 11. СЕРОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ У

ВЕТЕРИНАРНІЙ МІКРОБІОЛОГІЇ

Серед лабораторних методів дослідження фігурують

бактеріологічне, вірусологічне, празитологічне серологічні та ін. Серед
останніх особливе значення має серологічне ,що належить до групи
імунологічних методів. За його допомогою можна ідентифікувати
збудника, інколи визначати антигенну його характеристику (належність
до певної серогрупи, серотипу); здійснювати ретроспективну
діагностику. Остання базується на виявленні відповідних антитіл у
сироватці крові (інколи важливо встановити і динаміку наростання їх
титру).
В основу серологічних досліджень покладено специфічну реакцію
між антигеном та антитілом. За допомогою серологічних реакцій можна,
виявити антиген або антитіло. У першому випадку необхідно мати
специфічні антитіла, у другому – антигени.

118
 Антигенами називають генетично чужорідні речовини, які після
введення у організм викликають реакцію у вигляді утворення
специфічних антитіл. Антигени мають по кілька детермінантних
рецепторів, за допомогою яких можуть вступати в реакцію з
відповідними антитілами як в організмі тварин, так і за його межами (in
vitro).
Антитіла входять до імунних сироваток, тому останні є
постійними компонентами серологічних реакцій (латинська назва
сироватки – serum, звідси походить й назва реакцій – серологічні).
У мікробіологічній практиці широкого застосування набули
серологічні реакції: аглютинації, зв'язування комплементу, преципітації
та ін.

Лабораторна робота №1
РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ

Мета роботи: ознайомити студентів із сутністю і проведенням

реакції аглютинації.
Матеріали і устаткування: кювети плексиглазова панель із
лунками, гумові груші, піпетки на 1 мл, фізіологічний розчин, позитивна
сиворотка на бруцельоз, негативна сиворотка і антиген бруцельозний.

Реакцію аглютинації застосовують з метою діагностики

бруцельозу, сальмонельозу, колібактеріозу, лістеріозу, вібріозу,
лептоспірозу та інших захворювань. Існують кілька методів постановки
РА: пробірковий (об'ємний), крапельний (пластинчастий), кров'яно-
крапельний та ін.
Щоб поставити РА, необхідно мати такі компоненти: антиген,
досліджувану сироватку й фізіологічний розчин (0,85 %-й розчин натрію
хлориду на дистильованій воді). Антигеном в РА, як правило, є
суспензія живих або знеживлених мікроорганізмів. Суспензію з живих

119
мікроорганізмів готують змиванням фізіологічним розчином з поверхні
МПА однодобової мікробної культури.
Інактивовані антигени готують в умовах біологічної фабрики.
Антигени повинні мати необхідну концентрацію мікробних тіл.
Встановлюють її за допомогою бактерійних стандартів.
Кров'яна сироватка повинна бути прозорою й свіжою, її
одержують з крові методом відстою. Кров у великих тварин (корови,
коні, верблюди) беруть з яремної вени, у свиней – з судин хвоста чи
вушної раковини, птиці – з підкрильцевих судин у стерильні пробірки і
залишають у теплі. Після утворення згустка роблять «обводку». Для
цього профламбованим металевим стержнем верхню частину згустка
відокремлюють від стінки пробірки. Після цього останні ставлять у
холодильник (+4 °С). З появою достатньої кількості сироватку
відсмоктують у стерильні пробірки. Для ідентифікації мікроорганізмів,
ізольованих з патологічного матеріалу, застосовують стандартні
сироватки, одержані на біологічних фабриках шляхом гіпер-імунізації
тварин відповідними антигенами.
Постановка РА класичним (пробірковим) методом.
Досліджувані сироватки розводять у пробірках. При цьому
користуються відповідними інструкціями. Так, при діагностиці
бруцельозу сироватку крові великої рогатої худоби розводять у
концентрації 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, овець, кіз, свиней і собак – 1 :
25, 1 : 50, 1 : 100 та 1 : 200 (табл.1.4).
Розведення зручно здійснювати таким чином. Спочатку готують
основне розведення (1 :50 сироватки крові великих тварин і 1 : 25 –
дрібних). Щоб одержати розведення 1:50, беруть 0,1 мл сироватки і
змішують її з 4,9 мл фізіологічного розчину.

120
 Таблиця 1.4.
Розливання сироватки мікропіпеткою
Доза Антиген, розведений
до 500 млн мікробних
сироватки Розведення сироватки
тіл в 1 мл
0,04 1 1: 25
0,02 1 1: 50
0,01 1 1: 100
0,005 1 1:200

У штатив ставлять чотири пробірки (для кожної досліджуваної

сироватки) і в три (крім першої) вносять по 0,5 мл фізіологічного
розчину. Потім у першу і другу пробірки вносять по 0,5 мл основного
розведення досліджуваної сироватки. З другої пробірки 0,5 мл
переносять у третю, з третьої — у четверту, з четвертої 0,5 мл розчину
видаляють. Таким чином одержують розведення 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 та
1 : 400. Після цього в усі пробірки вносять по 0,5 мл стандартного
бруцельозного антигена, доводять фізіологічним розчином до робочого
титру. Вміст пробірок змішують і залишають протягом 4—6 год в
умовах термостату при температурі 37 °С, а потім – на 14 -16 год при
кімнатній температурі.
При масових дослідженнях сироватки крові свиней, овець, кіз і
собак допускається постановка реакції в двох перших розведеннях,
тобто 1 : 25, 1 : 50. При дослідженні сироватки крові великої рогатої
худоби, верблюдів - 1 : 50 та 1 : 100.
При постановці реакції аглютинації ставлять такі контролі:
● 0,5 мл фізіологічного розчину +0,5 мл антигена — для виключення
самоаглютинації;
● контроль сироватки крові, яка не містить антитіл проти збудника
бруцельозу;

121
 ● контроль сироватки, яка містить антитіла проти збудника
бруцельозу;
Контрольні сироватки досліджують у тих же розведеннях, що й
основні. Дози антигену при цьому аналогічні.
Результати постановки реакції аглютинації спостерігають
неозброєним оком або користуються аглютиніноскопом. Спочатку
розглядають контрольні пробірки. Результати РА записують за
допомогою умовних позначень (+) та (-).
(+ + + +) – повне прояснення вмісту пробірки, парасолька
сформована чітко. При струшуванні пробірки осад розбивається на
пластівці;
(+ + + ) – неповне прояснення вмісту пробірки. Осад такий же, як і
в першому випадку;
(+ + ) – прояснення вмісту пробірки слабке, парасолька
сформована недостатньо;
(+) – рдина каламутна, на дні пробірки — пластівці;
(—) – рідина каламутна, осад у вигляді ґудзика. При легкому
струшуванні пробірки він зумовлює рівномірне помутніння всього
вмісту пробірки.
Досліджувану сироватку вважають позитивною, якщо вона
зумовлює аглютинацію з оцінкою не менше двох хрестів у розведенні 1 :
100 і вище (велика рогата худоба, коні, верблюди) й 1 : 50 і вище
(собаки, вівці, свині, кози). При одержанні сумнівних результатів кров у
тварин беруть через 3-4 тижні й дослідження повторюють.
Крапельний (пластинчастий) метод РА застосовують з метою
швидкої орієнтувальної ідентифікації збудника чи антитіл у кров'яній
сироватці.
При ідентифікації збудника реакцію ставлять таким чином. У
центр предметного скла наносять краплю стандартної аглютинуючої

122
сироватки у розведенні 1 : 50, на лівий край — краплю сироватки у
розведенні 1 : 20, на правий – краплю фізіологічного розчину. У кожну
краплю бактеріологічною петлею додають невелику кількість
досліджуваної (агарової) культури і рівномірно розмішують. Результат
спостерігають через 2-3 хв.
При позитивній реакції у краплі з аглютинуючою сироваткою
з'являються пластівці, крупинки. Рідина стає прозорою. У контрольних
краплях остання залишається каламутною, а пластівці й крупинки не
утворюються. Реакцію краще роздивлятись на темному фоні.
При виявленні антитіл у сироватці спочатку готують різні її
розведення і наносять мікропіпеткою на предметне скло. Потім вносять
антиген, змішують скляною паличкою (починаючи з найбільшого
розведення сироватки) і враховують результат.
Кров'яно-крапельний метод РА найчастіше застосовують з
метою діагностики пулорозу (сальмонельозу) птиці. На знежирене
предметне скло наносять краплю крові (з гребеня чи сережки), вносять
антиген, змішують скляною паличкою. Щоб краще спостерігати
феномен аглютинації, користуються пофарбованим антигеном. У
позитивних випадках РА у краплі з'являються пластівці та крупинки
(аглютинат).
Реакцію аглютинації з молоком ставлять при обстеженні великої
рогатої худоби на бруцельоз. В пробірки наливають по 2-3 мл
досліджуваного молока і вносять по 0,2 мл антигену (забарвленого
гематоксилінеозином). Пробірки струшують до рівномірного
забарвлення молока і лишають у термостаті або витримують у водяній
бані протягом 45-60 хв за температури 37 °С.
При наявності у молоці антитіл утворюється комплекс антиген —
антитіло, який адсорбується на краплинах жиру. Останні при
відстоюванні спливають угору, утворюючи синє кільце у нижньому шарі

123
вершків. Стовпчик молока знебарвлюється. Негативна реакція
характеризується синім забарвленням всієї проби молока та жовтуватим
кольором вершків.

Методичні вказівки. Викладач коротко пояснює суть реакції

аглютинації, ознайомлює класичним та пластинчатим методами
постановки РА.
Самостійна робота студентів. Студенти ставлять реакцію
аглютинації з позитивною сироваткою на бруцельоз та негативною.
На другій день враховують результати реакції.

Питання для самоконтролю

1. Антигенна будова мікробної клітини.

2 Які компоненти потрібні для постановки РА?
3 Постановка РА пробірковим та пластинчастим методами.
4. Кільцева проба з молоком.

Лабораторна робота №2.

РЕАКЦІЯ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

Мета роботи: ознайомити студентів із сутністю і проведенням

реакції преципітації.
Матеріал і устаткування. Преципітующа сироватка проти
сибірки, стандартний сибірковий антиген, фізіологічний розчин,
піпетки Пастера, пробірки Уленгута.

Реакція преципітації (РП) основана на тому, що при взаємодії

антигена (преципітиноген) із специфічним антитілом (преципітин)
утворюється преципітат (осад). РП застосовують у ветеринарній
практиці переважно при дослідженні ураження шкіряної сировини
сибіркою.
За її допомогою можна виявити специфічний антиген у
патологічному матеріалі, відібраному від трупів, а також у шкіряній
сировині.

124
 Свіжий матеріал, витримавши протягом 18-20 год у термостаті, а
несвіжий — відразу після доставки у лабораторію, екстрагують гарячим
чи холодним способами. При гарячому способі шматочки
досліджуваного матеріалу (1-2 г) кладуть у пробірку або колбу,
заливають ізотонічним розчином натрію хлориду у співвідношенні 1 : 10
й кип'ятять протягом 30 хв у водяній бані. При холодному способі
шматочки матеріалу масою 1-2 г розтирають у ступці з піском, кладуть у
колбу, заливають 0,3%-м карболізова-ним ізотонічним розчином у
співвідношенні 1 : 10 й залишають на 16-18 год при кімнатній
температурі. Одержані екстракти фільтрують через азбестову вату
(перші краплі фільтрату видаляють). Екстракт повинен бути прозорим.
Реакцію можна ставити двома способами: нашаруванням та
підшаруванням. У першому випадку в уленгутівську пробірку
наливають 0,2-0,3 мл стандартної преципітуючої сибіркової сироватки й
пастерівською піпеткою нашаровують таку ж кількість одержаного
екстракту.
При підшаруванні спочатку вносять екстракт, а потім піпеткою
обережно додають специфічну сироватку. Якщо протягом 15 хв (при
кімнатній температурі) на межі екстракту і сироватки з'явиться білувате
кільце (преципітат), реакцію вважають позитивною.

Методичні вказівки. Викладач коротко пояснює суть реакції

преципітації. Ознайомлює з постановкою РП.
Самостій робота. Студенти ставлять реакцію преципітації
двома способами: нашаруванням та підшаруванням. Враховують
результати РП через 5-10 хв.

Реакція дифузійної преципітації (РДП). Метод простої дифузії за

Оуденом застосовують шляхом нашаровування антигена на поверхню
агару, який містить специфічну сироватку. Ставлячи реакцію за методом

125
Аухтерлоні, сироватку вносять у спеціальні лунки, зроблені в агарі, що
містить антиген.
Найчастіше застосовують метод подвійної дифузії. У
бактеріологічні чашки наливають розплавлений агар. Після його
застигання вирізають кілька лунок, користуючись спеціальним
пристосуванням. У центральну лунку вносять сироватку, що містить
відповідні антитіла, в решту лунок — досліджувані антигени або один і
той же антиген у різних розведеннях. Чашки ставлять в ексикатор чи
термостат. Результат враховують, аналізуючи стан агарової пластинки
між лунками з сироваткою й антигеном. У позитивних випадках на місці
контакту антигенів та антитіл утворюється молочно-біла лінія
преципітату. Якщо антигени ідентичні, зони їх дифузії з'єднуються і при
контакті з зоною дифузії антитіла утворюють загальну дугоподібну
лінію преципітації. Щоб запобігти утворенню псевдопреципітатів,
необхідно брати очищені антигени.
Існує кілька модифікацій постановки РДП. Крім описаного, часто
застосовують капілярний мікрометод, що характеризується високими
чутливістю й економічністю, а також значним скороченням часу
дослідження.
Реакція флокуляції дає змогу визначити токсичність
досліджуваних бактерій за допомогою антитоксичних сироваток. У
пробірки, що містять по 10 мл певного токсину, вносять специфічну
сироватку у різних кількостях (1,0; 0,9; 0,8...0,3 і т. д.). Пробірки
струшують, залишають при кімнатній температурі, а через деякий час у
них спостерігають опалесценцію, яка переходить у виразне помутніння.
Потім утворюються пластівці й випадає осад. Флокуляція спочатку
з'являється в окремих пробірках, потім — у решті, будучи показником
еквівалентності антигена (токсину) й антитіла (антитоксину), при якому
відбувається взаємодія антигена з антитілом (токсину з антитоксином),

126
повна нейтралізація токсину. У пробірках, де не досягнуто повного
насичення, флокуляція настає пізніше.
Реакцію нейтралізації (РН) (за Ерліхом з біопробою)
використовують для визначення видової належності бактерійних
токсинів у досліджуваному матеріалі та активності антитоксичної
сироватки. У вірусології її застосовують для ідентифікації деяких вірусів
або відповідних антитіл.
У пробірки з однаковою кількістю антигена в 1 мл (наприклад,
1000 смертельних доз токсину правцю) вносять такий же об'єм
специфічної протиправцевої антитоксичної сироватки, поступово
зменшуючи її концентрацію. Суміш токсин — антитоксин ставлять у
термостат на 1—2 год, потім вміст кожної пробірки вводять
лабораторним тваринам (з розрахунку одне розведення на дві тварини).
Організми, які одержали суміш, де відбулась нейтралізація токсину,
виживають, решта — гинуть. Найменшу кількість сироватки, яка
нейтралізує токсин, приймають за одиницю активності антитоксичної
сироватки (АО).
Імуноелектрофорез. Дослідження проводять у два етапи:
електрофоретичне розділення досліджуваного матеріалу в агарі;
імунологічний аналіз. В агарі паралельно з віссю міграції
електрофоретичних функцій роблять невеликі траншеї, куди вносять
імунну сироватку, що містить антитіла до досліджуваних антигенів. В
разі реакції між антигенами й антитілами формується преципітат у
вигляді дискретних дуг, що відповідають індивідуальним системам
антиген — антитіло.

Питання для самоконтролю

1. Реакція преципітації, її практичне застосування.

2. Методика постановки реакції дифузійної преципітації.

127
 3. Методика постановки реакції флокуляції.
4. Реакція нейтралізації, застосування її у практиці.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА). Реакція

імунофлуоресценції (РІФ).
Індикація бактеріальних і вірусних антигенів у інфікованих
матеріалах, тканинах тварин та клітинних культурах за допомогою
флуоресціюючих антитіл (сироваток) набула значного поширення в
діагностичній практиці. Імуно-флуоресцентний метод належить до
методів експрес-діагностики. За чутливістю і специфічністю він не
поступається перед іншими серологічними реакціями.
У РІФ використовують антитіла, до яких спеціальним методом
приєднано флуорохром (частіше флуоресцеїн — ізотіоціанат). Такі
антитіла зберігають здатність специфічно реагувати з антигеном і
завдяки наявності флуорохрому світитись під дією ультрафіолетових
променів.
Принцип методу визначення антигенів за допомогою
флуоресціюючих антигенів зводиться до того, що помічені
флуорохромом антитіла адсорбуються на поверхні відповідних
антигенів й міцно з ними зв'язуються. Якщо антиген (гетерологічний) не
відповідає поміченим антитілам, що знаходяться у сироватці, то останні
легко видаляються при промиванні препарату.
Приготування препаратів. Об'єктами дослідження можуть бути
мазки-відбитки, гістозрізи з уражених тканин, а також препарати з
інфікованих курячих ембріонів, клітинних культур. Предметні стекла
повинні бути чистими, знежиреними, без подряпин й інших
пошкоджень. Препарат (з досліджуваним матеріалом) підсушують на
повітрі і фіксують ацетоном (5 хв) або ж етанолом (10-15 хв) чи
метанолом (5-10 хв). Фіксацію здійснюють також шляхом нагрівання

128
препарату над полум'ям спиртівки (як і при звичайній мікроскопії).
Зафіксовані препарати зберігаються досить довго.
Є кілька методів реакції імунофлуоресценції.
Прямий метод РІФ. На предметне скло з фіксованим антигеном
наносять краплю люмінесціюючої імунної сироватки, яка містить
антитіла проти відповідного антигена. Препарати поміщають у вологу
камеру (бактеріологічні чашки із змоченим ватним тампоном чи
фільтрувальним папером) й витримують у термостаті при температурі 37
°С протягом 15-30 хв. Потім протягом 5-10 хв їх промивають у
проточній воді, щоб видалити надлишки сироватки або 0,15 М розчином
хлористого натрію у фосфатному 0,01 М буфері.
Промитий препарат висушують фільтрувальним папером і
мікроскопують. Специфічний об'єкт буде світитись у темному полі зору
мікроскопа. Цим методом користуються лише для ідентифікації
невідомого антигена. Недоліком його є необхідність приготування
люмінесціюючої сироватки для кожного виду ідентифікованого
мікроорганізму.
Непрямий метод РІФ. Порівняно з описаним вище методом цей
більш універсальний, тому що за допомогою однієї універсальної
сироватки можна виявити різні види мікроорганізмів. Метод
двоетапний. На першому етапі на фіксований препарат наносять краплю
імунної, не поміченої сироватки, специфічної до передбачуваного
антигена, і ставлять у термостат на 15-20 хв (в умовах вологої камери).
Потім промивають водою або буферним розчином. Антитіла, які
відповідають антигену, що є у препараті, не відмиваються.
На другому етапі на препарат наносять краплю антивидової
люмінесціюючої сироватки, що містить антитіла проти глобулінів
першої сироватки і знову поміщають у термостат в умовах вологої

129
камери на 15-20 хв. Після цього препарат промивають, висушують й
мікроскопують.
Антивидова сироватка — це помічені флуорохромом антитіла
проти глобулінів крові тих тварин, від яких одержано імунну сироватку
до передбачуваного антигена. Таким чином, антитіла першої (не
поміченої) сироватки є антигеном для помічених антитіл антивидової
сироватки. В результаті до комплексу антиген — антитіло, що утворився
на першому етапі реакції, приєднуються антитіла антивидові, тобто
утворюється подвійний комплекс, який можна виявити за допомогою
люмінесцентного мікроскопа.
Антикомплементарний (трикомпонентний) варіант. На предметне
скло з досліджуваним матеріалом наносять краплю імунної не поміченої
сироватки першого ступеня. Препарат ставлять у термостат, підсушують
і на мазок наносять краплю комплементу. Після цього препарат знову
ставлять у термостат на 15-20 хв, промивають і наносять
люмінесціюючу антикомплементарну сироватку. Описані процедури
аналогічні тим, які виконують при прямому (одноступінчастому)
варіанті.
Для підтвердження специфічності результатів необхідно ставити
такі контролі: для прямого варіанта люмінесцентною сироваткою
забарвлюють гомологічні й гетерологічні в антигенному відношенні
мікроорганізми. Світитись бактерії повинні лише у першому випадку.
Для непрямого варіанта необхідно мати три контрольних
препарати, оброблені: нормальною сироваткою, люмінесцентною
антивидовою сироваткою (без імунної, не поміченої сироватки) та
люмінесціюючою антивидовою сироваткою і завчасно відомою імунною
сироваткою першого етапу. Специфічне світіння бактерій повинно бути
лише у третьому контролі.

130
 Для непрямого варіанта з комплементом обов'язковими
контрольними препаратами є ті, у яких імунну сироватку заміщено
нормальною сироваткою того ж виду тварини й у тих же розведеннях, а
також препарати, оброблені усіма інгредієнтами, крім імунної
сироватки.
При оцінці результатів необхідно враховувати яскравість і колір,
локалізацію й структуру об'єкта, що світиться. Бактерії, забарвлені
люмінесціюючою сироваткою, поміченою ізотіоціанатом флуоресцеїну,
яскраво світяться зеленим кольором по периферії у вигляді кайми чи
ореолу. Центральна частина бактерій освітлена слабко. Таке світіння
називають специфічним (на відміну від неспецифічного, коли уся
мікробна клітина світиться рівномірно). Пластичні бактерії (лептоспіри,
вібріони) світяться рівномірно.
Інтенсивність світіння оцінюють за такою системою:
(++++) — дуже яскрава флуоресценція по периферії мікробної
клітини, яка чітко контрастує з темним тілом клітини;
(+ + + ) — яскрава флуоресценція по периферії клітини;
(+ + ) — слабке світіння по периферії клітини;
(+ ) — ледь помітне світіння по периферії;
(—) — світіння по периферії клітини відсутнє.
При ідентифікації різних збудників позитивним результатом
вважають специфічне світіння бактерійних клітин за умови ( + + + ).

Питання для самоконтролю

1. Суть методу флуоресціюючих антитіл.
2. Варіанти РІФ, їх принципова різниця.
3. Обов'язкові контролі при постановці РІФ.
4. Оцінка результату постановки РІФ.

131
 Лабораторна робота №3.
РЕАКЦІЯ ЗВ’ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ

Мета роботи: ознайомити студентів із використанням РЗК у

ветеринарній практиці.
Обладнання і устаткування. Фізіологічний розчин, 2,5%-а
суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині, бруцельозний
антиген, позитивна бруцельозна сироватка, нормальна сироватка
великої рогатої худоби, комплемент морської свинки, гемолізин, мірні
піпетки на 1-2 см3, водяна баня.

Реакцію зв'язування комплементу (РЗК) вперше описано Борде

і Жангу у 1901 р. В основі реакції лежать два явища – бактеріоліз та
гемоліз. У прояві цих явищ бере участь комплемент.
Реакція утворення комплексу антиген — антитіло — комплемент
невидима. Щоб виявити взаємодію компонентів, використовують
додаткову індикаторну систему, яка відображає результат взаємодії у
першій системі. Таким чином, РЗК передбачає використання двох
систем: бактеріологічної та гемолітичної.
РЗК здійснюють у два етапи. Спочатку готують бактеріологічну
систему. У пробірках змішують по 0,5 мл досліджуваної інактивованої
сироватки з антигеном, додають комплемент у чітко визначеній
кількості.
Суміш антиген – антитіло (сироватка) – комплемент
(бактеріолітична система) поміщають у водяну баню (термостат) при
температурі 37-38 °С на 20-40 хв. Результат взаємодії компонентів у
пробірці невидимий, рідина залишається прозорою і безбарвною. Щоб
визначити, зв'язався комплемент у бактеріолітичній системі чи ні,
необхідний другий етап реакції. Для цього у пробірки вносять
компоненти гемолітичної системи (відмиті еритроцити крові барана та

132
інактивовану гемолітичну сироватку) й знову ставлять у водяну баню на
15-20 хв.
Враховують попередній результат – наявність чи відсутність
гемолізу, залишають пробірки при кімнатній температурі на 18-20 год і
враховують остаточний результат.
Якщо сироватку одержано з крові хворої тварини, то в ній є
антитіла, які з'єднуються з відповідним антигеном. З комплексом
антиген — антитіло зв'язується комплемент. Відсутність останнього не
призведе до гемолізу еритроцитів в індикаторній системі, що свідчить
про позитивний результат постановки реакції.
Якщо сироватку одержано з крові здорової тварини, то вона
антитіл не утримує, комплекс антитіло – антиген не утворюється,
комплемент у бактеріологічній системі не зв'язується. При внесенні у
пробірку еритроцитів та гемолізину відбудеться гемоліз. Результат
постановки реакції в такому випадку вважають негативним.
РЗК використовують для визначення наявності у сироватці крові
хворої тварини специфічних антитіл (при діагностиці бруцельозу,
перипневмонії, сапу, лептоспірозу та ін.), вияву у досліджуваному
матеріалі специфічного антигена (бактеріальний, вірусний) при
наявності специфічної імунної сироватки.
Для постановки РЗК потрібно такі компоненти: проби кров'яних
сироваток з крові тварин, направлених на дослідження, дві позитивні
проби сироваток крові (стандартні, гіперімунні, які забезпечують
позитивний результат — для контролю) та дві проби сироваток з крові
здорових тварин також для контролю (усі сироватки в розведенні 1 : 10
інактивують з – метою руйнування їх власного комплементу
прогріванням у водяній бані при температурі 56 – 58 °С протягом 30 хв);
антиген у розведенні відповідно до титру (позначеному на упаковці);
комплемент-сироватка крові морської свинки (у розведенні відповідно

133
до встановленого титру); гемолізин у робочому титрі; суспензія
еритроцитів крові барана у розведенні 1 : 40; фізіологічний розчин.
Сироватки, що надійшли для дослідження, та контрольні
(позитивні, нормальні) розводять фізіологічним розчином у
співвідношенні 1 : 5 або 1 : 10, інактивують у водяній бані при
температурі 56-58 °С протягом 30 хв (сироватки крові ослів, мулів,
лошаків інактивують при температурі 61 °С протягом 30 хв).
Антиген для РЗК готують на біофабриках. Як правило, це
екстракти із зруйнованих бактерій або інфікованих ними тканин.
Антигени не повинні викликати гемолізу еритроцитів, що
контролюється під час постановки реакції (у пробірку вносять 1-2 робочі
дози антигена й 0,5 мл суспензії еритроцитів). На упаковці антигена
зазначено номер серії, контроль, дату виготовлення, строк придатності,
активність, тобто у якому розведенні його слід використовувати при
постановці реакції – 1 : 100, 1 : 150 і т. д. При тривалому зберіганні
робочий титр антигена встановлюють у лабораторії шляхом титрування.
Гемолізин готують на біофабриках гіперімунізацією кролів
відмитими еритроцитами крові барана. Кролям внутрішньовенно 5-6
разів з 2-3 добовими інтервалами вводять 40-50 %-ну суспензію
відмитих еритроцитів. Через тиждень після останньої ін'єкції у тварин
беруть кров. Після утворення та ретракції згустка асептично
відсмоктують сироватку, інактивують її, консервують гліцерином (1:1)
або 0,5 %-м фенолом, титрують, розливають в ампули. У лабораторії
перед постановкою РЗК гемолізин титрують знову.
Схема титрування гемолізину. Останній розводять у
співвідношенні 1 : 100 (0,2 мл гемолізину, консервованого
гліцерином+9,8 мл фізрозчину). Крім того, потрібно: комплемент – 1:20,
суспензія еритроцитів крові барана – 1:40, фізіологічний розчин NaCl.

134
 У штативі розміщують два ряди пробірок — один для
приготування розведень гемолізину, другий — для титрування. У першу
пробірку вносять вихідне розведення гемолізину – 1:100, потім
здійснюють послідовні розведення (рис. 1.40).
З кожної пробірки відповідного розведення гемолізину в окрему
пробірку переносять по 0,5 мл. В усі пробірки другого ряду вносять по
0,5 мл комплементу та суспензії еритроцитів і по 1 мл фізрозчину, щоб
загальний об'єм рідини досягав 2,5 мл. Усі пробірки легенько струшують
і ставлять на водяну баню при температурі 37-38 °С на 10-15 хв.
Результати титрування починають враховувати у пробірках з
найбільшою кількістю гемолізину (1:500, 1 : 1000). У пробірці з
найменшою кількістю гемолізину, де відбудеться повний гемоліз
еритроцитів, буде його граничний (фактичний) титр. В даному випадку
фактичний титр гемолізину становить 1 : 2000.
Для наступної роботи (титрування комплементу, головний дослід
РЗК) гемолізин використовують у подвоєному титрі (робочий титр). В
наведеному прикладі фактичний титр гемолізину становить 1 : 2000,
робочий - 1 : 1000, тобто при постановці РЗК відтитрований гемолізин
потрібно розвести фізіологічним розчином у співвідношенні 1 : 1000 (1
см3 гемолізину й 1000 см3 фізіологічного розчину).
Комплемент відкрито Бухнером (1889). Він має білкову природу.
Інактивується при нагріванні до 56 °С протягом 30 хв під дією
ультрафіолетових променів, хімічних речовин (кислоти, луги, ацетон,
хлороформ тощо), струшуванні.
Біологічна промисловість випускає комплемент, консервований
висушуванням. Одержують його з крові морських свинок.
Ліофілізовавий комплемент зберігається два роки. Перед кожною
постановкою РЗК комплемент титрують, тобто визначають його робочу

135
 Гемолізин
+
Фізіологічни 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл
й розчин
4 мл 4 мл 4 мл 4 мл 4 мл 4 мл

1:500 1:1000 1:1500 1:2000 1:2500 1:3000 1 :3500

Титрування

Гемолізин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,5
+
Комплемент 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0,5
+
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Еритроцити 0,5
+
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Фізіологічни 0,5
й розчин

ПГ ПГ ПГ ПГ ЧГ ЧГ ГВ

Умовні позначення: ПГ – повний гемоліз

ЧГ- частковий гемоліз
ГВ – гемоліз відсутній

Рис. 1.40. Схема титрування гемолізину

136
дозу — найменшу кількість, зумовлюючу повний гемоліз еритррцитів
крові барана в стандартних умовах постановки РЗК.
Комплемент титрують у гемолітичній та бактеріолітичній
системах.
Для титрування комплементу у гемолітичній системі готують
компоненти: комплемент у розведенні 1 : 20 (1 мл комплементу+18 мл
фізіологічного розчину), гемолізин, розведений відповідно до робочого
титру, суспензію відмитих еритроцитів крові барана (1 : 40),
фізіологічний розчин. У пробірки, поставлені в один ряд у штатив,
градуйованою піпеткою розливають різну кількість комплементу,
збільшуючи дозу на 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; від 0,22 до 0,43). Потім у ці
ж пробірки вносять фізіологічний розчин у кількості, що становить
разом з комплементом 0,5 мл, тобто у першу - 0,37, у наступні - 0,34;
0,31; 0,28 і т. д. Після цього в усі пробірки вносять по 0,5 мл гемолізину
та еритроцитів крові барана і по 0,1 мл фізіологічного розчину. Пробірки
струшують і ставлять у водяну баню на 10-15 хв при температурі 37-38
°С. Враховують результат (рис.1.41).

Фізіологічний
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
розчин
+ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Еритроцити
+
Гемолізин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
+
Фізіологічний
розчин 0,37 0,34 0,31 0,28 0,25 0,22 0,19 0,16
+
Комплемент 0,13 0,16 0,19 0,22 0,25 0,28 0,31 0,34

Рис. 1.41. Схема титрування комплементу у гемолітичній системі

137
 При титруванні комплементу та гемолізину (всю роботу - від
титрування комплементу до постановки основного досліду РЗК —
здійснюють протягом одного дня) ставлять контроль, кожний компонент
у окремій пробірці — 0,5 мл гемолізину у робочому титрі + 0,5 мл
суспензії еритроцитів +1,5 мл фізіологічного розчину; 0,5 мл
комплементу 1 : 20 + 0,5 мл еритроцитів + 1,5 мл фізіологічного
розчину. Пробірки струшують і ставлять у водяну баню. У контрольних
пробірках гемолізу не повинно бути.
Схема титрування комплементу у бактеріолітичній системі.
Готують комплемент (1 :20), суспензію еритроцитів крові барана (1 : 40),
гемолізин у робочому титрі й дві позитивні та дві нормальні проби
сироватки, специфічний антиген (у титрі, зазначеному на етикетці).
Сироватку (1 : 10) інактивують при температурі 56-58 °С протягом 30 хв.
Кожну пробу сироватки розливають у два ряди пробірок по 0,5 мл і
вносять комплемент у зростаючій кількості, починаючи з дози його
титру в гемолітичній системі. У наступні пробірки вносять комплемент,
щоразу збільшуючи його дозу на 0,03 мл (як і при титруванні
комплементу у гемосистемі). Додаючи фізрозчин, вирівнюють об'єм
вмісту пробірок (до 0,5 мл). У пробірки одного ряду кожної проби
сироватки (позитивні й нормальні) додають по 0,5 мл антигена, другого
ряду – по 0,5 мл фізрозчину. Всі пробірки струшують і ставлять у водяну
баню при 37-38 °С на 30 - 40 хв, після чого в кожну з них вносять по 0,5
мл гемолізину і суспензії еритроцитів, струшують і повторно ставлять у
водяну баню на 10-15 хв.
Враховують результат титрування, починаючи з пробірок другого
ряду кожної проби сироватки (без антигена) і проб нормальної
сироватки з антигеном (перший ряд). У цих пробірках слід чекати
повного гемолізу, враховуючи лише найменшу кількість комплементу,
що зумовив цей гемоліз за умови, що у перших рядах пробірок з

138
позитивними сироватками й антигеном з тією ж дозою комплементу
буде повна затримка (відсутність) гемолізу. Найменшу кількість
комплементу, що забезпечує повний гемоліз в нормальній сироватці з
антигеном і без нього, при повній затримці його в позитивній сироватці
з антигеном, називають титром комплементу у бактеріолітичній системі.
У цьому титрі використовують комплемент при постановці РЗК з
діагностичною метою.
Постановка головного досліду РЗК (діагностичне дослідження).
У штативи ставлять два ряди пробірок (згідно з кількістю проб
сироваток досліджуваної крові). Кожну пробу інактивованої сироватки
(1 : 10) вносять в обидві пробірки по 0,5 мл. У першу пробірку додають
специфічний антиген (0,5 мл), у другу – фізрозчин без антигена (0,5 мл).
Потім в усі пробірки (першого й другого рядів) вносять комплемент (по
0,5 мл), легенько струшують і ставлять у водяну баню на 20-40 хв за
температури 37— 38 °С. Це – бактеріолітична система. Після
витримування у водяній бані в усі пробірки вносять компоненти
гемолітичної системи — гемолізин та суспензію еритроцитів крові
барана (по 0,5 мл кожного), струшують, повторно ставлять у водяну
баню на 15-20 хв. Для будь-якої кількості проб досліджуваних сироваток
як контроль використовують позитивну (дає позитивний результат) і
нормальну (дає негативний результат) сироватки (рис. 1.42).
Результат враховують двічі: вперше — відразу після виймання з
водяної бані, вдруге — через 18-20 год відстоювання у пробірках при
кімнатній температурі. Під час попереднього аналізу звертають увагу на
пробірки другого ряду й пробірки з нормальною сироваткою та
антигеном, де має відбутись гемоліз. У пробірках з позитивною
сироваткою і антигеном спостерігають відсутність гемолізу (еритроцити
зумовлюють рівномірне помутніння вмісту пробірки).

139
 Пробірки з антигеном

Досліджувана
сироватка 0,5 Позитивна 0,5 Нормальна
сироватка сироватка 0,5
+
Антиген 0,5 0,5
0,5
+
Комплемент 0,5 0,5
0,5

Пробірки без антигену

Досліджувана
сироватка 0,5 0,5 0,5
+
Фізрозчин 0,5 0,5 0,5
+
Комплемент 0,5 0,5 0,5

Результат:
Досліджувана 0,5
сироватка 0,5 0,5
+ 0,5
Антиген 0,5 0,5
+ 0,5
Комплемент 0,5 0,5

(+) або (-) (+) – гемоліз (-) – повний

відсутній гемоліз

Рис. 1.42. Схема постановки головного досліду РЗК

140
 Заключний аналіз свідчить про те, що у пробірках, де раніш
відмічався повний гемоліз еритроцитів, ніяких змін не відбулось, а у
пробірках, де гемоліз не спостерігався, еритроцити мають вигляд осаду.
Рідина над осадом прозора й безбарвна.
Показники реакції вважають достовірними, якщо у пробірках з
позитивною сироваткою та антигеном гемоліз відсутній при повному
гемолізі еритроцитів у пробірках з позитивною сироваткою без антигена
і в усіх пробірках з нормальною сироваткою.
РЗК передбачає контроль антигена, комплементу, гемолізину,
еритроцитів. Для цього в окремі пробірки вносять антигене
еритроцитами крові барана, комплемент з еритроцитами крові барана,
комплемент без гемолізину, гемолізин з еритроцитами без комплементу,
еритроцити й фізіологічний розчин. Об'єм вмісту кожної пробірки
доводять фізіологічним розчином до 2,5 мл. Пробірки струшують,
ставлять у водяну баню при температурі 37 °С на 20 хв. В усіх
контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.
Результат РЗК виражають за допомогою умовних позначень
залежно від ступеня його інтенсивності:
▪ (++++) — повна затримка гемолізу (результат позитивний);
▪ (+++) — чітко виражена затримка гемолізу, є значний осад
еритроцитів, рідина над ним слабко-рожевого кольору (результат
позитивний),
▪ (++) — часткова затримка гемолізу, спостерігається компактний
осад еритроцитів, рідина має яскраве червоне забарвлення (результат
сумнівний);
▪ (+)—слабка затримка гемолізу, осад незначний, рідина
інтенсивно забарвлена у червоний колір (результат негативний);
▪ (—) —повний гемоліз («лакова кров»), осад відсутній (результат
негативний).

141
 РЗК використовують з метою вияву у сироватці крові хворої
тварини специфічних антитіл (діагностика бруцельозу, сапу,
лептоспірозу тощо) та специфічного антигена (бактеріальний або
вірусний) у різних матеріалах за допомогою специфічних
імуносироваток.
Реакцію тривалого зв'язування комплементу (РТЗК)
запропоновано Якобшином (1910). Суть її полягає у тому, що
бактеріологічну систему витримують у трьох температурних режимах:
після змішування компонентів — при кімнатній температурі протягом
15 хв, при температурі 4 °С (у холодильнику) протягом 12—18 год, після
чого підігрівають протягом 15 хв у водяній бані (37 °С) і вносять
гемолітичну систему. Залишають, як і при постановці РЗК, у водяній
бані і враховують результати реакції. РЗК вважають більш «чутливою».
її рекомендовано для діагностики туберкульозу, кампілобактеріозу,
бруцельозу та ін.

Методичні вказівки. Викладач коротко пояснює суть реакції

зв’зування комплементу. Ознайомлює з схемати титрування гемолізину,
комплементу та постановкою головного досліду РЗК.

Самостійна робота. Студенти проводять титрування

комплементу, ставлять основний дослід РЗК та враховують
результати реакції.

Питання для самоконтролю

1. Суть РЗК. Призначення гемолітичної системи.
2. Принцип одержання гемолізину. Методика титрування.
3. Призначення в РЗК комплементу.

142
 РОЗДІЛ 2

СПЕЦІАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

ТЕМА 1. ЗБУДНИКИ БАКТЕРІАЛЬНИХ ІНФЕКЦІЙ

Мета: Ознайомити студентів з деякими небезпечними

збудниками бактеріальних хвороб, зокрема сибірки, туберкульозу,
бруцельозу, ботулізму, сальмонельозу.
Матеріал і обладнання. світлові мікроскопи, препарати-мазки
(попередньо виготовлені та пофарбовані).

ЗБУДНИК СИБІРКИ

Сибірка — гостре інфекційне захворювання, що характеризується

явищами септицемії, інтоксикацією, утворенням специфічних
карбункулів. Чутливі до сибірки всі види диких і домашніх тварин,
люди. Найчутливіші травоїдні, більш стійкі свині, малочутливі —
собаки, кішки.
Збудник Bacillus anthracis — нерухлива, грампозитивна,
утворююча капсули і спори паличка (3-10 х 1-1,5 мкм).
Аероб, невибаглива до умов вирощування, добре росте на
звичайних живильних середовищах (оптимальна рН 7,2—7,6). Капсули
утворює в організмі, а також на середовищах, збагачених кров'ю чи
сироваткою. Спори утворює у зовнішньому середовищі. В трупах, що не
піддавали розтину, спори не формуються.
Бактеріологічна діагностика. При підозрі на сибірку труп
розтинати забороняється. В лабораторію надсилають вушну раковину
(якщо труп лежить на правому боці — правого вуха і навпаки). На
основі вушної раковини зав'язують дві паралельні лігатури. Між ними

143
раковину відрізають. Культю дезінфікують (краще розжареним
металом). Раковину загортають у чисту марлю, просочену З %-м
розчином карболової кислоти, потім — у поліетиленову плівку чи
пергаментний папір, кладуть у металевий ящик. Можна надсилати мазки
крові. Місце її відбору дезінфікують 75 %-м етиловим спиртом, а після
маніпуляцій обробляють розжареним металом. Роблять три-чотири
товсті мазки на предметних стеклах й висушують їх на повітрі. Сушити
слід не під прямими сонячними променями, не допускати, щоб з мазком
контактували комахи. Після цього мазки перекладають сірниками
(мазком всередину) і загортають у пергаментний папір.
При підозрі на сибірку у свиней (під час огляду туш) відбирають
заглоткові лімфовузли та набряклі місця сполучної тканини. Якщо труп
тварини випадково розтинали, у лабораторію надсилають шматочок
селезінки.
Мікроскопія. Готують мазки з крові та мазки-відбитки з іншого
матеріалу. Забарвлюють за Грамом, Романовським-Гімзою. Вас. anthracis
виявляють у вигляді поодиноких, парних паличок або коротких
ланцюжків. Внутрішні краї паличок мов би обрубано, вільні краї
заокруглено (рис.2.1.).
У мазках, забарвлених за
Романовським-Гімзою, чітко
видно капсулу збудника. У
матеріалі від свиней форма Вас.
anthracis може бути іншою:
короткі, товсті, зернисті палички,
інколи «роздуті» по центру чи на
Рис. 2.1. Вас. anthracis в мазках із кінцях.
культур

144
 Виділення чистої культури. Посіви здійснюють на МПА і МПБ.
Інкубують у термостаті при температурі 37—38 °С 18—24 год. При
відсутності росту культури пробірки витримують у термостаті ще дві
доби. На МПА Вас. anthracis утворює R-форми колонії. Поверхня її
матова, краї з локоноподібними відростками. Інколи Вас. anthracis
утворює S- чи М-форми колонії (при підвищеному вмісті СО2, внесенні
у живильне середовище сироватки крові тощо). На МПБ — типовий (R-
форми) ріст у вигляді шматочка вати на дні пробірки. Бульйон
залишається прозорим. Інколи він мутніє (S- або М-форма). При
мікроскопії мазків, зроблених з агарової культури (звичайні
середовища), знаходять довгі ланцюги грампозитивних паличок. У
бульйонних культурах — короткі ланцюжки, поодиноко чи попарно
розміщені грампозитивні палички. Капсули не виявляються.
Біохімічні властивості. Вас. anthracis ферментує з утворенням
кислоти без газу глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу та
декстрини. Утилізує цитрати, утворює ацетилметилкарбінол, в
результаті чого дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера. Редукує
метиленовий синій.
У природі існує чимало мікроорганізмів, подібних за морфологією
й деякими іншими властивостями до Вас. anthracis. Серед них, зокрема,
так звані «антрокоїди» Вас. megaterium, Вас. subtilis, Вас. cereus та ін..
Диференціацію збудника сибірки і антракоїдів здійснюють за
допомогою ряду тестів. На відміну від антракоїдів, збудник сибірки
патогенний для білих мишей, утворює капсулу, лізується сибірковим
бактеріофагом, втрачає ригідну стінку клітини під впливом пеніциліну
(тест «намисто перлини»), нерухливий, не гемолізує еритроцитів крові
(табл..2.1). Для ідентифікації збудника сибірки використовують також
імунофлуоресцентний метод.

145
 Тест «намисто перлини» оснований на пригніченні пеніциліном
синтезу компонентів клітинної стінки у Вас. аnthracis. Досліджувану
культуру засівають в пробірки або бактеріологічні чашки з МПА, який
містить 0,5 та 0,05 ОД пеніциліну в 1 мл. Інкубують протягом 3 год. у
термостаті. На агарі з пеніциліном Вас. аnthracis утворює ланцюжки зі
сферичних клітин, що нагадують «намисто перлини». Антракоїди в
аналогічних умовах морфології не змінюють (рис.2.2).
Таблиця 2.1.
Диференційні ознаки Вас. anthracis та сапрофітних бацил
Вид бактерій роду
Вас. Вас. Вас. Вас.
Ознака anthracis cereus megateium subtilis
Рухливість __ + + +
Капсулоутворення + — — —
Гемолітичні властивості __ + — ±
Патогенність для білих мишей + + __ __
Чутливість до пеніциліну
(феномен «намисто») + — — —
Чутливість до сибіркового
бактеріофагу + — — —

Біопроба. Білим мишам або

морським свинкам підшкірно
вводять суспензію з патматеріалу
чи культуру збудника (відповідно
0,1—0,2 та 0,5—1,0 мл). При
наявності збудника сибірки
тварини гинуть протягом 24—48
год. Трупи розтинають й
Рис. 2.2. Bac.anthracis (феномен досліджують бактеріологічно.
«намисто»)

146
 Дослідження шкіряної сировини на сибірку за допомогою РП
(реакції преципітації). У лабораторію надсилають проби шкіри будь-
якої характеристики. їх відбирають у вигляді невеликих (4 х 4 см)
квадратиків або кружечків. Якщо проб багато, їх нанизують на тонкий
дріт у порядку, що відповідає порядку сировини на складі.
Проби від парної й мороженої сировини витримують для
нагромадження антигену протягом двох діб при температурі не нижче 20
°С. Решту проб досліджують відразу після надходження в лабораторію.
Порядок дослідження наступний:
1. Стерилізація проб в автоклаві з метою знищення збудника (1,5
атм протягом 30 хв або 1 атм протягом 1 год).
2. Подрібнення проб здійснюють ручним (ножиці) або механічним
способом. Від кожної проби нарізають невеличкі шматочки загальною
масою 1 г і кладуть у скляні 50-мілілітрові банки. Від кожної проби
мокросолоної сировини нарізають 2 г і кладуть в окремі банки.
3. Екстракція проб. При дослідженні парної, мороженої, прісно-
сухої та сухо-солоної сировини використовують карболізований 0,85 %-
й розчин натрію хлориду, при дослідженні мокро-солоної сировини —
дистильовану воду з доданням 0,3 % карболової кислоти.
Мокро-солоні проби заливають 7-8 мл екстрагуючої рідини, решту
проб – 10 мл. Вміст банок ретельно розмішують й екстрагують
холодним способом (16-20 год при кімнатній температурі). Проби
свинячих шкір екстрагують гарячим способом.
4. Фільтрування екстракту. Застосовують азбестову вату,
попередньо перевірену на рН (нейтральний).
5. Постановка РП. Стандартна протисибіркова преципітуюча
сироватка повинна бути абсолютно прозорою. Для цього її відстоюють й
видаляють верхній прозорий шар або фільтрують через азбестову вату.
При дослідженні сухо-солоної чи мокро-солоної сировини до сироватки

147
додають 3-4 % (інколи 5 %) хімічно чистого NaCl. Сироватку
перевіряють на активність та специфічність (зі стандартним сибірковим
антигеном реакція повинна бути позитивною, а з екстрактом вільної від
сибіркового антигену шкіри — негативною). Реакцію ставлять методом
нашарування екстракту на сироватку. Користуються апаратурою
Флоринського (на 0,25 — 0,3 мл сироватки нашаровують 0,25 — 0,3 мл
екстракту і залишають при кімнатній температурі).
6. Врахування результату постановки реакції. При дослідженні
мороженої та прісно-сухої
сировини результат реакції
фіксують у період з 10-ї по 15-
ту хв від моменту постановки
реакції, при дослідженні сухо-
солоної — через 30 хв, мокро-
солоної — через 1 год. При
виявленні характерного
сірувато-білого диска на межі
компонентів реакцію
Рис. 2.3. Позитивна реакція на сибірку
вважають позитивною
(рис.2.3).
Експрес-діагностику сибірки здійснюють за допомогою прямого
чи непрямого МФА. Використовують також МФА, основану на системі
фаг — флуоресцентний антифаг. Цей метод належить до непрямих.
Питання для самоконтролю
1. Який матеріал надсилають у лабораторію для дослідження?
2. Особливості відбирання матеріалу при підозрі на сибірку.
3. Морфологія та культуральні властивості збудника.
4. Диференціація Вас. anthracis і сапрофітів.
5. Серологічні методи виявлення сибіркового антигену у різних
матеріалах.
6. Схема дослідження шкіряної сировини.

148
 ЗБУДНИК ТУБЕРКУЛЬОЗУ

Туберкульоз — інфекційне захворювання тварин і людини, яке

перебігає найчастіше хронічно і характеризується утворенням в
уражених органах й тканинах особливих вузликів (туберкулів), схильних
до казеозного розпаду.
Збудник туберкульозу має три основних види: Mycobacterium
tuberculosis, M. bovis, М. avium, M. murium, M. роykilothermorum.
M. tuberculosis – це прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1-6
і шириною 0,3-0,6 мкм (рис. 2.4). Зустрічаються дуже короткі або
видовжені й навіть гіллясті форми.
M. bovis – дещо коротші прямі або злегка зігнуті палички
довжиною 1,5-2 і шириною 0,3-0,6 мкм. (рис. 2.4). Цей вид є основним
збудником туберкульозу у великої рогатої худоби, інших жуйних, рідше
уражує людей, м’ясоїдних тварин і деякі види птиці.
М. avium – основний збудник
туберкульозу птахів, інколи викликає
захворювання у свиней і великої
рогатої худоби. У нього виражений
поліморфізм: поряд з тонкими прямими
або зігнутими паличками мікобактерій
туберкульозу зустрічаються
кокоподібні й нитчасті форми (рис.
Рис. 2.4. Основні види 2.4).
збудника туберкульозу
Діагностика туберкульозу
комплексна й основана на застосуванні патологоанатомічних,
бактеріологічних, імунологічних та алергічних методів з урахуванням
епізоотологічних даних і клінічних ознак хвороби.

149
 Для бактеріологічної діагностики в лабораторію надсилають
заглоткові, підщелепні, бронхіальні, пахвинні, надвим'яні,
передлопаткові лімфатичні вузли, а також внутрішні органи, які
відбирають за умови наявності в них підозрілих змін. Трупи птиці
відправляють цілими.
Матеріал надсилають у свіжому чи замороженому стані або
консервують 30 %-м водним розчином хімічно чистого гліцерину.
За життя від тварин відбирають бронхіальний і вагінальний слиз,
проби молока (150-200 мл) та фекалій (50-100 г). Перед проведенням
бактеріологічних досліджень патологічний матеріал піддають
спеціальній обробці, мета якої полягає в знищенні сторонньої
мікрофлори і концентрації туберкульозних бактерій у невеликому об'ємі.
Внутрішні органи й лімфатичні вузли подрібнюють (ножицями) на
невеличкі шматочки, які розтирають у стерильній ступці з додаванням
стерильного битого скла або піску, заливають 3-5 %-м розчином сірчаної
або 5-10 %-м розчином щавлевої кислоти у співвідношенні 1 : 4,
фільтрують через два шари стерильної марлі і центрифугують при 3000
об/хв протягом 10-15 хв. Надосадову рідину зливають, осад двічі-тричі
відмивають фізіологічним розчином (за допомогою центрифуги) і
використовують для виготовлення мазків та проведення посівів з метою
виділення чистої культури збудника.
Бактеріологічний метод діагностики туберкульозу включає три
основні позиції: мікроскопію мазків із підготовленого матеріалу,
виділення чистої культури мікобактерій та постановку біопроби.
Бактеріоскопія. Із нативного матеріалу, підготовленого для
досліджень, готують по два мазки із кожного органу і лімфатичного
вузла. Після висушування препарати фіксують полум'ям і фарбують за
методом Ціля-Нільсена:

150
 1. карболовий розчин фуксину Ціля наносять на мазок через
смужку фільтрувального паперу і нагрівають протягом 5 хв (до
пароутворення);
2. після остигання залишок фарби зливають, мазок проминають
водою;
3. препарат обробляють 3%-м розчином солянокислого спирту
(до 97 см3 70 %-го етилового спирту додають 3 см3 концентрованої
соляної кислоти) до появи ледь помітного рожевого відтінку;
4. промивають ретельно водою і дофарбовують метиленовим
синім протягом 3-5 хв;
5. фарбу змивають водою, мазок висушують і досліджують під
мікроскопом з використанням імерсійної системи.
Кислотостійкі мікобактерії туберкульозу після обробки фуксином
не знебарвлюються солянокислим спиртом і зберігають рубіново-
червоний колір. Розміщуються по одній або невеличкими скупченнями.
Зернисті (нерівномірно забарвлені). Фон мазка, клітини патологічного
матеріалу та інші види бактерій набувають синього кольору.
Виділення чистої культури. Оброблений за описаною вище
методикою матеріал сіють у 5-10 пробірок з середовищем Левенштейна-
Йенсена або Гельберга, Петраньяні, у гліцериновий МПБ тощо. Збудник
культивують в аеробних умовах. Перші ознаки росту з'являються через
два тижні і пізніше. На щільних середовищах M. bovis через 20-60 діб
утворюють дрібні кулясті колонії кольору слонової кістки. Колонії M.
tuberculosis — зморщені, сухі (R-варіант) (рис. 2.5.). Інколи
зустрічаються гладенькі колонії S-варіанта. Представники M. avium
ростуть швидше і на 10-15-ту добу з'являються м'які, ослизлі, сірувато-
білі або з жовтуватим відтінком колонії, які, зливаючись, утворюють
суцільне нашарування.

151
 Важливою ознакою, характерною для трьох видів туберкульозних
бактерій, є їх здатність
культивуватись на яєчних
середовищах без саліцилату натрію,
формуючи безпігментні колонії.
У гліцериновому МПБ, інших
рідких середовищах М. tuberculosis
утворює на поверхні товсту
складчасту плівку, тоді як М. bovis
Рис.2.5. Ріст мікобактерій на росте у вигляді тонкої, ніжної,
середовищі Петраньяні
сітчастої плівки. Поверхнева плівка
М. avium спочатку суха, потім стає ослизлою. У всіх випадках бульйон
залишається прозорим.
Для визначення виду виділеної культури ставлять біопробу на
морських свинках, кролях і курях. Для диференціації М. tuberculosis і М.
bovіs двом морським свинкам підшкірно вводять виділену культуру у
дозі 1 мг/мл фізіологічного розчину. Двох кролів заражають
внутрішньовенно у дозі 0,1 і 0,01 мг/мл фізіологічного розчину. Обидва
види збудника у морських свинок викликають інтенсивний
туберкульозний процес і тварини гинуть на 20-90-й день після
зараження.
У кролів генералізований туберкульоз викликає тільки М. bovіs.
При цьому в легенях виникає багато туберкульозних вогнищ, на відміну
від печінки та селезінки, де ураження можуть бути лише поодинокими,
або й не зустрічаються зовсім. Через 2-3 місяці кролі гинуть.
М. tuberculosis не викликає прогресивно інфекційного процесу у
кролів. Інколи виникають лише поодинокі туберкули в легенях і нирках.
Остаточний висновок про результати біопроби роблять після забою
тварин (через 3 міс), що залишилися живими, і їх патолого-анатомічного

152
розтину.
У курей М. bovis і М. tuberculosis при внутрішньовенному
зараженні не викликають захворювання, у той час як М. avium
призводить до розвитку генералізованого септичного процесу й загибелі
птиці на початку третього тижня.

ЗБУДНИК БОТУЛІЗМУ

Ботулізм — гостре кормове отруєння тварин, зумовлене токсином

С.botulinum. Переважають ознаки нервово-паралітичного характеру.
Летальність становить 85-100 %.
С. botulinum — поліморфний, в основному кокоподібної форми
мікроорганізм величиною 4-6 мкм, грампозитивний, утворює спори.
Останні надзвичайно термостійкі — витримують кип'ятіння протягом 5-
6 год. Спори овальної форми, розміщені термінально або
субтермінально. Багато спорулюючих клітин — ракеткоподібного
вигляду (рис.2.6). Збудник — суворий анаероб, продукує сильнодіючий
екзотоксин, неоднорідний за
антигенною структурою. Розрізняють
токсини А, В, С, D, Е та F. Кожний з
них нейтралізується лише
типоспецифічною сироваткою.
Бактеріологічна діагностика
ботулізму полягає у виявленні
ботулінічних токсинів, а також самого
Рис. 2.6. СІ. botulinum
збудника. У лабораторію надсилають
проби корму (силос, зерно, дерть, м'ясні й рибні відходи тощо), вміст
шлунка, відрізки кишок з вмістом, кров.

153
 Проби корму і вміст шлунка ретельно розтирають у ступці з
стерильним піском чи склом, заливають подвійною кількістю
ізотонічного розчину кухонної солі й використовують для вияву токсину
і виділення збудника.
Виявлення токсину С. botulinum. Підготовлену описаним вище
способом пробу витримують 1-2 год при кімнатній температурі,
фільтрують через ватно-марлевий фільтр або центрифугують при 3000
об/хв протягом 20-30 хв. Одержаний фільтрат (центрифугат)
використовують для зараження білих мишей живою масою 16—18 г.
Двом з них вводять фільтрат в дозі 0,5-0,8 мл внутрішньочеревно або
підшкірно. Одночасно заражають мишей прогрітим (100°С — 30 хв)
матеріалом. При наявності токсину С.botulinum тварини, яким ввели
непрогрітий матеріал, захворюють з характерними ознаками
(розслаблення м'язів, параліч), гинуть, а ті, що одержали прогрітий
матеріал, лишаються живими.
З метою ідентифікації ботулінічного токсину ставлять реакцію
нейтралізації. Для цього перед введенням тваринам матеріал змішують з
полівалентними (при можливості — моновалентними)
протиботулінічними сироватками й витримують їх протягом 30 хв при
температурі 32 °С. Тварини, які одержали суміш токсину з
гомологічною сироваткою, виживають, а решта — гинуть.
Мікроскопія. Мазки фарбують за Грамом. Наявність у полі зору
грампозитивних паличок, овальних спор, характерних «тенісних
ракеток» дає змогу впевнитись, що у матеріалі є збудник ботулізму.
Виділення чистої культури. Посів роблять на середовище Кітт-
Тароцці або кров'яний агар. Культивують в анаеробних умовах. У
рідкому середовищі С. botulinum зумовлює помутніння, потім —
утворення осаду й прояснення рідини, газоутворення. На агарі
утворюються колонії неправильної форми з відростками, навколо яких

154
— зона гемолізу. Токсин і його тип у мікробній культурі визначають, як
і при виявленні у патологічному матеріалі. З цією метою
використовують фільтрат або центрифугат чистої 4-8-добової культури.

Питання для самоконтролю

1. Особливості лабораторної діагностики ботулізму.
2. Методика виявлення ботулінічного екзотоксину.
3. Виділення й ідентифікація СІ. botulinum.

ЗБУДНИК БРУЦЕЛЬОЗУ

Бруцельоз — хронічне інфекційне захворювання багатьох видів

тварин, яке характеризується абортами, ендометритами, маститами,
артритами, бурситами, тендовагінітами, орхітами. На бруцельоз
хворіють також люди.

Збудник належить до роду Brucella, який об'єднує шість видів:

Brucella melitensis — виділяється переважно від кіз та овець, становить
найбільшу небезпеку для людей; Br. abortus — уражає переважно велику
рогату худобу; Br. suis — виділяється від свиней; Br. ovis — збудник
інфекційного епідидиміту баранів;
Br. canis і Br. neotome — виділені
відповідно від собак і
чагарникових пацюків.
Бруцели — дрібні
кокоподібні бактерії, не рухливі, не
утворюють спор і капсул, грам
негативні (рис.2.7.). Величина
Рис. 2.7. Brucella abortus (світлова
мікроскопія) клітини коливається в межах 0,3 ×

155
0,6 мкм ~ 0,6 × 2,5 мкм.
Лабораторні методи діагностики бруцельозу включають
проведення бактеріологічних та імунологічних досліджень. Масове
обстеження тварин у господарствах здійснюють алергічною пробою.
Для бактеріологічного дослідження в лабораторію надсилають
дрібні абортовані плоди (від свиноматки — не менше трьох). Від
великих плодів відбирають шлунок з вмістом, а також шматочки печінки
і селезінки. Крім того, відбирають ділянки плодових оболонок з
вогнищами геморагічної інфільтрації, виділення з родових шляхів, вміст
уражених бурс. Одночасно від тварин, що абортували, для серологічного
дослідження відбирають проби крові та молока.
Патологічний матеріал упаковують та негайно відправляють в
лабораторію. При відсутності можливості доставити протягом 24—30
год матеріал консервують 30 %-м стерильним водним розчином
гліцерину.
Бактеріологічна діагностика бруцельозу основана на
бактеріоскопії мазків із патологічного матеріалу, виділенні культури
бруцел і при необхідності — постановці біопроби.
Мазки (по два з кожного об'єкта) фіксують над полум'ям,
фарбують за Грамом і за Козловським.
Фарбування мазків за методом Козловського. Фіксовані мазки
фарбують протягом 2 хв 2 % -м водним розчином сафраніну з
підігріванням до появи пухирців. Препарати швид ко промивають
водопровідною водою, дофарбовують протягом 30-60 с 0,75-1,0 %-м
водним розчином малахітового зеленого, знову промивають водою і
висушують.
Бруцели порівняно з іншими бактеріями повільно сприймають
анілінові фарби, тому «не встигають» перефарбуватись малахітовим

156
зеленим, зберігають яскраво-червоне забарвлення, тоді як інша
мікрофлора й основний фон препарату набувають зеленого кольору.
Для виділення чистої культури бруцел використовують спеціальні
середовища типу: м'ясо-пептонний-печінковий бульйон (МППБ),
печінково-глюкозо-гліцериновий бульйон (ПГГБ), аналогічний агар
(ПГГА). Для пригнічення сторонньої мікрофлори до середовищ додають
бактеріостатичні препарати — генціанвіолет і малахітовий зелений в
концентрації 1 : 200 тис., кристалвіолет у концентрації 1 : 100 тис. або
оцтовокислий натрій із розрахунку 0,125 мг/мл.
Перед посівом із паренхіматозних органів вирізають шматочки
розміром 2х1,5х2,5 см, обробляють спиртом і розтирають у ступці з
фізіологічним розчином до одержання суспензії, яку сіють
пастерівською піпеткою в об'ємі 0,1—0,2 мл на щільні середовища.
Вміст шлунка плода сіють на щільні й рідкі середовища.
Для знищення сторонньої мікрофлори у матеріалі з плодових
оболонок шматочки проби на 30 хв заливають 3 %-м розчином
гідроксиду калію, промивають стерильним фізіологічним розчином й
приготовану в ступці суспензію висівають на середовища з
бактеріостатиками.
Засіяні бактеріологічні чашки (пробірки) поміщають у термостат
при температурі 37—38 °С, а посіви від великої рогатої худоби
інкубують в атмосфері з вмістом 10— 15 % СО2. Цього можна досягти
заповненням ексикатора з посівами вуглекислим газом з апарата Кіппа
або спалюванням в ньому невеликої кількості спирту.
За посівами спостерігають протягом 30 днів. Пробірки чашки, в
яких відмічено ріст мікрофлори через 24 год, видаляють.
Бруцели розвиваються досить повільно. Перші ознаки росту
з'являються через 7-10, інколи — через 30-40 днів. Одержані культури в
іншій генерації ростуть значно швидше (на 3-5-й день).

157
 На поверхні щільних живильних середовищ бруцели утворюють
дрібні, блискучі, випуклі, з рівними краями й поверхнею, голубуваті
колонії, які згодом сіріють. В рідких середовищах вони зумовлюють
рівномірне помутніння з пристінковим кільцем. Через кілька днів
випадає невеликий осад.
Виділені культури ідентифікують на основі морфологічних,
тинкторіальних культуральних особливостей, а також за допомогою
реакції аглютинації на склі з бруцельозною діагностичною сироваткою.
При цьому на добре знежирене предметне скло наносять краплю
бруцельозної сироватки в розведенні 1 : 50 й поряд — краплю цієї ж
сироватки у розведенні 1:2. Бактеріологічною петлею в обидві краплі
вносять культуру й ретельно перемішують до утворення рівномірної
суспензії. Якщо виділена культура виявиться бруцельозною, то через 1-3
хв утворюються пластівці або грудочки з одночасним проясненням
рідини. Контролем є нормальна (негативна) сироватка в таких же
розведеннях + віділена культура. Аглютинації в контролі не повинно
буті.
Біологічну пробу при діагностиці бруцельозу ставлять на
морських свинках (не менше двох особин) живою масою 300-400 г, в
сироватці крові яких відсутні антитіла до бруцельозного антигену.
Тварин заражають суспензією із органів і вмісту клунка на
фізіологічному розчині у співвідношенні 1 : 10 підшкірно, в дозі 1 мл, з
внутрішнього боку стегна. Аналогічну суспензію готують також із
плодових оболонок і плаценти. Вміст бурс вводять підшкірно в дозі 0,2-
0,3 мл.
У заражених свинок інфекція розвивається у латентній формі без
будь-яких клінічних ознак. У зв'язку з цим у піддослідних тварин беруть
проби крові на 15-й, 25 і 40-й дні після зараження. Одержану сироватку
досліджують за допомогою пробіркової РА з бруцельозним антигеном в

158
розведеннях від 1:10 до 1 : 80. У випадку вияву антитіл щодо згаданого
антигену в розведенні 1 : 10 й більше біопробу вважають позитивною.
Морських свинок забивають, відмічають патологоанатомічні зміни в
селезінці, печінці й лімфатичних вузлах. Проводять бактеріологічне
дослідження. При негативній РА тварин витримують до 60 днів, і
остаточний результат біопроби оцінюють за даними серологічних та
бактеріологічних досліджень.
Серологічні методи діагностики бруцельозу основані на
виявленні в сироватці крові тварин специфічних антитіл щодо
бруцельозного антигена, чого досягають постановкою РА, роз-бенгал
проби (РБП), реакції зв'язування комплементу (РЗК), реакції тривалого
зв'язування комплементу (РТЗК).
Реакцію вважають позитивною при наявності аглютинації з
сироватками крові великої рогатої худоби, коней і верблюдів,
починаючи з розведення 1 : 100; кіз, овець, буйволів, оленів і собак — з
розведення 1 : 50; хутрових звірів та морських свинок — починаючи з
розведення 1 : 10 з інтенсивністю не менше ніж на два хрести.
Сумнівною вважають реакцію, при якій виникає аглютинація в
розведенні 1 : 50 з сироватками крові великої рогатої худоби, коней і
верблюдів, у розведенні 1 : 25 — з сироватками крові овець, кіз,
буйволів, оленів і собак з оцінкою не менш як на два хрести.
Роз-бенгал пробу (Rose Bengal Tegt) відповідно до вимог ГОСТ
25385—82 проводять при температурі 18—30 °С на чистому склі або
сухій металевій емальованій пластині з лунками. Нерозведену
досліджувану сироватку крові в об'ємі 0,03 см3 мікропіпеткою вносять
на дно лунки. При дослідженні сироваток крові великої рогатої худоби,
коней, верблюдів і свиней в кожну лунку з сироваткою вносять також
0,03 мл бруцельозного антигена, пофарбованого бенгальським рожевим,
а при дослідженні сироваток крові овець, кіз, буйволів й оленів — 0,015

159
мл. Компоненти ретельно перемішують, пластину злегка погойдують
протягом 2 хв. В позитивних випадках з'являються маленькі й великі
пластівці аглютинату рожевого кольору.
Якщо сироватки, що дали позитивну РБП, надійшли з
благополучного щодо бруцельозу господарства, то їх обов'язково
досліджують за допомогою РА і РЗК з метою встановлення титру
специфічних аглютинінів. Якщо позитивні сироватки крові відібрані від
овець, кіз, свиней та оленів, вирощуваних в неблагополучних
господарствах, то цих тварин вважають хворими на бруцельоз.
Сироватки крові від інших тварин з таких господарств, позитивно
реагуючі в РБП, додатково досліджують постановкою РА і РЗК.
РЗК та РТЗК ставлять за описаною вище схемою. їх вважають
позитивними за умови затримки гемолізу на два — чотири хрести в
одному або декількох розведеннях сироватки (1 : 5 і більше) та іщвному
гемолізі в контрольних пробірках без антигена. Затримку гемолізу в
один хрест розцінюють як сумнівний результат.
Кільцева реакція з молоком. В уленгутівські пробірки наливають
по 0,05 мл кольорового бруцельозного антигена і додають по 1 мл
молока. Якщо реакцію ставлять у пробірках Флоринського або
серологічних, то компоненти беруть відповідно в об'ємах 0,1 і 2 мл.
Після ретельного перемішування компонентів пробірки вміщують у
водяну баню або термостат при температурі 37—38 °С на годину.
Якщо в сироватці молока будуть присутні антитіла щодо
бруцельозного антигену, то стовпчик молока знебарвиться, а у верхній
його частині утвориться чітке синє кільце. Інтенсивність реакції
враховують за чотирибальною» системою в хрестах.
Від корів, молоко яких дало позитивну чи сумнівну реакцію,
беруть кров для дослідження на бруцельоз в РА, РЗК, РТЗК або РБП.

160
 Алергічний метод застосовують при обстеженні тварин на
бруцельоз безпосередньо в господарствах, застосовуючи при цьому
алерген бруцелін ВІЕВ.
Питання для самоконтролю

1. Основні види бруцел.

2. Характеристика біологічних властивостей бруцел.
3. Який патологічний матеріал надсилають у лабораторію для
бактеріологічного дослідження на бруцельоз?
4. Основні етапи бактеріологічного дослідження.
5. Як ставлять біопробу при діагностиці бруцельозу?
6. Які критерії оцінки сироваток крові при їх дослідженні на
бруцельоз в РА та РЗК?
7. Які ще реакції ставлять при серологічній діагностиці
бруцельозу?

ТЕМА 2. ГРИБКОВІ ІНФЕКЦІЇ

Мікозами називають інфекційні захворювання грибної етіології,

при яких достовірно встановлено паразитичне існування в організмі
гриба - збудника хвороби. Найбільш поширеними є дерматомікози
(трихофітія, мікроспорія, фавус), мікози, що викликаються аспергілами,
пеніцилами, мукоровими грибами, кандідами, актиноміцетами.

Лабораторне заняття №1

ЗБУДНИКИ ДЕРМАТОМІКОЗІВ

Мета: Ознайомити студентів з основними збудниками

дерматомікозів, методами дослідження.
Матеріал і обладнання. світлові мікроскопи, культури грибів,
препарувальні голки, предметні та покривні скельця, гліцерин.

Дерматомікозами називають заразні хвороби людини, тварин,

птиці і риб багатьох видів, які характеризуються ураженнями шкіри та її
похідних. Відповідно до збудників — незавершених грибів —

161
розрізняють трихофітію, мікроспорію і фавус (паршу), які тривалий час
були відомі під загальною назвою «стригучий лишай».
Трихофітія — інфекційне захворювання тварин і людини, яке
характеризується запальною реакцією шкіри і може перебігати у трьох
клінічних формах: дисемінованій, плямистій і везикулярній.
Збудники захворювання — гриби із роду Trichophyton. Зокрема, Т.
verrucosum, Т. faviforme є основним збудником трихофітії у великої
рогатої худоби, буйволів, зебу, оленів. В інших видів тварин
захворювання зумовлюють Т. mentagrophytes, T. equinum, T. gallinae. У
людини – T. violaceum, T. tonsurans.
Для підтвердження діагнозу на трихофітію у лабораторію
надсилають обламані шерстинки разом із шматочками шкіри, які
відбирають пінцетом на межі здорової й ураженої ділянок шкіри від
тварин, яких не лікували. Матеріал вміщують в стерильні пробірки або
бактеріологічні чашки.
Мікроскопічне дослідження. Частину надісланого матеріалу
перед мікроскопією освітлюють 10-20 %-м розчином їдкого калі або
натру при слабкому підігріванні над полум'ям спиртівки. Кірочки,
лусочки з шерстинками переносять на предметне скло, розрівнюють
препарувальними голками, додають краплю спирту-гліцерину,
накривають покривним склом й досліджують під малим і середнім
збільшеннями мікроскопа.
В уражених шерстинках гіфи міцелію трихофітонів — прямі, з
перетинками, розміщуються рядами вздовж. При розпаді міцелію
утворюються одноклітинні круглі або овальні спори, які розміщуються в
шерстинці ланцюжками, а в його основі формують своєрідний чохол
(рис. 2.8.).

162
 Культуральні
властивості. Гриби з
роду Trichophyton —
аероби, культивуються на
спеціальних живильних
середовищах типу сусло-
агар, агар Сабуро та ін.
при оптимальній
Рис. 2.8. Дерматофіти в
ураженому волоссі. температурі 25 - 28 °С.
1 – Microsporum;
Ріст грибів повільний,
2 – Trichophyton;
3- Achorion. колонії з'являються на 10-
30-й день після посіву. Колонії Т. verrucosum щільні, складчасті,
піднімаються над середовищем, сірувато-білого кольору. Т.
mentagrophytes росте швидше й утворює рівні, плоскі, з характерним
ущільненням у центрі колонії. Останні у Т. equinum — бархатисті,
білого кольору, з радіальними заглибленнями. Протилежний бік колонії
забарвлений у жовтий колір.
При мікроскопічному дослідженні колоній виявляють септований
рівний міцелій, гіфи якого шириною 2,5- 4,0 мкм. Характерними є
макро- і мікроконідії, хламідоспори, а також округлі і чотирикутні
клітини, що утворюють ланцюжки. Окремі гіфи деяких трихофітонів
закручено у спіраль або кільця.
Мікроспорія найчастіше зустрічається у коней, котів, собак,
свиней, кролів, хутрових звірів, лабораторних, а також деяких диких
тварин. Дуже небезпечна для людини. Плямиста і дисемінуюча форми
клінічно подібні до трихофітії. При атиповій та субклінічній формах
ексудативні і запальні явища виражені слабо. Можуть бути ураженими
лише окремі шерстинки без утворення лусочок та кірочок.

163
 Збудники захворювання - гриби із роду Microsporum.У коней
основний збудник - М. equinum, рідше - М. саnis, інколи - М. distortum; у
хутрових звірів, котів і собак захворювання викликають М. canis, M.
lanosum, свиней - М. nanum.
Діагноз мікроспорії комплексний і ґрунтується на клініко-
епізоотологічних даних та результатах лабораторних досліджень. Для
мікроскопії беруть лусочки, кірочки з уражених ділянок із залишками
шерстинок. Матеріал обробляють і досліджують аналогічно трихофітії.
В уражених шерстинках знаходять прямі, розгалужені гіфи міцелію з
рідкими перетинками. При розпаді останнього утворюються округлі
одноклітинні спори, що розміщуються хаотично.
Для виділення чистої культури посів із матеріалу здійснюють
переважно на сусло-агар і середовище Сабуро. Представники роду
Microsporum ростуть швидко. Колонії починають формуватись уже на 5-
й день. Вони мають округлу форму, білий або сіруватий колір, зморщену
поверхню, інколи — з радіальними борозенками. Зворотний бік колонії
— жовтого або червоного кольору.
При мікроскопічному дослідженні виділених культур виявляють
розгалужений міцелій з септами, у деяких видів – з ракетоподібними
потовщеннями. Іноді знаходять велику кількість макроконідій із
заокругленими кінцями й декількома перетинками, хламідоспори та
мікроконідії.
Люмінесцентний аналіз досить важливий при дослідженні
матеріалу, відібраного від тварин з атиповим перебігом захворювання.
Суть методу зводиться до того, що шерстинки, уражені грибами із роду
Microsporum, здатні зумовлювати яскраво-зелене світіння в
ультрафіолетових променях. При цьому досліджуваний матеріал у
бактеріологічних чашках опромінюють лампою Вуда.

164
 При диференціації трихофітії від мікроспорії звертають увагу на
ланцюжкове розміщення спор в першому випадку і хаотичне — у
другому. Спори збудників трихофітії не світяться в ультрафіолетових
променях. Враховують також культуральні й морфологічні властивості
представників обох родів.
Фавус (парша) — інфекційне захворювання птиці, рідко —
ссавців, а також людини, яке характеризується ураженням шкіри, пір'я,
кігтів, волосся, внутрішніх органів. В природних умовах найчастіше
хворіють кури, качки, індики. На гребені й сережках птиці з'являються
невеличкі плями, які, зливаючись, утворюють сірувато-білі зони, вкриті
кірочками (скутулами). Через деякий час гребінь і сережки вкриваються
товстим нашаруванням, яке важко відділяється. В інших місцях біля
основи пір'їн утворюється чохол із спор збудника, внаслідок чого пір'я
випадає. Збудники захворювання — гриби із роду Achorion (син.
Trichophyton), зокрема A. gallinae, A. quinckeanum, A. Schonleiпі).
Останній є збудником хвороби у людини.
При мікроскопії препаратів із патологічного матеріалу знаходять
тонкий міцелій з рідкими септами, в гіфах якого видно прямокутні
клітини з двоконтурною оболонкою (рис.2.8). Спори розміщено рядами
або групами, мають округлу або багатогранну форму, діаметром 4 – 8
мкм. Гіфи гриба розміщуються вздовж пір'їн і часто оточено пухирцями
повітря. Кінці гіф мають веретеноподібні утворення.
Для культивування представників роду ахоріон використовують ті
ж середовища, що й для інших грибів. На агарі Сабуро A. gallinae
утворює гладенькі білі колонії, які пізніше набувають рожевого чи
червоного кольору, робляться складчастими й борошнистими. Діаметр
зрілих колоній - близько 12 мм.

165
 Питання для самоконтролю

1. Які захворювання називають мікозами?

2. Основні збудники дерматомікозів
3. Який патологічний матеріал надсилають у лабораторію при
уточненні діагнозу на трихофітію?
4. Як диференціюють збудників трихофітії та мікроспорії?
5. Культуральні властивості збудників дерматомікозів.

Лабораторне заняття №2

ЗБУДНИКИ ЦВІЛЕВИХ МІКОЗІВ

Мета: Ознайомити студентів з основними збудниками, мікозів

та мікотоксикозів, що викликаються грибами та їх токсинами.
Матеріал і обладнання. світлові мікроскопи, колонії грибів,
вирощені на спеціальних живильних середовищах: агар Чапека, сусло-
агар, агар Сабуро, уражений корм, препарувальні голки, предметні та
покривні скельця, спирт-гліцерин.

Аспергільоз — інфекційне захворювання птиці, рідше ссавців, яке

характеризується ураженням органів дихання і супроводжується
кон'юнктивітами, нервовими явищами, ознаками бронхіту і пневмонії.
Збудники захворювання — плісеневі гриби із роду Aspergillus.
Зустрічаються переважно A. fumigatus, A. flavusv рідше збудниками
можуть бути A. niger, A. nidulans.
У зовнішньому середовищі аспергіли живуть як сапрофіти, однак
при проникненні в ослаблений організм «перебудовуються» на
паразитичний спосіб життя. Перебуваючи в тканинах, гриби продукують
протеолітичні ферменти; та ендотоксин, який зумовлює гемолітичну і
токсичну дії. Присутність гриба в уражених тканинах, а також загальна
інтоксикація, що виникає, перетворюють аспергільоз в
аспергілотоксикоз.

166
 При порушенні умов утримання птиці аспергіли проникають в
яйця, що призводить до їх псування. При інкубації значна частина
ембріонів гине.
Діагностика захворювання комплексна: враховують клінічні
ознаки, патологоанатомічні зміни й обов'язково результати
лабораторних досліджень. У лабораторію надсилають цілі трупи птиці
або уражені повітроносні мішки, легені, в яких на розрізі знаходять
нещільні сірі вузлики діаметром близько 1 мм. При генералізованій
формі вузлики (гранульоми) знаходять у печінці, селезінці та серцевих
м'язах.
Із патологічного матеріалу готують препарати, в яких знаходять
гіфи знебарвленого міцелію.
Для виділення чистої культури збудника з уражених органів
асептично вирізають шматочки з гранульомами, які розкладають на
поверхню агару Чапека, середовище Сабуро, звичайний і кров'яний
МПА (рН 5,5—6,5). Засіяні таким способом чашки інкубують в аеробних
умовах при температурному оптимумі 20—35 °С.
Колонії A. fumigatus — бархатисті, рівні або шорсткуваті,
спочатку білого, потім — майже чорного кольору. В препаратах
знаходять короткі, без септ конідієносці, які закінчуються
колбоподібним розширенням з радіально розміщеними стеригмами й
ланцюжками конідій на них. Субстратний міцелій має перетинки.
Колонії A. niger темно-коричневого кольору. A. flavus утворює
дрібнозернисті колонії зеленувато-жовтого кольору.
Патогенність виділених культур підтверджується біопробою.
Внутрішньовенно кролям, морським свинкам і білим мишам вводять
суспензію спор гриба в дозі 500 тис.— 1 млн. спор. У піддослідних
тварин розвивається генералізована форма аспергільозу з
гранулематозним ураженням внутрішніх органів.

167
 Мукоромікоз (фікомікоз) — інфекційне захворювання тварин і
людини, при якому у внутрішніх органах, тканинах, лімфовузлах
розвиваються жовтуваті гранульоми, а в ротовій порожнині, стравоході
та шлунку утворюються виразки.
Збудники хвороби — гриби з класу зигоміцетів - Mucor racemosus,
М. pusillus та ін.
Для підтвердження діагнозу в лабораторію надсилають уражені
органи з гранульомами, некротичну тканину із виразок, ексудат, гнійно-
некротичну масу з вузликів, що розпались.
Із патологічного матеріалу, який попередньо витримують у 20 %-
му розчині їдкого калі протягом 10 — 15 хв, готують препарати. В
позитивних випадках знаходять широкі гіфи міцелію без септ, які
проростають у тканину.

ЗБУДНИК КАНДИДОМІКОЗУ
Кандидомікоз (моніліоз, молочниця, поверхневий бластомікоз)
— захворювання тварин багатьох видів і людини, при якому уражуються
слизові оболонки шлунково-кишкового тракту з утворенням білуватих
зернистих нашарувань.
Збудники захворювання — дріжджеподібні гриби із роду Candida
— переважно С. albicans, рідше — С. tropicalis, С. krusei, С. slofii. Досить
поширені в природі, існують на слизових оболонках здорових тварин на
фоні зниження стійкості організму проти захворювання, особливо при
різних травмах слизових оболонок зумовлюють запальний процес.
Представники роду Candida — одноклітинні організми, які при
поділі утворюють псевдоміцелій та міцелій, мають бластоспори,
гломерули, псевдоконідії. Від дріжджів відрізняються тим, що не
формують плодових сумок (аск). Діаметр клітин залежно від їх зрілості
коливається в межах від 2 - 5 до 5 - 9 мкм (рис.2.9).

168
 Діагностика захворювання ґрунтується переважно на даних
лабораторних досліджень, для проведення яких використовують
зіскрібки нашарувань із слизових
оболонок ротової порожнини й
шлунково-кишкового тракту, молоко
з уражених часток вим'я корів,
частини внутрішніх органів з
вузликами.
Із патологічного матеріалу
готують мазки, які досліджують
Рис. 2.9. Гриби з роду Candida
непофарбованими, а також після
фарбування за Грамом, Ціль-Нільсеном, Романовським-Гімзою. В
препаратах знаходять короткі нитки псевдоміцелію, який формується за
рахунок поділу 2 - 4 клітин. Зустрічається також переплетений
справжній міцелій з септами. В інших полях можна виявити овальні,
подібні до дріжджів клітини, що брунькуються.
Чисту культуру збудника одержують посівом патологічного
матеріалу на середовище Сабуро, пивне сусло, МПА з вмістом 2 %
глюкози, картопляний і кукурудзяний агари тощо.
Гриби роду Candida добре ростуть в аеробних умовах при
температурі 25-30 °С. На щільних середовищах утворюють S- і R-колонії
сірувато-білого або кремового кольору, що вростають у субстрат.
Діаметр колоній на 10—12-й день після посіву досягає 1 см. На рідких
середовищах випадає щільний осад, утворюється пристінне кільце.
Патогенність виділених культур підтверджують біопробою. Білих
мишей заражають у черевну порожнину, кролів — у вену. В позитивних
випадках тварини хворіють, у їхніх внутрішніх органах утворюються
вузлики, що підлягають казеозному розпаду. Із патологічного матеріалу

169
лабораторних тварин виділяється культура збудника, а в мазках
виявляються його характерні форми.

ЗБУДНИК АКТИНОМІКОЗУ
Актиномікоз — хронічне захворювання тварин, яке
характеризується гранулематозним ураженням з некротичним розпадом
різних органів і тканин. Найчутливіша до актиномікозу велика рогата
худоба, менш чутливі свині, вівці, кози та коні. Зрідка хворіють люди.
У великої рогатої худоби уражаються переважно підщелепні
лімфовузли, кістки щелепи з утворенням ущільненої пухлини —
актиномікоми. У коней найчастіше уражаються сім'яний канатик, холка,
нижня щелепа. У свиней поширений актиномікоз вим'я.
Збудник захворювання — Actinomyces bovi .
Лабораторна діагностика передбачає мікроскопічне дослідження
гною, що виділяється із актиноміком, а також гранулематозних тканин, в
яких знаходять дрібні сіруваті зерна-друзи. Ці структури промивають
дистильованою во дою, переносять на предметне скло в краплю 10-20
%-го лугу, трохи підігрівають або витримують у лузі протягом 15 хв,
наносять краплю 50 %-го гліцерину, накривають покривним склом. Під
малим збільшенням мікроскопа друза має такий вигляд: від ущільненого
гомогенного центру, здатного
розпадатись, радіально
розходяться променеві
колбоподібні утворення При
середньому збільшенні можна
помітити тонкий переплетений
міцелій без перетинок
(рис.2.10).
Рис. 2.10. Актиноміцети

170
 Виділення чистої культури збудника рідко закінчується успіхом.
Кількість позитивних випадків — 5-50%. Патологічний матеріал
відбирають асептично, промивають стерильним фізіологічним розчином,
центрифугують. Осад сіють на спеціальні м'ясні середовища, збагачені
кров'яною сироваткою, декстрозою, гліцерином, глюкозою. Збудник
культивується як в анаеробних, так і аеробних умовах при температурі
37 °С (рН середовища — 7,3-7,6). Величина колоній коливається в
межах від 0,5 до 3,0 мм. Колонії нагадують округлі грудочки білуватого
кольору.
В мазках із колоній актиноміцет, пофарбованих за Грамом,
виявляють довгі, темно-синього кольору палички, які розміщуються під
кутом одна до одної (у вигляді римської п'ятірки). В аеробних умовах
збудник формує колонії величиною до 4 мм, з втиснутими в агар краями
і нерівною поверхнею, які складаються з довгого міцелію без септ,
здатного позитивно фарбуватись за Грамом.

Питання для самоконтролю

1 Збудники цвілевих мікозів.

2. Якими ознаками супроводжується аспергільоз?
3. Які дослідження проводять при лабораторній діагностиці
аспергільозу?
4. Морфологія аспергілових грибів.
5. Що таке мукормікоз?
6 Як діагностують мукормікоз у лабораторії?
7. Яке захворювання викликають дріжджеподібні гриби роду
Candida?
8. Який патологічний матеріал досліджують на кандідамікоз?
9 Культуральні властивості збудника кандідамікозу.
10. Як клінічно перебігає актиномікоз?
11. Що таке друзи і яке вони мають значення при діагностиці
актиномікозу?

171
 ТЕМА 3. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ ОБ'ЄКТІВ ЗОВНІШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

Мета: Оволодіти методиками мікробіологічного дослідження

води, повітря, ґрунту.

Основні відомості. В процесі отримання тваринницької продукції

періодично проводять санітарно-бактеріологічне дослідження грунту,
води й повітря як основних об'єктів зовнішнього середовища з метою
уточнення і прогнозування епізоотичної (епідемічної) ситуації. Прямий
вияв у цих об'єктах збудників інфекційних захворювань має вирішальне
значення при визначенні факторів поширення інфекцій.
Сучасні методи бактеріологічних досліджень не є універсальними,
до того ж кожний збудник потребує застосування спеціальних прийомів
для індикації; кількість патогенних мікроорганізмів у забруднених
об'єктах часто незначна, а їх розміщення — нерівномірне. Все це
створює суттєві труднощі при здійсненні відповідних робіт. У зв'язку з
цим санітарно-бактеріологічний контроль об'єктів зовнішнього
середовища грунтується, в першу чергу, на визначенні загальної
кількості мікроорганізмів у певному об'ємі (масі) досліджуваного
матеріалу.
Більш достовірні дані про можливий вміст патогенних бактерій у
навколишньому середовищі одержують шляхом визначення
мікроорганізмів, які перебувають у тих місцях, що й хвороботворні.
Вони одержали назву санітарно-показових, або індикаторних.
Наприклад, показником наявності збудників кишкових інфекцій у воді
або грунті може бути присутність нормальної мікрофлори кишковика
тварин і людини.

172
 Санітарно-мікробіологічне дослідження води

Матеріал і обладнання. Проба водопровідної води об’ємом

500 см , стерильний флакон з кришкою об’ємом 1000 см3, МПА, Ендо,
3

ГПС, напіврідке середовище з глюкозою, стерильні бактеріологічні

чашки, пробірки, піпетки, бактеріологічна петля, стерильний
фізрозчин, реактив для оксидазного тесту, набір для фарбування за
Грамом, мікроскоп, термостат.

Відбір проб і мікробіологічний аналіз води проводять згідно з МВ

10.2.1-113-2005 «Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної
води».
Відбір проб води здійснює особа, яка володіє методикою відбору
та умов транспортування проб. Проби води відбирають у спеціально
призначені стерильні флакони місткістю не менше 500 см3 зі щільно
закритими пробками, які захищені та фіксовані ковпачками. Пробки
повинні бути з матеріалу, який витримує стерилізацію сухим жаром чи в
автоклаві.
Відбір проб проводять з дотриманням правил асептики: пробка з
ковпачком знімається безпосередньо перед відбором проби, край
флакона та пробка не повинні ні до чого торкатися.
Перед взяттям проби водопровідної води кран фламбують за
допомогою тампона, змоченого спиртом і зливають воду протягом 10-15
хв. при повністю відкритому крані. Воду відбирають безпосередньо з
крану без гумових шлангів, водорозподільчих сіток чи інших насадок.
Проби хлорованої водопровідної води відбирають в ємності, куди
попередньо для нейтралізації залишкової кількості дезінфектанту
вносять до стерилізації 10 мг натрію сірчистокислого у вигляді кристалів
чи 2 см3 його 1,5% розчину на 500 см3 води. Відібрані проби маркують і
супроводжують актом відбору проб води.

173
 Проби води із відкритих водойм беруть на відстані 10-15 см від
поверхні води і від дна у стерильні флакони за допомогою спеціальних
приладів (батометр) з дотриманням правил асептики.
З криниці проби відбирають до початку користування нею або
через 10-12 год після останнього набирання води. Загальний об'єм води,
який надсилають у лабораторію, повинен становити не менше 500 мл.
Доставка проб в лабораторію здійснюється в продезінфікованих
термоконтейнерах при температурі (6 ± 2) Со.
Бактеріологічне дослідження води здійснюють по можливості
швидко й не пізніше як через 2 год після відбирання проб. Мінімальний
термін зберігання проб може бути подовжений до 6 год при температурі
4-5 °С. В разі неможливості дотримання термінів доставки проби і
температури зберігання аналіз проводити не рекомендується.
Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води
встановлює ступінь її епідбезпеки відповідно до вимог, що
пред'являються при централізованому питному водопостачанні
ДСанПіНу N 383/96 "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води
централізованого господарсько-питного водопостачання".
Основним санітарно-показовим тестом забруднення води
виділеннями кишечника теплокровних тварин і людини є бактерії
групи кишкових паличок (БГКП). БГКП не є таксономічною групою, це
утилітарна назва, і за визначенням до неї входять грамнегативні бактерії,
що не утворюють спор, не мають ферменту оксидази і ферментують
глюкозу з утворенням кислоти та газу.
Кількісно наявність БГКП характеризується двома показниками:
індексом БГКП і титром БГКП. Індекс БГКП (колі-індекс) - це кількість
бактерій групи кишкових паличок в 1 літрі води. Титр БГКП (колі-
титр) – це найменша кількість досліджуваної води (в мл), у якій
виявляють одну БГКП.

174
 Визначення БГКП. Е. соlі є цінним санітарним індикатором,
оскільки наявність їх у воді свідчить про фекальне забруднення
водоймищ.
При визначенні колі-титру води значного поширення набув метод
мембранних фільтрів.
Пробу води в об'ємі 300 - 500 см3, відібраної з джерела
централізованого водопостачання, пропускають через нітроцелюлозні
фільтри № 3, які стерилізують кип’ятінням у дистильованій воді двічі-
тричі протягом 10 - 15 хв з обов'язковою зміною води. З відкритих
водоймищ воду фільтрують в об'ємах 100, 10, 1 і 0,1 мл. Після
закінчення фільтрації фільтри знімають стерильним пінцетом і
накладають на поверхню середовища Ендо у бактеріологічну чашку, яку
ставлять у термостат при температурі 37 °С на 24 год. Підраховують
кількість колоній, характерних для кишкової палички. Для остаточного
визначення кишкової палички із типових колоній здійснюють посів на
глюкозо-пептонне середовище. Результат вважають позитивним при
утворенні кислоти й газу.
При дослідженні води невідомої якості спочатку готують її 10-
разові розведення, орієнтуючись на попередній дослід таким чином, щоб
на фільтрах після пропускання проби виросло не більше 50—70 колоній,
в т. ч. не більше 30 колоній кишкової палички.
Для виведення показника колі-індексу кількість колоній, що
виросли на фільтрі, перемножують на 1000 і ділять на об'єм води, який
було пропущено через фільтр. У якісній питній воді колі-індекс не
вищий за 3 КУО/дм3, що відображено в державному стандарті ДСанПіН
N 383/1940.
При визначенні колі-титру методом бродильної проби певні
об'єми води висівають в одне із середовищ накопичення (глюкозо-

175
пептонне або лактозо-пептонне з індикатором та бродильною трубкою) з
наступним пересівом на щільне середовище Ендо або Левіна.
Характерні для кишкової палички колонії досліджують шляхом
мікроскопії та за оксидазним тестом. Для цього смужки фільтрувального
паперу змочують розчином -нафтолдіетил-n-фенілдіаміну і
бактеріологічною петлею штрихами наносять на них мікробну масу з
характерних колоній. Якщо в мазках знаходять типові для кишкової
палички форми, а смужка паперу після нанесення культури не змінює
кольору, то це остаточно підтверджує наявність Е. сої.
При невідповідності якості питної води нормативам за
органолептичними та іншими інтегральними показниками визначають
показник «загальне мікробне число» - загальну кількість
мікроорганізмів при різних температурах інкубації - при (36 ± 1) С0
протягом 24 год. та при (22 ± 1) Со протягом 48 год.
Зростання числа колоній при інкубації (36 ± 1) Со свідчить про
можливе забруднення антропогенною мікрофлорою. Зростання числа
бактерій, які розвиваються при (22±1) Со, свідчить про погіршення
санітарно-гігієнічного стану системи водопідготовки чи водопостачання.
Крім того, різке підвищення цього показника може свідчити про появу
джерела забруднення або виникнення умов для вторинного
розмноження мікроорганізмів. Визначення цього показника на етапах
підготовки води несе суттєву інформацію щодо ефективності технології
її очищення та знезараження.

Визначення загального мікробного числа.

Для визначення загальної кількості бактерій із загальної проби
води – 500 см3, у стерильних умовах відбирають 1 см3 і отримують
розведення у пробірках з 9 см3 фізрозчину від 1:10 до 1:100. З цих
розведень відбирають по 1 см3 і вносять у чашки Петрі. Далі засіяні

176
чашки заливають 10-12 см3 розплавленого і остудженого до 450С МПА.
Після цього чашку закривають і обережно перемішують агар з посівним
матеріалом. Після того, як агар затвердіє чашки перевертають догори
дном і ставлять у термостат. Інкубують за різних температур - при (36 ±
1) С0 протягом 24 год. та при (22 ± 1) С0 протягом 48 год.
Через 24 (48) годин враховують результат. Оцінюють тільки ті
розведення, при посіві яких на чашці виросло від 30 до 300 колоній. При
посіві 1 см3 нерозведеної проби враховують будь-які кількості колоній,
але не більше 300. Результат підрахунку колоній у кожній чашці
виражають у кількості бактерій на 1 см3 води з урахуванням посіяного
об’єму. За кінцеву кількість бактерій приймають середнє арифметичне
результату підрахунку на чашках різних розведень.
Питна вода безпечна в епідемічному плані, якщо мікробне число
не перевищує 100 КУО/см3. Загальну оцінку якості води за
мікробіологічними показниками подано в табл. 2.2.
Поряд з визначенням у воді санітарно-показових бактерій також
визначають санітарно-показовий вірус – кишковий бактеріофаг.
Виявлення бактеріофагів у воді з резервуару чистої води свідчить про
недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі
водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного
забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.
Також визначають наявність патогенних бактерій та вірусів, які в
нормі повинні бути відсутні в 1 л води. Насамперед це визначення
сальмонел, шигел, холерних вібріонів, ентеро-, адено- та ротавірусів.
Передбачено також визначення наявності інших збудників
бактеріальних та вірусних інфекцій у відповідності з наявною
епідемічною ситуацією.

177
 Таблиця 2.2.
Класифікація якості води за мікробіологічними показниками
(ГОСТ 17.1.3.07—82)
Клас якості і Загальна Кількість Відношення
оцінка води кількість бактерій, сапрофітних загальної кількості
106 клітин/см3 бактерій, 10а бактерій до
клітин/ см3 кількості
сапрофітних
І. Дуже чиста Менше 0,5 Менше 0,5 Менше 103
II. Чиста 0,5—1,0 0,5—5,0 Більше 103
III. Помірно 1,0—3,0 5,1—10,0 103-102
забруднена
IV. Забруднена 3,0—5,0 10,1—50,0 Менше 102
V. Брудна 5,1—10,0 50,1—100,0 Менше 102
VI. Дуже брудна Більше 10,0 Більше 100,0 Менше 102

Санітарно-мікробіологічне дослідження повітря

Прилади та обладнання. Стерильні чашки Петрі з середовищами

МПА, глюкозо-кров’яний агар, апарат Кротова.

Повітря – не є сприятливим середовищем для розвитку

мікроорганізмів, але відіграє суттєву роль у їх розповсюдженні, в тому
числі патогенних. Мікроорганізми потрапляють у повітря з поверхні
ґрунту та рослин, із викидами деяких виробництв тощо. Мікробіота
атмосферного повітря бідна та варіабельна і залежить від інтенсивності
сонячної радіації, вітру, осадів, характеру ґрунту, пори року.
Через повітря людині можуть передаватися разом з краплинами
слизу й мокротиння при чханні, кашлі, розмові збудники хвороб –
скарлатини, дифтерії, коклюшу, стафілококової, стрептококової і
менінгококової інфекцій, ангіни, туберкульозу, грипу, кору, натуральної

178
і вітряної віспи, герпесу, епідемічного паротиту, краснухи,
аденовірусних та інших захворювань. Повітряно-пиловим шляхом
розповсюджуються спори сибірки, правця, мікроскопічних грибів,
збудники Ку-лихоманки, орнітозу та ін.
Для контролю загального санітарного стану повітряного
середовища, а також у зв'язку з тим, що повітряно-крапельним шляхом
передаються збудники багатьох інфекційних захворювань, періодично
проводять бактеріологічне дослідження повітря закритих приміщень.
Санітарно-бактеріологічне дослідження повітря проводять у
плановому порядку в дитячих закладах, лікарняних палатах,
операційних, пологових залах, аптеках тощо. Критеріями санітарно-
гігієнічної оцінки повітря приміщень є його загальна бактеріальна
забрудненість, а також наявність у ньому α- і -гемолітичних
стрептококів та гемолітичних стафілококів.
Розрізняють два основних методи дослідження мікрофлори
повітря: седиментаційний та аспіраційний.
Суть седиментаційного методу полягає у тому, що
бактеріологічні чашки з щільним живильним середовищем залишають
відкритими в місцях проведення досліджень на 5 - 10 хв при визначенні
загального забруднення і до 40 хв – при індикації кокової флори. Потім
чашки закривають й переносять у термостат на 24 год, витримують
стільки ж при кімнатній температурі і підраховують кількість колоній,
що виросли. Орієнтовно вважають, що на поверхню живильного
середовища бактеріологічної чашки площею 100 см2 протягом 5 хв осяде
стільки бактерій, скільки міститься в 10 л повітря.
Аспіраційні методи дослідження повітря базуються на фільтрації
або аспірації (просмоктуванні) його через спеціальні прилади (апарат
Кротова) або фільтри, рідини чи порошки, що адсорбують мікрофлору.

179
Метод Кротова базується на ударно-прибивній дії потоку
досліджуваного повітря.

Рис. 2.11 Апарат Кротова: зовнішній вигляд (а), схема будови

(б).

Прилад складається (рис.2.11) з основи (2), корпусу (1) і кришки

(8). В корпусі знаходиться електромотор (3), центробіжний вентилятор
(4) і диск-підставка для чашки Петрі (5). У кришці є клиновидна щілина,
через яку засмоктується повітря (10).
Для визначення й регулювання кількості повітря, яке
пропускається через апарат, із зовнішньої сторони корпусу знаходиться
ротаметр. Потік повітря, проходячи через клиновидну щілину з великою
швидкістю, вдаряється в поверхню поживного середовища. В результаті
удару мікроорганізми, аерозолі та пилові частинки прибиваються до
поверхні середовища і рівномірно розподіляються на ньому (чашка
Петрі обертається рівномірно разом із диском-підставкою). Після
вирощування у термостаті підраховують кількість колоній і проводять
перерахунок на вміст бактерій в 1 м3 повітря.

180
 При дослідженні повітря лабораторій, приміщень, де утримували
хворих на інфекційні хвороби тварин, за інших епізоотичних показників
з повітря виділяють патогенні мікроорганізми. В таких випадках
використовують спеціальні живильні середовища, розраховані на
культивування конкретних збудників.
Дослідження повітря на наявність гемолітичних стрептококів.
Через апарат Кротова пропускають не менше 250 л повітря з
використанням двох бактеріологічних чашок з елективним середовищем
на вибір: 3-5 %-й кров'яний агар, середовище Гарро, середовище
Туртецького. Чашки ставлять у термостат при температурі 37 °С,
інкубують близько 24 год, витримують при кімнатній температурі дві-
три доби. Після цього звертають увагу на наявність дрібних, сірувато-
зелених колоній, оточених прозорою або зеленуватою зоною гемолізу. З
колоній, характерних для стрептококів, готують мазки, які фарбують за
Грамом. Стрептококи розміщуються парами або утворюють невеликі
ланцюжки типу дипло-стрептокока і за цими ознаками легко
виявляються.
Офіційних стандартів чистоти повітря не розроблено,
запропоновані лише тимчасові положення про допустиме нормування
мікробного забруднення окремих лікарняних та інших приміщень. Так, у
повітрі операційних, родильних залів, реанімаційних, перев’язувальних і
процедурних приміщень загальна кількість бактерій в 1 м3 до роботи не
повинна перебільшувати 500, після роботи – 1000; кількість S. aureus не
більше 4, а гемолітичних стрептококів взагалі не повинно бути. У
повітрі лікарняних палат взимку ЗМЧ не повинно перевищувати 3500, S.
aureus – до 24, а гемолітичних стрептококів не більше 24. Влітку ці
показники не повинні перевищувати відповідно 5000, 52 і 36 КУО/ м3
повітря відповідно.

181
 Санітарно-мікробіологічне дослідження ґрунту

Прилади та обладнання. Стерильні чашки Петрі, колби на 250

мл, що містять 99 мл стерильної водопровідної води, пробірки з 9 мл
стерильної води, піпетки на 1 см3; пробірки з МПА; олівці; наважки
ґрунту, годинникове скло; ваги; металеві шпателі або ложки.

З усіх об'єктів зовнішнього середовища грунт містить найбільшу

кількість мікроорганізмів, де вони захищені від згубного впливу
ультрафіолетових сонячних променів, знаходять живильні середовища і
вологу — сприятливі умови для росту й розмноження.
Основні представники мікрофлори ґрунту – нітрифікуючі,
денітрифікуючі, азотфіксуючі бактерії, сірко-, залізобактерії, гриби,
найпростіші. З виділеннями людей і тварин у грунт попадають і деякий
час там зберігаються збудники правця, злоякісного набряку, ботулізму,
сибірки, черевного тифу, дизентерії, холери, окремі віруси.
Необхідність у проведенні бактеріологічного аналізу грунту
виникає у зв'язку з вибором ділянок для будівництва різних об'єктів, в
тому числі й тваринницьких ферм, при визначенні впливу на нормальну
мікрофлору грунту різних хімічних добавок (гербіциди, пестициди,
мінеральні добрива тощо), при виникненні підозри на наявність у грунті
збудників інфекційних хвороб.
Необхідність досліджувати мікрофлору ґрунту виникає у зв'язку з
вибором ділянок для будівництва різних об'єктів, в тому числі й
тваринницьких ферм, санаторіїв, дитячих майданчиків, таборів
відпочинку, пляжів, при визначенні впливу на нормальну мікрофлору
грунту різних хімічних добавок (гербіциди, пестициди, мінеральні
добрива тощо), при виникненні підозри на наявність у грунті збудників
інфекційних хвороб.
Залежно від завдань і мети дослідження проводять короткий або
повний санітарно-мікробіологічний аналіз ґрунту, а також виявлення

182
патогенних бактерій і вірусів. При короткому аналізі встановлюють
загальне мікробне число (ЗМЧ), титр бактерій групи кишкових паличок
(колі-титр), титри ентерококів, титр анаеробів (перфрінгенс-титр) і
термофільних мікроорганізмів. При повному аналізі ґрунту, крім
названих показників, визначають ще загальне число і відсоток спор,
кількість актиноміцетів, грибів, аеробних целюлозних і амоніфікуючих
бактерій. За необхідності визначають наявність у ґрунті патогенних
мікроорганізмів.
Відбір проб. Відповідно до міждержавного стандарту ГОСТ
17.4.4.02-84 «Охорона природи. Ґрунти. Методи відбору та підготовки
проб для хімічного, бактеріологічного, гельмінтологічного аналізу»,
проби відбираються «методом конверту» на прямокутних чи квадратних
ділянках розміром 10х20 чи більше метрів. У кожній з п’яти точок
«конверта» відбирають 1 кг ґрунту на глибині 20 см. З відібраних зразків
готують середню пробу масою 1 кг.
До відібраної проби заповнюють супровідний бланк, у якому
вказують: місце, адресу і призначення земельної ділянки, тип ґрунту,
рельєф, рівень стояння ґрунтових вод, мету і об’єм аналізу, результати
досліджень, виконаних на місці, дату і час відбору, погодні умови
попередніх 4-5 днів, ким відібрана проба, його підпис. Проби
упаковують у скляний закритий посуд, поліетиленові мішечки.
Ґрунтові зразки бажано досліджувати в день їх відбору, оскільки
кількість мікроорганізмів може змінитися й зберігають в холодильнику
при температурі 4-5 °С не більше 24 год.
У лабораторії пробу розподіляють по стерильній поверхні,
видаляють різні включення (коріння рослин, камінці тощо), потім
збирають, розтирають у стерильній ступці і просівають через стерильне
сито з діаметром вічок 3 мм. Після ретельного перемішування для
аналізу відважують 30 г грунту.

183
 В процесі досліджень визначають мікробне число (загальна
кількість бактерій, що містяться в 1 г грунту), колі-титр, перфрінгенс-
титр (табл.2.3.).
Якісне дослідження з визначенням видового складу проводять за
показниками наявності у грунті патогенних мікроорганізмів.
Таблиця 2.3.
Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту

Характеристика Загальне Колі-титр Перфрінгенс- К-сть

грунту мікробне титр термофільних
число бактерій в 1 г
(ЗМЧ)
Чистий >5 х 105 1,0 і більше 0,01 і більше 102-103
Помірно <5 х 106 0,9-0,01 0,009-0,0001 103-105
забруднений
Сильно 5 х 106 0,009 і 0,00009 і 105-107
забруднений менше менше

Визначення мікробного числа. В колбу, що містить 270 мл

стерильної водопровідної води, вносять 30 г грунту і ретельно
перемішують струшуванням. З одержаної суспензії готують серійні
розведення проби з коефіцієнтом 10. Для чистих грунтів досить
чотирьох ступенів розведення, для забруднених — шести — дев'яти.
У штатив ставлять відповідну кількість пробірок, які містять по 9
мл стерильної водопровідної води. Із колби з суспензією 1 : 10
стерильною піпеткою відбирають і переносять їв першу пробірку 1 мл
суспензії, ретельно перемішують і послідовно переносять по 1 мл з
першої в другу, потім в третю і т. д., одержуючи при цьому розведення
суспензії 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 і т. д. Для зручності показники
розведення краще записувати так: відповідно ІСН, 10-2, 10-3 і т. д. З
останніх трьох-чотирьох пробірок окремими піпетками у стерильні
бактеріологічні чашки вносять по 1 мл суспензії, додають по 15—20 мл
розплавленого й охолодженого до температури 50 °С МПА,

184
перемішують легеньким струшуванням. Після застигання агару чашки
поміщають в термостат при температурі 28—30 °С. Через 48 год
підраховують кількість колоній, що виросли в кожній чашці,
перемножують на ступінь розведення й одержують середньо-
арифметичне число, яке і буде показником кількості мікроорганізмів у 1
г грунту (Сидоренко, 1978).
Приклад. Посіяно 0,1 мл суспензії із розведення 10-4 (1 : 10 000).
На площі першої бактеріологічної чашки виросло 100 колоній, другої —
80- (середній показник — (100+80):2= 90). У зв'язку з тим, що посіяно
0,1 мл із розведення 10~4, то остаточне розведення грунту становить 10-5
(1 : 100 000). Кількість колоній в перерахунку на 1 г грунту — 90-105 =
9-106 (9 000 000). Отже, 1 г грунту містить 9 млн бактерій.
Для визначення кількості бацил використовують розведення
ґрунтової суспензії в концентрації з 10-1 до 10-3. Суспензію прогрівають
на водяній бані при температурі 80 °С протягом 15 хв. Посів здійснюють
на живильне середовище, яке складається із рівних частин сусло-агару і
звичайного МПА.
Колі-титр грунту найчастіше визначають титраційним методом
на середовищі Кесслер-Свенертона (див. додаток). Перше розведення
ґрунтової суспензії здійснюють у стерильній колбі у співвідношенні 1:10
(10 г грунту розводять у 100 мл стерильної водопровідної води). Решту
розведень (по 10 мл) готують у пробірках описаним раніше способом.
Перше розведення (1 : 10) в об'ємі 10 мл сіють у колбу з 50 мл
середовища Кесслер-Свенертона (у 9 см3 глюкозо-пептонного або
лактозо-пептонного середовища), що відповідає посіву 1 г грунту. Із
наступних розведень в пробірки з цим же середовищем в об'ємі 9 мл
сіють по 1 мл, що відповідатиме 0,1 г; 0,01; 0,001 г і т. д. маси грунту.
Засіяні пробірки витримують у термостаті при температурі 43 °С
(допускається 37 °С). В розведеннях, де відмічено процеси

185
газоутворення й помутніння, можуть мати місце бактерії групи кишкової
палички. З таких пробірок здійснюють пересів у бактеріологічні чашки
на середовище Ендо, які витримують у термостаті при температурі 37 °С
протягом 24 год. У випадку присутності кишкової палички на поверхні
середовища виростають характерні колонії темно-червоного кольору з
металевим блиском фуксину, із яких готують препарати й
мікроскопують, ставлять пробу на оксидазу й вираховують титр БГКП
так само, як і для води.
Найбільше розведення грунту, в якому вдається виявити кишкову
паличку, відповідатиме колі-титру проби.
Визначення перфрінгенс-титру. Перфрінгенс-титр (титр
анаеробів) ґрунту – мінімальна кількість грунту в грамах, в якій
міститься одна анаеробна клостридія C. perfringens.
Розведення ґрунтової суспензії готують за описаним раніше
способом. Для знищення неспороутворюючих мікроорганізмів пробірки
прогрівають при температурі 80 °С протягом 15 хв, висівають в
середовище_Вільсона-Блер (див. додаток) й інкубують у термостаті 24
год CL. perfringens виявляють за наявністю чорних колоній. За титр
цього мікроорганізму приймають найменшу масу грунту, в якій
з'являється характерний ріст з почорнінням середовища.
При підозрі на наявність патогенних мікроорганізмів (збудники
сибірки, туберкульозу, бруцельозу тощо) грунт досліджують відповідно
до методів індикації конкретних видів.

Питання для самоконтролю

1. Які мікроби називаються санітарно-показовими?

2. Як визначають мікробне число грунту?
3. Основні етапи визначення колі-титру і титру-перфрінгенс
грунту.

186
 4.Як відбирають проби води для санітарно-бактеріологічного
дослідження?
5. Що таке мікробне число води і як його визначають?
6. Що таке колі-титр та колі-індекс води?
7. Методи дослідження мікрофлори повітря

ТЕМА 4. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛОКА І МОЛОЧНИХ ПРОДУКТІВ

Лабораторне заняття №1

МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛОКА

Молоко — складний біологічний продукт, в якому можуть

розмножуватись бактерії найрізноманітніших видів, у т. ч. й патогенні.
Дослідження вмісту мікрофлори, дотримання заходів, що запобігають
мікробному обсіменінню молока та молочних продуктів, ретельний
мікробіологічний контроль – це складові належного успіху в отриманні
якісного та безпечного асортименту молочних продуктів.
Санітарно-бактеріологічну оцінку молока основано на визначенні
загального мікробного забруднення, встановленні колі-титру й індикації
патогенних мікробів (при наявності епізоотичних показників). Загальне
бактеріальне обсіменіння молока у виробничих умовах визначають за
допомогою редуктазної проби з метиленовим синім, а також пробою з
резазурином.
Відбирання проб сирого молока для мікробіологічного
контролю проводять згідно ДСТУ ISO 707-2002 «Молоко і молочні
продукти. Настанови з відбирання проб». Дотримуються наступних
правил:
1. Відбір проб для мікробіологічних досліджень проводить
особа, що має відповідну підготовку до застосування такої методики.

187
 2. Відбирання проб треба виконувати таким чином, щоб проби
цілком характеризували продукт.
3. Слід відбирати паралельні проби і зберігати їх на випадок
проведення арбітражних досліджень.
4. Обладнання з відбирання проб повинно бути виготовлене з
нержавіючої сталі або іншого придатного для цього матеріалу
відповідної міцності, який не буде викликати змін у пробі, що можуть
вплинути на результати дослідження. Вci поверхні повинні бути
гладенькі, без тріщин. Кути повинні бути заокруглені. Перед
використання м обладнання має бути сухим.
5. Проби для мікробіологічного контролю відбирають у
стерильний посуд, використовуючи стерильне приладдя та накривають
стерильними накривками.
6. Стерилізацію приладдя проводять такими двома основними
методами:
- витримують в сушильній шафі за температури 170-175ºC
упродовж 2±0,5 год;
- витримують в автоклаві за температури 121±1ºС не менше, ніж
20 хв.
Можна використати також один з додаткових методів:
- витримують упродовж 1-2 сек. робочі поверхні обладнання в
полум’ї спиртівки або газового пальника;
- занурюють у розчин етанолу концентрацією не менше 70 %;
- занурюють в етанол концентрацією 96 % з наступним
фламбуванням.
7. Перемішування сирого молока перед відбиранням проб
проводять мішалками (колотівками) ручними або механічними
(рис.2.12).

188
 8. Відбір проб проводять відбірником або черпаком, які перед
використанням повинні бути простерилізовані.
9. З точкових проб, відібраних з кожної фляги, відра,
цистерни, баку готують об’єднану пробу. Кількість об’єднаної проби
повинна бути не меншою, ніж 100 см3.
10. Відібрані проби молока забезпечують етикеткою, на якій
помічають: номер проби, номер та обсяг партії, дату та час відбирання
проби, посаду та підпис особи, що відбирала пробу.
11. Мікробіологічне контролювання продукту виконують не
пізніше, ніж через 4 год з моменту відбирання проби. До початку
контролювання пробу зберігають у холодильнику за температури не
вище 6°С. Проби продукту повинні бути доставлені в лабораторію не
пізніше ніж через 2 год після їх відбирання.

А В

Рис. 2.12. А- Ручна мішалка для бідонів і відер (розміри у

міліметрах); Б - мішалка для автомобільних, залізничних цистерн і
цистерн на фермах (розміри у міліметрах)

Мікробіологічне дослідження молока і молочних продуктів

здійснюють відповідно до ДСТУ 7357:2013 «Молоко та молочні
продукти. Методи мікробіологічного контролювання».

Визначення бактеріальної забрудненості сирого молока за

редуктазною пробою
Для визначення ступеня обсіменіння сирого молока мікрофлорою
застосовують редуктазну пробу. Суть її полягає у встановленні

189
біохімічної активності мікроорганізмів, які продукують фермент
редуктазу, що здатна знебарвлювати деякі фарби, зокрема метиленовий
синій.
В основу методу покладено визначення часу, необхідного для
знебарвлення барвника. Перевага редуктазної проби в порівнянні з
прямим бактеріологічним методом полягає у швидкості отримання
результату (приблизно через 5,5 год). Чим швидше відбувається
знебарвлення чи зміна кольору фарбника тим більше в дослідній пробі
молока редуктази й мікроорганізмів, які її продукують.
Однак не всі мікроорганізми володіють редукуючою активністю.
Більшою мірою це властивість мають молочнокислі стрептококи,
кишкові палички, маслянокислі і гнильні бактерії, дещо менше -
сальмонели і стафілококи, а збудники маститу стрептококової етіології
позбавлені цієї здатності. Тому показники редуктазної проби необхідно
враховувати в комплексі з іншими результатами досліджень.
Визначення бактеріальної забрудненості молока за визначення
редуктази можуть проводити двома методами: з метиленовим синім чи
резазурином.
Метод визначення редуктази з метиленовим синім
Метод заснований на відновленні метиленового синього
окислювально-відновлювальними ферментами, що виділяють в молоко
мікроорганізми. По тривалості знебарвлення метиленового синього
оцінюють бактеріальну забрудненість сирого молока.
Прилади і реактиви: стерильні пробірки з корками, піпетки 1, 20
мл, редуктазник або водяна баня, робочий розчин метиленового синього.
Приготування розчину: метиленової синьки 0,5 г переносять у
мірну колбу ємністю 100 мл, доводять до мітки кип'яченою і охоло-
дженою до (25±2°С) дистильованою водою. Суміш ретельно перемі-

190
шують до повного розчинення. Термін зберігання розчину - не більше 12
місяців у банках, захищених від світла.
Техніка визначення. Попередньо готують робочий розчин
метиленового синього (до 5 мл насиченого спиртового розчину
метиленового синього додають 195 мл дистильованої води). Одержаний
розчин розливають у пробірки (по 1 мл), куди вносять проби молока (по
20 мл), закорковують гумовими пробками, ретельно перемішують
триразовим перевертанням.
Пробірки поміщають у редуктазник, або водяну баню з
температурою води (37±1) оС. Рівень води у редуктазнику, водяній бані
після занурення пробірок з молоком повинен доходити до рівня рідини в
пробірці, або бути дещо вищим. Температура води повинна бути (37±1)
о
С упродовж всього терміну дослідження.
Момент занурення пробірок у редуктазник чи інший прилад
вважають початком процесу контролювання. Зміну кольору молока
враховують через 20 хв, 2 год і 5 год 30 хв від моменту вміщення
пробірок в редуктазник. Закінчують спостереження, як тільки молоко
почне знебарвлюватись. Ледь забарвлений кільцеподібний шар зверху
(товщиною не більше 1 см) або невелику забарвлену частину знизу
пробірки, при знебарвленні проби, не беруть до уваги.
Опрацювання результатів. Ступінь бактеріального забруднення
визначають за тривалістю знебарвлення молока з метиленовим синім
(табл.2.4).
Незважаючи на простоту виконання й доступність, згадана проба
має істотні недоліки, а саме:
-необхідні тривалі спостереження при оцінці доброго (якісного)
молока (5 год 30 хв);
- проба дає орієнтовні показники, бо приблизно третя частина
мікрофлори молока повільно знебарвлює метиленовий синій;

191
 - патогенні стрептококи і психрофільні бактерії не мають
редуктазної активності щодо метиленового синього;
- на показники проби негативно впливає низька температура, і в
охолодженому молоці бактерії втрачають здатність виділяти редуктазу.
Таблиця 2.4.
Ступінь бактеріального забруднення за тривалістю
знебарвлення молока з метиленовим синім
Тривалість Орієнтовна кількість
знебарвлення, год бактерій в 1 см3 молока, КУО
Від 5 год та більше До 100 тис.
Від 2 год до 5 год до 300 тис.
Від 20 хв до 2 год до 500 тис.
До 20 хв. до 3 млн

З урахуванням згаданих недоліків для визначення мікробного

числа молока було запропоновано резазуринову пробу, яка має деякі
переваги над редуктазною з метиленовим синім.
Основними перевагами резазуринової проби є її незначна
тривалість (аналіз прискорюється у п'ять разів), а також здатність всієї
мікрофлори молока знебарвлювати даний барвник.

Метод визначення редуктази з резазурином

Метод заснований на відновленні резазурину окислювально-
відновлювальними ферментами, що виділяють в молоко мікроорганізми.
По тривалості зміни забарвлення резазурину оцінюють бактеріальне
обсіменіння сирого молока.
Прилади і реактиви: чисті пробірки з корками, піпетки 1 і 10 мл,
редуктазник або водяна баня з термометром, робочий розчин
резазурину.

192
 Приготування розчину резазурину. Резазурин (C12 H7 NO4), або
оксазон— чутливий до дії світла препарат, який зберігають у темноті.
Основний розчин резазурину готують шляхом розчинення 100 мг
препарату в 200 мл перевареної й охолодженої до 25±2°С дистильованої
води. Зберігають у темноті не більше 20 діб.
Для одержання робочого розчину основний розводять
дистильованою водою 1 : 10, Термін зберігання робочого розчину в хо-
лодильнику при температурі 8—10 °С - не більше 3 діб.
Техніка визначення. Дослідження редуктазної активності слід
виконувати не раніше, ніж через 2 год після доїння.
У пробірки наливають по 1 см3 робочого розчину резазурину і по
10 см3 досліджуваної проби молока, закривають гумовими корками і
змішують, повільно перевертаючи пробірки тричі.
Пробірки поміщають у редуктазник, або водяну баню з
температурою води (37±1) оС, де витримують їх протягом 4 год. Рівень
води у редуктазнику, водяній бані після занурення пробірок з молоком
повинен доходити до рівня рідини в пробірці, або бути дещо вищим.
Температура води повинна бути (37±1) оС упродовж всього терміну
дослідження.
Момент занурення пробірок у редуктазник чи інший прилад
вважають початком процесу контролювання. Результати проби
враховують через 20 хв, 1 год. Можливе забарвлення молока в цих
пробірках при струшуванні не враховують. Через 1 год пробірки
дістають із редуктазника (водяної бані). Пробірки з молоком, які мають
забарвлення від сіро-бузкового до бузкового зі слабким сірим відтінком,
залишають у редуктазнику ще на 30 хв.
Опрацювання результатів. Рівень бактеріального забруднення
молока визначають за тривалістю знебарвлення або зміною кольору
індикатору резазурину (табл.. 2.5, Додаток А).

193
 Таблиця 2.5.
Рівень бактеріального забруднення молока та зміна
забарвлення молока з резазурином

Забарвлення молока Орієнтовна

кількість бактерій в 1
Через 20 хв Через 60 хв см3 молока, КУО

Сіро-бузкове до бузкового Від 100 тис до

Без змін
зі слабким сірим відтінком 500 тис
Бузкове з рожевим Від 500 тис до 3
Без змін
відтінком або яскраво-рожеве млн
Біле Рожеве бліде або біле Більше, ніж 3 млн

Мікробіологічні показники для молока наведені в таблиці 2.6.

відповідно до «Медико-біологічних вимог і санітарних норм якості
продовольчої сировини та харчових продуктів» №5061-89.
Таблиця 2.6.
Нормативні мікробіологічні показники для молока

МАФАнМ, Маса продукту (г), в якому не

КУО/г, не допускаються
Назва продукту більше БГКП Патогенні
ентеробактерії, у т.ч.
сальмонели
1 2 3 4
Молоко пастеризоване 5х104 1,0 50
(для дитячого
харчування)
Молоко пастеризоване: 5х104 1,0 25
Група А
Група В 1х105 0,1 25
У флягах і цистернах 2х105 0,1 25

194
 Додаток А
Шкала кольору молока за редуктазною пробою (кількість
мікроорганізмів, КУО/см3 )
забарвлення молока

через 1 год
через 20 хв

від 100 тис до 500 тис від 500 тис до 3 млн більше, ніж 3 млн більше, ніж 3 млн

Визначення кількості мезофільних аеробних і факультативно–

анаеробних мікроорганізмів (КМАФАнМ)

Метод базується на здатності мезофільних аеробних і

факультативно- анаеробних мікроорганізмів розмножуватися на
селективних твердих поживиних середовищах за температури (30±1) оС
упродовж 72 год.
Підготовка проб. Молоко, вершки, продукти переробки молока
(знежирене молоко, маслянка, сироватка), молоко (вершки) термічно,
оброблене (пастеризоване, стерилізоване, УВТ-оброблене тощо) перед
дослідженням ретельно перемішують, для того щоб отримати гомогенну
суспензію мікроорганізмів. Необхідно уникати утворення піни. Інтервал
між перемішуванням і перенесенням дослідної проби не повинен

195
перевищувати 3 хв. Для контролювання відбирають стерильною
піпеткою 10 см3 продукту в стерильну пробірку або колбу.
Проведення контролю:
Кількість продукту, який використовують для посіву, визначають
за ступенем найвірогіднішого мікробного забруднення відповідно до
чинних нормативних документів на продукти або сировину. Для того,
щоб отримати достовірні результати, розведення повинно бути таким,
щоб забезпечити утворення від 10 до 150 колоній на одній чашці.
Чашки Петрі перед посівами маркують, вказуючи номер проби та
розведення. В одну чашку засівають одне розведення молока.
Після внесення посівного матеріалу у кожну чашку Петрі додають
(10-15) см3 розплавленого і охолодженого до температури (40-45)оС
поживного середовища МПА, все ретельно перемішують легкими
коловими похитуваннями для рівномірного розподілу посівного
матеріалу у середовищі.
Проміжок часу від закінчення готування проби продукту до
змішування дослідної проби з середовищем не повинен перевищувати 15
хв.
Засіяні чашки залишають за температури (18 ± 2)°С на чистій
горизонтальній поверхні для застигання. Термостатування здійснюють
за температури (30±1) °С упродовж (72±2) год.
Опрацювання результатів.
Підраховують колонії в чашках Петрі, які містять їх не більше ніж
300.
Для полегшення підрахунку колоній можна використовувати лупу
або прилад для підрахунку колоній.
Підраховують кількість колоній мікроорганізмів у кожному з
паралельних посівів одного розведення. За результатами визначають
середньоарифметичне значення числа колоній у посівах одного

196
розведення або вихідної проби. За підрахунку враховують кратність
розведення проб.
Результат виражають у колонієутворюючих одиницях (КУО) в 1
3
см досліджуваної проби.
Кількість мікроорганізмів у 1 см3 випробної проби обчислюють за
формулою:

С d (1)
n1 + 0,1n2 

де ∑С - сума колоній, що виросли на всіх чашках,

n1 - кількість чашок з першим розведенням,
n2 - кількість чашок з другим розведенням,
d - коефіцієнт найнижчого розведення.

Результат підрахунку виражають двома значущими цифрами.

Якщо цифрою, яку округлюють, є п'ять, то цифру, що стоїть зліва,
залишають такою самою.
Приклад:
Розведення 10-2: 278 та 290 колоній
розведення 10-3: 33 та 28 колоній
278 + 290 + 33 + 28 629
КУО / см 3 = = = 29000 = 2,9  10 4
2 + 0,1 210 2
0,022

Визначення колі-титру молока. Пробу молока розводять

стерильною водопровідною водою (від 10-1 до 10~5). Кожне розведення
(по 1 мл) висівають на середовище Кесслера (див. додаток), витримують
у термостаті при температурі 43 °С протягом 18—24 год. За колі-титр
молока приймають те його розведення, яке зумовлює процес бродіння з
утворенням газу. Колі-титр пастеризованого пляшкового й пакетного
молока групи А становить не менше 3 мл, групи Б — 0,3 мл.

197
 Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі
групи з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних,
визначених напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись)
завдань (визначити загальну мікрофлору сирого молока, колі-титр
тощо) .
За результатами спостережень організації роботи у
ветеринарній лабораторії та власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1.Як відбирають проби сирого молока для мікробіологічного
дослідження?
2.Як відібрані проби молока готують до дослідження?
3.Які методи використовують для визначення бактеріальної
забрудненості молока?
4.Яка суть методів визначення редуктази з метиленовим
блакитним та резазурином?
5.Як проводять оцінку сирого молока за методом визначення
редуктази з метиленовим блакитним?
6.Як проводять оцінку сирого молока за методом визначення
редуктази з резазурином?
7.Що таке редуктаза?
8. Які переваги має резазуринова проба над редуктазною з
метиленовим
синім?
9. Як визначають колі-титр молока?

Лабораторне заняття №2

МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ КИСЛОМОЛОЧНИХ

ПРОДУКТІВ

Кисломолочні продукти – молочні продукти (відновлені,

рекомбіновані), які виробляють ферментацією молока (маслянки,
сироватки) спеціальними мікроорганізмами.
Залежно від технології виробництва і використаних заквасок
кисломолочні продукти ділять на: продукти молочнокислого бродіння
(сир, сметана, кисле молоко, ряжанка, ацидофілін, йогурт) та продукти

198
змішаного бродіння, молочнокислого і спиртового (кефір, ацидофільне-
дріжджове молоко, кумис, курунга, шубат).
У перших бактерії розщеплюють молочний цукор з утворенням
молочної кислоти, під дією якої казеїн молока коагулює (випадає у
вигляді пластівців), в результаті чого засвоюваність, в порівнянні з
молоком, значно підвищується.
У продуктах змішаного бродіння поряд з молочною кислотою з
молочного цукру утворюються спирт, вуглекислий газ, леткі кислоти,
також підвищують засвоюваність продукту. За вмістом білків і жиру
кисломолочні продукти майже не відрізняються від цільного молока.
Також часто кисломолочні продукти збагачуються різними
пробіотичними культурами, такими як біфідобактерії.
Санітарно-мікробіологічний контроль виробництва
кисломолочних продуктів включає санітарно-мікробіологічний
конроль приміщень, обладнання, контроль технологічних процесів і
готової продукції.
Готову продукцію контролюють на наявність бактерій групи
кишкових паличок, коагулазопозитивних стафілоків, сальмонел, іноді
виявляють цвіль і дріжджі. Показник МАФАнМ у даній групі
продуктів не визначають.
Мікробіологічні показники різних кисломолочних продуктів
наведені в таблиці 2.7. відповідно до «Медико-біологічних вимог і
санітарних норм якості продовольчої сировини та харчових продуктів»
№5061-89.
При погіршенні мікробіологічних показників готового продукту
проводять додатковий контроль технологічних процесів цих продуктів
для встановлення причин, що впливають на якість готової продукції.
До кисломолочних продуктів дитячого харчування пред'являються
більш високі мікробіологічні вимоги, ніж до продуктів масового

199
споживання, відповідно і до харчової сировини і компонентів, що
використовуються для їх виготовлення.
Таблиця 2.7.
Мікробіологічні показники кисломолочних продуктів

Маса продукту (г), в якій не

допускаються

Вид продукту Staph. Примітки

БГКП Патогенні, у
аureus,
(коліфор тому числі
КУО в 1 г
ми) сальмонели
не більше
Простокваші (звичайна,
мечниківська, південна,
0,1 25 -
ацидофільна, ряжанка,
варенець, йогурт і ін.)
Інші кисломолочні
напої (кефір, кумис, 0,1 25 -
ацидофільні та ін.)
Біфідобактерій не
6 3
Біфідопродукти 0,01 25 - менше 10 в 1 см

Вміст дріжджів у
готовому продукті в
кінці терміну
Кефір 0,01 25 - придатності не
менший 103 КУО в 1
г продукту
Сметана з термічною
0,01 25 -
обробкою
Сметана всіх видів 0,001 25 -

Закваски рідкі 10 100 -

Сири сичужні тверді,
0,01 25 5х102
Сир «Російський»
Не
Сир кисломолочний 0,001 25 допускається
в 0,01 г

В рідких кисломолочних продуктах дитячого харчування загальна

кількість мезофільних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів
аеробів не нормується. Коліформні бактерії для більшості продуктів не

200
допускаються в 3 см3. В заквасках не повинні виявлятися в 10 см3, а в
заквасці кефіру повинні бути відсутні в 3 см3.
Коагулазопозитивні стафілококи (Staph. aureus) не допускаються в
10 см3, а в заквасці - в 1 см3. Патогенні мікроорганізми, у тому числі,
сальмонели, не повинні виявлятися в 50 см3 продукту і в 100 см3
закваски.
Мікробіологічний контроль безпечності кисломолочних продуктів
здійснюють відповідно до ДСТУ 7357:2013 «Молоко та молочні
продукти. Методи мікробіологічного контролювання».
Підготовка проб. Відібрані проби кисломолочних напоїв і
продуктів перед дослідженням перемішують та нейтралізують. Для
цього у стерильну пробірку або колбу, відбирають стерильною піпеткою
10 см3 продукту або закваски, що аналізують, додають 1 см3 стерильного
розчину двовуглекислого натрію з масовою концентрацією 100 г/дм3,
вміст ємності перемішують. Проби сиру (кисломолочного, твердого,
напівтвердого, м'якого, розсольного, плавленого) асептично зважують у
кількості 10 г, переносять у стерильну або профламбовану ступку або в
ємність роторного змішувача та ретельно гомогенізують.

Визначання коліформних бактерій (бактерій групи кишкових

паличок)
Метод базується на здатності коліформних бактерій зброджувати
лактозу з утворенням кислоти і газу за температури (37±1) оС упродовж
24 год.
Проведення контролювання
Кількість посівного матеріалу, який засівають у середовище,
вказано у таблиці 2.8.
Посів у середовище Кеслера. По 1 см3 зазначених у таблиці 2.8.
розведень продукту засівають у пробірки 5 см3 середовища Кеслера.

201
 Таблиця 2.8.
Обсяги проб для аналізування вмісту БГКП у продуктах

Кількість пробірок
Кількість
чи колбочок, які
Назва продукту посівного матеріалу,
засівають із
см3 чи г
кожного розведення
Молоко та вершки сирі Від 0,1 до 0,00001 1
Молоко та вершки, відібрані після
10 1
пастеризації
Молоко, сироватка, маслянка та
вершки пастеризовані, молоко з
наповнювачами, кисломолочні 1; 0,1; 0,01 1
продукти і напої з та без
наповнювачів
Морозиво, молочні десерти,
0,1 1
молочні коктейлі
Масло, спреди 1; 0,1; 0,01 1
Сир після пресування Від 0,001 до 0,00001 1
Сир зрілий (або наприкінці
Від 0,1 до 0, 001 1
визрівання)
Сир кисломолочний, сир домашній,
Від 0,1 до 0,0001 1
сиркові вироби, альбумінні вироби
Сметана, паста ацидофільна,
Від 0,1 до 0,0001 1
вершкові продукти
Закваска рідка 3 1
Бактеріальні концентрати 1; 0,1 1
Молоко і вершки згущені з цукром,
какао і кава зі згущеним молоком і
цукром:
у спожитковій тарі 1 1
у транспортній тарі 0,1 1
Молоко сухе, вершки сухі, лактоза,
0,1 1
ЗНМ і інші сухі продукти

Посів 10 см3 пастеризованого молока, відібраного з пастеризатора

після проведення пастеризації, 10 см3 рідкої закваски, 3 см3 кефірної
закваски або 10 см3 розведення 1:10 згущеного молока і вершків із
цукром, какао і кави зі згущеними молоком та цукром у спожитковій
тарі, здійснюють у колби з 40 см3 середовища Кеслера.

202
 Пробірки або колби з посівами поміщають у термостат за
температури (37±1) оС і витримують упродовж (18 – 24) год.
При дослідженні морозива засіяні пробірки витримують у
термостаті за температури (37±1) оС упродовж 48 год.
Опрацювання результатів
Переглядають пробірки або колби з посівами. Висновок щодо
відсутності коліформних бактерій роблять на підставі відсутності
газоутворення у найменшому із використаних розведень.
За наявності у найменшому із розведень газу у поплавку,
вважають, що у цьому розведенні присутні коліформи.
Підтвердження присутності коліформних бактерій на
середовищі Ендо. Суть методу полягає у здатності коліформних
бактерій утворювати на середовищі Ендо темно-червоні колонії з
металевим блиском або рожево-червоні без металевого блиску.
Беруть посівний матеріал із позитивних проб, отриманих на
середовищі Кеслера та висівають на підготовлені чашки Петрі з
середовищем Ендо, оміщають їх у термостат за температури (37 ± 1) оС і
витримують упродовж (19±1) год.
Опрацювання результатів
За відсутності на середовищі Ендо характерних колоній продукт
вважають таким, що не є забрудненим коліформними бактеріями.
Наявність грамнегативних паличок, які утворюють характерні колонії на
середовищі Ендо, свідчить про наявність коліформних бактерій.

Посів на селективний агар для одночасного визначання

коліформних бактерій та E.coli

Метод базується на здатності характерного для групи коліформних

бактерій ферменту β-D-галактозидази та специфічного для виду E.coli

203
ферменту β-D-глюкуронідази розщеплювати певні хромогенні субстрати
з утворенням пігментів, що забарвлюють колонії коліформних бактерій
у червоний колір, а E.coli – від темно-синього до фіолетового.
Ефективність селективності хромогенного середовища забезпечує
спеціальний реагент Тергітол-7, що пригнічує розвиток широкого кола
грампозитивних та деяких грамнегативних бактерій за винятком виду
Escherichia coli. Додатковим тестом щодо підтвердження розмежування
коліформних бактерій та E.coli служить реакція з виявлення наявності
індолу, для проведення якої використовують реактив Ковача.
По 1 см3 зазначених у таблиці 2.8. розведень продукту засівають у
підготовлені чашки Петрі глибинним або поверхневим методами.
Інкубують посіви упродовж 24 год за температури (36 ± 2) ºС.
Переглядають колонії, що утворилися на поверхні агару. Темно-
сині або фіолетові колонії свідчать про наявність бактерій виду E.coli,
колонії від жовтувато-рожевого до червоного кольору свідчать про
присутність інших коліформних бактерій. Якщо на чашці реєструють
безбарвні або блідо-голубі колонії, то це свідчить про наявність інших
грамнегативних мікроорганізмів.
Підтверджувальне контролювання
Для того, щоб підтвердити наявність бактерій виду E.coli, на
колонії, що мають темно-синє та фіолетове забарвлення, наносять по 1
краплі реактиву Ковача. Якщо забарвлення реактиву змінюється за
декілька секунд на вишнево-червоне, то це свідчить про позитивну
реакцію на індол і підтверджує присутність E.coli.
У разі отримання незадовільних результатів хоча б за одним із
показників якості проводять повторне відбирання та контролювання
подвійної вибірки продукту від тієї ж партії.
У разі отримання незадовільних результатів повторного
контролювання подвійної вибірки продукту всю партію бракують.

204
 Метод мікроскопіювання
Метод базується на перегляданні мікроскопічних препаратів,
пофарбованих спеціальними фарбниками, для орієнтовної
характеристики мікрофлори молока та кисломолочних продуктів та
розмежування грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Проведення мікроскопіювання
Для приготування мікроскопічного препарату на чисте знежирене
предметне скло петлею наносять невелику краплю випробного матеріалу
і розподіляють на ділянці площею (1±0,2) см2. Препарат сушать за
температури (20±2) ºС, фіксують над полум‘ям спиртівки і фарбують
метиленовим синім.
Склад мікрофлори продуктів подано у ДСТУ 2212-2003
«Виробництво молока та кисломолочних продуктів. Терміни та
визначення понять».
Фарбування препаратів за Грамом
Метод базується на застосуванні диференційованого фарбування
мікроскопічних препаратів бактерій, згідно з яким грампозитивні
бактерії фарбуються у фіолетовий колір, а грамнегативні – в рожевий.
Метод полягає у фарбуванні мікроскопічного мазку фарбником
карболовим генціановим фіолетовим та розчином Люголю з наступним
знебарвленням етанолом, при цьому грампозитивні бактерії утримують
барбник, тоді як грамнегативні потребують додаткового дофарбовування
фуксином (або сафраніном).
Особливості фарбування
Мазок має бути тонким. Знебарвлення слід проводити дуже
швидко (щоб не вимити фарбу з грампозитивних клітин). Додаткове
контрастне фарбування розчином фуксину має бути короткотривалим –
не більше ніж 40 с (щоб не замаскувати попередньо нанесену фарбу).

205
 При контролі кисломолочних продуктів методом мікроскопування
проглядають забарвлені препарати під мікроскопом для характеристики
мікрофлори цих продуктів. Орієнтовний склад мікрофлори
досліджуваних кисломолочних продуктів представлений в 2.9.
Таблиця 2.9.
Мікрофлора кисломолочних продуктів

Найменування продуктів Склад мікрофлори

Сир кисломолочний*, сирні вироби,

сметана, кисле молоко звичайне; напої:
«Російський», «Слов'янський»,
«Новинка», «Любительський»,
«Ювілейний»
Ацидофільне молоко, ацидофільна
паста, напій «Московський»
Ацидофільно-дріжджове молоко,
ацидофільний дріжджовий напій, кумис
Кисле молоко мечниківське, Південне,
йогурт, ряжанка, варенець; напої:
«Південний», «Сніжок», «Російський»,
«Коломенський»; пахта «Ідеал», пахта
дієтична, сметана ацидофільна
Ацидофілін
Напій «Віта»
Кефір, напій «Здоров'я»
Напої: «Углицький», «Біфідін»
Молочнокислі стрептококи
Молочнокислі палички
Молочнокислі палички, дріжджі
Молочнокислі стрептококи і
палички
Молочнокислі стрептококи і
палички, поодинокі дріжджі
Молочнокислі палички,
біфідобактерії, допускається
наявність молочнокислих
стрептококів
Молочнокислі стрептококи і
палички, поодинокі дріжджі
Молочнокислі стрептококи і
біфідобактерії

*В мікроскопічному препараті сиру допускаються поодинокі клітини

дріжджів і паличок.

206
 Одночасно з відбором проб для контролю технологічного процесу
беруть проби для контролю санітарно-гігієнічного стану цеху
(ефективність миття устаткування, посуду, чистота повітря, чистота рук,
одяг робітників і ін.) і наявності на устаткуванні термостійких
молочнокислих паличок і дріжджів (у разі появи в продукції вад - зайва
кислотність і здуття).

МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ МАСЛА, СПРЕДІВ

Згідно визначень ДСТУ 4399:2005 «Масло вершкове» маслом

вважається продукт, виготовлений лише з коров'ячого молока та
продуктів його перероблення. Тепер масло виробляють тільки з вершків
або продуктів перероблення коров'ячого молока, яке має притаманний
йому смак, запах та пластичну консистенцію за температури 12±2°С, з
вмістом молочного жиру не меншим ніж 51,5%, що становить однорідну
емульсію типу "вода в жирі". У таблиці 2. 10 наведена класифікація
масла залежно від масової частки жиру.
Залежно від технологічних особливостей та органолептичних
показників вершкове масло поділяється на такі види:
- солодковершкове та солоне солодковершкове,
- кисловершкове та солоне кисловершкове.
Таблиця 2.10.
Класифікація масла залежно від масової частки жиру

Види вершкового масла % жиру

Вершкове масло "екстра" 80,0–85,0
Вершкове масло "селянське" 72,5–79,9
Вершкове масло бутербродне 61,5–72,4
Топлене масло (молочний жир) Не менше 99% (99,8%)

207
 Солодковершкове масло виробляють з натуральних
пастеризованих вершків, а кисловершкове — з пастеризованих вершків,
сквашених чистими культурами молочнокислих бактерій. Солоне масло
виробляють з додаванням кухонної солі.
Серед мікробіологічних показників у вершковому маслі
нормується МАФАнМ, БГКП (колі-форми), золотистий стафілокок,
дріжджі, плісняві гриби, патогенні мікроорганізми, в тому числі
сальмонели, а також лістерії (L. monocitogenes) (табл.. 2.11.). Вміст
показників нормують відповідно до «Медико-біологічних вимог і
санітарних норм якості продовольчої сировини та харчових продуктів»
№5061-89.

Таблиця 2.11.
Мікробіологічні показники вершкового масла

Норма для груп масла

Екстра і селянське Вершкове бутербродне
Назва показника Солодко- Кисло- Солодко- Кисло-
вершкове вершкове вершкове та вершкове
Топлене
та солоне та солоне солоне та солоне
солодко- кисло- солодко- кисло-
вершкове вершкове вершкове вершкове
МАФАМ, не більше
1,0х105 — 5,0х105 — 1,0х105
ніж КУО/г
БГКП, не дозволено
0,01 0,01 0,01 0,01 1,0
в г продукту
Патогенні, в т.ч.
25 25 25 25 25
сальмонели
Стафілококи
золотисті, не
1,0 0,1 0,1 0,1 —
дозволено в г
продукту
Дріжджі в 1 г не
100 100 100 100 200
більше ніж
Плісняві гриби, КУО
100 100 100 100 —
в 1 г, не більше ніж
L.monocitogenes, не
дозволено в г 25 25 25 25 —
продукту

208
 Для виробництва масла дозволено використовувати молоко
коров'яче незбиране, вершки, молоко знежирене, вершки пластичні,
молоко незбиране сухе и молоко нежирне сухе, маслянку-сировину і
маслянку суху, закваску бактеріальну або заквашувальний препарат
згідно з чинними нормативними документами (ДСТУ 3662; 4273 та ін.),
сіль кухонну "Екстра" або вищого ґатунку згідно з ДСТУ 3583(ГОСТ
13830), воду питну — згідно ГОСТ 2874.
На сьогодні, в багатьох країнах світу розроблено широкий
асортимент продуктів типу вершкового масла із змішаною жировою
фазою - молочний жир/рослинна олія, їх промислове виробництво
санкціоновано рішенням Міжнародної молочної федерації (ММФ). Такі
комбіновані жирові продукти рекомендовано називати комбінованим
маслом, або спредом.
Згідно ДСТУ 4445:2005 «Спреди та суміші жирові. Загальні
технічні умови», спред - жировий продукт із масовою часткою жиру від
50% до 85%, який виготовляється із суміші молочного та рослинного
жиру, в якому частка молочного жиру не менш ніж 25% від загального
жиру, із щільною або м’якою консистенцією з (без) додавання харчових
добавок, наповнювачів та вітамінів.
Розрізняють 4 види спредів: солодковершковий, кисловершковий,
солоний, з наповнювачами. Залежно від масової частки загального жиру
продукти поділяють на дві групи: спреди з масовою часткою загального
жиру від 50 до 85% і суміш жирову.
У ДСТУ "Спреди і суміші жирові" визначені вимоги до сировини.
Крім молочної сировини, дозволяється використання соняшникової,
кукурудзяної, соєвої, арахісової, бавовняної, оливкової, гірчичної,
ріпакової, пальмової, пальмоядрової, кокосової, олеїну пальмового,

209
стеарину пальмового, твердих рослинних жирів та жирових композицій,
замінників молочного жиру вітчизняного та закордонного виробництва.
Вміст мікробіологічних показників для спредів нормують
відповідно до ДСТУ 4445:2005 «Спреди та суміші жирові. Загальні
технічні умови».
Підготовка проб. Вершкове масло, спреди, суміші жирові
зважують по 10 г в ємність і ставлять її на водяну баню з температурою
від 40 оС до 45 оС, витримують доки вся дослідна проба не розплавиться.
Показник МАФАнМ і БГКП визначають згідно з ДСТУ 7357:2013
«Молоко та молочні продукти. Методи мікробіологічного
контролювання», сальмонели визначають за ДСТУ IDF93А-2003
«Молоко і молочні продукти. Визначення Salmonellа», наявність
золотистого стафілококу визначають згідно з ГОСТ 30347-97 «Молоко і
молочні продукти. Методи визначення Staphylococcus aureus», кількість
плісняви та дріжджів – за ГОСТ 10444.12 «Продукти харчові. Метод
визначення дріжджів і плісняви».

Визначення Staphylococcus aureus

Наважку 1 см3 рідкого продукту або його розведення наносять на
поверхню поживних середовищ Байрд-Паркера, жовтково-сольовий агар
або молочно-сольовий агар у 3 чашки Петрі, ретельно розтирають
шпателем по поверхні живильного середовища. Посіви інкубують при
температурі (37 ± 1)°С протягом 24-48 год.
На жовтково-сольовому агарі колонії S. aureus мають форму
плоских дисків діаметром 2-4 мм білого, жовтого, кремового,
лимонного, золотистого кольору з рівними краями; навколо колоній
утворюється райдужне кільце і зона помутніння середовища.

210
 На молочно-сольовому агарі колонії S. aureus ростуть у вигляді
непрозорих круглих колоній, пофарбованих від білого до оранжевого
кольору, діаметром 2-4 мм, злегка опуклих.
На середовищі Байрд-Паркера колонії S. aureus ростуть у вигляді
чорних, блискучих, опуклих колоній діаметром 1-1,5 мм, оточених
зоною просвітління середовища шириною 1-3 мм.
Після термостатування підраховують кількість характерних
колоній на кожній чашці Петрі. З кожної чашки Петрі відбирають не
менше п'яти характерних і/або підозрілих колоній S. aureus і пересівають
на поверхню скошеного поживного агару. Пробірки з посівами
витримують в термостаті при температурі (37 ± 1) ° С протягом 24 год.
Культури, що виросли, фарбують за Грамом і ставлять реакцію
плазмо коагуляції для визначення патогенності.
Стафілококи фарбуються за Грамом позитивно (темно-фіолетового
кольору), мають кулясту форму і розташовуються скупченнями,
найчастіше нагадують грона винограду.
Постановка реакції плазмокоагуляції
У пробірку з 0,5 см3 розведеної кролячої плазми вносять петлю
добової агарної культури. Внесену культуру ретельно розмішують. Для
контролю одну пробірку з плазмою залишають незасіяної, а в іншу
засівають контрольний штам S. aureus (коагулазопозитивний
стафілокок). Пробірки поміщають в термостат і витримують при
температурі (37 ± 1) ° С протягом 3-6 год. Якщо через 6 год. коагуляції
плазми не відбулося, то залишають ці пробірки до 24 год. Якщо через 24
год плазма не згорнулася, то випробувану культуру стафілокока
відносять до коагулазонегативних.
При визначенні коагулазної активності реакцію вважають
негативною в тих випадках, коли в плазмі не утворюються окремі нитки

211
або згустки, або в тих випадках, коли в плазмі з'явилися окремі нитки
(реакцію плазмокоагуляції оцінюють на один плюс).
Реакцію вважають позитивною, якщо:
+ + + + - Згусток щільний;
+ + + - Згусток, який має невеликий відсік;
+ + - Згусток у вигляді зваженого мішечка.
Всі три варіанти є позитивним результатом.
При отриманні позитивної реакції вважають, що в посівах
виявлений Staphylococcus aureus.
Морфологічні, культуральні властивості та позитивна реакція
плазмокоагуляції свідчать про присутність коагулазопозитивних
стафілококів у продукті.
Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі
групи з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних,
визначених напередодні завдань
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1.Як відбирають проби кисломолочних продуктів для
мікробіологічного дослідження?
2.Як відібрані проби кефіру, масла, сиру готують до дослідження?
3.Які методи використовують для визначення бактеріальної
забрудненості кисломолочних продуктів?
4. Як визначають наявність коліформних бактерій та E.coli у
кисломолочних продуктах ?
5. Як визначають наявність Staphylococcus aureus у маслі ?

212
 ТЕМА 5. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
М'ЯСА
Бактеріологічні дослідження м’яса та субпродуктів проводять
(згідно з ГОСТ 21237-75) з метою оцінки їх щодо можливої контамінації
збудниками сибірки, сальмонельозів, бешихи, лістеріозу, пастерельозу і
ін., а також для виявлення кишкової палички, протея, кокової
мікрофлори. Досліджують у всіх випадках, передбачених чинними
нормативно-правовими актами, а також за вимогою органів, що
здійснюють державний ветеринарний контроль та нагляд.
Бактеріологічне дослідження м’яса здійснюють обов’язково:
- у разі вимушеного забою (незалежно від причини забою);
- при шлунково-кишкових захворюваннях;
- при хворобах органів дихання з важким перебігом;
- при виявленні серозних і фібринозних перикардитів у свиней;
- при септико-піємічних хворобах;
- при обширних опіках;
- при підозрі на наявність сальмонел чи токсигенних коків;
- при видаленні кишечнику з туші пізніше ніж через 2 години з
моменту забою;
- у разі сумніву, щодо придатності м’яса та неможливості
визначити останнє органолептично.
Матеріал для дослідження відбирають асептично, з урахуванням
тропізму збудника. Від туші відбирають такі зразки:
- ділянку м’яза згинача та розгинача передньої чи задньої кінцівок
довжиною не менше 8 см, або ж шматочок іншого м’яза
розміром не менше 8х6х6 см;
- лімфатичні вузли (поверхневий шийний чи власне підкрильцевий
і зовнішній паховий разом з оточуючою їх сполучною і жировою
тканиною, а від свиней –поверхневий шийний дорсальний (в

213
 разі, якщо зміни в ділянці шиї і голови відсутні), або ж
підкрильцевий 1-го ребра та надколінний;
- частку печінки з печінковим лімфатичним вузлом чи жовчним
міхуром, звільненим від жовчі;
- селезінку і нирку.
Для дослідження на сибірку направляють лімфатичний вузол, який
збирає лімфу з місця локалізації ураженого вогнища, тканину, що
набрякла, а від свиней, крім того – підщелепові лімфатичні вузли.
При дослідженні на лістеріоз надсилають головний мозок, долю
печінки і нирку.
В разі дослідження напівтуші чи чверті туші відбирають шматок
м’язів, лімфатичні вузли і трубчасту кістку.
При дослідженні м'яса дрібних тварин і птиці направляють цілі
тушки. Кожну пробу загортають окремо у поліетиленову плівку або
пергаментний папір, поміщають у паперовий пакет, на якому ставлять
дату відбору проб, номер туші і направляють у лабораторію в
спеціальному опломбованому ящику.
У супровідному документі зазначають:
· назву продукту із зазначенням виду м'яса, від якого відібрана
проба та її кількість;
· назву підприємства або господарства, де відібрана проба, його
адресу;
· номера проб;
· причину направлення проб на дослідження;
· короткі патологоанатомічні дані та попередній діагноз;
· дату відбору проб і підпис особи, яка направляє їх на дослідження.
Бактеріологічне дослідження м'яса проводять за відповідною схемою
(рис. 1).

214
Рис. 1.13. Схема бактеріологічного дослідження м’яса

215
 Дотримуючись цієї схеми, можна порівняно швидко дати відповіднь
про наявність у м'ясі збудників основних мікробних інфекцій, які
викликаються аеробами (сибірки, бешихи свиней, пастерельозу,
лістеріозу, кокових інфекцій), а також бактерій групи сальмонела,
умовно патогенних мікроорганізмів і анаеробів, що викликають харчові
токсикоінфекції і бактеріотоксикози.
У лабораторії ветсанекспертизи на ринках проводять лише
бактеріоскопічне дослідження, а за необхідності проби відправляють у
лабораторію ветеринарної медицини, де проводять бактеріологічне
дослідження м'яса протягом трьох і більше діб. Хоча у випадку
виявлення збудника сибірки результат може бути відомий раніше цього
терміну на основі даних бактеріоскопії мазків-відбитків, а подальше
бактеріологічне дослідження в лабораторії буде продовжуватись.

Лабораторне заняття №1.

ВИЗНАЧЕННЯ СВІЖОСТІ М'ЯСА МЕТОДОМ
МІКРОСКОПІЧНОГО АНАЛІЗУ

Мета роботи. Оволодіння мікроскопічним методом визначення свіжості

м'яса – шляхом підрахунку мікроорганізмів у отриманих з нього мазках та
виявлення ознак розпаду тканини.
Матеріальне забезпечення . Проби м’яса (свіже та несвіже); шпатель, вата;
стерильні ножиці та пінцет, предметні скельця; мікроскоп; набір реактивів для
фарбування за Грамом.

Основні відомості. М'ясо, одержане від клінічно здорових, не

стомлених тварин практично не містить мікроорганізмів; таке м'ясо
може обсіменятися мікрофлорою лише екзогенним шляхом,зокрема з
поверхні туші. Причиною ендогенного мікробного обсіменіння м»са
можуть різні стресові фактори: перевтомлення тварин, перегрівання або
переохолодження, голодування перед забоєм, інфекційні захворювання,

216
різноманітні патологічні процеси неінфекційної природи – травми,
порушення обміну речовин тощо. На фоні низької резистентності
організму тварини кишкова мікрофлора легко долає природні бар»ри та
обсіменяє різні органи і тканини.
Обсіменіння мікроорганізмами м’яса екзогенним шляхом має
місце при недотриманні належних санітарних умов під час забою,
тварин, дозрівання, зберігання і транспортування. З поверхні туші
мікроорганізми можуть проникати в глибину м'яса. Інтенсивність цього
явища залежить як від виду контамінанта так і від інших обставин,
зокрема температури зберігання м»ясної сировини.
Видовий склад мікрофлори свіжого м'яса дуже різноманітний. Це
переважно аеробні і факультативно-анаеробні мікроорганізми:
стафілококи, мікрококи, бактерії групи кишкової палички і протея,
клостридії, коріне- та молочнокислі бактерії, дріжджі, актиноміцети і
гриби. М'ясо може бути контаміноване і патогенними
мікроорганізмами, зокрема сальмонелами, ієрсиніями, патогенними
клостридіями (Clostridium perfringes), бациллами (Bac. anthracis,
Bacillus cereus), ентерококами та ін.
При сприятливих умовах мікроорганізми швидко розмножуються на
поверхні м'яса, поступово проникають у середину тканин і викликають
псування продукту.
Порушення умов і термінів зберігання м'яса сприяє розвитку
мікроорганізмів і виникненню різних вад: ослизнення, гниття, кислого
бродіння, пігментації, пліснявіння та ін.

Проби м’яса для визначення його свіжості відбирають відповідно

до ГОСТу 7269-79 та керуючись постановою Кабінету міністрів України
від 14 червня 2002 р. "Про порядок відбору зразків продукції

217
тваринного, рослинного і біотехнологічного походження для проведення
досліджень”

Відбір проб м’яса та визначення органолептичних показників

свіжості м’яса кролів та птиці проводять згідно ГОСТ 20235.0-74 та
ГОСТ 7702.0-74.
Визначення органолептичних показників свіжості яловичини,
свинини та баранини (ГОСТ 7269-79) включає визначення зовнішнього
вигляду і кольору м’яса, поверхні туші, стан м’язів на розрізі, його
консистенції, запаху, стану жиру та сухожиль, а також якості бульйону в
пробі варінням.
М’ясо краще досліджувати з природним освітленням. Якщо ж
працюють із штучним, то підбирають світильники, які не змінюють
кольорового забарвлення м’яса під час його огляду.
Проведення роботи.
Приготування мазків. Поверхню м'яса, що досліджується,
припікають розпеченим шпателем або обпалюють тампоном змоченим у
спирті, вирізають стерильними ножицями шматочки розміром 2x1,5 x
2,5 см. Зрізаною поверхнею на предметному склі роблять по три
відбитки. Препарати висушують на повітрі, фіксують, фарбують за
Грамом і мікросопують (продивляються не менше 25 полів зору).
Мікроскопічний аналіз. Метод мікроскопічного аналізу
заснований на визначенні кількості бактерій та ступеня розпаду м'язової
тканини при мікроскопуванні мазків-відбитків.
В залежності від кількості мікроорганізмів, навності та
інтенсивності ознак розпадання тканин розрізняють:
- м'ясо свіже - якщо у мазках відбитках не виявляють мікрофлори
або у полі зору мікроскопа видно поодинокі (до 10 мікроорганізмів)
коки і паличкоподібні бактерії та немає слідів розпадання тканин;

218
 - м'ясо сумнівної свіжості - якщо у полі зору мазка - відбитка
виявляють не більше 30 мікробних тіл та лише сліди розпадання
тканини (ядра м'язових волокон у стані розпаду, смугастість волокон
виявляється слабо);
- м'ясо несвіже - якщо у полі зору мікроскопа виявляють більше 30
мікробних тіл та яскраві яознаки розпадання тканин.
Самостійна робота студентів. Студенти готують мазки-
відбитки з різних зразків м’яса, мікроскопують, роблять аналіз. У
висновках вказують придатність м'яса, що досліджувалось, для
споживання.

Лабораторна робота №2.

БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ М’ЯСА

1. Визначення загального мікробного обсіменіння м'яса

Мета роботи: навчити студентів володіти методикою підготовки зразків
м'яса для проведення мікробіологічних досліджень;здійснювати посів на живильні
середовища та визначати загальне мікробне обсіменіння м'яса (мікробне число).
Матеріальне забезпечення. Зразки м'яса; стерильні пінцет, ножиці,
скальпель; вага з різноважками; гомогенізатор або стерильна ступка і кварцовий
пісок; стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду; спирт етиловий 96°. МПА;
голодний агар; чашки Петрі; стерильні піпетки на 1 см2 і на 10 см2.

Підготовлення зразків м'яса до мікробіологічних досліджень.

1. Кожен відібраний для дослідження зразок м'яса (від однієї
тварини) звільняють від жирової і сполучної тканини, занурюють на 2-
3 хв у етиловий спирт та обпалюють з поверхні. Стерильними ножицями
вирізають шматочки розміром 2x1,5 x 2,5 см. Відібрані шматочки всі
вирізані кусочки ретельно подрібнюють для виготовлення середньої
проби.
2. Відважують 20 г подрібненої проби і заливають 80 мл
ізотонічного розчину натрію хлориду та гомогенізують в електричному
гомогенізаторі або розтирають у стерильній ступці з кварцовим піском.

219
Одержану суспензію відстоюють протягом 15 хв і для дослідження
відбирають надосадову рідину.
Проведення роботи. З одержаної суспензії м'яса стерильною
піпеткою відбирають 0,5 мл і вносять у пробірку із 9,5 мл ізотонічного
розчину натрію хлориду (при цьому одержують розведення 1:10).
У стерильні чашки Петрі вносять по 0,5 мл суспензії: у першу чашку
нерозведеної, а у другу розведеної у співвідношенні 1:10 суспензії.
Дальше, згідно загальноприйнятої методики, у чашки Петрі заливають
розплавлений і охолоджений до 45°С 9-15 мл МПА, перемішують
шляхом обережного похитування чашкою та ставлять на рівну поверхню
для застигання. Після цього на поверхню МПА наливають 4-5 мл
голодного агару (з метою попередження росту бактерій роду Proteus).
Посіви ставлять у термостат на 48 год. при 37 °С і підраховують
кількість колоній, що виросли на середовищі.
Загальне число мікробів у 1 г м'яса визначають так, як описано в
попередніх роботах.
Студенти записують результати досліду і роблять висновки про
подальше використання м'яса.

2. Визначення вмісту БГКП у м'ясі

Мета роботи. Оволодіння методикою визначення бактерій групи кишкової
палички у м'ясі .
Матеріальне забезпечення. 10 %-а суспензія м'яса; стерильні чашки Петрі з
середовищами Ендо, Левіна, Плоскірєва; скошений агар Сімонса; індикаторні
папірці для виявлення індолу; фарби для методу Грама; предметні і покривні
скельця; демонстраційні посіви мікроорганізмів групи кишкової палички на
елективних середовищах; стерильні піпетки на 1 мл.

Основні відомості. Ешерихії широко розповсюджені в природі.

Основним біотопом для них є товстий і тонкий кишечник людини та
тварин. Ешерихії постійно виділяються з випорожненнями в зовнішнє
середовище, де зберігаються досить довго.

220
 Виявлення бактерій групи кишкової палички – ешерихій,
здійснюють за морфологією, культуральними та ферментативними
властивостями, зокрема за ознаками росту на елективних середовищах з
лактозою, здатності утилізувати цитрат, утворювати сірководень та
індол.
Для санітарно-мікробіологічної оцінки харчового продукту
важливо не лише встановити наявність у ньому кишкової палички, але
необхідно вирахувати іх кількість, що дозволить зробити висновок про
тупінь фекального забруднення. тракту.
Слід пам'ятати, що кишкова паличка належить до санітарно-
показових мікроорганізмів і її присутність у досліджуваному матеріалі
свідчить про непрямо вказує на можливе забруднення продукту (об'єкту)
та іншими мікроорганізмами.
Самостійна робота студента
1. Студенти проглядають демонстраційні посіви мікроорганізмів
на живильних середовищах. На агарі Ендо бактерії кишкової палички
ростуть у вигляді червоних колоній з металевим блиском (або без
нього), рожевих з червоним центром, середовище навколо колоній
червоне; на еозин-метиленовому синьому агарі (агар Левіна) - у вигляді
темно-фіолетових блискучих колоній; на бактоагарі Плоскірєва - у
вигляді цегляно-червоних з глянцевою поверхнею колоній.
2. Із характерних для бактерій кишкової паличк колоній
виготовляють мазки, фарбують за Грамом та мікроскопують.
Бактерії кишкової палички – дрібні грамнегативні палички із
заокругленими кінцями.
З метою визначення рухливості виготовляють препарати „висяча""
або «роздавлена» краплі та мікроскопують.
3. Для визначення сірководню культури, що досліджуються,
висівають на трицукровий агар уколом у стовпчик і ставлять у

221
термостат на 24 год, за температури 37 °С. Бактерії кишкової
палички не утворюють сірководню, і агар не забарвлюється у червоний
колір.
4. Ферментацію лактози встановлюють посівом культури
кишкової палички у середовище Пса, яке містить 10% лактози.
Абсолютна більшість бактерій кишкової палички ферментують лактозу.
5. Для встановлення здатності кишкової палички розщеплювати
сечовину, досліджувану культуру засівають на трьохцукровий агар з
сечовиною та витримують 24 год. у термостаті при температурі 37
°С. Збудники не розщеплюють сечовини і не змінюють кольору
середовища. За наявності бактерій, які розщеплюють сечовину, реакція
середовища стає різко лужною і середовище зафарбовується у яскраво-
червоний колір.
6. Індол визначають за допомогою індикаторного папірця. Кишкові
палички частіше утворюють індол.
Для визначення здатності утилізувати цитрати культуру, що
досліджується засівають на скошений агар Сімонса, посіви ставлять у
термостат на 24 год. при температурі 37 °С. Бактерії кишкової
палички не ростуть на цьому середовищі і не змінюють його кольору;
бактерії, які асимілюють цитрат, ростуть, підлужнюючи середовище і
змінюють його колір з оливково-зеленого у синій.
Після перегляду посівів, запропонованих кафедрою, студенти
здійснюють посіви досліджуваного зразка на живильні середовища,
термостатують, аналізують одержані результати, роблять висновки
та оформляють протокол досліду.

3. Виявлення у м'ясі бактерій роду Salmonella

Мета роботи. Оволодіння методами виявлення сальмонел у м»ясі;
ознайомлення з методами визначення серотипу сальмонел

222
 Матеріальне забезпечення. Суспензія м'яса, шо містить в 1 см3 0,5 г
продукту; середовища збагачення (селенітовий Ф-бульйон, середовища Мюлера,
Кауфмана, Кіліана, хлористомагнієве середовище „М"; культури сальмонел,
вирощені на різних середовищах (агарі Ендо, Левіна, Плоскірєва, вісмут-
сульфітному агарі); бактеріологічні чашки з стерильними середовищами Ендо,
Левіна, Плоскірєва, вісмут-сульфітним агаром; скошений МПА; предметні і
покривні скельця; реактиви для фарбування за Грамом.

Основні відомості. Сальмонельози – широко розповсюджені

захворювання тварин, хворіють також люди.
Сальмонели належать до збудників, які викликають харчові
токсикоінфекції у людини і тварин. На сальмонельоз хворіють люди та
усі види тварин. Нерідко вони можуть бути бактеріоносіями без
клінічного прояву хвороби. При забиванні тварин-сальмонелоносіїв
м'ясо, як правило, контаміноване сальмонелами.
Бактерії роду Salmonella - грамнегативні короткі палички, рухливі,
за рідким виключенням. Факультативні аароби. Спор не утворюють.
Бактерії отримали назву в честь відомого американського вченого
Д.Сальмона, який у 1885 році вперше встановив їх етіологічну роль при
кишкових захворюваннях людини й описав В. cholerae suis – збудника
хвороби свиней. Пізніше, у 1888 році А.Гартнер, під час спалаху гострих
гастроентеритів у Саксонії, виділив з м'яса вимушено вбитої корови та
органів людини, яка померла, В. enteritidis, що виявились патогенними
також для овець та кіз. У 1896 році в Бреславлі К.Кенше та у 1898 році в
Ертриці Ж.Нобель при харчових захворюваннях виявили та описали В.
typhimurium. На сьогодні відомо більше 2200 антигенних варіантів
сальмонел, проте у 85-90 % випадках захворювання викликають
серотипи S. typhimurium, S. enteriditis, S. cholerae suis.
Сальмонели характеризуються високою стійкістю у навколишньому
середовищі. Вони добре переносять низькі температури: при охолод-
женні до 0 °С зберігають життєздатність до 142 діб, за температури

223
10°С – до 115. При кімнатній температурі сальмонели активно
розмножуються та зберігаються в різних харчових продуктах.
Виявлення та ідентифікація сальмонел здійснюється шляхом посіву
матеріалів на живильні середовища з подальшим вивченням
морфологічних, тинкторіальних, культаральних, ферментативних та
антигенних властивостей. Розроблено також молекулярно-генетичний
метод (ПЛР).
Проведення роботи. Перед проведенням досліджень для виявлення
сальмонел студенти роздивляються та описують характер росту
сальмонел на демонстраційних посівах у бактеріологічних чашках на
звичайних і спеціальних середовищах
На спеціальних середовищах сальмонели ростуть з утворенням
характерних колоній:
- на агарі Ендо збудник ріст у вигляді круглих, безбарвних або
злегка рожевих прозорих, чи напівпрозорих колоній;
- на агарі Левіна збудники сальмонельозу ростуть у вигляді
прозорих, блідих, ніжно-рожевих або рожево-фіолетових колоній.
- на бактоагарі Плоскірєва сальмонели формують безбарвні
колонії;
- на вісмут-сульфітному агарі сальмонели ростуть у вигляді чорних
або коричневих колоній з характерним металевим блиском, (при цьому
спостерігається зафарбовування у чорний колір ділянки середовища під
колонією, крім деяких серологічних типів з групи С, які на згаданому
вище середовищі ростуть у вигляді ніжних світло-зелених або великих
сірувато-зелених колоній).
Виділення сальмонел проводять у чотири послідовних етапи:
1) первинний (прямий) посів;
2) збагачення;
3) посів із середовищем збагачення;

224
 4) підтвердження.
Первинний посів проводять шляхом посіву суспензії дослідного
матеріалу на щільні елективні середовища. Ці посіви витримують у
термостаті при температурі 37 °С і досліджують на наявність колоній,
які є типовими або підозрілими на сальмонели.
У випадку відсутності росту бактерій сальмонел при первинному
(прямому) посіві на елективних середовищах, через 12-24 год. проводять
пересівання на середовища збагачення.
Збагачення проводять шляхом посіву на рідкі живильні середовища,
які витримують за температури 37 °С 18-24 год. На селенітовому Ф-
бульйоні кращою температурою для накопичення сальмонел є 43 °С.
На наступному етапі здійснюють пересівання з рідких середовищ на
щільні селективні діагностичні середовища, які після витримування у
термостаті за температури 37 °С 18-24 год. досліджують на наявність
типових сальмонел колоній.
Із виявлених колоній виготовляють мазки та фарбують за Грамом,
За необхідності визначають серотипи ізолятів. З цією метою
використовують специфічні монорецепторні сироватки крові
(здійснюють постановку крапельної РА).
Одержані результати порівнюють із типовими ознаками росту
сальмонел і записують у результатах досліду та роблять висновки.

4. Виявлення у м'ясі бактерій групи протею

Мета роботи. Оволодіння студентами методами виявлення та типізації
мікроорганізмів роду Proteus.
Матеріальне забезпечення. Суспензія м'яса, що містить в 1 см3 0,5 г
продукту; чашки Петрі з МЛА; скошений МПА; агар Плоскірєва; трьохцукровий
агар з сіллю Мора; трьохцукровий агар з сечовиною; кольоровий ряд цукрів; фарби
для фарбування за методом Грама; предметні і покривні скельця для виявлення
рухливості; демонстраційні посіви штамів протея на МПА.

225
 Основні відомості. Мікроорганізми роду Proteus належать до
санітарно-показових, а їх наявність у продукті свідчить про гнилісний
розпад і його псування. Бактерії роду Proteus можуть бути причиною
харчової токсикоінфекції. Ці бактерії широко розповсюджені, часто
виділяються з вмістимого кишечника тварин.
З метою виявлення протею здійснюють посіви на живильні
середовища, вивчають характер росту, морфологію, рухливість та
ферментатаині властивості ізолятів.
Проведення роботи. Студенти вивчають характер росту протеїв на
демонстраційних посівах запропонованих кафедрою. Визначають
морфологічні, тинкторіальні властивості і рухливість мікроорганізмів.
В залежності від виду штамів протея ріст може бути вуглеподібним,
або ж у вигляді ізольованих колоній. Вуглеподібний ріст характерний
для Proteus vulgaris – надзвичайно рухливого мікроорганізма, Н-форма
якого виявляє характер рій на поверні середовища (феномен «роїння»).
Наявність на живильному середовищі у чашках Петрі
вуалеподібного росту мікроорганізмів (Н-форма, феномен „роїння"), при
мікроскопії якого виявляються поліморфні рухливі палички, що
фарбуються за Грамом негативно, вказує на зміни викликані «звичайним
протеєм»; поряд з колоніями, які дають розпливчастий по поверхні ріст,
можуть траплятися й ізольовані колонії середніх розмірів, ніжні
напівпрозорі з рожевим центром, палички цих колоній нерухливі (О-
форма). Для підтвердження наявності протею (Н-форма) проводять
посіви у конденсаційну воду за методом Шукевича.
Для виявлення О-форм (які не „рояться") проводять посів на агар
Плоскірєва. На цьому середовищі протеї ростуть у вигляді прозорих
колоній, які викликають характерний запах і злегка підлужнюють
середовище, яке зафарбовується біля них у жовтий колір. Більш старі
колонії часто мутніють, а їх центр набуває бурого забарвлення.

226
 Для виявлення біохімічних властивостей чисту культуру мікробів
висівають на трицукровий агар з сіллю Мора з метою визначення
здатності утворювати сірководень, на трицукровий агар із сечовиною
для визначення здатності розщеплювати сечовину і на кольоровий ряд
цукрів.
Протеї утворюють сірководень (стовпчик агару чорніє),
розщеплюють сечовину (середовище набуває яскраво-червоного
кольору) і не ферментують маніт.
Дослідження запропонованої суспензії м'яса проводять згідно
методик описаних в даній роботі і порівнюють із демонстраційними
посівами та виявленими морфологічними, тинкторіальними та
культуральними властивостями.
Дані записують у результатах досліду та роблять висновки.

5. Виявлення у м'ясі анаеробів СІ. perfingens і СІ. botulinum

Мета роботи. Оволодіння студентами методами виявлення у м'ясі анаеробів
вивчення характеру росту анаеробів на демонстраційних посівах.
Матеріальне забезпечення. Суспензія м'яса, що містить в 1 см3 0,5 г
продукту; кусочки поражених м'язів, набряклі тканини, лімфатичні вузли, печінка і
селезінка (для виявлення збудників злоякісного набряку); кров з серця, слизова
оболонка сичуга і тонкого відділу кишечнику, Інфільтрат підшкірної клітковини
(для виявлення збудників брадзоту овець); вміст кишечнику, поражена нирка (для
виявлення збудників дизентерії ягнят і ентеротоксемії овець); некротичні фокуси
паренхіматозних органів (для виявлення збудника некробактеріозу); вміст шлунка,
товстих кишок, селезінки, кусок печінки і головний мозок (для виявлення збудника
ботулізму); у пробірках середовище Кітт-Тароцці.

Основні відомості. Клостридіози — харчові токсикоінфекції та

токсикози, які викликаються бактеріями, що відносяться до численної
групи (86 видів) анаеробних мікроорганізмів. Особливо небезпечними
представниками клостридій є СІ. perfringens і СІ. botulinum, які
викликають важкі харчові отруєння при вживанні продуктів харчування.
Найчастішою причиною харчових токсикоінфекцій є термостійкі штами
СІ. perfmgens типу А. Вони широко розповсюджені в навколишньому

227
середовищі (в грунті, воді, пилу, продуктах харчування) та в кишечнику
тварин, риб і людини, в першу чергу можуть розглядатись як штами, що
створюють потенційну небезпеку щодо виникнення харчових
токсикоінфекцій.
Захворювання у людини виникає лише при вживанні інфікованих
СІ. perfringens продуктів. Джерелом інфекції є тварини, а також люди
(зрідка), хворі та бактеріоносії. Із грунту СІ. perfringens потрапляють в
корм тваринам та їжу людям. В кишечнику людей та тварин СІ.
perfringens розмножуються досить швидко і в окремих випадках
кількість клітин в 1 г випорожнень складає більше 1 млн.

Ботулізм (botulus - ковбаса) – найважче харчове отруєння., яке

виникає від вживання в їжу продуктів, контамінованих токсинами С.
botulinum, і характеризується ураженням центральної й вегетативної
нервових систем. Збудник захворювання виділив Е. ван Ерменгем у 1896
р. з шинки, яка стала причиною масового отруєння.
За останні роки смертність від ботулізму досягла 20 %,
Інкубаційний період складає, як правило, 4—72 год. За цей час токсин
всмоктується в кишечнику та досягає центральної нервової системи, де
настає фіксація отрути, яка викликає нервово-паралітичні симптоми
ураження організму. У деяких випадках на початковій стадії
захворювання превалюють ознаки гострого гастроентериту, порушення
зору, ядухи та ін. І тільки своєчасна діагностика та введення в організм
специфічної протиботулінічної сироватки можуть забезпечити
одужання.
Сl. botulinum – велика грампозитивна паличка завдовжки 4-10 мкм і
завширшки 0,6-1,5 мкм з округленими кінцями й перитрихіально
розташованими джгутиками. Потрапляючи в зовнішнє середовище,
утворює великі овальні субтермінальні спори, які перебільшують

228
поперечний розмір клітини й деформують її. Палички зі спорами мають
характерний вигляд тенісної ракетки.
Клостридії ботулізму – строгі анаероби, невибагливі до живильних
середовищ, оптимальна температура росту для різних сероварів
коливається від 25 до 40 °С. На середовищі Кітт-Тароцці утворюють
помутніння та осад, мають гострий запах згірклого масла. На цукрово-
кров'яному агарі виростають неправильної форми колонії з
фестончастими краями або ниткоподібними відростками із зонами
гемолізу навколо них.
Виявлення анаеробів полягає у визначенні їх здатності рости без
доступу кисню, морфології збудників, росту на живильних середовищах
і патогенності шляхом зараження лабораторних тварин.
Проведення роботи. Наявність у матеріалі збудників анаеробних
інфекцій визначають методом бактеріоскопії, посівом матеріалу на
живильні середовища і біопробою на лабораторних тваринах, яку
проводять у лабораторіях ветеринарної медицини.
На заняттях проводять вивчення демонстраційних посівів
запропонованих кафедрою, виготовляють із них декілька мазків або
мазків-відбитків, які фарбують метиленовою синькою або за Грамом.
При мікроскопії звертають увагу на форму, розміщення окремих клітин,
наявність і розміщення спор, наявність капсул та відношення до
фарбування за Грамом і порівнюють з даними таблиць щодо морфології
та характеру росту на середовищі Кітт-Тароцці. Одержані дані
записують у результатах досліду.
Для посіву використовують суспензію м'яса. При цьому відбирають
3~5 см3 суспензії, засівають у чотири великі пробірки з регенерованим
середовищем Кітт-Тароцці залиті шаром вазелінового масла товщиною
0,5 см. Посіви перед внесенням у термостат прогрівають для всіх
вказаних анаеробів: дві пробірки при температурі 80 °С 20 хв; для

229
дослідження на Сl. botulinum типу Е одну пробірку при температурі 60
°С 15 хв (за цієї температури зберігаються спори вказаного типу
збудника ботулізму), а другу при 80 °С 20 хв. Інші пробірки залишають
непрогрітими.
При підозрі на СІ, botulinum для виявлення типу Е - одну непрогріту
і одну прогріту при 60 °С витримують при температурі 28 °С, а інші дві
пробірки при температурі 37 °С для виявлення інших анаеробів.
Витримують пробірки у термостаті протягом 5-10 діб. Спостереження за
ростом проводять щоденно. При виявленні росту проводять
мікроскопічне дослідження. Виділення чистої культури проводять
методом розсіву по Вейон-Віньялю. При необхідності вивчають
культуральні і біохімічні властивості та ставлять біопробу.
За одержаними результатами роблять висновки.

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись) (оцінити
м’ясо на свіжість, визначити загальну мікрофлору м’яса, вміст БГКП,
сальмонел, протея, анаеробів у м'ясі тощо) .
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. В яких випадках проводять обов’язково бактеріологічний
контроль м’яса?
2. Як відбирають проби м’яса для мікробіологічного дослідження?
3. Чим можна консервувати проби, що підлягають бактеріологічному
дослідженню?
4. Що вказують у супровідних документах?
5. Які методи застосовують для визначення свіжості м’яса забійних тварин?
6..Які методи використовують для визначення загального
бактеріального забруднення м’яса?
7. Як визначають наявність БГКП, сальмонел, протею, анаеробів
у м’ясі?

230
 ТЕМА 6. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
КОВБАСНИХ ВИРОБІВ

Мета роботи. Набуття студентами навичок підготовлення відібраних проб

та проведення мікробіологічних досліджень ковбасних виробів.
Матеріальне забезпечення. Проби ковбасних виробів; стерильні пінцет,
ножиці, скальпель; вага з різноважками; гомогенізатор або стерильна ступка і
кварцовий пісок;; спирт 96°; МПА; голодний агар; ізотонічний розчин натрію
хлориду. Пробірки, що містять по 5 мл середовища «ХБ», чи Кеслера, або
середовища Хейфеца подвійної концентрації, або середовища КОДА; чашки Петрі з
середовищами Ендо, Левіна і Плоскірєва; сльфітциклосеринове середовище (СЦС);
середовище Вільсон-Блера; середовище Кітт-Тароцці; демонстраційні посіви
мікроорганізмів групи кишкової палички, сальмонел на елективних середовищах;
стерильні пробірки; стерильні чашки Петрі; стерильні піпетки на 1 мл і на 10 мл;
газові пальники або спиртівки; бактеріологічні петлі; стерильні скляні шпателі.

У процесі приготування ковбасних виробів ковбасний фарш

обсіменяється мікроорганізмами, які потрапляють в нього з різних
джерел. Ступінь вихідного мікробного обсіменіння ковбасного фаршу
залежить від санітарно-гігієнічних умов виробництва і дотримання
технологічних режимів.
У силу відмінностей технологічних процесів вироблення варених
та копчених ковбасних виробів мікрофлора цих продуктів змінюється
неоднаково. При порушенні термінів і режимів зберігання готових
ковбасних виробів в результаті протікання в них мікробіологічних
процесів може відбуватися зміна їхньої якості, тобто псування цих
продуктів.
Мікробіологічний контроль ковбасних виробів і продуктів з м'яса
(варені, копчено-варені, копчено-запечені, запечені, смажені,
сирокопчені) проводять:
- періодично, але не рідше одного разу на 10 днів;
- на вимогу контролюючих організацій;

231
 - у випадках встановлення використання підозрілого по
доброякісності сировини та допоміжних матеріалів, порушення
температурного або санітарно-гігієнічного режиму при виготовленні
продукції.
Бактеріологічний аналіз ковбасних виробів і продуктів з м'яса
здійснюють відповідно до ГОСТ 9958-81 і Санітарними правилами і
нормами (СанПіН 2.3.2.560-96). Дослідження спрямовані на виявлення
чотирьох груп мікроорганізмів:
- санітарно-показових - мезофільних аеробних і факультативно-
анаеробних мікроорганізмів (МАФАнМ) і бактерій групи кишкових
паличок (коліформи);
- умовно-патогенних мікроорганізмів, до яких відносяться E. coli,
S. aureus, бактерії родів Proteus, B. cereus і сульфітредукуючих
клостридії;
- патогенних мікроорганізмів, у тому числі сальмонел;
- мікроорганізмів псування - в основному це дріжджі та плісняві
гриби.
Відбір проб. Відбирають точкові проби згідно з ГОСТ 9792-73,

ГОСТ 51447-99 і за загальноприйнятими методами за ГОСТ 26668-85.

Проби продукту масою не менше 250-300 г відбирають у
пергаментний папір. На кожній пробі відзначають ґатунок і вид ковбаси.
Усі відібрані зразки запаковують в один загальний паперовий пакет.
Проби зі стороннім запахом запаковують кожний в окремий пакет. До
проб надається супровідний акт, в якому вказується найменування і час
виготовлення продукту, місце і час відбору проб, причина направлення
їх на аналіз і мета дослідження. У лабораторії проби ковбасних виробів
досліджують органолептичними та бактеріологічними методами.
Залежно від виду продукту об'єднану пробу масою 50 г складають з
окремих проб таким чином:

232
 - ковбасні вироби в оболонці і продукти з свинини, баранини і
яловичини вносять у металевий або емальований посуд, ретельно
протирають ватним тампоном, змоченим у етиловому спирті, і двічі
обпалюють над полум'ям. Потім батони розрізають поздовжньо
стерильним (профламбованим) ножем або скальпелем на дві половини,
не розсікаючи оболонку протилежного боку батону. Пробу відбирають із
декількох ділянок центральної частини і з під оболонки обох половинок
батону;
- із свинячих, баранячих і яловичих продуктів на кістках та з бекону
проби вирізають стерильним інструментом з різних ділянок обпаленого
зразку на глибині 2-3 см від поверхні, бажано ближче до кістки;
- вироби без оболонки (м'ясні хліби, паштети, холодці та інші
вироби) досліджують із поверхні і глибини продукту.
Для аналізу поверхні виробів без оболонки, після розгортання
упаковки, із поверхні виробів, що досліджується роблять змив (з кожної
відібраної проби новим зволоженим ватним тампоном) з тих ділянок, з
якими могли контактувати руки пакувальника. Тампони вносять у
пробірки, заповнені на 1% їх висоти середовищем «ХБ», Хейфеца чи5
см3 середовища Кеслера.
Для аналізу глибинних ділянок продукту проби вносять у металевий
або емальований посуд, змочують етиловим спиртом і обпалюють.
Потім роблять поздовжній розріз і відбирають наважку методом,
вказаним для ковбасних виробів і продуктів в оболонці, складаючи з них
одну об'єднану пробу для кожного зразка окремо, яку вносять у
попередньо зважений бюкс або чашку Петрі.
Проведення роботи.
Приготування розведень. З відібраних проб ковбасних виробів
роблять наважки вагою 20 г і вносять у стерильну колбу гомогенізатора
або стерильну фарфорову ступку для виготовлення суспензії. Дальше у

233
колбу додають стерильного ізотонічного розчину NaCl у
чотирикратному об'ємі (80 см3). У гомогенізаторі матеріал подрібнюють
спочатку на малих обертах ножів, а потім при частоті обертів 15000-
20000 хв протягом 2,5 хв.
При використанні замість гомогенізатора стерильної ступки
суспензію готують шляхом розтирання у ній відваженої проби ковбаси з
2-3 г стерильного кварцового піску і поступовим доливанням 80 мл
стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду або стерильної води.
Якщо для виготовлення суспензії використовуються ліверні
ковбаси, то стерильний пісок можна і не додавати.
В результатах досліду записують із яких ковбас виготовлено
суспензії для аналізу і вираховують скільки продукту міститься у 1 мл
суспензії.
У висновках записують правила етикетування і транспортування
відібраних проб ковбас для мікробіологічного аналізу.

1. Визначення загального мікробного числа ковбасних виробів

(МАФАнМ в 1 г продукту)
Суть методу досліджень полягає у здатності МАФАнМ рости на
живильному агарі при температурі 30°С з утворенням колоній, видимих
при збільшенні 5х.
Для посівів використовують суспензію після 15-хвилинного її
відстоювання при кімнатній температурі.
Для визначення МАФАнМ з кожної проби роблять не менше двох
різних за обсягом посівів, взятих з таким розрахунком, щоб на чашках
зросла від 30 до 300 колоній.
З досліджуваної суміші, стерильними піпетками, в одну
бактеріологічну чашку здійснюють посів 0,1 г, в іншу - 0,01 г продукту (по
1 см3 розведення), заливають 12-15 см3 розплавленого та охолодженого

234
до 45 0С МПА і швидко перемішують вміст чашки, обережно рухаючи її
на поверхні стола. Для того, щоб не розвивалися на поверхні агару
спороутворюючі мікроби і бактерій групи протеїв (Н-форм),
допускається нашарування розплавленого і охолодженого до
температури 45-50 °С голодного агару товщиною 3-4 мм. Після
застигання агару чашки Петрі ставлять у термостат при температурі 30
0
С на 72 год.
Через 72 год підраховують загальну кількість колоній, які виросли
на чашках.
Облік результатів. При визначенні загальної кількості МАФАнМ
в 1 г продукту підраховану кількість колоній перемножують на ступінь
розведення аналізованого продукту по кожній чашці і роблять висновок.
Мікробне число деяких видів і сортів ковбас, паштетів сальтисонів
та холодцю представлені у таблиці 2.12.
Таблиця 2.12.
Мікробне число деяких видів і сортів ковбас, паштетів
сальтисонів та холодцю:
Кількість
Види і сорти ковбас МАФАнМ,
КУО/ г
сирокопчені (ГОСТ 16131-86) і напівкопчені не визначають;
(ГОСТ 16351-86) ковбаси
напівкопчених ковбасах (ДСТУ УРСР 1840 - 84 1х103;
варені ковбаси, сосиски і сардельки (РСТ УССР не більше 1x10
950 -89)
варені ковбаси, сосиски і сардельки 2x103
(тернопільська і славутичська)
варені ковбаси, сосиски і сардельки не більше 5x103
(дніпропетровська субпродуктова, харківська,
приморська, київська субпродуктова, поліська
субпродуктова і ковбаска ліверна українська)
паштет з печінки вищого сорту і сальтисон 1x103;
київський (з поросят) -
сальтисон білий, дніпропетровський, український 2х103
(з рубця), любительський

235
холодць 5х103;
ковбаса кров'яна з сиром 1х103;
ковбаса кров'яна українська і дарницька 5х103
2. Визначення бактерій групи кишкової палички (БГКП) в 1 г
продукту.
Мета визначення бактерій цієї групи - перевірка дотримання режиму
варіння ковбас або санітарно-гігієнічних умов у процесі виробництва
сирокопчених ковбасних виробів.
Аналіз на БГКП проводять за загальноприйнятою методикою з
використанням середовищ, що містять вуглеводи (глюкоза, лактоза). До
них відносяться середовища Хейфеца, ХБ, КОДА, Кесслер. БГКП
ферментують глюкозу і лактозу, тому в середовищах ХБ, Хейфеца і КОДА
утворюються кислі продукти, що змінюють колір індикаторів, а в
середовищі Кесслер в поплавці утворюється газ внаслідок розщеплення
глюкози.
Бактерії групи кишкових паличок позначають у мікробіологічних
нормативах абревіатурою БГКП. Термін БГКП ідентичний схваленому у
міжнародній практиці терміну coliformіs (коліформні бактерії або
коліформи). До них належать такі роди з родини Enterobactericeae:
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Усі харчові
продукти, для яких розроблені та затверджені мікробіологічні
нормативи, регламентуються за вмістом загальної групи коліформ
(БГКП), які встановлюються альтернативним способом ("не
допускаються у певній масі продукту"). Регламенти за припустимим
вмістом БГКП у продовольчій сировині зазвичай встановлюють у межах
0,01-0,001 г (мл), а для продуктів, готових для вживання - 1,0-0,1 г (мл).
Проведення роботи. У пробірки, що містять по 5 см середовища
Кода одного з середовищ запропонованих кафедрою, вносять
стерильною піпеткою 5 см3 виготовленої суспензії.. Допускається

236
використання середовища Кеслера по 10 см3. Засіяні пробірки ставлять у
термостат при температурі 37 °С на 8-20 год.
Посіви змивів, відібраних тампонами із поверхні виробів без
оболонок, витримують при температурі 43°С (для виявлення повторного
бактеріального забруднення).
При рості бактерій групи кишкової палички середовища «ХБ» і
КОДА зафарбовуються у жовтий колір, середовище Хейфеца набуває
також жовтого кольору, який може змінюватися до салатно-зеленого, а
на середовищі Кеслера у поплавку утворюється газ.
Для підтвердження наявності у продукті БГКП проводять посів з
середовища Кеслера (пробірки, що забродили) або Хейфеца (зміна
кольору середовища) у чашки Петрі з середовищем Ендо або
Плоскірєва, або Левіна. Чашки ставлять у термостат при температурі 37
°С. Через 18-20 год. посіви проглядають:
- на середовищі Ендо БГКП утворюють темно-червоні колонії з
металевим блиском або рожево-червоні без блиску,
- на середовищі Плоскірєва – цегляно-червоні з глянцевою
поверхнею,
- на середовищі Левіна - темно-фіолетові колонії або фіолетово-
чорні, блискучі.
Із підозрілих колоній виготовляють мазки, які фарбують за
Грамом. Специфічні зміни середовищ «ХБ» і КОДА не потребують
додаткового підтвердження. При мікробіологічному контролі ковбасних
виробів у виробничих лабораторіях можна обмежуватися виявленням
бактерій з групи кишкової палички без їх біохімічної диференціації.
Виявлення грамнегативних не утворюючих спор паличок, які
специфічно змінюють колір диференційно-діагностичних середовищ і
утворюють характерні колонії на елективних середовищах із лактозою,
вказує на наявність бактерій групи кишкової палички.

237
 У результатах досліду записують на яких середовищах визначався
вміст БГКП, яка їх кількість та порівнюють із демонстраційними
посівами. Роблять висновок про дотримання необхідного режиму при
варінні ковбас і про придатність продукту для вживання.

3. Визначення бактерій з роду сальмонел у 25 г продукту

У різних об'єктах навколишнього середовища сальмонели
зберігаються досить довго. У ковбасах вони виживають від 6 до 13 днів,
в яйцях і замороженому м'ясі - до року. Кип'ятіння викликає їх загибель
у перші секунди, але при низьких температурах вони довго залишаються
живими. Присутність сальмонел і їх токсинів не змінює
органолептичних якостей продуктів.
Відповідно до технічних умов сальмонели не повинні виявлятися у
25 г ковбасних виробів, паштетів, сальтисонів і холодці.
Проведення роботи. Перед проведенням досліджень для виявлення
сальмонел студенти розглядають та описують ріст збудників на
демонстраційних посівах на елективних і селективних середовищах.
Виділення сальмонел проводять у чотири послідовних етапи:
1) первинний (прямий) посів;
2) збагачення;
3) посів із середовищем збагачення;
4) підтвердження.
Первинний посів проводять шляхом посіву суспензії дослідного
матеріалу на щільні елективні середовища. Ці посіви витримують у
термостаті за температури 37 °С і досліджують на наявність колоній, які
є типовими для сальмонел.
У випадку відсутності росту сальмонел при первинному (прямому)
посіві на елективних середовищах, через 12-24 год. проводять
пересівання на середовища збагачення.

238
 Наважку продукту масою 25 г з об'єднаної проби вносять у флакон
Сокслета з 100 см3 середовища збагачення (Мюллера або Кауфмана).
Флакони ретельно змішують і ставлять у термостат при температурі 37
°С на 18-24 год.
На наступному етапі здійснюють пересів з рідких середовищ на
щільні середовища. Через 16-24 год. після ретельного перемішування, з
допомогою бактеріологічної петлі або пастерівської піпетки, проводять
пересів з середовища збагачення у бактеріологічні чашки з попередньо
підсушеним середовищем Ендо, БФА, Плоскірєва, Левіна або вісмут-
сульфіт-агар.
Чашки з посівами ставлять у термостат за температури 37 °С; посіви
проглядають через 16-48 год.
На середовищі Ендо сальмонели утворюють безбарвні або з
рожевим відтінком колонії.
На середовищі БФА сальмонели утворюють крупні, гладкі, прозорі з
червонуватим відтінком колонії. БГКП утворюють колонії жовто-
зеленуватого кольору. Бактерії групи протею проявляють ознаки росту
через 72 год інкубації.
На середовищі Плоскірєва сальмонели ростуть у вигляді безбарвних
колоній, проте колонії більш щільні і дещо меншого розміру, ніж на
середовищі Ендо.
На еозин-метиленовому синьому агарі (агарі Левіна) збудники
ростуть у вигляді прозорих, блідих, ніжно-рожевих або рожево-
фіолетових колоній.
На вісмут сульфітному агарі сальмонели ростуть у вигляді чорних
або коричневих колоній з характерним металевим блиском. При цьому
спостерігається зафарбовування у чорний колір ділянки середовища під
колонією, (крім деяких серологічних типів з групи С), які на згаданому

239
вище середовищі ростуть у вигляді ніжних світло-зелених або великих
сірувато-зелених колоній.
Із виявлених колоній виготовляють мазки, фарбують за Грамом,
мікроскопують і проводять дослідження на рухливість.
Ізольовані характерні колонії сальмонел пересівають на
трицукровий агар Крумвіде-Олькеницького у модифікації Ковальчука,
штрихом по скошеній поверхні та уколом у стовпчик. Посіви ставлять у
термостат на 12-16 год. в термостат за температури 37 °С.
Колір скошеної поверхні вищевказаного середовища внаслідок
росту бактерій з роду сальмонел – рожевий. При посіві у стовпчик
сальмонели обумовлюють жовто-буре забарвлення. Газоутворення
встановлюють за наявністю тріщин і розриву стовпчика агару.
Сірководневоутворюючі сальмонели – викликають потемніння
стовпчика середовища.
Інші грамнегативні бактерії обумовлюють наступні зміни кольору
середовища:
- БГКП - все середовище зафарбовується у синій або синьо-зелений
колір, з утворенням газу або без нього;
- бактерії з групи протею - середовище зафарбовується у яскраво-
червоний колір, іноді утворюється утворюватися чорний осад;
- збудники черевного тифу - косяк зафарбовується у рожевий колір,
стовпчик - в синій або синьо-зелений.
Допускається замість середовища Крумвіде-Олькеницького у
модифікації Ковальчука здійснювати посів на вуглеводневі середовища
у короткий кольоровий ряд, що включає середовища з глюкозою,
лактозою, сахарозою, манітом, мальтозою. Для визначення рухливості,
здійснюють посів на напіврідкий агар та бульйон Хотінгера для
визначення утворення індолу і сірководню.

240
 За потреби, для подальшої ідентифікації бактерій вивчають
серологічні властивості шляхом постановки пробної аглютинації на
предметному склі з аглютинуючою полівалентною сальмонельозною О-
сироваткою. При отриманні позитивної реакції на склі проводять
ідентифікацію за допомогою монорецепторних аглютинуючих О-
сироваток. Після встановлення серологічної групи, за допомогою Н-
сироваток визначають вид бактерій.
Результати досліду студенти оформляють протоколом, роблять
висновок про наявність сальмонел у дослідних зразках ковбас.

4. Визначення бактерій з роду Proteus

Основні відомості. Мікроорганізми роду Proteus належить до
родини ентеробактерій. Це поліморфні грамнегативні палички, які
виявляють ознаки росту на середовищах у Н-формі (рухливі) і О-формі
(нерухомі), ферментують глюкозу і сечовину, не ферментують лактозу і
маніт. Протеї беруть участь у процесах аеробного гниття. Виявлення
вказаних мікроорганізмів у харчових продуктах свідчить про їх
гнильний розпад, а у випадках споживання людиною продуктів з
великою кількістю збудників може привести до виникнення харчових
токсикоінфекцій. Токсичність протея пов'язана, головним чином, з
ентеротоксином - глюцидо-ліпідо-протеїновим комплексом клітини і
виявяється при її руйнуванні, однак відомі штами протея, що
виробляють етеротоксин.
На харчові продукти протей потрапляє через забруднення
фекаліями людей та тварин, під час транспортування, зберігання та
технологічної обробки. Відомі випадки зараження м'яса за життя варин,
хворих на кишкові захворювання, що викликаються протеєм.
Найчастіше спалахи протейних токсикоінфекцій виникають при

241
куштуванні сирого фаршу, вживанні кров'яних ковбас, які виготовлені з
порушенням санітарних правил.
Проведення роботи. Для підтвердження наявності протея у Н-
формі 0,5 см3 досліджуваної суспензії, яка аналізується вносять у
конденсаційну воду свіжоскошеного МПА, розлитого в широкі пробірки,
(метод Шукевича). Вертикально поставлені пробірки ставлять у
термостат за температури 37 °С.
Через 18-24 год. посіви проглядають. Звертають увагу на утворення
повзучого вуалеподібного нашарування з голубуватим відтінком. На
скошеному агарі культура піднімається із конденсаційної рідини вверх
по поверхні МПА. При виявленні характерного росту мікробів роду
Proteus, роблять мазки, фарбують за Грамом та мікроскопують. У
препаратах «роздавленої краплі» або «висячої краплі» досліджують
рухливість бактерій.
Для виявлення О-форм протея посів здійснюють на агар Плоскірєва.
О-форма росте у вигляді прозорих колоній, середовище навколо колоній
забарвлюється у жовтий колір, в результаті утворення лужних продуктів.
Підозрілі колонії пересівають на середовище Крумвіде-
Олькеницького у модифікації Ковальчука, де за наявності протеїв
середовище зафарбовується у яскраво-червоний колір (внаслідок
розщеплення сечовини) і може утворюватися чорний осад, іноді з
розривом агарового стовпчика (внаслідок утворення сірководню).
Ідентифікацію протея проводять за морфологічними ознаками (це
грамнегативні палички), здатності до гідролізу сечовини і утворення
сірководню. Додатково вивчають ферментацію глюкози (позитивний
результат), лактози і маніту (негативний результат), рухливість в висячої
або роздавленої краплі або проводять посів уколом у стовпчик
напіврідкої середовища.

242
 Виявлення поліморфних грамнегативних паличок, рухливих, що
утворюють характерний повзучий ріст на скошеному м’ясопептонному
агарі (за Шукевичем), зброджують глюкозу і сечовину,
неферментруючих лактозу і маніт, вказує на наявність у продукті
бактерій з роду протея.
Студенти аналізують результати досліджень, складають
протокол досліджень, роблять висновки.

6. Визначення коагулазопозитивних стафілококів

Метод виявлення стафілококів у продукті заснований на
визначенні морфології, характеру росту на живильних середовищах і
здатності окремих стафілококів ферментувати лецитиназу і коагулювати
цитратную плазму крові кролика під впливом ферменту коагулази.
Для виявлення лецитиназної активності з дослідної суміші роблять
посіви на чашки Петрі з жовтково-сольовим агаром, який містить 6,5%
натрію хлористого. Суміш наносять на поверхню агару по 0,2 мл та
рівномірно розтирають по всій поверхні середовища. Чашки ставлять у
термостат за температури 37 оС на 24 год, а потім витримують 24 год
при кімнатній температурі.
Колонії стафілокока мають вигляд плоских або злегка випуклих
блискучих колоній з рівним краєм, які можуть утворювати “райдужний
вінчик”. З підозрілих колоній готують мазки, фарбують за Грамом.
Стафілококи – грампозитивні дрібні коки, розташовані гронами.
Для підтвердження ознак патогенності стафілококів ставлять
реакцію плазмокоагуляції. Для постановки реакції плазмокоагуляціі
використовують, як правило, суху нітратну плазму крові кролика.
У пробірку з 0,5 мл цитратної плазми крові кроля вносять петлю
чистої добової культури стафілокока і ставлять у термостат при

243
температурі 37 0С. Реакцію враховують через 3-4 год і залишають у
термостаті на 24 год для кінцевого урахування через 24 год.
Реакцію вважають позитивною, якщо плазма коагулюється у
згусток. Для визначення кількості стафілококів враховують колонії, які
дали позитивну реакцію плазмокоагуляції.
Наявність стафілококів в 1 г продукту не допускається.
7. Визначення сульфітредукуючих клостридій
Основні відомості. Наявність сульфітредукуючих клостридій у
харчових продуктах свідчить про їх забруднення грунтом та ймовірності
контамінації іншими патогенами, зокрема збудниками ботулізму.
Регламенти за допустимим вмістом сульфітредукуючих клостридій
встановлені для тих продуктів, що відомі як потенційно можливі
фактори передачі ботулізму: ковбасні вироби, білкові продукти для
виробництва ковбас та ін. (не допускаються в 0,1-0,01 г продукту).
Суть методу полягає у здатності сульфітвідновлюючих клостридій
проявляти специфічний ріст на середовищах СЦС або Вільсон-Блера. В
результаті відновлення сірчистокислого натрію у сірчанокислий натрій
відбувається взаємодія з хлористим залізом. При цьому середовище
забарвлюється у чорний колір за рахунок сірчистого заліза.
При виявленні клостридій у продукті, що досліджується визначають
їх титр – максимальне розведення суспензії, яке обумовило почорніння
середовища. Наприклад, якщо характерні зміни спостерігаються у
пробірках з розведенням 10-1, то вважають, що у досліджуваному
продукті буде 10 (або 1х101) мікробних клітин у 1г; якщо характерні
зміни спостерігаються у пробірках з розведення 10-2 – вважають, що у
досліджуваному продукті -100 (або 1x102) мікробних клітин в 1 г).
Проведення роботи. У пробірки, які містять по 9 см3 розплавленого
о
та охолодженого до 45 С середовища Вільсона-Блера, вносять
стерильною піпеткою по 1 см3 десятикратних розведень (від 10-1 до 10-7)

244
суміші досліджуваного продукту. Вміст пробірок ретельно
перемішують. Посіви інкубують за температури 46 оС протягом 8-12 год.
Поява у середовищі чорних колоній або почорніння середовища вказує
на присутність сульфітредукуючих клостридій.
Почорніння середовища Вільсона-Блера можуть викликати і
ентеробактерії. З метою диференціації сульфітвідновлюючих клостридій
здійснюють пересів у пробірки з середовищем Кітт-Тароцці, попередньо
прогрітого протягом 25 хв. у киплячій водяній бані із наступним
охолодженням до 45 °С. Дослідні пробірки ставлять у термостат за
температури 37 °С. Щоденно протягом 5 діб їх контролюють на
наявність помутніння середовища, виділення газу, появу специфічного
запаху, розпаду шматочків печінки.
Зразу після виявлення ознак росту виготовляють мікроскопічний
препарат для мікроскапії. Для цього матеріал беруть із дна пробірки
пастерівською піпеткою. Мікроскопією мазка виявляють грампозитивні
палички, які утворюють овальні спори.
У спороутворюючих грампозитивних мікроорганізмів виявляють
каталазну активність за допомогою розчину перекису водню 30 г/дм3.
Відсутність бульбашок газу при додаванні до краплі культуральної
рідини такої ж кількості перекису водню дає підставу вважати, що у
посівах наявні мікроорганізми із роду клостридій. У випадку відсутності
спор у мікроскопічному препараті, позитивної проби на каталазу,
наявності у посівах “змішаної" мікрофлори, 1-2 краплі
накопичувального середовища переносять у стерильну бактеріологічну
чашку, заливають розплавленим і охолодженим до 45 °С середовищем
Вільсона-Блера. Після застигання середовища на його поверхню
наливають голодний агар. Посіви ставлять у термостат 24-48 год.за
температури 37 °С. Виявлення у нижньому шарі агару чорних або

245
коричневих колоній свідчить про наявність у посівах
сульфітвідновлюючих клостридій.
За результатами досліджень вказують наявність або відсутність у
ковбасних виробах клостридій. У випадку виявлення останніх, вказують
що необхідно робити із продуктом. Мікробіологічні показники
ковбасних виробів і продуктів з м'яса забійних тварин і птиці
регламентовані СанПіН 2.3.2.1078-01 представлені в таблиці 2.13 -2.14.
Таблиця 2.13.

Мікробіологічні показники ковбасних виробів і продуктів з

м'яса забійних тварин і птиці

Продукт Маса продукту (г), в якій не Примітка

допускається
МАФАн Патогенні Сульфітре
М, КУО/г, БГКП ентеробакт дукуючі
ерії у клостридії
т.ч.сальмо
нели
Ковбаса сирокопчена, - 1,0 25 0.01
напівкопчена, варено-
копчена
Ковбаса варена 1х103 1,0 25 0.1 S.aureus в 1
г не допуск
Бекон пресований 1х103 1,0 25 -
Рулет з яловичини в 5х102 1,0 25 -
упаковці і без неї
Шинка в целофані 1х102 - 10 25 -
Шинка в оболонці 2х102

Таблиця 2.14.
МАФАн Маса продукту, в якій не допускається наявності
М, КУО / БГКП Сульфіт- S. Патогенні м-ми
Група продуктів г, не редукуюч сальмо лістерії
більше их aureus нели
клостриді
ї
Ковбаса сирокопчена - 0,1 0,01 1 25 25
і напівкопчена
Ковбаса варено- - 1,0 0,01 1 25 25
копчена
Ковбасні вироби - 1,0 0,1 1 25 25
сирокопчені, варено-

246
копчені,
напівкопчені,
нарізані та упаковані
під вакуумом в
полімерну плівку
Ковбаси варені 1 * 10 3 1,0 0,01 1 25 25
вищий і I сорт
Ковбаси варені II 2,5 * 10 3 1 0,01 1 25 25
сорт

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись) (оцінити
м’ясо на свіжість, визначити загальну мікрофлору м’яса, вміст БГКП,
сальмонел, протея, анаеробів у м'ясі тощо) .
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.
Питання для самоконтролю.
1.Як відбирають зразки ковбасих виробів для санітарно-
мікробіологічного дослідження?
2.Як проводиться підготовка зразків ковбасих виробів до
мікробіологічних досліджень?
3. Які методи застосовують для визначення свіжості м’яса забійних
тварин?
3.Які методи використовують для визначення загального
бактеріального забруднення м’яса, наявністі БГКП, сальмонел, протею,
анаеробів у м’ясі?

ТЕМА 7. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОПЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

М’ЯСОКОПЧЕНОСТЕЙ

Мета роботи. Оволодіння методиками, щодо підготовки проб копченостей

(окостів копчених і варено-копчених, рулетів яловичих копчених і копчено-варених,
корейок і грудинок, буженини, карбонаду тощо) для проведення бактеріологічного
дослідження та методологією контролю санітарного стану копченостей у процесі
їх виготовлення.
Матеріальне забезпечення. Проби копченостей; гомогенізатор або стерильна
фарфорова ступка; стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду або стерильна
вода; стерильний пісок; стерильна колба гомогенізатора; МПА; голодний агар;
ізотонічний розчин натрію хлориду; шприцювальний і заливний розсоли; пробірки з 4
мл стерильної води; пробірки з нагрітим і охолодженим до 45 °С середовищем
Вільсона-Блера; стерильні піпетки на 1 і на 10 см3, спирт-ректифікат; ватні
тампони; спиртівка. бактеріологічні петлі; стерильні шпателі.

247
 Основні відомості. Копченням називають обробку м'ясних виробів
димовими газами, які утворюються внаслідок неповного згоряння
деревини. Під дією компонентів диму призупиняється не лише вплив
мікроорганізмів на виготовлений продукт, але і окислювальна дія
оксигену повітря на жирову тканину. Сприяє проникненню компонентів
диму у глибинні шари продукту їх попереднє засолювання.
Бактерицидний ефект зростає зі збільшенням концентрації диму і
температури копчення.
До дії коптильних речовин надзвичайно стійкими є плісеневі гриби,
які здатні розвиватися навіть на добре прокопчених продуктах, особливо
за високої вологості. Спори більшості мікроорганізмів гинуть після 14-
18-годинної дії диму. Неспороутворюючі бактерії і вегетативні форми
спороутворюючих мікробів гинуть після 1-2-годинного витримування у
димі. Досить чутливі до дії диму кишкова паличка, протей і стафілококи.
Виживання мікроорганізмів на поверхні виробу залежить від
початкового мікробного обсіювання, температури та відносної вологості
диму.
Санітарно-мікробіологічне дослідження копчених виробів, як і
ковбас, проводиться при систематичному плановому контролі
відповідності їх якості і за епідемічними показаннями для вияснення
причини виникнення харчових токсикоінфекцій. Згідно діючих
нормативів прийнято визначати: загальне мікробне обсіменіння та
санітарний стан розсолу за вмістом клостридій.
Для санітарно-мікробіологічного дослідження від кожного виду
продукту відбирають проби для дослідження відповідно до ГОСТу 9792-
73 і ГОСТу 26929-86. З відібраних проб виготовляють об'єднану пробу
кожного виду копченого продукту масою 50 г так, як описано у
попередній роботі (розділ 2, тема 5).

248
 З об'єднаної проби кожного зразка відбирають у стерильний посуд
(пергамент) наважку масою 20 г і виготовляють суспензію продукту
аналогічно, як при дослідженні ковбас (1 см3 виготовленої суспензії, що
досліджується містить 0,2 г продукту).

Визначення загального мікробного числа м’ясокопченостей

Визначення мікробного числа копчених продуктів проводять
аналогічно дослідженню ковбасних виробів (розділ 2, тема 6). У
результатах досліду записують підраховану кількість колоній мікробів,
що виросли на МПА і вирахуване мікробне число досліджуваного
продукту.
За одержаними результатами роблять висновки про якість продукту
у відповідності із санітарними вимогами.

Дослідження санітарного стану розсолу за вмістом клостридій

У процесі соління вміст мікроорганізмів у поверхневих і глибоких
шарах м'ясних відрубів збільшується у декілька разів. Однією з
основних причин цього збільшення може бути розсіл.
Використання некип'яченого розсолу приводить і до зростання
мікробного числа у сировині для виготовлення копченостей. У
використаному розсолі нагромаджується різна мікрофлора: найчастіше
мікрококи, лактобацили, стрептококи, дріжджі, ешерихіїї, псевдомонади
і рідше – протеї, стафілококи, клостридії, плісеневі гриби. Особливу
небезпеку у розсолі представляють сальмонели, які можуть зберігатися
тривалий час на стінках недостатньо вимитих чанів, а також у розсолі і
навіть у сировині.

249
 Основним видом псування розсолу є його гниття. За цих умов розсіл
стає каламутним на вигляд, на краях засолювального чану можна
спостерігати піноутворення; часто розсіл стає в'язким, іноді на ньому
може з’являтися плівка плісняви і затхло-гнильний запах.
При вийманні м'яса з розсолу органолептичні зміни виявляються як
на його поверхні, так і у глибоких шарах. Санітарний стан розсолу
оцінюють за ступенем забруднення його клостридіями, серед яких
можуть траплятися як патогенні, так і сапрофітні мікроорганізми.
Проведення роботи. Виготовляють послідовні розведення з 1 мл
шприцювального і 1 мл заливного розсолів так, як описано в попередній
роботі (тема 3. «Санітарно-бактеріологічне дослідження води»).
Перед проведенням посівів пробірки з розведеннями розсолів
прогрівають у водяній бані за температури 80 °С протягом 20 хв.
Стерильними піпетками відбирають по 1 мл різних розведень розсолу і
переносять їх у пробірки з розплавленим і охолодженим до 45 °С
середовище Вільсона-Блера. Вміст пробірок змішують шляхом їх
обертання між долонями. Посіви інкубують за температури 43 °С
протягом 12-18 год. Визначають найвище розведення розсолу, яке дає
ріст колоній чорного кольору та газоутворення на середовищі.
Розраховують кількість мікроорганізмів в 1 см3 розсолу. Санітарну
оцінку розсолу проводять за ступенем забруднення його клостридіями,
згідно таблиці 2.15.
Таблиця 2.15.
Санітарна оцінка розсолу за вмістом клостридій
Ступінь Кількість Кількість
забруднення розсолу мікроорганізмів у 1 мікроорганізмів у 1
мл шприцювального мл заливного розсолу
розсолу
Дуже малий Менше 500 Менше 100 тис.

Малий 500-5000 100 тис. - 1 млн.

250
 Середній 5000 - 20000 1-5 млн.

Високий 20000 - 50000 5-25 млн.

Дуже високий Понад 50000 Понад 1 5 млн.

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись) (оцінити
м’ясокопченості на свіжість, визначити загальну мікрофлору
м’ясокопченості, дати санітарну оцінку розсолу за ступенем забруднення
його клостридіями.
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. .Як відбирають зразки копчених м’ясних виробів для санітарно-
мікробіологічного дослідження?
2. Як проводиться підготовка зразків м’ясокопченостей до
мікробіологічних досліджень?
3. Як визначається загальне мікробне число у копчених м’ясних
продуктах?
4. Як проводиться мікробіологічний контролю санітарного стану
копченостей у процесі їх виготовлення.
5. Як оцінюється санітарний стан розсолу за ступенем
забруднення його клостридіями?

ТЕМА 8. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

М'ЯСНИХ КОНСЕРВІВ

1. Мікробіологічний контроль консервів до стерилізації

Мета роботи. Ознайомлення з методами визначення в консервах перед
стерилізацією мезофільних аеробних і факультативно - анаеробних мікроорганізмів
( МАФАМ ) та спор мезофільних анаеробних мікроорганізмів ( МАнМ ) .

Матеріальне забезпечення. Консерви до стерилізації; МПА; голодний агар;

ізотонічний розчин натрію хлориду; середовище Кітт-Тароцці з глюкозою,

251
стерильні пробірки; стерильні бактеріологічні чашки; стерильні піпетки на 1 см3 і
на 10 см3.

Основні відомості. Сировину для виготовлення консервів

контролюють один раз в зміну на кожній лінії і по всьому асортименту.
Проби відбирають перед тепловою обробкою (по три банки) через
годину після початку роботи лінії.
Для вмістимого м'ясних консервів встановлені нормативи вмісту
мікроорганізмів, у випадку перевищення яких у вмістимому консервів
перед їх стерилізацією необхідно проконтролювати санітарно-
мікробіологічні показники всього технологічного циклу консервного
виробництва для виявлення і усунення джерел забруднення сировини.
Якщо в сировині виявляють підвищений вміст мікроорганізмів, то
це вказує на можливість наявності в ньому спор анаеробних
мезофільних і термофільних мікроорганізмів.
До мезофільних анаеробів відносяться клостридії (патогенні і
непатогенні). Температурний оптимум фізіологічного розвитку їх
становить в межах 25...45 °С. Ці мікроорганізми живуть в грунті, повітрі,
воді, можуть міститися на шкіряному покриві тварин, в шлунково-
кишечному тракті.
Клостридії добре розвиваються при попаданні в м'ясо під час
розділення туші в цеху переробки тварин, при порушенні вимог гігієни
під час зберігання і транспортування м'яса. Залишки сировини на
обладнанні, тарі та інших місцях також є поживним середовищем для
цих мікробів.
Термофільні мікроорганізми, їх спори попадають в м'ясну сировину
в основному із грунту. Найчастіше серед термофільних бацил виділяють
B.stearothermophilus, B.thermoaerophilus.
Дослідження сировини м'ясних консервів на наявність спор
термофільних бактерій – збудників плоско-кислого псування, проводять

252
при виявленні даного виду псування в готовій продукції або в порядку
профілактичного контролю нерідше 1 разу в тиждень по кожному виду
продукції, що виробляється. До збудників плоско-кислого псування
відносять B.stearothermophilus, B.aerothermophilus, B.coaqulans,
Cl.aceticum та ін.
За діючими нормативами в 0,5 см сировини консервів перед
стерилізацією у сировині взагалі не повинно бути спор облігатних
мезофільних або термофільних анаеробів.
Санітарний стан обладнання, тари та інвентаря контролюють після
проведення санітарної обробки. При цьому на 1 см2 їх поверхні
кількість мікроорганізмів не повинна перевищувати 300, а наявність
протея і кишкової палички не допускається.
Джерелом бактеріального обсіменіння консервів можуть бути також
прянощі і, рідше, недостатньо промиті внутрішні поверхні консервних
банок. Із прянощами у консерви вноситься основна маса спор бацил.
Бактеріальне обсіменіння скляних консервних банок за умов
повторного їх використання є зазвичай вище ніж у нових банок.
У процесі технологічних операцій, які здійснюються перед
стерилізацією, постійно відбувається збільшення кількості
мікроорганізмів у продукті, що консервується. Особливо це необхідно
враховувати у літній період, і у тому випадку, якщо підготовчі роботи
проводяться у приміщеннях, які з'єднані з приміщеннями для
стерилізації. При затримці стерилізації, зокрема і вже закупорених
банок, можливе розмноження мікроорганізмів, що негативно
відбивається на якості та може приводити до мікробного псування
продукції. В 1г продукту, що консервується, до стерилізації
допускається не більше 100 клітин B.cereus.
Загальна кількість бактерій (МАФАнМ) у консервах перед
стерилізацією в 1г (1см3) не повинна перевищувати 10000 - 50000

253
мікробних клітин (в залежності від виду продукту). У консервах для
дитячого харчування показник МАФАнМ не повнен перевищувати – 200
мікробних клітин у 1 г, клостридії не повинні виявлятися в 0,5 см3
вмісту банки.
Проведення роботи. Для визначення кількості мікроорганізмів у
сировині для консервування, відбирають пробу для аналізу на
стерильність і промислову стерильність.
Для визначенні стерильності консервів підготовлену пробу
висівають без розведення та визначають кількість мікроорганізмів в 1
см3 або в 1 г продукту за формулою:
X = a : q;
де:
X - загальна кількість мікроорганізмів в 1 см3 або 1 г продукту;
а - середньоарифметичне число колоній, що виросло на чашках;
q - об'єм посівного матеріалу, внесеного у бактеріологічну чашку.

Визначення промислової стерильності консервів проводять шляхом

відбирання 1 см3 матеріалу із підготовленої для аналізу проби продукту,
що консервується, і перенесення його у першу пробірку з попередньо
налитими 9 см3 розчинника. З одержаного першого розведення 1 х 10"'
відбирають 1 см3 матеріалу і переносять у наступну пробірку з 9 см3
розчинника і т. д. (найчастіше готують розведення 1х103 або 1х 104).
Розрахунок проводять за формулою:

Х = а- 10 п (Vnp. +Vводи)/ Vnp. • q; (1)

де:
10 п - ступінь розведення продукту при виготовленні послідовних
розведень;
V води - об'єм води, використаний для підготовки проби;

254
 V пр. - об'єм продукту, використаного для підготовки проби;
q - об'єм посівного матеріалу, внесеного на чашку Петрі.
При аналізі змивів з продукту розрахунок ведуть за формулою:

Х-а- 10" • V води /Vnp • q;

Із паралельних посівів визначають середньоарифметичне число
колоній, що виросло на чашках, множать його на відповідне розведення
і знаходять кількість мікробів в 1 см3 або 1 г продукту за формулою (1).
Після підрахунку колоній, за потреби, визначають їх рід і вид.
Результати роботи записують у результатах досліду.
За одержаними результатами студенти оформляють протокол
досліджень, де роблять висновки і характеризують мікроорганізми, які
можуть міститися у сировині, яка консервується.

2. Мікробіологічний контроль консервів після стерилізації

Мета роботи. Оволодіння методикою визначення залишкової мікрофлори у

м'ясних консервах (виявлення в продукті життєздатних мезофільних аеробних і
факультативно-анаероних мікроорганізмів (МАФАнМ), мезофільних анаеробних
мікроорганізмів (МАнМ); ознайомлення із причинами псування консервів.

Матеріальне забезпечення. Консерви, витримані у термостаті при

температурі 37 °С протягом 5 днів; 2 пробірки з МПБ; середовище Кітт-Тароцці
бактеріологічні петлі; предметні скельця; барвники для фарбування за Грамом;
імерсійна олія; спиртівка або газовий пальник; мікроскопи.

Основні відомості. Мікроорганізми, які в процесі стерилізації

консервів залишилися життєздатними, називають залишковою
мікрофлорою.

255
 Видовий склад залишкової мікрофлори залежить від продукту, що
стерилізується, і режиму стерилізації. Частіше всього зустрічаються
мезофільні аеробні і факультативно-анаеробні бактерії, зокрема
B.subtilis, B.megaterium, B.cereus, B.pumilus, кислотоутворюючі
термофільні спорові аероби B.stearothermophilus, B.aerotermophilus, В.
polymyxa, мезофільні гнильні анаеробні бактерії Clostridium sporogenes,
Cl. putrificum; термофільні газоутворюючі анаероби –
СІ.thermosaccharolyticum, B.perfringens; маслянокислі бактерії.
При стерилізації консервів у автоклавах гинуть спочатку ті
мікроорганізми, які знаходяться у фасованому продукті біля стінок
банок. В останню чергу гинуть мікроорганізми, які знаходяться в
геометричному центрі консервів. Тривалість термічної обробки цієї зони
найкоротша, а тому у ній, найчастіше можуть виживати мікроорганізми,
які називають залишковою мікрофлорою.
У залишковій мікрофлорі консервів з високою кислотністю, що
проходять термічну обробку при відносно невисоких температурах,
можуть зберігатися деякі неспороутворюючі молочнокислі бактерії.
Причинами формування залишкової мікрофлори можуть бути
недостатня стерилізація і вторинна контамінація консервів
мікроорганізмами.
Стерилізація буває недостатньою найчастіше внаслідок порушення
режиму автоклавування і часткового видалення повітря. За цих умов у
залишковій мікрофлорі можуть виявлятися спорові і безспорові
грампозитивні палички та коки, а також грамнегативні бактерії. Останні
виявляють в основному внаслідок суттєвих порушень технології
виготовлення консервів.
За повторної контамінації мікроорганізми попадають у вміст
консервів вже після правильно проведеної стерилізації через нещільно
закриті місця банок. У цьому випадку повторне обсіювання консервів

256
мікроорганізмами проходить не тільки з води для стерилізації, але і
внаслідок проникнення охолоджуючої води, у якій іноді може
знаходитися велика кількість мікроорганізмів, у т. ч. патогенних.
Консерви з вторинною мікробною контамінацією містять, як
правило, змішану мікрофлору. Найчастіше виявляють грамнегативні
бактерії, зокрема Proteus і бактерії групи кишкових паличок (БГКП).
Перші обумовлюють гнильний розпад нежирних частин м'яса і часто
розріджують желатин. БГКП призводять до зміни кольору, появи
неприємного запаху. В разі попадання грам позитивних мікрококів та
лактобацил спостерігається закисання консервів.
Для виявлення залишкової мікрофлори консерви вибірково (5-10%
від партії) термостатують, тобто витримують (на складі або в
термостатних камерах) при температурі 20°, 37° іноді 55°С (в залежності
від виду продукту) до 15 діб. При цьому створюються сприятливі умови
для розвитку мезофільних і термофільних бактерій. Показником
мікробіологічної стабільності консервів є збереження нормального
зовнішнього вигляду тари. Результати термостатування і
мікробіологічного контролю консервів є основою для висновку про
доброякісність і можливість зберігання.
Проведення роботи. З кожної банки консерви, витриманої у
термостаті за температури 37 °С протягом 5 днів, бактеріологічною
петлею роблять посіви вмісту у дві пробірки з МПБ. Посіви інкубують у
термостаті при цій же температурі протягом 5 діб, проглядаючи їх кожен
день. У випадку виявлення ознак росту (помутніння, утворення
пристінкового кільця або плівки чи осаду) виготовляють мазки,
зафарбовують їх за Грамом і мікроскопують.
При виявленні у мазках великих грампозитивних паличок або коків
проводять посів на МПА у бактеріологічні чашки і колонії, що виросли,
ідентифікують.

257
 Якщо у мазках виявляють дрібні грамнегативні неспороутворюючі
палички, то з первинних посівів роблять висіви на середовище Ендо,
скошений агар (за Шукевичем) і на МПА з 1% глюкози. За наявності
росту на цих середовищах, характерного для кишкової палички і
протею, вивчають їх властивості.

Виявлення анаеробних мікроорганізмів у консервах.

У залишковій мікрофлорі консервів часом виявляють збудників
харчових отруєнь – СІ.botulinum, Cl. Perfringes та ін. Особливо
небезпечною є Cl botulinum, при розмноженні цього мікроорганізму,
відсутні зовнішні ознаки псування консервів, хоча токсин мікроба
міститься у продукті.
Оскільки мікробне псування може не викликати помітних змін тари
(здуття, хлопавка), в окремих випадках, передбачених нормативною
документацією, проводять мікробіологічний контроль: визначають
наявність мікроорганізмів та їх видовий склад. У баночних консервах не
всі мікроорганізми, що залишилися після стерилізації, здатні
розвиватися. Псування м'ясних консервів найчастіше виникає наслідок
життєдіяльності бацил і клостридій.
Розмноження у консервах бацил супроводжується появою кислого
або різко вираженого гнильного запаху. Значних відхилень у кольорі і
консистенції вмісту консервів при цьому не спостерігається. Псування
консервів, викликане клостридіями, найчастіше проявляється появою
запаху тухлих яєць і зміною кольору.
При розмноженні у консервах мезофільних клостридій – Clostridium
putrifaciens і Clostridium sporogenes майже у всіх випадках виникає їх
бомбаж. Вміст банок стає м'яким, частково кашоподібним і блідим.
Желатин розріджується, а у рідині виявляють бульбашки газу з
неприємним запахом (індол, скатол, путресцин, сірководень, аміак,

258
тощо). Кінцевим етапом анаеробного розпаду є те, що все вміст банки
перетворюється у мутну пінисту рідину.
Проведення роботи. Проводять посів проб консервів у дві пробірки
з середовищем Кітт-Тароцці без вазелінового масла, але з додаванням
0,15% агару. Перед посівом для видалення розчиненого кисню
середовище регенерують шляхом прогрівання, потім стерильною
пастерівською піпеткою у кожну пробірку вносять не менше 5 г вмісту
консервної банки. Засіяні проби ставлять у термостат за температури 37
°С на 5 діб. При наявності росту мікробів з культури виготовляють
мазки, фарбовують за Грамом і мікроскопують. Особливу увагу
звертають на виявлення у мазках ракеткоподібних паличок. У випадку їх
виявлення, проводять посів 1-2 см3 культури у бактеріологічну чашку з
глюкозним МПА „під скло". Чашки ставлять у термостат за температури
37 °С на 1-2 доби.
У результатах досліду, студенти записують як проявляється ріст
облігатних анаеробів „під склом". Роблять висновки щодо подальшого
використання консервів в яких проявляється ріст анаеробних
мікроорганізмів.

Дослідження вмісту консервів на наявність токсину

СІ.botulinum

Мета роботи. Студентів ознайомити з особливостями підготовлення м'ясних

і рибних консервів для виявлення токсину; оволодіння методикою визначення
токсину ботулізму;.
Матеріальне забезпечення. Дослідні проби консервів; ватно-марлевий фільтр
або центрифуга; центрифужні пробірки (у випадку використання центрифуги) або
біологічні пробірки; антитоксична сироватка; суміш діагностичних сироваток
типів А, В, С, Е проти збудника ботулізму; білі миші живою масою 16-17 г;
стерильний шприц; спиртовий розчин йоду; ватний або марлевий тампон;
стерильні піпетки на 1 см3,

Основні відомості. У консервах з нормальною залишковою

мікрофлорою слід враховувати можливість збереження патогенних і

259
умовно-патогенних клостридій. Найбільш небезпечним представником
таких мікроорганізмів є Clostridium botulinum, який є причиною важкої,
часто смертельної харчової токсикоінфекції – ботулізму.
Токсин Cl. botulinum – білок, який проявляє нейротоксичну дію.
Часовий інтервал між попаданням токсину в організм і виникненням
перших ознак ботулізму не перевищує 24 години, але може проявлятися
від 4-6 до 96 годин і більше. Проявлення хвороби залежить від природи
продукту, який став причиною отруєння, кількості токсину, який
потрапив в організм і станом хворого. Першою, але не постійною
ознакою отруєння є розлади шлунково-кишкового тракту (нудота,
блювота, болі у животі). Часто хворі жаліються на сухість у роті або
підвищене слиновиділення. Одночасно розвивається головний біль і
нервово - паралітичні явища (порушення ковтання), а також
периферичні ураження нервово – м'язової передачі, які проявляються на
початку в'ялістю або повною втратою руху з наступним розвитком
парезів і паралічів очних, глоткових і гортанних м'язів, а також м'язів
шиї і кінцівок.
Для виявлення токсину банки з консервами витримують у
термостаті 10-12 діб. Слід враховувати і те, що у консервів дуже часто
не виявляють ніяких відхилень зовнішнього вигляду. Після
витримування у термостаті консерви відкривають, стерильно відбирають
50-100 г розтирають і фільтрують через ватно-марлевий фільтр або
центрифугують при частоті обертів 2500-3000 хв протягом 30 хвилин. У
надосадовій рідині визначають токсин, а за необхідності, в осаді -
збудника. Токсини збудника ботулізму термолабільні, але для повної
інактивації необхідне кип'ятіння протягом 20 хв.
Проведення роботи. З одержаними фільтратами або
центрифугатами ставлять реакцію нейтралізації токсину антитоксичною
сироваткою. Попередньо реакцію нейтралізації проводять з сумішшю

260
протиботуліністичних діагностичних сироваток типів А, В, С, Е на білих
мишах живою масою 16-17 г. Якщо у пробі виявляють токсин то
проводять розгорнуту реакцію нейтралізації для визначення типу
токсину з типоспецифічними сироватками.

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись) (оцінити
якість консервів
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. .Як відбирають зразки консервів для бактеріологічного
дослідження?
2. Як проводиться підготовка зразків консервів до мікробіологічних
досліджень?
3. Як здійснюється мікробіологічний контроль консервів до
стерилізації.
4. Що таке промислова стерильність консервів? За якими
показниками можна визначити промислову стерильність консервів?
5. Залишкова мікрофлора консервів, методи її визначення.
6. Як проводиться мікробіологічний контроль консервів після
стерилізації?
7. Які особливості підготовлення консервів для виявлення токсину
збудника ботулізму?

ТЕМА 9. МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЯЄЦЬ І

ЯЄЧНОЇ ПРОДУКЦІЇ

Мета роботи:оволодіти методикою мікробіологічного дослідження курячих

яєць і яєчної продукції.
Матеріальне забезпечення. Курячі яйця (3 штуки), яєчний меланж 100 г,
яєчний порошок 100 г, стерильні колби Ерленмейєра, стерильні пробірки,
бактеріологічні чашки. піпетки, фізрозчин, скляні буси, скальпель, 70 % етанол,
0,2%-й розчин кальцинованої соди, спиртівка, мікроскоп, предметні скельця, набір
фарб для фарбування за Грамом, живильні середовища (МПА, Кесслера, Ендо,
Кауфмана, вісмут-сульфітий агар, Олькеницького), сироватки сальмонельозні для
постановки РА.

261
 Основні відомості. Контамінація яєць мікрофлорою може
відбуватися ендогенним та екзогенним шляхами. При ендогенному
забрудненні мікроорганізми проникають у яйце у процесі його
формування в яєчнику хворої птиці. Яйця, отримані від птиці, хворої на
сальмонельоз, туберкульоз, респіраторний мікоплазмоз, лейкоз та інші
інфекційні хвороби, мають важливе епідеміологічне та епізоотологічне
значення. Особливу небезпеку становлять яйця водоплавної птиці, котрі
часто бувають інфіковані S.enteritidis, S.cholerae suis, S.typhimurium,
S.newport, S.dublin, S.anatum, стафілококами, кишковою паличкою,
протеєм, синьо гнійною паличкою та іншими бактеріями.
Доведена можливість передачі збудників через яйця при
пастерельозі, інфекційному бронхіті, нейтролімфоматозі курей та інших
інфекціях. Крім того, можливе ендогенне інфікування яєць при хворобах
яєчників та яйцеводів різної етіології.
Екзогенне обсіменіння яєць пов’язане із забрудненням шкаралупи
підстилкою, пір’ям та іншим брудом. Забруднена шкаралупа не тільки
псує їх товарний вигляд, але й різко зменшує тривалість зберігання. У
яйця через шкаралупу із зовнішнього середовища можуть проникати як
сапрофітні, так і патогенні мікроорганізми.
Основним джерелом бактеріального обсіменіння яєчного меланжу є
шкаралупа. Тому яйця при виготовленні меланжу необхідно
дезінфікувати. Найчастіше в готовому меланжі виявляють різні види
кокових бактерій, плісеневих грибів, P.vulgaris, Bac.subtilis,
Bac.mesentericus, іноді - E.coli, а також патогенні бактерії, особливо з
роду Salmonella. Невисока температура сушки яєчного порошку
забезпечує загибель тільки частини вегетативних форм мікроорганізмів.
У порошку іноді виявляють життєздатну спороутворюючу мікрофлору,

262
стафілококи, стрептокок, кишкову паличку та зрідка представників роду
Salmonella.
Відбір яєць для досліджень. Для перевірки відповідності якості
курячих харчових яєць вимогам чинного стандарту від партії яєць
роблять вибірку пакувальних одиниць із різних місць і шарів партії
(зверху, середини, знизу).
Якщо кількість пакувальних одиниць у партії до 10 включно, то
відбирають 1 пакувальну одиницю; від 11 до 50 - 3; від 51 до 100 - 5; від
101 до 1000 - 15.
Якщо яйця не відповідають вимогам чинного стандарту, то
прийманню не підлягають.
Для проведення досліджень із кожної прокладки вибраних
пакувальних одиниць відбирають яйця в кількості, що вказана у таблиці
2.16. Одна стандартна пакувальна одиниця (ящик) містить 12 прокладок.
Таблиця 2.16.

Відбір яєць для досліджень із пакувальних одиниць

Кількість відібраних Кількість яєць, які

Загальна кількість
пакувальних відбирають із кожної
відібраних яєць, шт.
одиниць, шт. прокладки, шт.
1 30 360
3 15 540
5 10 600
15 6 1080

При отриманні незадовільних результатів проводять повторно

відбір проб і дослідження. Результати повторних досліджень

263
поширюють на всю партію. Пошкоджені одиниці упаковки у вибірку не
включають, вони підлягають 100%-му розсортуванню.
Чистоту шкаралупи відібраних яєць визначають візуально, запах
вмісту яйця - органолептично. Після проведення досліджень яйця з
непошкодженою шкаралупою приєднують до партії.
Проведення роботи.
Приготування розведень із вмісту яйця. Відібране для аналізу
куряче яйце протирають теплим 0,2%-м розчином кальцинованої соди,
потім занурюють його в 70%-й етанол і обпалюють над полум’ям
спиртівки. На гострому кінці яйця стерильним скальпелем роблять отвір
і також обпалюють. Вміст яйця виливають у колбу Ерленмейєра і добре
перемішують за допомогою стерильних скляних бус. З отриманої суміші
відбирають 10 см3 і переносять у колбу з 90 см3 фізрозчину. В результаті
отримують розведення 1:10 (перше розведення). Далі відбирають 1 см3
1-го розведення, переносять його у пробірку, яка містить 9 см3
фізрозчину, і отримують таким чином розведення 1:100 (2-е розведення).
Дослідження поверхні шкаралупи яєць Досліджують змиви з
поверхні шкаралупи яйця. Яйце занурюють у ступку з 10 см3
стерильного фізрозчину, за допомогою стерильного тампона обмивають
поверхню яйця протягом 2-3 хв. Яйце виймають, а змив залишають для
дослідження.
1. Визначення МАФАнМ З отриманих розведень стерильними
піпетками здійснюють посіви по 1 см3 у бактеріологічні чашки,
заливають їх 12-15 см3 розплавленого та охолодженого до 45 оС МПА і
швидко перемішують вміст чашки, обережно рухаючи її на поверхні
стола. Після застигання агару чашки Петрі ставлять у термостат за
температури 30 оС на 72 год. Через 72 год підраховують загальну
кількість колоній, які виросли на чашках та розраховують кількість
мікроорганізмів в 1 г матеріалу

264
 2. Визначення бактерій групи кишкової палички. По 1 см3
розведень вмісту яйця від 1:10 до 1:100 засівають у пробірки з 5 см3
середовища Кесслер. Посіви поміщають у термостат при 37 оС на 18-24
год. Якщо протягом зазначеного часу в пробірках не з’явилося ознак
газоутворення, яйця вважають не забрудненими кишковими паличками.
При виявленні пробірок з газоутворенням проводять подальшу
ідентифікацію БГКП. Для цього з таких пробірок за допомогою
бактеріологічної петлі роблять посів на чашки з середовищем Ендо.
Інкубують за температури 37 оС протягом 18-24 год. При відсутності на
середовищі Ендо характерних колоній, яйця вважають не забрудненими
кишковою паличкою.
При наявності на середовищі Ендо характерних для БГКП колоній,
їх вивчають. Готують мазки, фарбують їх за Грамом і мікроскопують.
3. Визначення бактерій з роду сальмонел. З об’єднаної проби
відбирають 25 г продукту і вносять у флакон Сокслета, що містить 100
см3 середовища збагачення (Мюллера або Кауфмана). Флакон ретельно
струшують і ставлять у термостат за температури 37 оС. Через 16-24 год
здійснюють посів на середовище Ендо, Плоскірєва або вісмут-сульфіт-
агар. Інкубують за температури 37 оС протягом 16-48 год.
Колонії, характерні для бактерій з роду сальмонел, пересівають на
трьохцукровий агар Крумвіде-Олькеницького у модифікації Ковальчука
по скошеній поверхні та уколом у стовпчик. Посіви витримують у
термостаті при температурі 37 оС протягом 12-16 год. При рості бактерій
з роду сальмонел колір середовища зі скошеною поверхнею стає
рожевим, стовпчика – жовто-бурим; газоутворення викликає тріщини та
розрив стовпчика агару, сірководнеутворення - потемніння стовпчика.
Остаточну ідентифікацію сальмонел здійснюють за методикою
описаною у розділі 2, тема №5.

265
 Методика мікробіологічного дослідження яєчного меланжу та
порошку
Проба заморожених яєчних продуктів для мікробіологічного аналізу
– 100 г. Перед проведенням дослідження пробу розморожують у водяній
бані за температури не вище 45 оС до температури всередині продукту
не вище 1-5 оС.
Проба сухого яєчного продукту для мікробіологічного аналізу - 100
г. Для приготування розведень беруть наважку 10 г (порошку або
меланжу) і поміщають у стерильну колбу з 90 см3 стерильного
фізрозчину, ретельно перемішують і готують десятикратні розведення
(орієнтуючись на ступінь обсіменіння продукту, що передбачається).
Визначення МАФАнМ, БГКП та патогенних бактерій, зокрема
сальмонел, проводять згідно з методиками, описаними для дослідження
яєць.
Визначення протея. У конденсаційну воду пробірки із скошеним
МПА вносять 0,5 см3 досліджуваної суміші (метод Шукевича). Пробірки
ставлять у термостат при 37 оС. Через 18-24 год посіви проглядають.
Звертають увагу на утворення повзучого вуалеподібного нашарування і
вивчають рухливість мікробів у “висячій краплі”. Для визначення „О-
форм” проводять посів на чашки з агаром Плоскірєва. „О-форма” протея
росте на цьому середовищі у вигляді прозорих колоній, які
зафарбовують середовище у жовтий колір.
Визначення коагулазопозитивних стафілококів здійснюють за
методикою описаною у розділі 2 тема №5.
Не відповідають вимогам чинного стандарту яйця, які мають
такі вади:
· мала пляма - яйце з однією або декількома нерухомими плямами під
шкаралупою, загальним розміром не більше ніж 1/8 поверхні
шкаралупи;

266
· велика пляма - яйце з наявністю плям під шкаралупою загальним
розміром більше за 1/8 поверхні всього яйця;
· красюк - яйце з одноманітним рудуватим забарвленням вмісту;
· тік - яйце з пошкодженою шкаралупою і підшкаралупною оболонкою,
що зберігається більше однієї доби, не рахуючи дня знесення;
· кров'яна пляма - яйце з наявністю на поверхні жовтка або білка
кров'яних включень, які можна виявити під час овоскопії;
· тумак - яйце із зіпсованим вмістом внаслідок дії пліснявих грибків і
гнильних бактерій. При овоскопії яйце не прозоре, вміст його має
гнильний запах;
· зелена гниль - яйце з білком зеленого кольору і різким неприємним
запахом;
· міражне яйце - яйце, взяте з інкубатора як незапліднене;
· запашисте - яйце зі стороннім запахом;
· виливок - яйце з частковим змішуванням жовтка з білком;
· присушка - яйце з присохлим до шкаралупи жовтком.
Таблиця 2.17
Нормативні мікробіологічні показники для яєць та яєчних
продуктів (ДСТУ 5028: 2008)
Найменування МАФАнМ Маса продукту в г, у якій не допускається
продукту КУО/г, БГКП Патогенні у S.aureus Proteus
т.ч.
сальмонели
Меланж 5х105 0,1 25 1,0 1,0
яєчний
Яєчний 5х104 0,1 25 1,0 0,1
порошок

Таблиця 2.18.
Мікробіологічні показники для якості харчових яєць
Норма для яєць Метод
Назва показника Дієтичних Столових контролюва
«екстра» та охолоджених та ння
класу А класу В

267
Кількість МАФАнМ від 5х102 Від 5х104 Згідно ГОСТ
КУО/г, не більше до 5х103 до 5х105 10444.15
Бактерії групи кишкової Згідно ГОСТ
палички (БГКП), маса 0,1 Від 0,01 до 0,1 30518
продукту в г, в якому не
дозволено
Патогенні мікроорганізми, 5 х 25 25 Згідно ДСТУ
у т.ч. роду Salmonella, маса EN 12824
продукту в г, в якому не
дозволено
Примітка. Для аналізу використовують жовтки

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись), щодо
мікробіологічної оцінки якості яєць
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. Назвати основні джерела обсіменіння яєць і яєчних продуктів
мікроорганізмами.
2. Як відбираються змиви з яєць для бактеріологічного
дослідження?
3. Які показники визначають при санітарно-мікробіологічному
дослідженні яєць та яєчних продуктів?

ТЕМА 10. МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ РИБИ І

РИБНОЇ ПРОДУКЦІЇ

Мета роботи. Оволодіння методами мікроскопічного і бактеріологічного

дослідження риби
Матеріальне забезпечення. Жива риба, солона, морожена, риба холодного і
гарячого коптіння, шпатель, вата; стерильні ножиці та пінцет, предметні
скельця; мікроскоп; набір реактивів для фарбування за Грамом. стерильні пінцет,
ножиці, скальпель; вага з різноважками; гомогенізатор або стерильна ступка і
кварцовий пісок; стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду; спирт етиловий
96°. МПА; голодний агар; чашки Петрі; стерильні піпетки на 1 см2 і на 10 см2;
бактеріологічні чашки з стерильними середовищами Ендо, Левіна, Плоскірєва,
вісмут-сульфітним агаром; середовища Мюлера, Кауфмана, скошений МПА; РПБ
жовтково-сольовий агар, середовищі Вільсона-Блера. предметні і покривні скельця;

268
 Основні відомості. Риба, яку виловлюють з водоймищ,
забруднених стічними побутовими та промисловими водами,
органічними речовинами, може бути інфікована патогенною і умовно-
патогенною мікрофлорою. Така риба не проявляє жодних ознак
захворювання, а є лише мікробоносієм. Використання такої риби у
сирому, в’яленому, копченому вигляді, а також недостатньо термічно
обробленої з наступним довготривалим зберіганням при кімнатній
температурі може викликати захворювання на бешиху, холеру, чуму,
лептоспіроз та ін.
У рибних продуктах зустрічаються такі збудники харчових
токсикоінфекцій та токсикозів: сальмонели, стафілококи, Cl.botulinum,
Cl.perfringens, Bac.cereus, бактерії групи протею та інші. Для
бактеріологічного дослідження відбирають лише живу рибу, у зв’язку з
тим що у загиблої риби швидко розвивається мікрофлора, яка заважає
виділенню збудника захворювання.

Мікробіологічне дослідження живої риби

Проведення роботи. Відбір проб. Під час взяття проб
дотримуються правил асептики. Перш за все досліджують матеріал,
відібраний з уражених ділянок (абсцес, виразка тощо). Вміст абсцесів
набирають пастерівською піпеткою після припікання шпателем місця
відбору. Кров для посіву відбирають з серця або з хвостової артерії.
Першу краплю крові видаляють, а наступні 2-3 висівають на живильне
середовище. Розтинають рибу на спеціальних дошках, попередньо
протертих денатурованим спиртом або 3-5%-м фенолом чи ін.
Рибу кладуть на правий бік черевною стороною до того, хто робить
розтин і фіксують препарувальною голкою на дошці в ділянці голови і
хвоста. Тулуб з лівої сторони звільняють від луски, видаляють грудний і
черевний плавники, бік і черево протирають ватним тампоном,

269
змоченим спиртом. Обережно, щоб не пошкодити кишечник, розрізають
черевну стінку (рис. 2.14.).

Мазки-
Рис. 2.14 . Контури розрізів черевної стінки
б відбитки з
органів і тканин отримують при доторканні предметного скла до зрізаної
стерильним скальпелем поверхні. На одному склі роблять декілька
відбитків. Мазок висушують і фіксують над полум’ям спиртівки. Далі
фарбують мазки за Грамом, Ціль-Нільсеном, Романовським-Гімза,
Міхіну або іншим методом.
Для визначення ступеня мікробного обсіменіння риби підраховують
кількість мікроорганізмів у 5 полях зору і вираховують середнє
арифметичне в 1 полі зору. Якщо в 1 полі зору нараховують поодинокі
мікроорганізми (до 10), вважають що риба свіжа і здорова;
- якщо нараховують від 10 до 30 мікробних клітин – риба сумнівної
свіжості;
- якщо більше 30 мікробних клітин – риба або несвіжа, або хвора.
Дослідження рибних продуктів (солоної риби, риби холодного і
гарячого копчення) проводять відповідно до методичних вказівок (МВ)
15.2-5.3-004:2007 п. 7.9 «Порядок санітарно-мікробіологічного
контролю виробництва продукції з риби та інших водних живих ресурсів
на підприємствах та суднах». При цьому визначають:
1) загальну кількість мікроорганізмів (МАФАнМ, КУО в 1 г
продукту);
2) наявність БГКП;
3) наявність бактерій роду Salmonella;

270
 4) наявність бактерій роду Proteus;
5) наявність коагулазопозитивних стафілококів;
6) наявність сульфітредукуючих клостридій.
Методика визначення цих показників описана в розділі 2 тема №6.
Для мікробіологічних аналізів зразки відбирають до взяття зразків
для фізико-хімічних і органолептичних досліджень.
Підготовка зразків. Зразки риби для дослідження готують
відповідно до ДСТУ ISO 6887-1:2003. «Мiкробiологiя харчових
продуктiв та кормiв для тварин. Готування дослiджуваних проб, вихiдної
суспензiї та десятикратних розведень для мiкробiологiчного
дослiджування. Частина 1. Загальнi правила готування вихiдної суспензiї
та десятикратних розведень».
З цією метою рибу подрібнюють і відбирають наважку масою 10 г.
Пробу вносять у стерильний флакон і повільно додають 90 см3
фізрозчину. Суміш ретельно перемішують, залишають на 3-5 хвилин.
Отримано розведення 1:10. Далі досліджують надосадову рідину. При
необхідності готують послідуючі розведення, при цьому
використовують кожний раз нову піпетку.
Продукти, які містять жири, нагрівають на водяній бані, у
о
термостаті або у сушильній шафі до температури 40-45 С і
перемішують.
Заморожені продукти попередньо розморожують до температури
всередині тіла риби або куска до 0о – 1оС.
Для дослідження на сальмонельоз і парагемолітичні вібріони зразки
сировини і продукції із гідробіонтів відбирають із частиною кишечника і
зябрів. Із середнього зразка відбирають наважку у 25 г.
В основному продукти розводять у пептонно-сольовому або
фізіологічному розчині (ізотонічний розчин натрію хлориду). Якщо
продукти містять більше 6% солі – у 0,1%-му водному розчині пептону

271
(пептонна вода). Розведення м’ясних і молочних продуктів готують у
фізіологічному розчині.
Для дослідження в’яленої риби дрібну рибу відбирають по 3 – 10
екземплярів із різних місць дослідної партії. Зразок складають із цілих
екземплярів риб, попередньо знявши з них шкіру в стерильних умовах.
Від 3 - 4 екземплярів великої риби після зняття шкіри вирізають 6
– 8 шматочків товщиною 1,0 – 1,5 см від приголів’я, середньої та
хвостової частини (не зачіпаючи кишечнику).
Для аналізу продукцію гарячого копчення подрібнюють разом зі
шкірою, а холодного - без шкіри, у жодному разі не торкаючись
кишечника. Перед зняттям шкіри з риби необхідно поверхню об'єкта
протерти спиртом. Беруть наважку 10 г і вносять у 90 см3 рідини для
розведень.
Таблиця 2.19.
Нормативні мікробіологічні показники для риби і рибних
продуктів (МВ 15.2-5.3-004:2007 п. 6)
Продукт МАФАн Маса продукту (г), в якій не Примітка
М, допускається
КУО/г, БГКП S.aureus Сальмо Сульфітред
нели укуючі
клостридії
Риба-сирець і 5х104 0,01 0,01 25 –
свіжа
Риба 5х104 0,01 0,01 25 –
охолоджена і
заморожена
Філе рибне 1х105 0,01 0,01 25 –
Фарш рибний 1х105 0,01 0,01 25 0,01
харчовий
Риба гарячого 1х103 1,0 1,0 25 0,1
коптіння
Риба холодного 5х103 0,1 1,0 25 0,1
коптіння
Риба солона 1х105 0,1 - 25 0,1
Риба в’ялена 5х104 0,1 - 25 1,0 Плісені не
більше 50

272
 КУО/г,
Дріжджів не
більше 100
КУО/г

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись), щодо
санітарної оцінки риби і рибних продуктів.
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. Які патогенні збудники можуть зустрічатися у живій рибі?
2. Як відбирають зразки риби для бактеріологічного дослідження?
3. Які показники визначають при санітарно-мікробіологічному
дослідженні риби і рибних продуктів?
4. Які особливості відбору зразків риби і рибної продукції для
мікробіологічного дослідження?

ТЕМА 11. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНИЙ КОНТРОЛЬ

АПАРАТУРИ І ОБЛАДНАННЯ ВИРОБНИЧИХ ЦЕХІВ

Прилади та обладнання. Металевий трафарет (S -100 см2);

ватні або марлеві тампони; фізіологічний 0,5% розчин NaCl або
стерильна водопровідна вода; пробірки з 10 см3 стерильної води або
фізіологічного розчину; розплавлений і охолоджений до 45°С МПА;
пробірки з середовищем Кеслера; стерильні бактеріологічні чашки;
спиртівка; стерильні піпетки на 1 см3; восковий олівець.

Санітарний контроль за мікробним забрудненням на

підприємствах із переробки тваринницької сировини є обов’язковим
заходом. Плановому мікробіологічному контролю підлягають
промислові приміщення (стіни, підлога, столи), всі апарати та
обладнання, одяг персоналу, а також обов’язковим є медичний огляд
персоналу.

273
 Основними тестами мікробної забрудненості приміщень та
обладнання є загальна кількість мікроорганізмів на одиницю поверхні
(см2) досліджуваного об’єкта (мікробне число) і наявність на предметах
санітарно-показових мікроорганізмів.
Контроль проводиться після миття, дезінфекції і пропарювання
перед початком роботи шляхом посіву відібраних змивів для визначення
загальної кількості мікроорганізмів в 1 мл., а у випадку необхідності
присутність слизоутворюючих бактерій. У ряді харчових підприємств
(безалкогольні, дріжджові) змиви одночасно досліджують на
присутність бактерій кишкової палички. Готують стерильні ватні чи
марлеві тампони, пробірки з 10 мл стерильної води (чи фізіологічний
розчин) і стерильні пінцети.
Тампони можна закріпити на дерев'яних стержнях, кожний окремо
опустити у пробірки, з 10 мл води і простерилізувати при 0,1 МПА
протягом 20-30 хв. Змиви з великого обладнання апаратів беруть за
допомогою нержавіючих металевих трафаретів, з вирізаною серединою
(площа вирізу 10,25 або 100 см2). Перед тим, як взяти проби, трафарет
замочують спиртом, обпалюють і накладають на досліджувану
поверхню. Обмежену площу промивають змоченим тампоном, після
чого тампон опускають у ту ж пробірку опускають у воду, що за
залишилася або в фізіологічний розчин і добре перемішують. Висівають
1 мл змиву на м’ясо-пептонний агар. Визначають загальну кількість
мікроорганізмів після термостатування при 37°С протягом 18 год. Змив
можна використати для визначення слизоутворюючих бактерій
(лейконостока) висівом на спеціальні середовища. Залишок змивної
рідини разом з тампоном висівають в пробірки з поплавками і 5 мл
середовища Кесслер, витримують в термостаті при 43 °С.
У змивах стерильного обладнання і апаратів мікроорганізми
відсутні. У добре вимитих апаратах загальна кількість мікроорганізмів і

274
титр кишкової палички не повинен перевищувати їх вміст у чистій воді,
яка поступає для миття. Кількість слизоутворюючих бактерій не
повинна бути більше 0-5 в 1 мл.
Контроль трубопроводів, рукавів, шлангів. Внутрішня поверхня
трубопроводів, рукавів, шлангів деяких апаратів недоступна для взяття
змивів за допомогою трафарету. У цьому випадку перевірку на
присутність мікроорганізмів і колі-титр проводять шляхом
мікроскопування препаратів промивної води і посівом останньої на
живильні середовища.
У стерильний посуд відбирають зразки води при виході з
досліджених об'єктів, 10 мл промивної відцентрифугують при 1500-2000
об/хв. протягом 10 хв. Центрифугат зливають, осад мікроскопують. В 10
полях зору повинно бути не більше 5-6 клітин. На присутність
мікроорганізмів у кожному полі зору вказує на незадовільне миття.
Посів на загальну кількість мікроорганізмів проводять на пептид ний чи
сусло-агар.
Колі-титр визначають методом мембранних фільтрів чи
бродильних проб. Загальна кількість мікроорганізмів і колі-титр
промивної води не повинні відрізнятись від показника води, яка
застосовується у промисловості.
Контроль посуду та інвентарю. З кожної мийної машини
відбирають 5-10 вимитих пляшок і закривають стерильними ватними
корками. У лабораторії їх добре прополіскують і 100 мл стерильної води
(чи фізіологічного розчину), послідовно переливають з однієї пляшки в
іншу і змочують всю поверхню, з останньої пляшки роблять посів для
визначення загальної кількості мікроорганізмів. У перерахунку на одну
пляшку повинно бути не більше 300 слизоутворюючих бактерій в 1 мл
промивної води не більше, ніж у воді, яка застосовується для
прополіскування пляшок; колі-титр повинен бути не менше 100.

275
 Бочки, бідони, цистерни також контролюють. Визначення якості
миття проводять мікроскопуванням осаду після центрифугування
останньої промивної води чи шляхом її посіву на щільні поживні
середовища. Загальна щільність мікроорганізмів у 1 мл і колі-титр не
повинен відрізняється від води, яка застосовується у промисловості.
Цеховий інвентар. Для оцінки миття цехового інвентарю проби
відбирають в той момент, коли інвентар підготовлений до роботи. З
дрібного інвентарю (мішалки, пробники, термометри, ножі, шприци)
мазки беруть стерильними тампонами з всієї поверхні предмета і
досліджують на загальну кількість мікроорганізмів, а також роблять
посів в середовище Кесслер для визначення присутності кишкової
палички. Зі столів, лотків, відер, лопат і т.д. мазки беруть стерильним
тампоном за допомогою обпаленого трафарету і роблять аналогічні
аналізи.
Контроль чистоти промислових приміщень. Чистоту стін і
підлоги приміщень контролюють шляхом мікроскопування проб, взятих
таким шляхом: збирають частину забрудненої поверхні, цю частину
поміщають у пробірки зі стерильною водою добре збовтують, готують
препарат і розглядають під мікроскопом без забарвлення або після
забарвлення масел метиленовим синім.
Для кількісного підрахунку мікроорганізмів користуються
трафаретом і стерильним, змоченим ватним тампоном, з наступним
висівом на щільні середовища у бактеріологічні чашки.

Мікробіологічний контроль матеріалів виробництва

Для виявлення мікроорганізмів і набуття навичок контролю

матеріалів виробництва досліджують пергамент, зіскреби з дерев'яної
тари, сіль і цукор.

276
 Контроль пергаменту. З рулону пергаменту профламбованими
ножицями вирізають дві проби по 10 см. Одну пробу, для визначення
плісеней, вносять стерильним профламбованим пінцетом у стерильну
чашку Петрі і заливають тонким шаром суслового агару або середовища
Сабуро. Другу пробу, для виявлення БГКП, вносять у 100 мл
середовища Кесслера. У випадку газоутворення в середовищі Кесслера
через 24 год., інкубації матеріал не може бути допущений у
виробництво. При відсутності бродіння матеріал оцінюють за кількістю
колоній плісеневих грибів.
Контроль дерев'яної тари. Виготовляють зіскреби тонкого шару
з 10 см2 деревини. Одну частину проби вносять у стерильну чашку Петрі
і заливають стерильним Сусловим агаром або середовищем Сабуро,
другу - вносять у 100 . середовища Кесслера. Результати оцінюють так,
як і при аналізі пергаменту.
Контроль кухонної солі. У 100 мл дистильованої води
розчиняють 5 г солі; 1 мл розчину висівають для визначення загальної
кількості бактерій. Сіль задовільної якості повинна містити не більше
100 мікроорганізмів у 1 г.
Контроль цукру. 10 г цукру розчиняють у 90 мл стерильної води;
роблять посів 1 мл розведення в стерильну чашку Петрі і заливають
Сусловим агаром або середовищем Сабуро. У випадку виявлення через
2-3 доби колоній дріжджів і плісеневих грибів цукор піддають
пастеризації.
Максимально допустимою кількістю мікроорганізмів у 1 г цукру,
що використовується для виготовлення ковбас є такою: мезофільних
бактерій - 20, спор термофільних аеробів - 15, спор анаеробів - не
допускається, дріжджів і гіфоміцетів - 1. Наявність у цукрі
протеолітичних бактерій Іноді може стати причиною псування
сирокопчених ковбас.

277
 Метод визначення колі-титру у спеціях і прянощах.
Дослідження базується на здатності бактерій групи кишкової палички
розщеплювати глюкозу і лактозу. За цих умов у середовищах
утворюються кислі продукти, які змінюють колір індикаторів, а у
середовищі Кесслера у поплавку утворюється газ внаслідок
розщеплення лактози.
У пробірки, що містять по 5 см3 одного з середовищ «ХБ»,
Хейфеца і КОДА, вносять стерильною піпеткою з широким кінцем 5 см3
суспензії зі спецій і прянощів. Допускається використання середовища
Кесслера по 10 см3. Засіяні пробірки ставлять у термостат при
температурі 37 °С на 8-20 год.

Контроль особистої гігієни працівників підприємств з

переробки тваринницької сировини

Прилади та обладнання. Марлеві або ватні тампони; стерильна

вода; пінцет; спиртівка; пробірки з 10 мл стерильної води; пробірки із
середовищем Кесслера; йод-крохмальний розчин, який виготовляють
змішуючи у рівних співвідношеннях 6% розчин калію йодистого і 4%
розчин водорозчинного крохмалю (4 г розчинного крохмалю і 96 мл
дистильованої води перемішують, доводять до кипіння і охолоджують
до температури 20 °С); 3% розчин натрію гіпосульфіту.

Контроль чистоти рук і одягу. Чистоту перевіряють перед

початком процесу у робітників, які мають контакт з продукцією чи
чистим обладнанням. Контроль проводять без попередження.
Закріплений на дерев'яному стержні стерильний тампон змочують
стерильною водою чи (фізіологічним розчином) і протирають ним
долоні, поверхню рук, під нігтями і між пальцями рук. Тампон
занурюють у ту ж пробірку, в якій проходило змочування, добре
збовтують, відбирають 1 мл і підготовлюють розведення (1:10 і 1:100).

278
 Для визначення загальної кількості мікроорганізмів у 1 мл змиву
проводять посів розведений на м'ясо-пептонний агар з послідовним
термостатуванням при 37 °С протягом 43 °С. Потім визначають
присутність кишкових паличок за методом бродильних проб. Можна
використати і такий метод: у складені долонями разом кисті рук
наливають 100 мл стерильної води так, щоб вода добре промивала
пальці. Стерильним тампоном протирають долоні та нігті.
Воду збирають у стерильну склянку і туди кидають тампон.
Змивну воду перемішують і проводять аналогічні посіви. Чистоту рук
оцінюють за кількістю мікроорганізмів у 1 мл зливу при відсутності
кишкових паличок.
Перевірка рук на наявність залишків хлорвмісних
дезінфектантів. Для цього проводять якісну реакцію: ватний тампон
змочують йодкрохмальним розчином і протирають деякі частини рук. У
присутності хлору тампон і протерта частина рук забарвлюється у
синьо-бурий колір.
Халати, куртки, рукавиці з тканини періодично досліджують на
присутність кишкових паличок шляхом посіву 1 мл змивної води у
середовище Кесслер. Кишкові палички з чистого спецодягу не
виявляють.
Для зменшення ступеня вторинного бактеріального обсіменіння-
важливо здійснювати такі профілактичні заходи:
- перед одержанням продукції проводити ретельну санітарну
обробку всіх інструментів і пристосувань шляхом їх миття і дезінфекції;
- регулярно міняти інструменти, періодично їх мити і
дезінфікувати (забезпечити дезінфекцію на робочому місці);
- обмивати фартухи холодною водою;
- мити і дезінфікувати руки (включаючи передпліччя) на всіх
етапах виробництва;

279
 - підвищувати кваліфікацію робітників;
- не допускати надлишкового контакту з тушами тварин.
Дотримання необхідних профілактичних вимог можна
контролювати шляхом виявлення мікробного обсіменіння м'яса і
контролем особистої гігієни працівників.

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись).
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю.

1. Як проводиться мікробіологічний контроль матеріалів
виробництва: пергамент, тара, сіль і цукор.
2. Як здійснюється контроль особистої гігієни працівників
підприємств з переробки тваринницької сировини?
3. Як проводиться перевірка рук на наявність залишків
хлорвмісних дезінфектантів?.

ТЕМА 12. МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ КОРМІВ

Мета заняття: Ознайомити студентів з правилами взяття зразків силосу, зерна,

коренеплодів для дослідження. Визначити мікрофлору силосу № 1 і № 2 :
приготування і мікроскопія мазків; ознайомлення з мікробіологічними
дослідженнями силосу (посіви і облік основних фізіологічних груп мікроорганізмів
на різних середовищах ). Оцінка якості силосу № 1 і 2 за А. Н. Міхіним.
Обладнання і матеріали. Фарфорові ступки з маточки (стерильні).
Предметні скельця. Барвник еритрозин. Пальник. Мікроскопи. Кедрова олія. Силос
№ 1 і 2 в чашках. Витяжки з силосів. Універсальний індикатор, піпетки.
Порцелянові чашки для визначення рН. Стандарт (кольорова шкала для визначення
рН). Ваги і важки до них. Чашки для зважування силосу. Пінцети. Дві банки з
притертими пробками. Банку з розведенням силосу 1:10 (40 г силосу-360 мл
стерильної води). Шість колб із стерильною водою по 90 мл в кожній. Піпетки для
приготування розведень (на 10 мл). Штатив з поживними середовищами: МПА - 5
пробірок, СА - 4, САМ (сусло-агар з крейдою) - 6, молоко - 6, сусло пивне - 6, лактоза
- 5, картопляне середовище Рушмана -5 пробірок.

280
 Основні відомості. Мікрофлора кормів багато в чому обумовлена
температурою, вологістю середовища і видовим складом рослин. Вона
змінюється під час заготівлі та подальшого зберігання кормів. Після
скошування порушуються захисні функції рослини, мікроби проникають
всередину, використовують поживні речовини і руйнують тканини. У
цей час особливо бурхливо розвивається гнильна мікрофлора,
викликаючи псування кормів. Скошені рослини можна зберегти шляхом
висушування або силосування, коли недостатньо вільної води або
створюються такі умови, при яких припиняється діяльність
аммоніфікаторів. Поряд із заготівлею сіна та сінажу в кормовиробництві
багатьох господарств широко практикується силосування.
У кормах можуть бути виявлені цвілеві гриби, гнильні, масляно –
кислі, збудники ботулізму й інші мікроорганізми.

ДОСЛІДЖЕННЯ СОКОВИТИХ КОРМІВ

До соковитих кормів належать силос, коренебульбоплоди, зелена
трава, баштанні культури, деякі відходи харчової промисловості. Всі
вони містять багато води (65–90 %), порівняно невелику кількість білка,
жиру, клітковини. У деяких багато вітамінів (А, В, С), в інших
(наприклад, у жомі) – вітаміни відсутні, проте вони багаті на цукор та
кальцій.
З метою збереження кормової цінності рослин їх силосують.
Силос – об’ємистий соковитий корм, виготовлений із
свіжоскошеної або підв’яленої (вологість не нижче 60 %) зеленої маси,
законсервованої в анаеробних умовах за рахунок спонтанного бродіння
або з додаванням консервантів (суміш соляної та фосфорної кислот,
мурашина, пропіонова, оцтова кислоти, препарати КНМК, ВІК-1, ВІК-2,
кухонна сіль, бісульфати натрію й амонію, нітрит натрію, піросульфат
натрію, вуглекислий газ, діоксид сірки, зневоднений аміак).

281
 В основі силосування лежать складні мікробіологічні і біохімічні
процеси, пов’язані з перетворенням простих цукрів у молочну, оцтову та
інші кислоти, які консервують корм і запобігають розвитку іншої
мікрофлори, особливо гнильної.
Якщо технологія процесу витримується, то в силосній масі швидко
збільшується активна кислотність (рН), в основному за рахунок
молочної та оцтової кислот. При порушенні технології силосування
(невідповідна фаза розвитку рослин, повільне закладання корму,
недостатнє його ущільнення і т.д.) рівень рН наростає повільно, а отже, і
консервація кислотами уповільнюється. За цих умов, крім
молочнокислих, розвиваються маслянокислі бактерії, які виробляють не
бажані для тварин продукти (масляну і пропіонову кислоти, бутанол,
ізопропанол, етанол, ацетон, вуглекислий газ, аміак тощо), а також
бактерії групи кишкової палички, гнильна мікрофлора, дріжджі та
плісеневі гриби. Подібні процеси спостерігаються і при порушенні
технології сіна жування кормів.
Порушення технології силосування, у тому числі засмічення його
землею, трупами гризунів, спричиняє утворенню в кормі особливо
небезпечного для всіх видів тварин токсину – гороутворюючих бактерій
Clostridium botulinum.
Сінаж – це корм, виготовлений із скошеної і провяленої до 45–55
%-ї вологості трави, законсервованої шляхом створення анаеробних
умов зберігання. За хімічними та фізіологічними властивостями він
займає проміжне положення між силосом і сіном, тому й дістав назву
“сіносилос” або сінаж. Консервування сінажної маси здійснюється за
рахунок її фізіологічної сухості. Для заготівлі сінажу використовують
багаторічні бобові трави (люцерну, конюшину і бобово-злакові суміші.
Зазвичай сінаж заготовляють в облицьованих траншеях.

282
 Коренебульбоплоди – кормові, напівцукрові та цукрові буряки,
турнепс, морква, бруква, куузику, топінамбур; належать до дієтичних
соковитих кормів, особливо важливих для годівлі тварин у зимовий
період.
Неправильно підготовлені до згодовування буряки зумовлюють
отруєння тварин нітритами, що нерідко призводить до масової загибелі,
особливо свиней. Згодовування пророслої і позеленілої картоплі при
неправильній їх підготовці спричиняє гострі або хронічні отруєння
тварин соланіном.
Заходи, спрямовані на профілактику масових захворювань тварин
від поїдання соковитих кормів, полягають насамперед у здійсненні
контролю їх санітарної якості за допомогою органолептичних, хімічних
та біологічних методів.
Відбір середньої проби соковитих кормів для аналізу.
Під час заготівлі зелених кормів при взятті зразка враховують
склад травостою і рельєф ділянки. Якщо травостій неоднорідний, всі
угіддя розбивають на однотипні ділянки, з яких на кожній виділяють
площу в 1 га, яку розбивають на 10 пробних ділянок розміром 1 м2. З
кожної ділянки у 10 місцях зрізають траву ножицями або серпом на
висоті 3–5 см від поверхні ґрунту. Проби беруть у суху погоду, після
спадання роси і до заходу сонця. Загальний зразок складають із трави,
взятої по діагоналі поля. Через кожні 10–15 м кладуть металевий або
деревяний “квадрат” площею 1 м3, у якому і зрізають траву. Взяту з усіх
ділянок траву розстеляють на брезенті рівним шаром і одержують
об’єднаний зразок. Для складання середнього зразка, маса якого має
становити 1,5–2 кг, траву беруть жмутами по 150–200 г з 10 місць
об’єднаного зразка.

283
 Для аналізу ботанічного складу травостою зразки розбирають за
фракціями – злаки, бобові, різнотрав’я, осоки, шкідливі й отруйні
рослини, визначаючи частку певної групи рослин у відсотках.
Зразки силосу необхідно брати в три строки: а ) під час закладки
силосу для визначення епіфітна мікрофлори; б ) через 10-15 днів після
закладки для визначення мікрофлори дозрілого силосу; в) при
відкриванні силосу.
У загальній масі силосу не у всіх її ділянках однаково проходять
мікробіологічні процеси, тому в башті беруть три проби силосу: першу
і другу - на відстані одного метра від верху і низу, третю - між ними.
Із силосних і сінажних траншей, що містять до 400 т маси, в
залежності від довжини, беруть дві або три проби по діагоналі, на
глибині одного метра від поверхні та 3–5 м від причілкових стін. Зразки
беруть не раніше, ніж через 4 тижні після його закладання, але не
пізніше ніж за 10 діб до згодовування.
В круглих ямах пробу беруть у центрі після зняття верхнього шару,
також на глибині одного метра. Проби силосу поміщають в стерильні
банки з притертими пробками .
Зразки ретельно перемішують і відбирають одну середню
пробу масою близько 1 кг, яку поміщають у скляну банку з
притертою пробкою або поліетиленовий пакет і старанно
герметизують. До банки або поліетиленового пакета прикріплюють
етикетку (супровідний документ). На аналіз проби повинні надходити
протягом 24 год. від часу їх відбору. В іншому випадку зразки необхідно
консервувати сумішшю хлороформу з толуолом у співвідношенні 1:1 з
розрахунку 5 мл суміші на 1 кг корму. Консервант вносять рівними
частинами на дно ємкості, посередині і зверху.

284
 При відборі середньої проби коренебульбоплодів спочатку
оцінюють умови їх зберігання. При цьому звертають увагу на
температуру (вона повинна бути в межах 0–3 °С при відносній вологості
80–90 %), наявність вентиляції (душників), забрудненість землею,
механічні пошкодження, ураженість цвіллю та гниллю, наявність
підморожених коренів і бульб.
Від кожної партії коренебульбоплодів відбирають зразки із різних
місць верхньої, середньої та нижньої частин, перемішують і відбирають
середню пробу масою 6 – 8 кг буряків і 4–5 кг картоплі.
Брагу відбирають у скляні банки, перед набиранням їх ретельно
перемішують.

Органолептичні методи дослідження соковитих кормів

Попереднє дослідження – органолептичне – проводять на місці
заготівлі та зберігання за такими показниками як ботанічний склад,
колір, запах, смак, консистенція, вологість.
Зелені корми за якістю поділяються на три категорії:
доброякісні – згодовуються тваринам без обмежень;
підозрілі – потребують обережного застосування;
непридатні до згодовування – підлягають спеціальній підготовці
перед використанням або вибраковуються.
До підозрілих відносяться: зелена маса рослин, що в певні фази
вегетації нагромаджує отруйні речовини (кукурудза, сорго, суданка);
корми, зібрані з переудобрених азотом ґрунтів (вика посівна, горох,
кормова капуста, конюшина, люцерна, кукурудза, овес, просо, пшениця,
райграс, ріпак, сорго, жито, ячмінь мають властивість нагромаджувати
багато нітратів) або після заморозків (кукурудза, люпин), дощу чи роси
(конюшина, люцерна).

285
 Непридатні для згодовування корми, які містять понад 1 % за
масою отруйних та шкідливих трав; корми, що тривалий час зберігались
в купах, уражені сажковими й іржастими грибами.
Оцінюючи зелений корм, зважають на його запах і колір. Зелений
корм має бути без плісняви, ознак ослизнення, затхлого та гнильного
запахів і з кольором, властивим рослинам даного виду (сорту). Для
оцінки якості силосу і сінажу колір також має важливе значення: він
повинен бути притаманним рослинам з яких вони виготовлені, але з
буруватим, жовтим, жовтувато-зеленим або світло-коричневим
відтінком. Зіпсований силос і сінаж темно-коричневого або матового
кольору.
Запах доброякісних соковитих кормів (силосу, сінажу, жому, барди)
фруктовий, квашених овочів, свіжоспеченого житнього хліба.
Зіпсований корм має запах прогірклої олії, редьки, оселедців, часто
уражений пліснявою.
Бажаний смак – слабо кислий або кислий. Зіпсований корм дуже
кислий, гіркуватий з пекучим присмаком.
Консистенція. Часточки доброякісного силосу зберігають
структуру і консистенцію рослин - листки, суцвіття, стебла. Листки
еластичні, легко віддаляються один від одного, без ослизнення. У
зіпсованому силосі структура повністю змінена; він має вигляд
ослизненої брудної маси, при розтиранні на пальцях залишаються
брудні плями.
Вологість силосу визначають за такими ознаками:
80 % і більше – при стисканні зразка рукою виділяється значна
кількість рідини;
80–75 % – при стисканні виділяється незначна кількість рідини;
75–65 % – при стисканні рукою рідина не виділяється.

286
 Вологість сінажу визначають висушуванням наважки у сушильній
шафі при температурі 105 °С до постійної маси за формулою: Х=(А х
100) / Б,
де Х – вологість, %;
А – маса випареної вологи, г;
Б – наважка сінажу, г.
Вологість сінажу повинна бути в межах 45–55 %. Якщо вона більша
за 63 %, то такий корм слід віднести до силосу.

Органолептичну оцінку коренебульбоплодів проводять за

наступною схемою:
За якістю коренебульбоплоди поділяють на три
категорії: доброякісні – чисті, без механічних пошкоджень і вад
(зморшкуватість допускається); підозрілі– частково загнилі, плісняві,
промерзлі, дуже забруднені ґрунтом; непридатні для згодовування –
дуже загнилі. На зберігання слід закладати чисті, сухі, непошкоджені,
середні за розміром овочі.
Хімічні методи дослідження соковитих кормів
Визначення кислотності силосованого корму. За хімічним
складом силос близький до зеленої маси, використаної для силосування,
проте відрізняється від неї підвищеним вмістом органічних кислот
(молочна, оцтова), що утворюються при зброджуванні цукрів
бактеріями. Кисла реакція середовища – основний фактор, який
зумовлює тривале зберігання силосованого корму за рахунок
гальмування розмноження і припинення життєдіяльності гнильних і
маслянокислих мікроорганізмів. Перевага молочнокислого бродіння
полягає в тому, що молочна кислота, як його результат, сильніша, ніж
оцтова і для її утворення потрібно менше цукру. Кислотність

287
визначається трьома показниками: величиною рН, загальною
кислотністю та вмістом небажаних кислот.
Приготування витяжки з силосу. У літрову банку (колбу)
поміщають 100 г дрібно нарізаного силосу. У банку приблизно до 3/4
обсягу наливають дистильовану воду, ретельно збовтують і доливають
до літра. Вміст протягом 4-5 год періодично збовтують. Потім
фільтрують і фільтрат використовують для дослідження ( наприклад, для
визначення рН ) .
Визначення рН силосу. Для визначення рН силосу готують дві
витяжки: одну з хорошого силосу, іншу - з свідомо недоброякісного.
Піпеткою в порцелянову чашечку або луночки вносять 1 мл витяжки та
краплю універсального індикатора. При змішуванні рідин відбувається
зміна забарвлення витяжки. Реакцію (рН силосу) визначають за
стандартною шкалою, яка нанесена на папері із захисним покриттям. За
А. Н. Міхіним, як індикатор використовують суміш бромтимолового
синього і метилового червоного. У луночки порцелянової чашки вносять
2 мл витяжки та 2-3 краплі суміші індикаторів. Залежно від величини рН
витяжка набуває різного забарвлення, яку знаходять по таблиці (2.16).
Таблиця 2.16.
Оцінка якості силосу в балах (за А. Н. Міхіним )
Параметры РН Бал
Визначення рН силосу ( забарвлення витяжки після додавання індикатора ) :
Червона 4,2 и ниже 5
Червоно - помаранчева 4,2-4,6 4
Помаранчева 4,6-5,1 3
Жовта 5,1-6,1 2
Жовто - зелена 6,1-6,4 1
Зелена 6,4-7,2 0
Зелено - синя 7,2-7,6 0

Запах
Ароматично - фруктовий , 4
слабокислий , хлібний
Слабоароматний , 3
оцтовокислий , огірковий

288
Різко оцтовокислий , запах 2-1
масляної кислоти
Затхлий, гнойовий , сильний 0
запах масляної кислоти
Колір силосу :
Зелений 3
Коричневий або жовто - 2
зелений 1
Чорно - зелений 0
Чорний

Дані бальної оцінки при визначенні рН , запаху , кольору

підсумовують, отримують загальний бал , за яким і визначають якість
силосу, балів :
- дуже хороший 11-12
- хороший 9-10
- середньої якості 7-8
- поганий 4-6
На практиці рН силосу визначають також колориметричним,
електрометричним й іншими методами .
Силос, має оцінку 3 бали і нижче , вважається дуже поганим і до
згодовування тваринам непридатний .

Хімічні показники якості сировини і технології заготівлі силосу.

Як правило, для удобрення грунту застосовують органічні та
мінеральні добрива, в тому числі азотовмісні. При надмірному або
неправильному внесенні останніх значна кількість добрів потрапляє у
рослини у вигляді нітратів, які при порушенні технології силосування
(затягування строків заповнення силосних ям і траншей, зігрівання
силосної маси) внаслідок мікробіологічних процесів переходять у
нітрити. Як нітрати, так і нітрити можна виявити якісними пробами. При
необхідності визначають їх кількість.

289
 Якісна проба на нітрати. Про кількість нітратів судять за
швидкістю появи забарвлення та його інтенсивністю.
Хід визначення. Наважку подрібненого корму залити такою ж
кількістю дистильованої води, настояти протягом 15-20 хв,
профільтрувати. До фільтрату додати невелику кількість сірчанокислого
розчину дифеніламіну і спостерігати за зміною кольору. Через 10-15 с у
фільтрат занурити смужку фільтрувального паперу.
Темно-синій колір вказує на значний вміст нітратів, світло-синій -
на незначну їх кількість.
Якісна реакції на нітрити із сульфанілевою кислотою та
альфанафтиламіном. При позитивній реакції утворюється барвник
рожево-червоного кольору, за інтенсивністю і швидкістю утворення
якого судять про приблизний вміст нітритів.
Хід визначення. Наважку подрібненого корму залити такою ж
кількістю дистильованої води, настояти 10-15 хв, профільтрувати. До 2
мл фільтрату додати спочатку 2 мл реактиву А (500 мг сульфанілової
кислоти розчиняють у 150 мл 20 %-ї льодяної оцтової кислоти), а потім 2
мл реактиву Б (200 г гідрохлориду альфанафтиламіну розчиняють у 150
мл 20 %-ї льодяної оцтової кислоти), обережно перемішати. При
позитивній реакції суміш набуде рожевого або яскраво-рожевого
забарвлення. Якщо інтенсивне забарвлення спостерігають уже через
кілька секунд після додавання реактивів, то це свідчить про значну їх
кількість. У цьому випадку слід провести кількісне їх визначення.

Мікробіологічні методи дослідження силосу

Мікроскопічне дослідження силосу. В фарфоровій ступці (з
невеликою кількістю стерильної дистильованої води) розтирають
шматочок силосу. З розтертої маси на предметному склі товкачем
роблять мазок, потім його фіксують і забарвлюють еритрозином. Мазок

290
розглядають під імерсійною системою і замальовують. В хорошому
силосі зустрічаються поодинокі палички і коки, в поганому силосі
виявляється велика кількість коків і паличок .
Мікробіологічне дослідження силосу проводять для виявлення
різних фізіологічних груп мікроорганізмів; молочнокислих, оцтово-
кислих, гнильних, газоутворюючих, дріжджів і цвілей. Перед посівом
готують розведення. З цією метою на технічних вагах відважують 40 г
силосної маси. Наважку з дотриманням правил стерильності переносять
в стерильну банку з притертою пробкою, в яку налито 360 мл стерильної
води. Щоб «відмити» мікроорганізми, які містяться на поверхні рослин,
силос в банці збовтують протягом 10 хв на шуттель-апараті або руками.
У банці виходить розведення 1:10. До цього часу повинні бути готові
колби зі стерильною водою по 90 мл в кожній і зроблені написи: II, III,
IV, V, VI, VII.
Наступні розведення готують шляхом внесення 10 мл розведення
1:10 в другу колбу з 90 мл стерильної води, в результаті чого виходить
розведення 1: 100. З другої колби 10 мл розведення 1: 100 переносять в
третю колбу, виходить розведення 1:1000 і т.д. Вміст колби перед
взяттям розведення силосу збовтують протягом 3 хв. Після
приготування розведення готують посуд (чашки Петрі, пробірки),
роблять написи.
Фізіологічні групи мікроорганізмів визначають на наступних
поживних середовищах:
- МПА - гнильну мікрофлору.
- СА - цвілі і дріжджі.
- САМ (з крейдою) - молочнокислі бактерії,
- молоці - молочнокислі бактерії,
- лактози – газоутворюючі (кишкові) бактерії,
- картопляне середовище Рушмана - оцтово-кислі бацили.

291
 У приготовлений посуд і середовища, починаючи з останньої колби,
вносять по 1 мл розведення: на МПА з I, II, III, IV, V разведення; на СА з
I, II, III, IV; на САМ з II, III, IV, V, VI, VII; на молоко з II, III, IV, V, VI,
VII; на сусло пивне з II, III, IV, V, VI, VII; на лактозу з I, II , III, IV, V; на
картопляне середовище Рушмана з I, II, III, IV, V разведення.
Легкими обертовими рухами чашок змішують розведення силосу із
середовищем і залишають на рівній поверхні для застигання. Чашки,
перевернуті догори дном, витримують в термостаті при температурі 30-
35 °С протягом трьох діб. На четверту добу проводять облік
фізіологічних груп мікроорганізмів.
Чисельність різних фізіологічних груп мікроорганізмів на щільних
поживних середовищах визначають шляхом підрахунку колоній, на
рідкому живильному середовищі - шляхом виявлення росту мікробів з
різних розведенні, а на молоці - по згортанню його. Те із середовищ, в
якому відбулося звертання білка, і в яке було внесено найбільше
розведення, і буде визначати кількість молочнокислих мікроорганізмів в
силосі. На щільних середовищах в чашках Петрі підрахунок ведуть з
трьох розведенні, в кожному з яких виросло не менш десяти колоній.
Оцінка якості силосу. Органолептична оцінка силосу. Колір
повинен бути ближче до кольору рослин, з яких приготовлений силос. У
доброякісного силосу можуть зустрічатися відтінки: жовтий, жовто-
зелений, коричнево-зелений, світло-коричневий. У зіпсованого силосу
переважає коричневий колір; зазвичай він буває темно-коричневий,
брудний. Запах доброякісного силосу повинен бути приємним, що
нагадує запах плодів, хлібного квасу, мочених яблук. При псуванні
силосу з'являється запах оцту. Зіпсований силос має запах редьки,
згірклого масла, оселедця, довго не зникає при розтиранні шматочка
силосу між пальцями.

292
 При наявності в силосі масляної кислоти розтертий між пальцями
силос видає неприємний запах гною. Смак доброякісного силосу
слабокислий, приємний. У зіпсованого силосу смак різко кислий з
гіркуватим присмаком. Консистенція у доброякісного силосу повинна
бути такою, яку мали вихідні рослини. У зіпсованого силосу рослинна
маса робиться ослизлою, масткою, листочки не відокремлюються один
від одного .
Дослідження силосу на присутність в ньому токсину збудника
ботулізму. Силос часто забруднюється грунтом, в якому поряд з іншими
мікроорганізмами можуть бути бацили ботулінуса (Cl.botulinum). Такі
мікроби в масі, що силосується розподіляються нерівномірно, гніздово,
тобто там, де є грунт.
З підозрілих ділянок беруть 1-2 кг силосу і поміщають його в
стерильні широкогорлі колби. Проби заливають подвійною кількістю
стерильної води і залишають для екстрагування. Потім, частину води і
корму переносять в стерильну порцелянову ступку і розтирають.
Витримують 1-2 год і після цього фільтрують до отримання прозорої
рідини.
Наявність токсину ботулінуса в силосі визначають на морських
свинках або білих мишах. Фільтрат ділять на дві частини: одну з них
нагрівають до 80-100 °С для руйнування токсину, іншу залишають без
зміни Дослід ставлять на чотирьох свинках. Матеріал випоюють за
допомогою шприца з конюлей або шприца без голки. Двом тваринам
дають по 2 мл прогрітого фільтрату, іншим - така ж кількість фільтрату,
яка не піддавалась термічній обробці.
При наявності в непрогрітому фільтраті токсину у тварин
з'являються паралічі задніх кінцівок, черевних м'язів і інші ознаки,
характерні для отруєння. Морські свинки зазвичай протягом 2-3 діб
гинуть. Це дає підставу (при відсутності клініки хвороби у контрольних

293
тварин, яким випоювали прогрітий фільтрат) вважати, що в
досліджуваному матеріалі є токсин.
Визначення наявності токсину в силосі можна проводити і на білих
мишах, при цьому дозу фільтрату зменшують до 0,5-1 мл. Відсутність
характерної клініки хвороби не виключає наявність токсину ботулінуса в
кормі, тому дослідження повторюють.

Розвиток мікробіологічних процесів у силосі

Перша фаза. Переважають бактерії з групи ентеробактерій, є також
і інші амоніфікатори, плісняві гриби і дріжджі. При дотриманні всіх
правил силосування така мікрофлора через 1-2 доби починає
пригнічуватися продуктами життєдіяльності молочнокислих бактерій .
Друга фаза. Протікає при домінуванні молочнокислих бактерій,
спочатку молочнокислих стрептококів, а потім молочнокислих паличок.
Третя фаза. Характеризується переважанням молочнокислих
паличок, чисельність кокових форм невелика. Вони менш стійкі до
більш високої концентрації молочної кислоти та інших продуктів
життєдіяльності мікробів. Кінцева величина рН в цій фазі досягає 4,0-
4,2. Кількість молочної кислоти в добротному силосі становить 1,5-2%
від маси корму, а рН в ньому не повинен бути вище 4,0-4,2.
Концентрація водневих іонів (рН), при якій можуть розвиватися
мікроорганізми, що знаходяться в силосі, наступна: молочнокислі
стрептококи 4,0-8,0, молочнокислі палички 3,0-7,0, маслянокислі
бацили 4,7-8,5, гнильні (амоніфікатори) 5,0-9,0, дріжджі 4,0-6,8, цвілеві
гриби 1,5-9,0

МІКОТОКСИКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
КОНЦЕНТРОВАНИХ КОРМІВ

294
 Ступінь ураженості зерна патогенними грибами залежить від
зовнішніх умов вирощування та зберігання насіння, а також від стану
зрілості й видової специфіки рослин. Зокрема, контамінація
свіжозібраного зерна мікроміцетами збільшується під час обмолоту,
транспортування, зберігання у вологих зерносховищах, а також
залежить від фізіологічного стану та морфологічної будови зерна. Так,
на зерні злаків більше мікробів, ніж на насінні з гладкою поверхнею,
наприклад у олійних культурах. Збагачення зерна мікродобавками
сприяє розвитку в ньому Aspergillus, Penicillium, Mucor, Cladosporium.
Мікотоксикологічний контроль кормів обов’язковий при підозрі на
кормові отруєння тварин і якщо якість корму сумнівна. При кормових
отруєннях досліджують зразки усіх кормів, що входили у добовий
раціон до випадку отруєння чи загибелі тварин, а також зразки залишків
корму з годівниць.
Обов’язковому санітарно-мікологічному контролю підлягають
корми, що перезимували під снігом, пізно зібрані, дефектні, а також ті,
що піддавалися самозігріванню.
Пробу для мікотоксикологічного дослідження відбирають
відповідно до державних стандартів. Проба повинна відображати всю
партію корму, бути типовою і однорідною. Якщо відібрані зразки мають
підвищену вологість, їх підсушують для запобігання розвитку на них
мікрофлори під час транспортування.
Маса середньої проби зерна, комбікорму, борошна тваринного
походження, висівок, макухи, шротів повинна бути не менш як 1 кг,
грубих кормів – 100 г, силосу і сінажу – 0,5 кг.
Зразки корму, що надійшли до ветеринарної лабораторії,
досліджують за такою схемою:
1.Органолептичний аналіз – визначення кольору, запаху, наявність
грибів-паразитів (сажка, маточні ріжки та ін.);

295
 2.Мікроскопічне дослідження змивів або зішкрібків з корму;
3.Первинні посіви зразків корму на відповідні живильні середовища
або у вологі камери з наступним виділенням чистої культури грибів;
4.Токсикобіологічний аналіз кормів та виділених чистих культур
грибів.
Органолептичний аналіз. Уражене грибками зерно втрачає колір і
блиск. Якщо процес розвитку пліснявих грибів не був своєчасно
зупиненим, то окремі зерна, а потім всі шари зернової маси повністю
вражаються колоніями мікроміцетів і зерно набуває гнильного запаху.
Під впливом життєдіяльності грибів, маса зерна може зігріватися до 45–
60 °С.
Мікроскопічне дослідження. Дослідження проводять з метою
встановлення роду гриба (Aspergillus, Mucor, Penicillium та ін.). Для
цього з ураженого корму роблять зіскоби і переносять на предметне скло
в краплю води або фізіологічного розчину, яку накривають покривним
склом. Під мікроскопом за характерними для кожного гриба
морфологічними ознаками встановлюють рід, а іноді й вид.
Виділення грибів із кормів проводиться методом прямого посіву
корму на тверде живильне середовище у бактеріологічних чашках з
наступною інкубацією в термостаті при температурі 26–28 °С протягом
3–5 днів, або методом нагромадження. При цьому корми висівають у
вологі камери, на дно яких кладуть 3–4 шари фільтрувального паперу
змоченого рідким поживним середовищем з послідуючою інкубацією і
аналізом росту грибів.
Партії нетоксичного зерна, яке перезимувало під снігом або було
самозігріте, застосовують з фуражною метою лише після просушування.
Зерно, уражене токсичними грибами з роду Fusarium і Stachybotrys,
слабкотоксичне за біопробою допускається на корм відгодівельним

296
тваринам у суміші з іншими кормами (не більше 25% до загального
раціону) періодично з 10-и денною перервою.

Самостійна робота студентів. Формуються дослідницькі групи

з 3 - 4-х студентів, котрі отримують одне з конкретних, визначених
напередодні завдань (з тим, щоб мали змогу підготуватись), щодо
мікробіологічної оцінки якості кормів
За результатами власних досліджень, студенти складають
протокол та захищають його.

Питання для самоконтролю

1. Як проводиться відбір середньої проби соковитих кормів для аналізу?
2. Охарактеризуйте особливості підготовки зразків силосу для
проведення мікробіологічних досліджень.
3. За якими показниками зелені корми поділяють на 3 класи за галузевим
стандартом?
4. Які зелені корми є підозрілими та непридатними до згодовування?
5. Як відбувається розвиток мікробіологічних процесів у силосі?
6. Як провести виробничу оцінку силосу за методом Міхіна?
7. За якими критеріями проводиться мікологічний аналіз
концентрованих кормів?
8. За якими показниками визначають якість сінажу?

297
 ДОДАТОК 1

Фуксин Ціля карболовий

Фуксин основний — — 1г
Карболова кислота кристалічна — 5г
Гліцерин — 0,5 мл
Етиловий спирт 96 %-й — 10 мл
Вода дистильована — 100 мл

Фуксин змішують з карболовою кислотою й розтирають у ступці,

додаючи кілька крапель гліцерину. Поступово доливають спирт. Після
ретельного подрібнення до порошку фуксину додають дистильовану
воду, добре змішують, фільтрують через вологий паперовий фільтр.
Розчин може довго зберігатись в посуді з темного скла.

Розчин Пфейффера

До однієї частини карболового фуксину Ціля додають дев'ять

частин дистильованої води. Розчин готують перед використанням.

Метиленовий синій Леффлера

Насичений спиртовий розчин метиленового синього —30 мл
Дистильована вода — 99 мл
їдке калі 1 % -й — 1 мл

Насичений розчин метиленового синього фільтрують через

паперовий фільтр, додають їдкого калі і розчиняють у дистильованій
воді. Розчин стійкий, зберігається тривалий час.

Барвник Романовського-Гімзи
Промисловість випускає концентрат барвника, до складу якого
входять суміш азуру, еозину й метиленового синього. Для приготування
робочого розчину 1—2 краплі концентрату додають на кожний мілілітр
нейтральної дистильованої води. Розчин нестійкий.

Середовище Гарро
До 100 мл розплавленого й остудженого до 45 °С МПА (рН 7,2)
додають 3—5 % крові кроля або барана і 0,2 % водного 0,1 %-го розчину
генціанового фіолетового.

298
 Середовище Левіна

До 100 мл розплавленого МПА додають 2 мл 0,5 %-го водного

розчину метиленового синього, 1,5 мл 2 %-го розчину еозину жовтого, 2
г лактози і 0,2 г двоосновного фосфату калію. Розчин готують на
дистильованій воді, стерилізують парою без тиску протягом години і
зберігають до використання. Лактозу та двоосновний фосфат калію
розчиняють у невеликій кількості стерильної дистильованої води,
кип'ятять В пробірках і додають в агар. Колір середовища — червоно-
фіолетовий.

Середовище Кітт-Тароцці

Печінку худоби нарізають шматочками (по 1,0—1,5 г), додають

потрійну кількість МПБ або бульйону Хоттінгера, кип'ятать протягом 30
хв. Профільтрований бульйон по 7—10 мл розливають у пробірки,
кладуть по 4—5 шматочків печінки. На бульйон наносять шар
вазелінової олії й стерилізують у автоклаві при 50,65 кПа протягом 30
хв.

Печінково-глюкозогліцериновий агар (ПГГА)

До печінкової води (500 г печінкового фаршу заливають 1 л води,

настоюють годину, варять 30 хв, фільтрують, стерилізують у автоклаві)
додають 1 % пептону, 0,5 % «х. ч.» хлориду натрію, варять в автоклаві
годину, додають 1 % глюкози і 2—3 % гліцерину. Стерилізують при 110
°С 30 хв.

Печінково-глюкозогліцериновий бульйон (ПГГБ)

Готують аналогічно ПГГА, але без агару.

Середовище Вільсона-Блер

Розплавляють 100 мл 3 %-го МПА з 1 % глюкози у водяній бані,

додають 10 мл 20 %-го розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 %-го розчину
хлориду заліза. Обидва розчини готують на стерильній дистильованій
воді й кип'ятять. Розливають у пробірки по 7 мл.

Середовище Кесслера

До 1 л дистильованої води додають 10 г пептону, 50 мл жовчі,

кип'ятять протягом 20—30 хв, фільтрують через вату, додають 10 г

299
лактози, доводять об'єм до 1 л, встановлюють рН-7,4—7,6, додають 4 мл
1%-го розчину генціанового фіолетового. Середовище розливають у
пробірки з поплавками і стерилізують при 50,65 кПа протягом 15 хв.
Колір середовища фіолетовий.

Глюкозопептонне середовище

А. Концентроване середовище Ейкмана. Віл води розчиняють 100

г пептону та 50 г хлориду натрію. Суміш нагрівають до кипіння,
фільтрують, додають 100 г глюкози, встановлюють рН 7,4—7,6,
розливають по 10 мл у колби ємкістю 250—500 мл з поплавками і по 1
мл в пробірки з поплавками. Стерилізують при температурі 112 °С.
Б. Розведене середовище. Готують аналогічно концентрованому,
однак кількість усіх інгредієнтів, крім води, зменшують у 10 разів.

Середовище Мюллера

У колбу, що містить 4,5 г стерильної крейди, додають 90 мл МПБ,

стерилізують при температурі 120 °С, вносять асептично 2 мл розчину
Люголя і 10 мл сірчистокислого натрію, 50 г якого розчиняють у 100 мл
дистильованої води. Суміш ретельно розмішують, розливають по 8 — 10
мл в стерильні пробірки або флакони ємкістю 90 мл. Тетратіо-натова
сіль натрію, що утворюється в середовищі, пригнічує ріст ешерихій і
сприяє росту тифозопаратифозних бактерій.

Середовище Кауфмана

До 500 мл середовища Мюллера додають 25 мл стерильної бичачої

жовчі і 5 мл 0,1 %-го розчину брильянтового зеленого. Розливають у
стерильні пробірки асептично. Стерилізації не потрібно.

300
 ЗМІСТ Стр.

ПЕРЕДМОВА ……………………………………………................... 4
РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ 6
МОРФОЛОГІЯ І ФІЗІОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Тема 1. ОБЛАШТУВАННЯ МІКРОБІОЛОГІЧНИХ 6

ЛАБОРАТОРІЙ, ТЕХНІКА МІКРОСКОПІЧНОГО
ДОСЛІДЖЕННЯ ……………………………………………………
Правила роботи й техніка безпеки в мікробіологічних 9
лабораторіях …………………………………………………………..
Мікроскопічні методи виявлення мікроорганізмів……………. 13
Тема 2. МОРФОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ ……………………… 35
Морфологія мікоплазм ………………………………………… 37
Морфологія рикетсій та хламідій………………………………. 37
Тема 3. ПРИГОТУВАННЯ ПРЕПАРАТІВ ДЛЯ 39
МІКРОСКОПІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ
МІКРООРГАНІЗМІВ ……………………………………………..
Лабораторне заняття №1. Приготування фіксованих 39
препаратів ……………………………………………………………..
Лабораторне заняття №2. Складні методи фарбування 44
препаратів ……………………………………………………………..
Лабораторне заняття №3. Фарбування препаратів з 48
метою виявлення спор бацил ………………………………………..
Лабораторне заняття №4. Фарбування капсул …………….. 51
Тема 4. ДОСЛІДЖЕННЯ БАКТЕРІЙ У 53
НЕПОФАРБОВАНОМУ ВИГЛЯДІ ………………………………
Тема 5. МОРФОЛОГІЯ ГРИБІВ ТА АКТИНОМІЦЕТІВ 57

301
 Тема 6. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ ………………………… 62
Тема 7. КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ ……… 72
Лабораторне заняття №1. Приготування живильних 72
середовищ, знайомство з методами культивування різних груп
мікроорганізмів ………………………………………………………
Лабораторне заняття №2. Техніка посіву мікроорганізмів 81
на живильні середовища, виділення чистих культур ………………
Лабораторне заняття №3 . Культуральні властивості 87
мікроорганізмів ……………………………………………………….
Лабораторне заняття № 4. Вивчення ферментативних 91
властивостей мікроорганізмів ……………………………………….
Тема 8. ВИЗНАЧЕННЯ ВИДУ МІКРООРГАНІЗМІВ …... 97
Тема 9. ВПЛИВ БІОЛОГІЧНИХ ФАКТОРІВ НА 100
БАКТЕРІЇ …………………………………………………………….
Бактеріофаги ……………………………………………………. 100
Антибіотики …………………………………………………….. 102
Тема 10. БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ 106
МАТЕРІАЛІВ У ЛАБОРАТОРІЇ ………………………………….
Лабораторне заняття №1. Лабораторні тварини та методи 107
їх зараження …………………………………………………………..
Лабораторне заняття №2. Патологічний матеріал, правила 113
відбору патологічного матеріалу, консервування та
транспортування в лабораторію; розтин трупів ………………..
Тема 11. СЕРОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ У 118
ВЕТЕРИНАРНІЙ МІКРОБІОЛОГІЇ ……………………………..
Лабораторна робота №1. Реакція аглютинації …………….. 119
Лабораторна робота №2. Реакція преципітації …………….. 124
Лабораторна робота №3. Реакція зв’язування комплементу 132

302
 РОЗДІЛ 2. СПЕЦІАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ 143

Тема 1. ЗБУДНИКИ БАКТЕРІАЛЬНИХ ІНФЕКЦІЙ …………. 143

Збудник сибірки ………………………………………………… 143
Збудник туберкульозу ………………………………………….. 149
Збудник ботулізму ……………………………………………… 153
Збудник бруцельозу …………………………………………….. 155
Тема 2. ГРИБКОВІ ІНФЕКЦІЇ ……………………………………. 161
Лабораторне заняття №1. Збудники дерматомікозів ………. 161
Лабораторне заняття №2. Збудники цвілевих мікозів ……... 166
Збудник кандидомікозу ……………………………………….. 168
Збудник актиномікозу ………………………………………… 170
Тема 3. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ 172
ДОСЛІДЖЕННЯ ОБ'ЄКТІВ ЗОВНІШНЬОГО
СЕРЕДОВИЩА ……………………………………………………..
Санітарно-мікробіологічне дослідження води ……………… 173
Санітарно-мікробіологічне дослідження повітря …………… 178
Санітарно-мікробіологічне дослідження ґрунту ……………. 18
Тема 4. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ 187
ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛОКА І МОЛОЧНИХ ПРОДУКТІВ …..
Лабораторне заняття №1. мікробіологічне дослідження 187
молока …………………………………………………………………
Лабораторне заняття №2. Мікробіологічне дослідження 198
кисломолочних продуктів ……………………………………………
Мікробіологічне дослідження масла, спредів ……………….. 207
Тема 5. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ 213
ДОСЛІДЖЕННЯ М'ЯСА ………………………………………….

303
 Лабораторне заняття №1. Визначення свіжості м'яса 216
методом мікроскопічного аналізу …………………………………..
Лабораторна робота №2. Бактеріологічне дослідження 219
м’яса …………………………………………………………………...
Тема 6. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ 231
ДОСЛІДЖЕННЯ КОВБАСНИХ ВИРОБІВ …………………….
Тема 7. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОПЧНЕ 347
ДОСЛІДЖЕННЯ М’ЯСОКОПЧЕНОСТЕЙ …………………….
Тема 8. САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ 251
ДОСЛІДЖЕННЯ М'ЯСНИХ КОНСЕРВІВ ……………………..
Тема 9. МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЯЄЦЬ І 261
ЯЄЧНОЇ ПРОДУКЦІЇ ………………………………………………
Тема 10. МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ РИБИ І 268
РИБНОЇ ПРОДУКЦІЇ ………………………………………………
Тема 11. САНІТАРНО-БАКТЕРІОЛОГІЧНИЙ 273
КОНТРОЛЬ АПАРАТУРИ І ОБЛАДНАННЯ ВИРОБНИЧИХ
ЦЕХІВ …………………………………………………………………
Мікробіологічний контроль матеріалів виробництва ………. 276
Контроль особистої гігієни працівників підприємств з 278
переробки тваринницької сировини …………………………………
Тема 12. МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ КОРМІВ ……. 280
Дослідження соковитих кормів ………………………………. 281
Мікотоксикологічне дослідження концентрованих кормів … 294
ДОДАТОК 1 …………………………………………………... 298
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ ……………. 305

304
 СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Бортнічук В.А., Скибіцький В.Г., Ібатулліна Ф.Ж. Ветеринарна

мікробіологія. Практикум. Вінниця «Наукова книга» .2007 р. 240 с.
2. Власенко В.В., Скибіцький В.Г., Власенко І.Г., Ібатулліна Ф.Ж.,
Козловська Г.В., Мельник М.В. Практикум «Мікробіологія м’яса та
м’ясних продуктів». –Вінниця, ПП «Едельвейс і К», 2008. – 306 с.
3. Ветеринарно-санітарний контроль на підприємствах м'ясної
промисловості: Навч. посіб. для підготов. фахівців в аграр. вищ. навч.
закл. III - IV рівнів акредитації із спец. "Ветеринар. медицина" /
Р.Й. Кравців, П.І. Вербицький, Ю.І.Остап'юк. — Л.: Галиц. вид. спілка,
2002. — 367с.
4. Ветеринарно-санітарна експертиза з основами технології і
стандартизації продуктів тваринництва / Якубчак О.М., Хоменко В.І.,
Мельничук С.Д., Ковбасенко В.М., Кравців Р.Й. та ін. – К.: Біопром,
2005. – 800 с.
5. Скибіцький В.Г., Власенко В.В., Власенко І.Г., Мельник М.В.,
Ібатулліна Ф.Ж., Козловська Г.В. Мікробіологія молока і молочних
продуктів. –Вінниця, ПП «Едельвейс і К», 2008. – 412 с.
6. Семанюк В.І., Захарів О.Я. Мікробіологічні дослідження об’єктів
довкілля, харчових продуктів тваринного походження, кормів.
Методичні рекомендації для проведення лабораторних занять з курсу
,,Ветеринарна мікробіологія” – Львів 2004. -54 с.
7. Санітарна мікробіологія сировини та продуктів тваринного
походження. Корнелаева Р. П., Степаненко П.П., Павлова Є. В.,-М.:
2006.-407С.
8. Харченко С.М. Мікробіологія. – К.:«Сільгоспосвіта»,1994.– 349 с.
9. ДСТУ IDF 122С:2003. Молоко і молочні продукти. підготовка
проб і розведень для мікробіологічного дослідження.

305
 10. ДСТУ 7357:2013 Молоко та молочні продукти. Методи
мікробіологічного контролювання – Введ. 2014-01-01. – Київ:
Мінекономрозвитку України, 2014. - 31 с.
11. МР 4,4.4.-108-2004 Методичні рекомендації. Періодичність
контролю продовольчої сировини та харчових продуктів за показниками
безпеки, затверджені Міністерством охорони здоров'я України. наказ №
329 від 02.07.2004 р.

306