Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

www.nature.com/npjprecisiononcology

ARTÍCULO ABIERTO

El veneno de abeja y la melitina suprimen la activación del receptor del factor de

crecimiento en el cáncer de mama triple negativo y enriquecido con HER2
ciara duffy1,2,3,4, Anabel Sorolla2,4, Edina Wang2,4, emily dorado2,4, Eleanor Woodward2,4, Kathleen Davern4,5, Diwei Ho6,
Elizabeth Johnston4,7,8, Kevin Pfleger4,7,8,9, Andrew Redfern10, K. Swaminathan Iyer5, Boris Baer11y Pilar Blancafort1,2,4,12✉

A pesar de décadas de estudio, los mecanismos moleculares y la selectividad de los componentes biomoleculares de la abeja melífera (Apis
mellifera) veneno como agentes anticancerígenos siguen siendo en gran parte desconocidos. Aquí, demostramos que el veneno de abeja y
su componente principal, la melitina, inducen potentemente la muerte celular, particularmente en los subtipos de cáncer de mama
agresivo triple negativo y enriquecido con HER2. El veneno de abeja y la melitina suprimen la activación de EGFR y HER2 al interferir con la
fosforilación de estos receptores en la membrana plasmática de las células de carcinoma de mama. Los estudios mutacionales revelan que
una secuencia de melitina C-terminal cargada positivamente media la interacción de la membrana plasmática y la actividad
anticancerígena. La ingeniería de un motivo RGD mejora aún más la orientación de la melitina a las células malignas con una toxicidad
mínima para las células normales. Por último, la administración de melitina potencia el efecto de docetaxel en la supresión del crecimiento
del tumor de mama en un modelo de aloinjerto.
npj Oncología de precisión (2020) 4:24; https://doi.org/10.1038/s41698-020-00129-0
1234567890():,;

INTRODUCCIÓN en células MCF7 de cáncer de mama y melanoma19. El veneno de abeja y la

La abeja europea (Apis mellifera)ha sido la fuente de una serie de productos
utilizados con fines medicinales por los seres humanos, como la miel, el
propóleo y el veneno durante miles de años1. Sin embargo, los
determinantes moleculares de la actividad anticancerígena del veneno de
abeja siguen sin comprenderse bien, en particular en el cáncer de mama, el
cáncer más común entre las mujeres en todo el mundo.2. Comprender la
base molecular y la especificidad del veneno de abeja contra las células
cancerosas es clave para desarrollar y optimizar nuevas terapias efectivas a
partir de un producto natural que está ampliamente disponible y es
rentable de producir en muchas comunidades de todo el mundo.
El componente activo del veneno de abeja es la melitina, que comprende
la mitad del veneno de abeja en peso seco.3,4. La melitina es un péptido
anfipático de 26 aminoácidos cargado positivamente.5que se asocia con los
fosfolípidos de la bicapa de la membrana, causando la muerte celular al
formar poros toroidales transmembrana de ~4,4 nm de diámetro que
pueden permitir la internalización de moléculas pequeñas adicionales con
actividades citotóxicas4,6,7.
Tanto el veneno de abeja como la melitina han demostrado efectos
antitumorales en el melanoma.8, cáncer de pulmón de células no pequeñas9,
glioblastoma10, leucemia11, ovario12, cervical13y cánceres de páncreas14, con
mayor potencia citotóxica en células cancerosas en comparación con células no
transformadas8,11,14,15. Las nanopartículas de melitina se han utilizado para
suprimir la metástasis hepática mediante la inmunomodulación de las células
endoteliales sinusoidales del hígado.dieciséis. Se han informado efectos
anticancerígenos aditivos y sinérgicos entre el veneno de abeja y otras
modalidades terapéuticas, incluso con cisplatino en neoplasias malignas
cervicales y laríngeas.17, y con docetaxel en células de cáncer de pulmón18. Se han
demostrado interacciones similares entre la melitina y la solución salina
tamponada con fosfato tratada con plasma.
melitina también indujeron la apoptosis en las células MCF720, y reducción
de la viabilidad celular y la migración en células de cáncer de mama MDA-
MB-23121,22. Veneno de abeja redujo metástasis de cáncer de mama al
pulmón23, inhibió el crecimiento tumoral y prolongó la supervivencia en
ratones con tumores de carcinoma mamario espontáneos24. La mayor
parte de la actividad antineoplásica del veneno de abeja se ha atribuido a la
melitina.25a través de la inhibición del eje PI3K/Akt/mTOR en el cáncer de
mama21, MAPK en melanoma26, JAK2/STAT3 en cáncer de ovario12, y vías de
señalización de NFκB en células de carcinoma de pulmón18. A diferencia del
veneno de abeja, el abejorro (bombus terrestris)veneno no contiene
melitina27, pero contiene fosfolipasa A2 secretora que indujo la apoptosis
mediante la inhibición de la fosforilación de Akt en células de leucemia
mielógena crónica humana28.
Hasta donde sabemos, no se han investigado los efectos de diferentes
venenos de abeja y melitina en los subtipos de cáncer de mama en comparación
con las células no transformadas. Cánceres de mama triple negativos (TNBC, que
carecen de la expresión de los receptores de estrógeno y progesterona, así como
del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, HER229) son
agresivos y se asocian con los peores resultados30–33. Aproximadamente el 50%
de los TNBC sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR)34, y los tumores enriquecidos con HER2 sobreexpresan HER2, otro
receptor de tirosina quinasa (RTK) que confiere señalización oncogénica, a
menudo dependiente de la vía PI3K/Akt corriente abajo34. El bloqueo de la
señalización de EGFR en TNBC con terapias estándar ha demostrado una eficacia
clínica limitada en ensayos clínicos de fase temprana debido a la falta de
dependencia de la vía de EGFR y la importancia de las vías colaterales35. Aunque
las terapias dirigidas a HER2 han mejorado drásticamente la mediana

1Escuela de Ciencias Humanas, Universidad de Australia Occidental, Perth, WA 6009, Australia.2Grupo de Epigenética del Cáncer, Instituto Harry Perkins de Investigación Médica, Perth, WA 6009,
Australia.3Biología de la Energía Vegetal, Universidad de Australia Occidental, Perth, WA 6009, Australia.4Centro de Investigación Médica, Universidad de Australia Occidental, Perth, WA 6009, Australia.
5Instalación de anticuerpos monoclonales (MAb), Instituto Harry Perkins de Investigación Médica, Perth, WA 6009, Australia.6Facultad de Ciencias Moleculares, Universidad de Australia Occidental,
Perth, WA 6009, Australia.7Endocrinología Molecular y Farmacología, Instituto Harry Perkins de Investigación Médica, Perth, WA 6009, Australia.8Centro del Consejo Australiano de Investigación para
Tecnologías Terapéuticas Personalizadas, Perth, Australia.9Dimerix Limited; Nedlands, Perth, WA 6009, Australia.10Escuela de Medicina, Universidad de Australia Occidental, Perth, WA 6009, Australia.11
Centro de Investigaciones Abejas Integrativas (CIBER), Departamento de Entomología; Universidad de California Riverside, Riverside, CA 92521, EE. UU.12Instituto de Investigación del Cáncer Infantil
Greehey, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, San Antonio, TX 78229, EE. UU. ✉correo electrónico: pilar.blancafort@uwa.edu.au

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota

 C Duffy et al.
2
supervivencia en el entorno metastásico, la resistencia también es casi
inevitable a largo plazo para este subtipo33,36. Claramente, el
descubrimiento de estrategias terapéuticas más efectivas y selectivas para
estos cánceres es un área prioritaria en oncología clínica.
Aquí, informamos que el veneno de abeja y la melitina inducen una muerte
celular potente y altamente selectiva en TNBC y carcinoma de mama enriquecido
con HER2 con efectos insignificantes en células normales, al interferir con las
interacciones RTK dependientes del factor de crecimiento críticas para la
fosforilación del receptor y la activación de PI3K/Akt señalización. Más allá del
cáncer de mama, también describimos modificaciones específicas de la melitina
para su uso potencial en combinación con quimioterapia para el tratamiento de
otros cánceres agresivos provocados por la sobreexpresión de los receptores del
factor de crecimiento.
RESULTADOS
El veneno de abeja y la melitina reducen la viabilidad del cáncer de mama
Para evaluar la eficacia y la selectividad anticancerígenas, se evaluaron el
veneno de las abejas europeas recolectadas en Perth, Australia y el péptido
de melitina en ensayos de respuesta a la dosis en un panel de líneas
celulares representativas de los subtipos de cáncer de mama intrínseco y
en células no transformadas (Fig.1a). El veneno de abeja mostró una alta
selectividad anticancerígena, con una potencia significativamente mayor en
TNBC (p. ej., SUM159 y SUM149) y en las líneas celulares de cáncer de
mama enriquecidas con HER2 (p. ej., MDA-MB-453 y SKBR3), seguido de
1234567890():,;
células de cáncer de mama luminal ( incluyendo MCF7 y T-47D), con el
impacto más bajo en las células normales (células primarias de fibroblastos
dérmicos HDFa y células mamarias MCF 10A y MCF-12A no transformadas)
(Fig.1b, izquierda; Mesa1; GLM, Chi-Cuadrado de Wald = 342,pag <0.001,
norte =33, ref =1). Una reducción significativa en la mitad de la
concentración inhibitoria máxima (IC50) para las líneas celulares de cáncer
TNBC SUM159 (5,58 ng/ μL) y HER2-enriquecido SKBR3 (5,77 ng/μL) en
comparación con la línea celular HDFa normal (22,17 ng/μL, Fig.1c,
izquierda; ANOVA unidireccional,pag <0,01).
De manera similar, la melitina fue significativamente más potente contra el cáncer de
mama enriquecido con HER2 y TNBC en comparación con las células normales (Fig. 1b,
c, derecha; Mesa1; GLM, Chi-Cuadrado de Wald = 12.9,pag <0.001,norte =
33, ref =1), con circuito integrado50valores de 0,94 a 1,49 μM en TNBC humano y
células de cáncer de mama enriquecidas con HER2, y de 1,03 a 2,62 μM en células
no transformadas. Los ensayos de viabilidad celular del veneno de abeja y la
melitina en el cáncer de mama murino y las líneas celulares normales
confirmaron una mayor selectividad para las líneas celulares tumorales murinas
agresivas, como el T11 bajo en claudina mutante p53 y el B.15 mutante BRCA.37,38
(Fig. 1 complementaria).
El veneno de las abejas melíferas de diferentes poblaciones de abejas
melíferas en Irlanda e Inglaterra redujo la viabilidad de las células SUM159
y SKBR3 significativamente más que la de las células HDFa no
transformadas (Fig.1d, ANOVA unidireccional,pag <0,001). También
probamos el veneno del abejorrobombus terrestrisDe Inglaterra. Las
muestras de obreras y reinas provocaron una muerte celular mínima en las
células de cáncer de mama en comparación con el veneno de abeja, incluso
a altas concentraciones de veneno (Fig.1mi).
Desarrollamos un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la
melitina para evaluar la abundancia relativa de melitina en todas las
muestras de veneno de abejas y abejorros mediante ELISA. De acuerdo con
los estudios de actividad anteriores, la abundancia relativa de melitina no
fue significativamente diferente en todas las muestras de veneno de abeja
de diferentes lugares (ANOVA de dos vías,pag > 0,999). Sin embargo, las
concentraciones de melitina fueron significativamente más altas en las
muestras de abejas en comparación con el veneno de abejorro y el control
de isotipo IgG (Fig.1f, ANOVA de dos vías,pag <0,001).
Los efectos anticancerígenos de la melitina se confirmaron mediante
experimentos de bloqueo in vitro, en los que explotamos el anticuerpo anti-
melitina para rescatar la viabilidad celular en células HDFa y SUM159. Las
células se trataron con veneno de abeja o melitina en combinación con
concentraciones crecientes del anticuerpo anti-melitina. La viabilidad
celular fue significativamente mayor cuando se bloqueó la melitina con
npj Oncología de precisión (2020) 24
el anticuerpo anti-melitina para células HDFa y SUM159 expuestas al veneno de
abeja o al péptido de melitina (Fig.1gramo,tpruebas,pag <0,0001). Estos datos
sugieren que la melitina presente en el veneno de abeja es el compuesto
anticancerígeno bioactivo más prominente dentro de todos los venenos
estudiados. El veneno de abeja recogido en Perth, Australia, se utilizó para todos
los experimentos posteriores.
El veneno de abeja y la melitina inducen la muerte celular del cáncer de mama
Para examinar el mecanismo y la cinética de la muerte celular, las células
TNBC se trataron con IC50de veneno de abeja o melitina durante 18 y 24 h, y
procesado mediante un ensayo de caspasa-3 escindida para cuantificar la
muerte celular apoptótica. La inmunotransferencia confirmó la inducción
de caspasa-3 escindida en células SUM159, y la melitina sola indujo un
mayor nivel de apoptosis que el veneno de abeja tanto a las 18 como a las
24 horas posteriores al tratamiento (Fig.2a, cuantificación en la Fig. 2
complementaria).
Para cuantificar las poblaciones de células muertas, necróticas o apoptóticas
después del tratamiento, realizamos un ensayo de detección de apoptosis con
anexina V-FITC. Las células SUM159 se expusieron al vehículo, veneno de abeja o
melitina usando IC50concentraciones y procesado por citometría de flujo después
de un tratamiento de 60 min (Fig.2b). Encontramos significativamente más
células apoptóticas/necróticas tardías para las muestras tratadas con melitina
(23,6 ± 5,7 %) en comparación con el veneno de abeja (8,3 ± 1,9 %) y el control del
vehículo (4,8 ± 0,4 %, ANOVA de dos vías,pag < 0,001, media ± SEM). Sin embargo,
no hubo diferencias significativas en los niveles de células apoptóticas o
necróticas tempranas en todas las condiciones (ANOVA de dos vías,pag >0,05,
media ± SEM). Para caracterizar la cinética de la muerte celular en tiempos más
cortos, se midió la viabilidad celular de las células HDFa, SKBR3 y SUM159
tratadas durante hasta 1 h con IC50concentraciones de veneno de abeja o
melitina (Fig.2C). El veneno de abeja redujo rápidamente la viabilidad celular, sin
diferencias significativas entre las líneas celulares normales y cancerosas durante
la hora (ANOVA de dos vías,p =0,97). Por el contrario, la melitina redujo
significativamente la viabilidad de ambas líneas celulares de cáncer de mama en
comparación con las células normales a partir de los 10 min en adelante, y
SUM159 significativamente más que SKBR3 a partir de los 30 min en adelante
(ANOVA bidireccional,pag < 0,0001).
Microscopía confocal de células vivas (Fig.2d) y microscopía electrónica
de barrido (Fig.2e) en células SKBR3 y SUM159 ilustraron una rápida
interrupción y reducción de la membrana plasmática con veneno de abeja y
tratamiento con melitina en relación con el tratamiento con vehículo
durante 10 a 60 min.
RGD mejora la focalización de la melitina en el cáncer de mama
El extremo C de la melitina forma una hélice α cargada positivamente que
se ha propuesto para mediar la unión a la membrana plasmática cargada
negativamente, lo que induce la formación de poros y la lisis celular
subsiguientes.39–41. Estudios previos han demostrado que truncar este
extremo C cargado positivamente reduce significativamente la unión de
melitina a las bicapas de fosfolípidos en comparación con la melitina de tipo
salvaje.39,42. Evaluar el papel funcional del positivo (K21RKR24) en el extremo
C de la melitina, diseñamos un péptido de melitina cargado negativamente
(D21EDE24-melitina). Se predijo que estos residuos negativos interrumpirían
la unión de melitina con la membrana plasmática. Descubrimos que DEDE-
melitina no provocó signos medibles de actividad anticancerígena en
ninguna de las líneas celulares analizadas (Fig.3a, b). Es importante
destacar que la actividad anticancerígena de DEDEmelitina se rescató con
una secuencia cargada positivamente (K21KKRKV26) presente en el antígeno
T grande del virus Simian 40 (SV40) (péptido SV40-melitina) que posee
capacidad de penetración celular43(Higo. 3b). De manera similar, injertar
una secuencia TAT cargada positivamente más grande (transactivador de la
transcripción, derivado del VIH-1)43en el extremo C de melitina también
restableció la actividad de DEDE-melitina (péptido TAT-melitina; Fig. 3
complementaria). Sin embargo, la potencia de la melitina y la melitina SV40
fue mayor que la de la melitina TAT, lo que podría deberse al tamaño más
grande de la TAT. Estos datos demuestran que los residuos requeridos para
la actividad de melitina incluyen
Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
 C Duffy et al.
3
a colección de abejas glándulas venenosas sobrenadante de veneno Péptido de melitina

glándula venenosa Veneno Subtipos de cáncer de mama

extracción recopilación luminal
TNBC
enriquecido con HER2
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ

b 120 Apis mellifera(Australia), 24 horas 120 Melitina, 24 horas

HDFa HDFa
FCM 10A FCM 10A
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

100 MCF-12A 100 MCF-12A
MCF7 MCF7
80 T-47D 80 T-47D
ZR-75-1 ZR-75-1
MDA-MB-231 MDA-MB-231
60 60
SUMA149 SUMA149
SUMA159 SUMA159
40 SKBR3 40 SKBR3
MDA-MB-453 MDA-MB-453
20 20

0 0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
log [proteína de veneno de abeja] (ng/μL) log [melitina] (ng/μL)

C
***
***
25 12 **
***
IC de veneno de abeja50(ng/μL) ± SEM

Normal Normal
luminal 10 luminal
20

IC de melitina50(ng/μL) ± SEM
TNBC TNBC
8 enriquecido con HER2
**
enriquecido con HER2

15 **
HDFa frente a SUM159 ** HDFa frente a SUM159 **
6
HDFa frente a SKBR3 ** HDFa frente a SKBR3 **
10
4

5
2

0 0

3
1
1

53

D
D

FC DFa
FC DFa

7
7

M -1
A- 5-1

2A
M 0A
2A
M 0A

3
49

59
R3
49

45
23
23

CF
CF

47
47

BR
D -75
4

A1

A1
A1

A1

-1
1
-1
1

B-
7

B-
B-

B-

M
M

T-
T-

H
H

SK
SK

M
M

M
M ZR-

M
M

CF
CF

M
M

SU

SU
SU

SU

A-
A-
A-

D
D

M
M
M

d 120Apis mellifera(Irlanda) HDFa CI 50 = 26,2 ng/μl 120 Apis mellifera(Inglaterra) HDFa CI 50 = 22,4 ng/μl
SUMA159 IC 50 = 9,1 ng/μL
** SUMA159 IC 50 = 9,1 ng/μL
**
** **
100 SKBR3 CI 50 = 9,5 ng/μL SKBR3 CI
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

100
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

50
= 8,6 ng/μL

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
log [proteína de veneno de abeja] (ng/μL) log [proteína de veneno de abeja] (ng/μL)

mi 120
bombus terrestris(Inglaterra)
120
Reinabombus terrestris(Inglaterra)
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

100 100

80 80

60 60

40 HDFa 40 HDFa
SUMA159 SUMA159
20 SKBR3 20 SKBR3

0 0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.25 0.75 1.25 1.75
log [proteína de veneno de abeja] (ng/μL) log [proteína de veneno de abeja] (ng/μL)

F 3.5 melitina
Apis mellifera(Australia) Apis mellifera(
gramo
100 veneno de abeja 100 melitina
ns
3.0 Irlanda) Apis mellifera(Inglaterra)
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Absorbancia (405 nm) ± SEM

bombus terrestris(Inglaterra) Reina *** 80 80

2.5 bombus terrestris(Inglaterra)ns

2.0 control de IgG 60 60

1.5
40 40
1.0
20 20
0.5 HDFa
HDFa
SUMA159 SUMA159
0.0 0 0
0 1 2 3 0 1 2 3
10

01

1
00
0.

log [anti-melitina] (ng/μL) log [anti-melitina] (ng/μL)

0.

0.

log [anticuerpo] (ng/μL)

los que residen en la hélice α C-terminal, que comprenden varios residuos motivo peptídico (RGD1-melitina, derivado de TGF-β3, secuencia HGRGDLGRLKK),
clave cargados positivamente necesarios para la interacción con la que interactúa con las integrinas αvβ6 y αvβ3 sobreexpresadas en las
membrana plasmática. membranas celulares del cáncer de mama y la vasculatura asociada al tumor44–46.
Para mejorar la selectividad de las células cancerosas, generamos un péptido de Cuando se diseñan con péptidos bioactivos, los motivos RGD mejoran la
melitina bifuncional mediante la ingeniería de un RGD alfa-helicoidal N-terminal orientación a las células de cáncer de mama47.

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
4
Figura 1El veneno de abeja y la melitina reducen específicamente la viabilidad de las células tumorales de mama. aEl proceso de recolección de veneno de abeja y
tratamiento con melitina de células de cáncer de mama, con una abeja recolectada en Australia.bEnsayos de viabilidad celular de un panel de líneas celulares humanas
normales y de cáncer de mama tratadas con veneno de abeja de Australia (izquierda) o melitina (derecha), conCel CI50valores (modelos lineales generalizados). Ensayos
de viabilidad celular de fibroblastos dérmicos humanos normales (HDFa) y líneas celulares de cáncer de mama (SUM159 y SKBR3) tratadas condveneno de poblaciones
de abejas en Irlanda (izquierda) e Inglaterra (derecha) (ANOVA unidireccional), ymiveneno de los abejorros trabajadores de Inglaterra (izquierda) y reina (derecha).F
Absorbancia (405 nm) de soluciones acuosas de melitina y veneno de abeja evaluada por ELISA con el anticuerpo anti-melitina y control IgG (ANOVA de dos vías).gramo
Ensayos de viabilidad celular en células HDFa y SUM159 después de bloquear la melitina usando el anticuerpo anti-melitina con veneno de abeja (izquierda) y melitina
(derecha). Los datos se representan como media ± SEM (norte =3). Las diferencias se consideraron significativas enpag <0,05 (*), pag <0,01 (**), ypag <0,001 (***). Véase
también la Fig. 1 complementaria.

Tabla 1. Concentraciones inhibitorias semimáximas (IC50s) de veneno de abeja y melitina.

Línea celular subtipo IC de veneno de abeja50(ng/μL) IC de melitina50(ng/μL) IC de melitina50(μM)

Humano

HDFa Normal 22,17 ± 1,91 7,45 ± 0,12 2,62 ± 0,04

FCM 10 A Normal 14,38 ± 0,47 2,94 ± 0,20 1,03 ± 0,07
MCF-12A Normal 12,00 ± 1,01 5,88 ± 0,41 2,07 ± 0,14
MCF7 Lumen A 10,77 ± 0,22 4,68 ± 0,12 1,64 ± 0,04
T-47D Lumen A 9,21 ± 0,69 10,36 ± 0,43 3,64 ± 0,15
ZR-75-1 Lumen A 8,32 ± 0,20 6,01 ± 0,18 2,11 ± 0,06
MDA-MB-231 TNBC, claudin-bajo 8,58 ± 0,39 3,24 ± 0,03 1,14 ± 0,01
SUMA149 TNBC, de tipo basal 6,86 ± 0,45 2,67 ± 0,27 0,94 ± 0,10
SUMA159 TNBC, claudin-bajo 5,58 ± 0,33 4,24 ± 0,14 1,49 ± 0,05
MDA-MB-453 enriquecido con HER2 7,46 ± 0,07 4,03 ± 1,20 1,42 ± 0,42
SKBR3 enriquecido con HER2 5,77 ± 0,51 3,59 ± 0,24 1,26 ± 0,09
murino
NIH/3T3 Normal 11,7 ± 0,81 4,51 ± 0,18 1,58 ± 0,06
BRCA−B.15 Basal-como 6,42 ± 0,44 2,36 ± 0,19 0,83 ± 0,06
p53−T11 claudin-bajo 6,24 ± 0,49 2,08 ± 0,08 0,73 ± 0,03

Los datos se presentan como media ± SEM en ng/μL o μM (con dos decimales). Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos.TNBCcáncer de mama triple negativo,HER2
receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano.

el CI50de RGD1-melitina no fue significativamente diferente en comparación
con la melitina parental en las células T11, lo que indica que la potencia no
se vio afectada por el motivo RGD (Fig.3b,tprueba,p =0,652). Tomando las
proporciones del IC50s de HDFa/SUM159 para RGD1-melitina (2,73 ± 0,14)
en comparación con melitina (1,76 ± 0,04), el motivo RGD aumentó
significativamente la ventana terapéutica entre las líneas celulares
los mutantes se deben a interacciones electrostáticas con la
membrana y no a cambios importantes en la estructura peptídica.
A continuación, explotamos el anticuerpo anti-melitina para detectar la
localización subcelular de los péptidos activos mediante inmunofluorescencia en
células TNBC SUM159 tratadas durante 30 minutos con vehículo, veneno de
abeja, melitina, RGD1-melitina o DEDE-melitina en IC50

normales y TNBC, lo que confirma una mayor selectividad de células
cancerosas conferida por RGD (Fig.3C,tprueba,pag <0,01, media ± SEM). La
inducción de la apoptosis en las células SUM159 TNBC tratadas con
melitina, DEDE-melitina y RGD1-melitina durante 24 h confirmó la actividad
anticancerígena tanto de la melitina como de la RGD1-melitina, pero no de
la DEDEmelitina (Fig.3d).
De acuerdo con la actividad anticancerígena de la melitina y la
melitina RGD1, encontramos que la interacción entre el anticuerpo
anti-melitina y la melitina no fue significativamente diferente de la de
la melitina RGD1 (Fig.3e, ANOVA de dos vías,pag >0.999), pero fue
significativamente diferente de DEDE-melitina y SV40-melitina (ANOVA
de dos vías,pag <0.05), con la absorbancia de SV40-melitina no
significativamente diferente del control de IgG (ANOVA de dos vías,
pag >0.1). Estos datos sugirieron que nuestro anticuerpo monoclonal
anti-melitina reconoce un epítopo conformacional que no se
interrumpe por la ingeniería de un péptido de dirección N-terminal.
Los estudios de modelado indicaron que la conformación de la porción
de melitina de los péptidos modificados no se interrumpió ni por las
mutaciones C-terminales ni por la adición N-terminal del motivo RGD (Fig.3
F). Cada péptido retuvo la característica estructura de hélice alfa doblada, lo
que potencialmente facilitó la formación de poros.4, lo que sugiere que las
diferencias en la actividad anticancerígena entre
concentraciones (Fig.3gramo). Independientemente de si las células fueron
expuestas a veneno de abeja, melitina o melitina RGD1, la melitina se
localizó predominantemente en la membrana plasmática de las células que
sobreexpresan EGFR, con un grado de tinción intracelular en el veneno de
abeja y las células tratadas con melitina, posiblemente debido a la ruptura
de la membrana y la formación de endosomas como se informó en otra
parte25,48. Además, el patrón de tinción de RGD1-melitina parecía dirigido de
manera distintiva solo a la membrana plasmática, lo que estaría en
consonancia con la selectividad mejorada del péptido objetivo para los
restos de la superficie de la célula tumoral. Observamos una falta de
reactividad del anticuerpo contra la melitina en las células tratadas con
DEDEmelitina. En resumen, estos resultados revelan que mientras que el
motivo RGD mejora la dirección de la melitina a las membranas celulares
del cáncer de mama, el motivo positivo C-terminal parece esencial para la
actividad anticancerígena.
El veneno de abeja y la melitina suprimen la fosforilación de RTK
Posteriormente, investigamos si tanto el veneno de abeja como la melitina interrumpen
las vías de señalización asociadas a RTK mediante el bloqueo de la activación
dependiente de ligandos de EGFR y HER2 en células de carcinoma de mama. Para
evaluar esto, realizamos un análisis de inmunotransferencia en SKBR3 (HER2+
y EGFR+) y SUM159 (EGFR+) extractos de células expuestas a EGF y
tratadas con el IC50de veneno de abeja o melitina de 2,5 a

npj Oncología de precisión (2020) 24 Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
 C Duffy et al.
5
a SUM159 (18 - 24 horas) 1 2 3 4 5 Leyenda:
1 - Vehículo
α-CL-csp-3 Asp 175 17 / 19 kDa 2 - Veneno de abeja 18 horas 3
- Veneno de abeja 24 horas 4 -
α-TUBULIN 50kDa Melitina 18 horas
5 - Melitina 24 horas

b SUMA159 (60 minutos)

Vehículo veneno de abeja melitina

necrótico Muerto necrótico Muerto necrótico Muerto

0,0% 4,8% 0,8% 8,3% 0,1% 23,6%

Yoduro de propidio

Yoduro de propidio

Yoduro de propidio
Vivir apoptótico Vivir apoptótico Vivir apoptótico
94,2% 1,0% 90,1% 0,8% 72,7% 3,6%

Anexina V FITC Anexina V FITC Anexina V FITC

C 120
veneno de abeja
120
melitina
ns
***
HDFa frente a SKBR3 y SUM159
100 100
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

80 80
**
SKBR3 frente a SUM159
60 60

40 40
HDFa HDFa
SKBR3 SKBR3
20 20
SUMA159 SUMA159

0 0
0 20 40 60 0 20 40 60
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)

dSKBR3 (60 minutos) Tiempo (mins) de tratamiento con veneno de abeja

0 10 20 30 40 50 60

miSUMA159 (60 minutos)

Vehículo veneno de abeja melitina

20min (fig.4a). Tanto el veneno de abeja como la melitina regularon a la MAPK (Thr202/Tyr204), p-Akt (Ser473 y Thr308), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) y p-
baja la fosforilación de los RTK y modularon las vías de señalización PI3K-/ p38 MAPK (Thr180/Tyr182) desde los 5 min en adelante (Fig.4una izquíerda; Fig. 4
Akt y MAPK asociadas de manera dependiente del tiempo. complementaria), con una ligera disminución en el total de proteínas HER2, EGFR
El veneno de abeja y el tratamiento con melitina en células SKBR3 y Akt solo después de 10 minutos de tratamiento con veneno de abeja, lo que
redujeron fuertemente p-HER2 (Tyr1248), p-EGFR (Tyr1068), p-p44/42 podría estar relacionado con el endosoma mediado.

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
6
Figura 2El veneno de abeja y la melitina inducen la apoptosis y la ruptura de la membrana. aWestern blot para la detección de caspasa-3 escindida (CL-csp-3) en células
SUM159 tratadas con vehículo (1), veneno de abeja (2–3) y melitina (4–5) durante 18 y 24 h.bAnálisis de citometría de flujo de células SUM159 tratadas con IC50de veneno
de abeja (5.58 ng/µL) y el IC50de melitina (4,24 ng/µL) durante 1 h.CEnsayos de respuesta temporal de viabilidad celular de fibroblastos dérmicos humanos normales
(HDFa) y células de cáncer de mama (SUM159 y SKBR3) tratadas con veneno de abeja (izquierda) o melitina (derecha) durante 1 hora (ANOVA bidireccional).dMicroscopía
confocal de células vivas de células SKBR3 tratadas con IC50de veneno de abeja (5,77 ng/µL) durante 1 h, con tiempo en minutos después del tratamiento. Las barras de
escala representan 15 µm.miMicroscopía electrónica de barrido de células SUM159 tratadas con IC50de veneno de abeja (5.58 ng/µL) y el IC50de melitina (4,24 ng/µL)
durante 1 h, con dos imágenes representativas que se muestran para cada grupo de tratamiento. El contorno blanco en las imágenes superiores indica las regiones
respectivas de cada celda en las imágenes inferiores. Las barras de escala representan 10 µm (fila superior) y 200 nm (fila inferior). Los datos se representan como media
± SEM (norte =3). Las diferencias se consideraron significativas en pag <0,05 (*),pag <0,01 (**), ypag <0,001 (***). Véanse también las figuras complementarias. 2, 10 y
16.

degradación del receptor25. En SUM159, el p-EGFR (Tyr1068) fue
fuertemente regulado a la baja por el veneno de abeja y la melitina de 10 a
20 min. El tratamiento de SUM159 con melitina también suprimió p-Akt
(Ser473 y Thr308) en todos los puntos de tiempo, pero aumentó p-p44/42
MAPK (Thr202/Tyr204), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) y p-p38 MAPK ( Thr180/
Tyr182) de 10 a 20 min, mientras que el veneno de abeja aumentó p-p44/42
MAPK (Thr202/Tyr204) y p-Akt (Ser473 y Thr308) de 10 a 20 min (Fig.4una,
derecha; Figura complementaria 4). Las vías de MAPK y Akt pueden haber
sido reguladas al alza en las células SUM159 debido a la liberación de un
ciclo de retroalimentación reguladora negativa que desencadena la
señalización de ERK para proteger las células de la muerte celular
apoptótica.8,49. El anticuerpo anti-melitina indicó una cantidad creciente de
melitina presente en los lisados de ambas líneas celulares a lo largo del
tiempo, con una señal más fuerte para el tratamiento con melitina en
comparación con el veneno de abeja en ambas líneas celulares.
Para caracterizar los efectos sobre las vías de señalización en otro
modelo de TNBC, realizamos inmunotransferencia en células MDA-MB-231,
en las que el tratamiento con EGF fosforiló EGFR e indujo la expresión de
EGFR (Figura 4 complementaria). La melitina redujo la fosforilación de EGFR
y MAPK, regulando a la baja las principales vías de proliferación
oncogénica. A diferencia de las células SUM159, la estimulación de EGFR
por EGF no se correlacionó con un aumento en la fosforilación en p-Akt,
posiblemente debido a la desconexión entre la señalización de EGFR y las
vías de Akt. Otros receptores de factores de crecimiento, como VEGFR1,
pueden mediar en la activación de estas vías50,51. Mientras que la melitina
inhibió previamente la señalización de JAK2/ STAT3 en el cáncer de ovario12,
no se observaron efectos moduladores en los inhibidores de la vía JAK/STAT
en células SUM159 después de un tratamiento de 60 minutos con veneno
de abeja o melitina (Fig. 5 complementaria).
Teniendo en cuenta que las células de carcinoma de mama enriquecidas
con TNBC y HER2 dependen en gran medida de la activación de EGFR y
HER2, realizamos experimentos de transferencia de energía por resonancia
de bioluminiscencia (BRET) para determinar si la melitina interfería con la
unión de EGF a EGFR, lo que conducía al crecimiento suprimido observado.
fosforilación del receptor del factor. El reportero NanoLuc se utilizó como
molécula donante bioluminiscente y se fusionó genéticamente con EGFR52,
53. Se usaron experimentos BRET cinéticos y de saturación para monitorear
la proximidad de NanoLuc-EGFR con las moléculas aceptoras marcadas con
fluorescencia TAMRA-EGF (control positivo), FITC-melitina y FITC-DEDE-
melitina (control negativo) en células HEK293FT transfectadas con NanoLuc-
EGFR. La transferencia de energía del donante bioluminiscente al aceptor
fluorescente se produce a distancias inferiores a 10 nm y es indicativa de
interacciones entre las moléculas de interés marcadas.54. La señal BRET se
determina monitoreando la proporción de emisión de luz del aceptor sobre
la emisión del donante.
Se seleccionó un rango de concentraciones de cada péptido, incluido el
IC50de FITC-melitina, con las correspondientes concentraciones molares de
FITC-DEDE-melitina. Encontramos que la señal BRET aumentó de manera
dependiente de la dosis para TAMRA-EGF y FITC-DEDE-melitina, y en menor
medida para FITC-melitina (Fig. 4b). FITC-DEDE-melitina mostró
proporciones BRET mucho más altas que FITC-melitina a las mismas
concentraciones, además de alcanzar proporciones BRET máximas en cada
dosis muy rápidamente. Un péptido no específico diseñado contra la
transcripción de Engrailed 1 (EN1)
factor55(FITC-EN1-mutante) exhibió proporciones y cinéticas BRET
similares a FITC-DEDE-melitina (Fig. 6 complementaria), lo que indica
que se requirieron más experimentos para determinar la especificidad
de las interacciones de unión con EGFR.
Para determinar la especificidad de la unión de melitina a EGFR en
el sitio de unión de EGF, realizamos ensayos BRET de saturación para
evaluar la competencia de EGF con cada uno de los péptidos que se
unen a NanoLuc-EGFR (Fig.4C). Si bien la unión de TAMRA-EGF a
NanoLuc-EGFR fue saturable y se redujo significativamente en
presencia de 1 µM EGF (ANOVA bidireccional,pag <0.0001), las señales
BRET de melitina FITC y melitina FITC-DEDE no fueron saturables y no
fueron significativamente diferentes con o sin EGF 1 µM (ANOVA de
dos vías, pag >0.999), lo que sugiere que ni la melitina ni la DEDE-
melitina se unieron en el sitio de unión de EGF.
Nuestros datos respaldan la noción de que la melitina se incorpora a la
membrana plasmática de las células cancerosas a través de una secuencia
cargada presente en el extremo C-terminal, lo que induce la remodelación y la
interrupción de la membrana plasmática. Los datos de BRET indican que la
melitina se puede colocar a una distancia de 10 nm de los RTK sin interferir con el
sitio de unión del factor de crecimiento endógeno (Fig.4d).
La melitina sensibiliza al TNBC al tratamiento con docetaxel in vivo
A continuación, probamos las sinergias potenciales entre la melitina y
los agentes quimioterapéuticos para aumentar la muerte de células de
cáncer de mama. El murino p53−La línea celular T11 de TNBC se trató
con docetaxel en combinación con veneno de abeja o melitina, y se
realizaron ensayos de viabilidad celular para determinar el índice de
combinación (IC) entre los tratamientos.56(Higo.5a). Observamos IC < 1
para todas las concentraciones probadas, lo que indica fuertes
interacciones sinérgicas (Fig.5b). También se observaron sinergismos
con cisplatino, un agente que se usa para tratar los TNBC en la clínica
(Fig. 7 complementaria). El modelo de xenoinjerto T11 se usó para
experimentos in vivo porque demostró la interacción farmacológica in
vitro más favorable entre melitina y docetaxel en múltiples líneas
celulares probadas (Figura 8 complementaria), y tiene un sistema
inmunitario intacto que permite que la respuesta inmunitaria a la
melitina ser evaluado.
Para investigar la eficacia de la combinación de melitina y docetaxel en la
reducción del crecimiento de TNBC, realizamos experimentos in vivo
trasplantando células T11 en ratones BALB/c. Este modelo de aloinjerto
recapitula la enfermedad de claudinlow TNBC altamente agresiva en
ratones con un sistema inmunitario intacto38,57,58. Tres días después de la
generación de tumores T11 (~50 mm3), los ratones fueron aleatorizados en
cuatro grupos (norte =12 ratones/grupo) y tratados intratumoralmente con
vehículo, melitina (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg) o una combinación de
melitina (5 mg/kg) y docetaxel (7 mg/kg). Los ratones fueron tratados cada
2 días desde el día 3, con 7 tratamientos en total. Encontramos que para el
tratamiento combinado, el control del tumor fue superior en comparación
con el tratamiento solo o con vehículo, particularmente en los días 7 y 9
posteriores a la inoculación de células T11, y la combinación logró una
reducción significativa en el volumen tumoral (Fig.5c, ANOVA
unidireccional, pag <0,001). Esto sugiere que los tumores resistentes a
docetaxel podrían volverse sensibles mediante la adición de melitina.
Validamos estos estudios mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI)
para no invasivamente

npj Oncología de precisión (2020) 24 Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
 C Duffy et al.
7
a120 b120

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

100 100

80 80 melitina CI50 = 1,35 ± 0,08 μM

ns
RGD1-melitina CI50 = 1,30 ± 0,07 μM
60 60 SV40-melitina CI50 = 1,63 ± 0,02 μM
SUMA159 IC50 > 10 μM DEDE-melitina CI50 > 4,5 μM
40 40
SKBR3 CI 50
> 10 μM
20 20

0 0
- 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 - 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0
log [DEDE-melitina] (μM) log [péptido] (μM)

C120 HDFa CI50 = 2,62 ± 0,04 µM 120

HDFa CI50 = 5,16 ± 0,22 μM = 1,89
SUMA159 IC 50 ± 0,02 μM***
d
= 1,49 ± 0,05 µM ***

na
SUMA159 IC

na
50

iti

iti
Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

el

el
100 100

m
o
SUMA159

na
ul

E-

1-
iti
íc

ED

D
h

el

RG
Ve

D
80 80
α-CL-csp-3 17 / 19 kDa
áspid 175
60 60

α-TUBULIN 50kDa
40 40

20 20

0 0
- 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
log [melitina] (μM) log [RGD1-melitina] (μM)

mi3.5 melitina
ns
F 1 21 26
3.0
RGD1-melitina
** melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ HGRGDLGRLKK
Absorbancia (405 nm) ± SEM

DEDE-melitina
SV40-melitina RGD1-melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
2.5 ns
control de IgG DEDE-melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIDEDEQQ
2.0 SV40-melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIKKKRKV

1.5

1.0

0.5

0.0
melitina RGD1-melitina DEDE-melitina SV40-melitina
01
10

1
1

1
0.

00
0.

log [anticuerpo] (ng/μL)

0.

gramo SUMA159
Vehículo veneno de abeja melitina RGD1-melitina DEDE-melitina

Hoechst

α-EGFR

α-MELITTINA

Unir

Zoom

realizar un seguimiento de los cambios en el crecimiento tumoral in vivo en Los efectos terapéuticos de melitina y docetaxel se validaron en tejidos
células T11 marcadas con un luciferasa-construcción contenedora (Fig.5d). Aquí tumorales el día 14 después de la inoculación de células T11 mediante
nuevamente, encontramos un control tumoral mejorado para el tratamiento inmunohistoquímica e inmunofluorescencia (Fig.5mi). El anticuerpo anti-
combinado de docetaxel y melitina en los días 10, 12 y 14 en comparación con melitina confirmó la localización intratumoral de células positivas para
todos los demás grupos. melitina tanto en la melitina (61,9 ± 0,7%) como en la

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
8
Fig. 3La ingeniería de melitina con un motivo RGD mejora la selectividad del cáncer de mama. aEnsayos de viabilidad celular de TNBC (SUM159) y células de cáncer de
mama enriquecidas con HER2 (SKBR3) tratadas con DEDE-melitina durante 24 h.bEnsayos de viabilidad celular de células T11 tratadas con melitina, RGD1-melitina, SV40-
melitina y DEDE-melitina durante 24 h (tprueba).CEnsayos de viabilidad celular de fibroblastos dérmicos humanos normales (HDFa) y SUM159 tratados con melitina
(izquierda) y RGD1-melitina (derecha) durante 24 h (tpruebas).dWestern blot para la detección de caspasa-3 escindida (CL-csp-3) en lisados de células SUM159 tratadas
con vehículo, melitina, DEDE-melitina o RGD1-melitina durante 24 h.miAbsorbancia (405 nm) de soluciones acuosas de melitina, RGD1-melitina, DEDE-melitina y SV40-
melitina sometidas a ELISA con el anticuerpo anti-melitina (ANOVA de dos vías).FLa secuencia de aminoácidos y el modelo 3D más predicho de melitina (verde), RGD1-
melitina (púrpura), DEDE-melitina (azul) y SV40-melitina (naranja). gramoImágenes de inmunofluorescencia de SUM159 tratadas con vehículo, veneno de abeja, melitina,
RGD1-melitina o DEDE-melitina durante 30 min. En azul: núcleos celulares, en rojo: anti-EGFR y en verde: anti-melitina. Los contornos blancos en las imágenes
combinadas indican las regiones respectivas en las imágenes ampliadas. Las barras de escala representan 25 µm y 6,25 µm para las imágenes ampliadas. Los datos se
representan como media ± SEM (norte =3). Las diferencias se consideraron significativas enpag <0,05 (*),pag <0,01 (**), ypag <0,001 (***). Véanse también las figuras
complementarias. 3 y 10.

grupos de tratamiento combinado (55,8 ± 1,3%), pero no en el control del
vehículo (ANOVA de una vía,pag <0,01, media ± SEM). Se encontró una
reducción significativa en la proliferación de células tumorales (evaluada
por la expresión de Ki-67) en los tumores tratados con la combinación de
melitina y docetaxel (5,7 ± 0,8 %) en relación con el vehículo (59,8 ± 1,7 %),
en comparación con melitina ( 31,7 ± 1,3 %) o docetaxel solo (21,0 ± 1,3 %,
ANOVA de una vía,pag <0,01, media ± SEM). La tinción TUNEL confirmó una
fragmentación del ADN y una inducción de apoptosis significativamente
mayores en el grupo de combinación (81,0 ± 3,1 %) en comparación con el
vehículo (1,0 ± 0,4 %, ANOVA unidireccional,pag <0,01, media ± SEM).
El ligando-1 de muerte programada de la proteína del punto de control
inmunitario (PD-L1) reduce la funcionalidad de las células T activadas. En
consecuencia, los bloqueos de puntos de control inmunitarios en combinación
con quimioterapia impiden el reconocimiento de PD-L1 de células T, lo que
previene esta resistencia inmunitaria adaptativa en TNBC y, por lo tanto,
aumenta la eficacia terapéutica sobre la quimioterapia sola.59. En contraste con
docetaxel solo (84,3 ± 0,6 %) que no afectó los niveles de PD-L1 en los tumores,
encontramos que la melitina redujo significativamente la expresión de PD-L1 en
tumores cuando se usó sola (52,9 ± 2,4 %) o con la combinación tratamiento (44,3
± 4,2 %) en comparación con el vehículo (84,9 ± 1,6 %, ANOVA de una vía,pag <
0,01, media ± SEM). En resumen, estos estudios respaldan la idea de que la
melitina sensibiliza a las células T11 al tratamiento con docetaxel y que la melitina
podría ayudar a atenuar la expresión de las proteínas del punto de control
inmunitario y, en consecuencia, mejorar las respuestas inmunitarias
antitumorales.
A continuación, realizamos inmunohistoquímica en los tumores T11
tratados para detectar p-HER2 (Tyr1248) y p-EGFR (Tyr1068) (Fig. 9
complementaria). La expresión de EGFR se redujo de forma moderada pero
significativa con la combinación de melitina y docetaxel (75,8 ± 6,4 %) en
comparación con el vehículo (100,0 ± 9,1 %, ANOVA de una vía,pag <0,05,
media ± SEM). La expresión de HER2 no fue significativamente diferente en
todos los grupos de tratamiento (ANOVA unidireccional,p =0,1536). Para p-
EGFR (Tyr1068), la fosforilación se redujo a un nivel significativamente
menor con el tratamiento de combinación de melitina y docetaxel (9,0 ± 2,4
%) en comparación con el vehículo (100,0 ± 8,1 %, ANOVA unidireccional,
pag <0,0001, media ± SEM). Los niveles de p-HER2 (Tyr1248) también se
redujeron a un nivel significativamente más bajo en el tratamiento de
combinación de melitina y docetaxel (50,3 ± 7,8 %) en comparación con el
vehículo (100,0 ± 5,6 %, ANOVA unidireccional, pag <0,0001, media ± SEM).
La disminución en la fosforilación de EGFR y HER2 in vivo después del
tratamiento con melitina es consistente con los efectos observados de la
melitina en la reducción de la fosforilación de estos RTK en células SKBR3,
SUM159 y MDA-MB-231 (Fig.4a; Figura complementaria 4).
DISCUSIÓN
La apiterapia es un campo emergente con el potencial de impactar los
aspectos económicos de la investigación del cáncer a nivel mundial,
particularmente en comunidades de escasos recursos. Sin embargo, hasta
la fecha, los estudios aún deben investigar completamente el mecanismo
de acción molecular del veneno de abeja y la melitina, y su uso óptimo
consiguiente en el campo de la oncología aún debe investigarse
exhaustivamente, en particular para el tratamiento del cáncer de mama, el
cáncer más común en mujeres en todo el mundo2. Los TNBC y los
tumores enriquecidos con HER2 son subtipos de cáncer de mama muy
agresivos. El TNBC está asociado con la mortalidad más alta y, a pesar
de la expresión frecuente de EGFR, comúnmente muestra resistencia a
las terapias anti-EGFR con alta dependencia de la señalización PI3K/Akt
para la proliferación, supervivencia y resistencia a la quimioterapia34.
Las terapias anti-HER2 han mejorado sustancialmente la supervivencia a largo
plazo en los cánceres positivos para HER2 en estadio temprano, pero la mayoría
de los pacientes en estadio tardío eventualmente desarrollan resistencia y
sucumben a la enfermedad.33,35,36. No solo demostramos la selectividad del
veneno de abeja y la melitina para las células malignas, sino que también
revelamos potencias más altas para estos tipos agresivos de cáncer de mama.
Aquí, mostramos que el veneno de abeja y la melitina suprimen la
fosforilación inducida por ligandos de EGFR y HER2, modulando
dinámicamente las vías de señalización aguas abajo en las células de cáncer
de mama. Proponemos que la melitina inhibe directa o indirectamente la
dimerización de RTK. La melitina también puede ingresar a la célula para
modular directa o indirectamente las vías de señalización posteriores.25,60.
Trabajos anteriores han demostrado que la melitina puede dirigirse a líneas
celulares que sobreexpresan HER2 utilizando inmunoliposomas que
contienen trastuzumab.61. Aquí, demostramos que la melitina sola se dirige
selectivamente a las células de cáncer de mama que sobreexpresan HER2 y
EGFR. Curiosamente, la melitina fue más potentemente tóxica para las
células de cáncer de mama en comparación con el veneno de abeja, lo que
justifica una mayor investigación.
En nuestro estudio, nos enfocamos en las líneas celulares SUM159 y
SKBR3. SUM159 es una línea celular de TNBC que expresa el producto del
gen EGFR y alberga mutaciones sin sentido en PI3KCA (H1047L) y en HRAS
(G12D)62,63. Por el contrario, SUM159 es KRAS, NRAS, BRAF, PTEN y MAP2K4
de tipo salvaje y negativo para la activación de AKT1 y la amplificación de
AKT2 y AKT363. SKBR3 es una línea celular de cáncer de mama enriquecida
con HER2 que sobreexpresa el producto del gen HER264, y es KRAS, HRAS,
NRAS, BRAF, PTEN, PI3KCA y MAP2K4 de tipo salvaje63,sesenta y cinco,66, y
también negativo para activación de AKT1, y amplificación de AKT2 y AKT363
. Teniendo en cuenta estas características moleculares, las vías de
señalización aguas abajo de EGFR no se activan constitutivamente en las
células SUM159, a pesar de las mutaciones existentes en HRAS y PI3KCA, ya
que estas no son suficientes para activar basalmente estas vías.67.
Reportamos una respuesta antitumoral potente y sinérgica con melitina
y docetaxel en un modelo TNBC altamente agresivo in vivo. Esto destaca el
potencial de la melitina para su uso en terapias combinadas para aumentar
potencialmente la eficacia y/o reducir la dosis de agentes citotóxicos, lo que
permite administrar tratamientos más rentables con potencialmente
menos efectos secundarios. La melitina también redujo los niveles de la
proteína de punto de control inmunitario PD-L1 involucrada en la evasión
inmunitaria. Por lo tanto, la melitina podría disminuir los efectos
inmunosupresores del microambiente tumoral, que prevalecen en los TNBC
en presencia de quimioterapia. Esto se suma a los datos de informes
anteriores que muestran que la melitina también puede reducir la
población de macrófagos asociados a tumores similares a M2 que
promueven tumores en el microambiente tumoral en un modelo de
carcinoma de pulmón.68. Presumimos que en nuestro modelo T11 in vivo,

npj Oncología de precisión (2020) 24 Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
 C Duffy et al.
9
a SKBR3 abeja SUMA159 abeja

FE ulo

FE ulo
veneno melitina

AG

AG
veneno melitina

íc

c
h

hí
Ve

Ve
minutos de tratamiento 2,5 5 10 15 20 2,5 5 10 15 20 minutos de tratamiento 2,5 5 10 15 20 2,5 5 10 15 20
α-p-HER2 Tyr 1248 185kDa
α-p-EGFR Tyr 1068 175kDa
α-HER2 total 185kDa
α-EGFR total 175kDa
α-p-EGFR Tyr 1068 175kDa
α-p-p44/42 MAPK (Erk1/2)
α-EGFR total 175kDa Thr 202 / Tyr 204 44, 42kDa

α-p-p44/42 MAPK (Erk1/2) α-p-AKT Ser 473

44, 42kDa 60kDa
Thr 202 / Tyr 204

α-p-AKT Ser 473 60kDa α-p-AKT Thr 308 60kDa

α-p-AKT Thr 308 60kDa

α-AKT total 60kDa
α-AKT total 60kDa
2,85 kDa
α-Melitina total
α-Melitina total 2,85 kDa

α-TUBULIN 50kDa
α-TUBULIN 50kDa

b 0.28 TAMRA-EGF
10 nm
0.6 FITC-melitina
15 METRO
2.0 FITC-DEDE-melitina
15 METRO

5 nm 6 METRO
6 METRO

Relación BRET sin procesar ± SEM

Relación BRET sin procesar ± SEM
Relación BRET sin procesar ± SEM

0.26 2,5 nm 3,61 millones 1.5 3,61 millones

CINÉTICA

1 nm 0.4 2,75 M 2,75 M

0 nm 0 minutos
0 minutos

0.24 1.0

0.2
0.22 0.5

0.20 0.0 0.0

0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60
Tiempo después de la adición de furimazina (min) Tiempo después de la adición de furimazina (min) Tiempo después de la adición de furimazina (min)

C 0.03
[TAMRA-EGF]
[TAMRA-EGF] + EGF (1 μM) 3
[FITC-melitina]
[FITC-melitina] + EGF (1 μM) 8
[FITC-DEDE-melitina]
[FITC-DEDE-melitina] + EGF (1 μM)
***
ns ns
Relación BRET sin procesar ± SEM

Relación BRET sin procesar ± SEM

Relación BRET sin procesar ± SEM

6
SATURACIÓN

0.02 2

0.01 1
2

0.00 0 0
0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
[TAMRA-EGF] nM [FITC-melitina] μM [FITC-DEDE-melitina] μM

d señal BRET señal BRET

Leyenda
Nluc Nluc Membrana de plasma

NanoLuc (Nluc)
formación de poros

Receptor Tirosina Quinasa

BRET inducido por ligando

receptor reducido
PDK1
PI3K PAG
PAG dimerización citosol EGF sin etiquetar

PAG Th r202 melitina

S241 T308 ras PAG FITC

PAG Rafa MEK ERK1/2

PAG PAG
akt
S473 Tyr204

La señalización de EGFR y HER2 puede modular la expresión de PD-L1 en las Se demostró que la proteína ALIX se correlaciona con la activación de EGFR, lo
células tumorales. Según estudios inmunohistoquímicos previos, PD-L1 tiene la que afecta la biogénesis del exosoma.73. PD-L1 se secreta a través de exosomas
expresión más alta en tumores TNBC, seguido de tumores enriquecidos con de una manera dependiente de ALIX, de modo que el deterioro de exosomas
HER269–72, y la expresión de PD-L1 se asocia con una supervivencia deficiente69. aumenta PD-L1 en la membrana celular. La regulación negativa de ALIX
En los cánceres de mama de tipo basal, la ausencia de promueve la supervivencia del tumor a través de la mejora de EGFR

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
10
Figura 4El veneno de abeja y la melitina suprimen la fosforilación de EGFR y HER2. aCinética de fosforilación de las vías HER2, EGFR y MAPK y Akt después del
tratamiento con veneno de abeja y melitina en células de cáncer de mama SKBR3 (izquierda) y SUM159 (derecha), evaluadas mediante inmunotransferencia.
bAnálisis cinético de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) de la interacción de TAMRA-EGF, FITC-melitina y FITC-DEDE-melitina
con NanoLuc-EGFR en células HEK293FT. Los péptidos se añadieron después de que las células se equilibraran en el lector con el sustrato furimazine de
NanoLuc durante 5 min.CAnálisis de unión a saturación de concentraciones crecientes de TAMRA-EGF, FITC-melitina y FITC-DEDE-melitina en células
HEK293FT transfectadas con NanoLuc-EGFR en presencia o ausencia de EGF no marcado (1 µM). Los datos se expresan como índices BRET sin procesar y se
representan como media ± SEM (norte =3, ANOVA de dos vías).dPropuesta de modelo de acción de la melitina interfiriendo con la dimerización y
fosforilación de RTKs en la membrana plasmática. Las diferencias se consideraron significativas enpag <0,05 (*),pag <0,01 (**), y pag <0,001 (***). Véanse
también las figuras complementarias. 4–6 y 11–15.
activación, y a través de la acumulación de membrana PD-L1, lo que lleva a
la inmunosupresión73. En el cáncer de mama enriquecido con HER2, la
diafonía entre HER2 y PD-L1 es poco conocida74. Sin embargo, en células de
cáncer de mama positivas para HER2 cocultivadas con células
mononucleares de sangre periférica humana y en un modelo de ratón, la
terapia anti-HER2 con trastuzumab resultó en una regulación positiva de
PD-L1.75,76. Por lo tanto, la incorporación de melitina con trastuzumab
podría anular esta respuesta inmunosupresora.
La selectividad de la melitina para los tumores impulsados por HER2 también
justifica la combinación con agentes dirigidos contra HER2, incluidos anticuerpos
monoclonales, trastuzumab-emtansina y otros conjugados de anticuerpos y
fármacos en los que las propiedades de ruptura de la membrana de la melitina
podrían mejorar la cinética de internalización de la carga útil citotóxica. Nuestro
trabajo también revela nuevas oportunidades para modificar regiones específicas
de melitina para aumentar aún más la eficacia y la especificidad específica para
las células malignas. Los péptidos dirigidos diseñados, como RGD1-melitina,
podrían administrarse por vía intravenosa para permitir una búsqueda y
absorción más selectivas en las células tumorales. La melitina también podría
administrarse a través de enfoques de nanopartículas específicas, como los
informados anteriormente con "nanobees"77,78. También podría explotarse la
vinculación de melitina con toxinas o profármacos, como se informó con fusiones
de melitina escindibles con uPA79. Se requerirán estudios futuros para evaluar
formalmente las toxicidades y las dosis máximas toleradas de estos péptidos
antes de los ensayos en humanos.
El veneno de abeja está disponible en todo el mundo y ofrece opciones
de tratamiento rentables y de fácil acceso en regiones remotas o menos
desarrolladas. Se requerirá más investigación para evaluar si el veneno de
algunos genotipos de abejas tiene actividades anticancerígenas más
potentes o específicas, que luego podrían explotarse. Más allá del cáncer de
mama, los tumores que sobreexpresan EGFR incluyen cáncer de pulmón,
glioblastoma y colorrectal80, y los tumores que pueden sobreexpresar HER2
incluyen cáncer gástrico, de ovario, de endometrio, de vejiga, de pulmón,
de colon y de cabeza y cuello81. En general, nuestros resultados podrían
aprovecharse para ayudar al desarrollo de nuevas modalidades
terapéuticas para muchos tipos de cáncer asociados con resistencia
frecuente a los medicamentos y mal pronóstico.
MÉTODOS
Reactivos químicos y anticuerpos
Todos los péptidos se adquirieron de China Peptides Corporation, Ltd. Se
conjugó una etiqueta fluorescente de isotiocianato de fluoresceína (FITC)
con el extremo N de FITC-melitina, SV40-melitina, TAT-melitina y mutante
EN1. CellTiter-Glo 2.0 del ensayo de viabilidad celular luminiscente,
NanoLuc-EGFR, FuGENE y furimazine se obtuvieron de Promega. TAMRA-
EGF se obtuvo de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific). El docetaxel (Cat.
No. D-1000) se obtuvo de LC Laboratories. El anticuerpo monoclonal para α-
Tubulin (1:5000, Cat. No. T5168), Hoechst (1:5000, Cat. No. 94403) y EGF
humano (Cat. No. E9644) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Mouse EGF (Cat.
No. 315-09) se obtuvo de Peprotech. Anticuerpos contra fosfo-HER2
(Tyr1248) (inmunotransferencia: 1:1000, inmunohistoquímica: 1:100, n.° de
cat. 2247), fosfo-EGFR (Tyr1068) (inmunotransferencia: 1:1000, n.° de cat. nº
2234; inmunohistoquímica: 1:350, cat. 3777, clon D7A5), fosfo-p44/42 MAPK
(Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (1:2000, Cat. No. 4370), fosfo-Akt (Ser473) (1:2000,
Cat. No. 4060), fosfo-Akt (Thr308) (1:1000, Cat. No. 13038), fosfo-SAPK/JNK
(Thr183/Tyr185) (1:1000, Cat. No. 4668), fosfo-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182)
(1:1000, Cat. No. 4511),
npj Oncología de precisión (2020) 24
AKT total (1:1000, Cat. No. 9272 y 4685), Caspasa-3 escindida (Asp175) (1:1000, Cat. No. 9661), Ki-67 (1:400, Cat. No. 9449), el Jak/Stat
Pathway Inhibitors Antibody Sampler Kit (1:1000, Cat. No. 8343), y el anticuerpo secundario anti-ratón IgG, ligado a HRP (1:10,000,
Cat. No. 7076) y anti-rabbit IgG, HRP El anticuerpo enlazado (1:10.000, Cat. No. 7074) fue fabricado por Cell Signaling Technology.
Anticuerpos monoclonales contra ErbB2 (inmunotransferencia: 1:1000, inmunohistoquímica: 1:100, Cat. No. ab8054, clon CB11),
EGFR (inmunotransferencia: 1:5000, inmunohistoquímica: 1:100, Cat. No. ab52894, clon EP38Y) , y PD-L1 [PD-L1/2746] (1:100, Cat.
No. ab238697) fueron fabricados por Abcam. El anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (1:500, Cat. No. A11001) y el anti-conejo de cabra
Alexa Fluor 594 (1:500, Cat. No. A11012) los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. El anticuerpo
secundario específico de cadena γ de IgG anti-ratón de cabra policlonal (ELISA: 1:1000, Cat. No. AP503P) se obtuvo de Millipore. Se
produjeron el anticuerpo IgG monoclonal de ratón específico para IL-12 humana (28/00 8C1-6) utilizado como anticuerpo de control
para los experimentos de ELISA, y el anticuerpo IgG monoclonal de ratón específico para melitina (ELISA: 1:350, clon 3B9). en la
Instalación de Anticuerpos Monoclonales en el Instituto Harry Perkins de Investigación Médica. El ensayo TUNEL (kit de detección de
muerte celular in situ) se obtuvo de Roche. Se produjeron el anticuerpo IgG monoclonal de ratón específico para IL-12 humana
(28/00 8C1-6) utilizado como anticuerpo de control para los experimentos de ELISA, y el anticuerpo IgG monoclonal de ratón
específico para melitina (ELISA: 1:350, clon 3B9). en la Instalación de Anticuerpos Monoclonales en el Instituto Harry Perkins de
Investigación Médica. El ensayo TUNEL (kit de detección de muerte celular in situ) se obtuvo de Roche. Se produjeron el anticuerpo
IgG monoclonal de ratón específico para IL-12 humana (28/00 8C1-6) utilizado como anticuerpo de control para los experimentos de
ELISA, y el anticuerpo IgG monoclonal de ratón específico para melitina (ELISA: 1:350, clon 3B9). en la Instalación de Anticuerpos
Monoclonales en el Instituto Harry Perkins de Investigación Médica. El ensayo TUNEL (kit de detección de muerte celular in situ) se
obtuvo de Roche.
colección de veneno de abeja
El veneno se recolectó utilizando obreras o reinas de varias poblaciones diferentes de
abejas Apid. Muestras de veneno recolectadas de abejas europeas (Apis mellifera)y
abejorros de cola de ante (Bombus terrestris audax)se originó en Perth (Australia),
Dublín (Irlanda) y Londres (Inglaterra). Se recolectó veneno de abeja de 30 trabajadores
de cada una de las tres colonias diferentes de un colmenar o granja como se describe. El
veneno de abeja de Australia se recolectó de un colmenar mantenido por el Centro para
la Investigación Integrativa de Abejas (CIBER), ubicado en la Universidad de Australia
Occidental (UWA: −31.980151, 115.817919). Se recolectó veneno de abeja de Irlanda de
una colonia en un colmenar en Trinity College Dublin (53.343933, −6.254635), y las otras
dos colonias de granjas cerca de Glasnevin (53.383245, −6.276333) y Blanchardstown
(53.384220,
− 6.375979). El veneno de abeja y abejorro de Inglaterra se recolectó en la Universidad
Royal Holloway de Londres (51,425626, −0,562987). El veneno de abejorro se recolectó
de 20 trabajadores de cada una de las 2 colonias compradas comercialmente, y los
abejorros de una sola reina de cada una de estas dos colonias se usaron para la
recolección del veneno de abejorro reina. Se prepararon mezclas maestras biológicas
independientes manteniendo separado el veneno de diferentes colonias, con el veneno
de 312 abejas recolectadas en total.
El veneno glandular se recogió mediante disección manual. Las abejas fueron
capturadas cerca de la entrada de la colmena para las abejas melíferas, o directamente
de la colonia para los abejorros, y anestesiadas con dióxido de carbono y enfriadas en
hielo. El aparato de picadura se diseccionó de cada individuo; luego se extrajo la
glándula venenosa y se colocó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las
glándulas se perforaron con una aguja Terumo (25 G × 5/8) y se centrifugaron (13.000
gramo,10 min, 4 °C), y se recogió el sobrenadante, que contenía veneno en suspensión
líquida. La concentración de proteínas de cada mezcla maestra se cuantificó con un
ensayo de proteínas compatibles con detergentes (Bio-Rad), midiendo la absorbancia a
750 nm con un Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (software Gen 5 1.11, versión
1.11.5). Luego, cada mezcla maestra se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C.
Líneas celulares y condiciones de cultivo.
Todas las líneas celulares se compraron de la American Type Culture Collection
(Manassas, VA, EE. UU.), excepto las células HEK293FT que se compraron de
Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 y SUM159 que
se obtuvieron de Asterand Bioscience (Detroit, MI, EE. UU.), y células T11 y B.15
que fueron amablemente proporcionadas por Charles Perou y Lyuba Varticovski
de la Universidad de Carolina del Norte en
Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
 C Duffy et al.
11
a Veneno de abeja + docetaxel Melitina + docetaxel b 1.5
Veneno de abeja + docetaxel

Índice de combinación
120 120
1.0

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM

Viabilidad celular relativa (%) ± SEM
100 100
0.5
80 80
0.0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
60 60 Fracción afectada

40 40 Melitina + docetaxel
1.5

Índice de combinación
melitina
20 Veneno de abeja
docetaxel 20 docetaxel 1.0
Combinación Combinación
0 0 0.5
0 4 5 6 7 (Veneno de abeja) 0 2 3 4 5 (Melitina)
0 10 50 250 500 (Docetaxel) 0 10 50 250 500 (Docetaxel) 0.0
Dosis de veneno de abeja (ng/μL) o docetaxel (nM) Dosis de melitina (ng/μL) o docetaxel (nM) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Fracción afectada

C 1000 ns
600 8 8 ** 8 **
** **
Volumen tumoral (mm3) ± SEM

Cambio relativo volumen tumoral

Cambio relativo volumen tumoral

** *

Cambio relativo volumen tumoral

800
6 6 6
400
600
4 4 4
400
200
200 2 2 2

0 0 0 0 0
0 3 5 7 9 11 13 13 15 17 Día 3 después de la inoculación Día 7 después de la inoculación Día 9 después de la inoculación
de células T11 de células T11 de células T11
Días post-inoculación de células T11 Vehículo melitina docetaxel Melitina + Docetaxel

d Vehículo melitina docetaxel Melitina + Docetaxel

4 10 12 14 4 10 12 14 4 10 12 14 4 10 12 14
Días post-inoculación de células T11 Días post-inoculación de células T11 Días post-inoculación de células T11 Días post-inoculación de células T11

mi Tumores T11 - Día 14

Vehículo melitina docetaxel Melitina + Docetaxel

α-MELITTINA 80
** 80 **
**
% de células positivas para melitina ± SEM

** **
% Ki-67 células positivas ± SEM

60
**
60

40 40
α-Ki-67

20 20

0 0

TUNEL
100 ** 100 **
** ** **
% de células positivas para PD-L1 ± SEM
% de células positivas TUNEL ± SEM

80 ** 80

60 60
Hoechst

40 40

20 20

0 0
α-PD-L1

Vehículo
melitina
docetaxel
Melitina + Docetaxel
ÉL

Chapel Hill y los Institutos Nacionales de Salud, respectivamente. T11 y B.15 son (FBS). MCF 10A y MCF-12A (células epiteliales inmortalizadas mamarias humanas, no
líneas celulares muy bien caracterizadas37,38. transformadas) se mantuvieron en DMEM/F-12 con suplementos (5 % de suero fetal de
Las células se incubaron a 37 ° C y 5% CO2y suplementado con antibiótico- caballo, 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 10 μg/μl de insulina, 100 ng/ml
antimicótico al 1%. Se cultivaron células HDFa (fibroblastos dérmicos humanos de toxina del cólera y 500 ng/mL de hidrocortisona). Las células NIH/3T3 (fibroblastos
adultos primarios normales) en DMEM con suero bovino fetal al 10 %. embrionarios murinos) se mantuvieron en DMEM con FBS al 10%.

Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
12
Figura 5La melitina sensibiliza los tumores TNBC muy agresivos al tratamiento con docetaxel in vivo. aEnsayos de viabilidad celular de células T11 tratadas con veneno
de abeja y melitina solas y en combinación con docetaxel durante 24 h. Se presentan parcelas representativas de los tratamientos combinados (norte =3).bGráficos de
índices de combinación obtenidos para diferentes fracciones de células afectadas en cada combinación, calculados mediante el software CompuSyn.CVolúmenes
tumorales de ratones tratados intratumoralmente con vehículo, 5 mg/kg de melitina, 7 mg/kg de docetaxel y 5 mg/kg de melitina
+ 7 mg/kg de docetaxel. Las flechas indican los días de tratamiento. Se indican los gráficos de dispersión correspondientes del cambio relativo en los volúmenes
tumorales en los días 3, 7 y 9 (ANOVA unidireccional,norte =12).dImágenes representativas de bioluminiscencia (BLI) de tumores T11-luciferasa en ratones en los días 4,
10, 12 y 14 después de la inoculación de las células.miImágenes representativas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en biopsias tumorales de ratones
extraídas el día 14 después de la inoculación de T11 teñidas con anti-melitina, anti-Ki-67, ensayo TUNEL, Hoechst, anti-PD-L1 y H&E (ANOVA unidireccional, norte =8). Las
barras de escala representan 100 µm. Los datos se representan como media ± SEM. Las diferencias se consideraron significativas enpag <0,05 (*),pag <0,01 (**), ypag <
0,001 (***). Véanse también las figuras complementarias. 7–9.

HEK293FT (células 293 de riñón embrionario humano que expresan de forma estable el
antígeno T grande de SV40) se cultivó en DMEM con FBS al 10 % y suplementos
(glutamina al 1 % y 0,4 mg/ml de G418 Geneticina, Gibco). MCF7 (cáncer de mama
humano luminal A) se mantuvo en MEM α con 10% de FBS y suplementos (1% de cada
uno de piruvato de sodio, bicarbonato de sodio y aminoácidos no esenciales). T-47D y
ZR-75-1 (ambos cáncer de mama luminal A humano) se cultivaron en RPMI con FBS al
10%. MDA-MB-231 (cáncer de mama humano con bajo nivel de claudina) se cultivó en
DMEM con FBS al 10%. SUM149 (cáncer de mama de tipo basal humano) se cultivó en
F-12 con FBS al 10%. SUM159 (cáncer de mama humano con bajo nivel de claudina) se
cultivó en F-12 con FBS al 5 % y suplementos (5 μg/ml de insulina y 1 μg/ml de
hidrocortisona). MDA-MB-453 (cáncer de mama enriquecido con HER2 humano) se
cultivó en DMEM con FBS al 10%. SKBR3 (cáncer de mama enriquecido con HER2
humano) se cultivó en RPMI con FBS al 10 % y piruvato de sodio al 1 %. p53−T11 (cáncer
de mama murino con bajo nivel de claudina) se mantuvo en medio RPMI 1640 con FBS al
10%. BRCA−
B.15 (cáncer de mama de tipo basal murino) se mantuvo en medio RPMI
1640 con FBS al 10%.
Ensayos de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente
según el protocolo del proveedor. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96
pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2durante 24 h. Para los ensayos de dosis-
respuesta, los medios se desecharon y se reemplazaron con medios que contenían las
concentraciones indicadas de veneno de abeja o péptido y se cultivaron durante 24 h.
Para la viabilidad celular durante 60 min, las células se trataron con IC50de veneno de
abeja o melitina para cada línea celular durante intervalos de tiempo cortos durante 1 h,
y la viabilidad determinada inmediatamente después del tratamiento. Para determinar
la viabilidad, las células se incubaron con reactivo CellTiter-Glo (CTG) 2.0 durante 10 min.
La viabilidad celular se cuantificó midiendo la luminiscencia usando un EnVision 2102
Multilabel Reader (PerkinElmer). Los experimentos se realizaron en réplicas biológicas (
norte =3).
se retiraron y las placas se lavaron tres veces en Tween-20 al 0,05% en PBS. El
anticuerpo secundario específico de cadena γ de IgG anti-ratón de cabra
policlonal se añadió a los pocillos (1:1000 en diluyente) y se incubó durante 1 hora
a temperatura ambiente. Se eliminaron los anticuerpos primarios y las placas se
lavaron tres veces en Tween-20 al 0,05 % en PBS. Tampón de desarrollo ELISA,
una solución de agua purificada que contiene 10 % de ácido cítrico (pH 4,2), 2 %
de ABTS y 0,1 % de H2O2, se añadió a los pocillos y las placas se incubaron en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. La absorbancia se registró a
405 nm utilizando el lector de placas VICTOR Light con el software Wallac 1420
Manager (PerkinElmer). El control fue el anticuerpo IgG monoclonal de ratón
(28/00 8C1-6) que reacciona con la IL-12 humana, aplicado al péptido de melitina
en la placa ELISA. Los experimentos se realizaron en réplicas biológicas (norte =
3).
Experimentos de competencia de anticuerpos anti-melitina
Las células HDFa y SUM159 se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos y se
incubaron a 37 °C y 5 % de CO2durante 24 h. Se incubaron concentraciones crecientes
del anticuerpo anti-melitina con el IC50concentraciones de veneno de abeja o melitina
para cada línea celular durante 1 h a temperatura ambiente, y luego se agregaron a las
células durante 24 h. La viabilidad celular se determinó como se describe en "Ensayos de
viabilidad celular". Los experimentos se realizaron en réplicas biológicas (norte =3).
mancha occidental
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 300 000 células/pocillo y se incubaron a 37 °C y 5
% de CO2durante 24 h. Los experimentos de cultivo celular se realizaron como se describe, y luego se siguió el
protocolo de transferencia Western estándar como se describe en este documento. Las células se lavaron con PBS
frío y se lisaron con tampón de lisis de proteínas frío (dodecilsulfato sódico al 2% (SDS), Tris-HCl 125 mmol/l, pH 6,8).
Las muestras se sonicaron durante 10 s a 10 mA y las concentraciones de proteínas se cuantificaron con el ensayo de
proteínas compatibles con detergentes (Bio-Rad). Se mezclaron cantidades iguales de proteínas con tampón de carga
(Laemmli Sample Buffer, Bio-Rad) complementado con el agente reductor ditiotreitol (DTT). Las muestras de proteína

se desnaturalizaron hirviéndolas a 95 °C durante 5 min, se cargaron en geles prefabricados Mini-PROTEAN (Bio-Rad) y

Producción de un anticuerpo monoclonal primario contra la melitina se sometieron a electroforesis a 100 V, y luego se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad) con Trans-Blot. Turbo

La producción de anticuerpos se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados Transfer System (Bio-Rad) durante 7 min. Las membranas se incubaron con TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150

por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación Médica Harry Perkins. mM y Tween-20 al 0,1 %) con leche desnatada al 5 % para bloquear la unión no específica. Las membranas se

Se inmunizaron ratones hembra A/J con veneno de abeja recolectado en incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios diluidos en BSA al 3 % y azida de sodio al 0,02 %. La

Australia. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 12 μg de señal se detectó con el sustrato HRP occidental Luminata Crescendo (Millipore) con el sistema de imágenes ChemiDoc

veneno en adyuvante completo de Freund (Difco), seguido de un refuerzo con MP (Bio-Rad) que ejecuta el software Image Lab (Bio-Rad, versión 6). Las transferencias Western se derivaron del

adyuvante incompleto de Freund el día 29 y un refuerzo acuoso con PBS a 7 μg/ mismo experimento y se procesaron en paralelo. Los escaneos sin recortar de las transferencias Western se

ratón el día 49. Se extrajo sangre de los ratones el día 60, y los sueros se proporcionan en las Figs. complementarias. 10–15. La señal se detectó con el sustrato HRP occidental Luminata

ensayaron por ELISA. El mejor respondedor recibió refuerzo con 7 μg de veneno Crescendo (Millipore) con el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad) que ejecuta el software Image Lab (Bio-

de abeja en PBS 4 días antes de la fusión. Las células de bazo se fusionaron con Rad, versión 6). Las transferencias Western se derivaron del mismo experimento y se procesaron en paralelo. Los

células de mieloma Sp2/O de acuerdo con los procedimientos estándar.82. Los escaneos sin recortar de las transferencias Western se proporcionan en las Figs. complementarias. 10–15. La señal se

sobrenadantes que contenían anticuerpos se examinaron mediante ELISA. Se detectó con el sustrato HRP occidental Luminata Crescendo (Millipore) con el sistema de imágenes ChemiDoc MP

seleccionó el clon de hibridoma 3B9 para estudios adicionales. El anticuerpo se (Bio-Rad) que ejecuta el software Image Lab (Bio-Rad, versión 6). Las transferencias Western se derivaron del mismo

produjo cultivando las células de hibridoma en biorreactores en Hybridoma experimento y se procesaron en paralelo. Los escaneos sin recortar de las transferencias Western se proporcionan en

Serum Free Medium (Gibco). El anticuerpo se purificó por cromatografía de las Figs. complementarias. 10–15.

proteína G-Sepharose. El anticuerpo purificado se dializó en PBS (pH 7,3). En lo

sucesivo, el anticuerpo se denominó anticuerpo anti-melitina (3B9).
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Los venenos y los péptidos se sembraron en placas de 96 pocillos basadas en
curvas claras a 5 μg/mL en tampón de carbonato y se incubaron a 4 °C durante
24 h. Se eliminó el líquido y las placas se lavaron tres veces en una solución de
TWEEN-20 al 0,05 % ("Tween-20", Sigma-Aldrich) en PBS. Los anticuerpos
primarios se agregaron a los pocillos con diluciones 1:2 a partir de 10 μg/mL en
diluyente (albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % en PBS), y se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios
Citometría de flujo
La apoptosis y la necrosis se evaluaron utilizando el kit I de detección de apoptosis de
Anexina V-FITC (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células
SUM159 se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 h. Luego se descartó
el medio y se reemplazó con medio que contenía veneno de abeja o melitina (IC50
concentraciones) y cultivadas durante 60 min. Las células se recogieron con tripsina y
medios y se centrifugaron (1000gramo,5 min, 24 °C), lavado con PBS frío, centrifugado
(1000gramo,5 min, 24 °C) y se resuspendió en tampón de unión 1X. Las células se
prepararon a una concentración de 1 millón de células/mL en tampón de unión 1X. Las
muestras se incubaron con FITC y PI (5 µL de cada uno) en la oscuridad durante 15 min.
La presencia de células vivas, muertas, apoptóticas o necróticas.

npj Oncología de precisión (2020) 24 Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota

se evaluó con el citómetro BD Accuri C6 (BD Biosciences, San José, EE. UU.) con el
software BD Accuri C6 y se analizó con FlowJo™(Ashland, EE. UU., versión de
Windows 7). Los experimentos se realizaron en réplicas biológicas (norte =3). Las
estrategias de activación se presentan en la figura complementaria 16.
Microscopía de células vivas
Las células SKBR3 se sembraron en una placa de micropocillos con fondo de
vidrio (10 × 35 mm, MatTek) y se incubaron durante 24 h. La placa de
micropocillos se dejó equilibrar en una cámara de incubación de microscopio
confocal NIKON Eclipse Ti (37 °C y 5 % de CO2) durante 20 min. Se utilizó el
objetivo de 20x con alineación de Kohler y se tomaron imágenes cada minuto
desde 10 min antes hasta 1 h después del tratamiento con el IC50de veneno de
abeja recolectado en Australia. Los autores reconocen las instalaciones y la
asistencia científica y técnica que ofrece el Centro Nacional de Imágenes, una
capacidad de la Estrategia de Infraestructura de Investigación Colaborativa
Nacional (NCRIS), así como el Centro de Investigación de Microscopía y
Microanálisis de Australia, ambos en el Centro de Microscopía, Caracterización y
Análisis ( CMCA), UWA, una instalación financiada por los gobiernos de la
Universidad, el Estado y el Commonwealth.
Microscopía electrónica de barrido
Los cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro, Menzel, Thermo Fisher Scientific) se
recubrieron con poli-Lbromhidrato de lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y luego se
lavó dos veces con agua purificada. Las células SUM159 se sembraron en portaobjetos
de vidrio a una densidad de 62 500 células/pocillo y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2
durante 24 h. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se trataron con vehículo
o IC50concentraciones de veneno de abeja y melitina durante 1 h. Las células se lavaron
dos veces con PBS, luego se fijaron con formaldehído al 4 % en PBS durante 25 min y
luego se lavaron nuevamente tres veces con PBS. En preparación para la microscopía,
las muestras se sumergieron en glutaraldehído al 2,5 % y se incubaron a 4 °C durante 2
h. Las muestras se lavaron con agua desionizada y se sumergieron en concentraciones
crecientes de etanol (50 %, 70 %, 95 %, 100 % y luego 100 % de etanol absoluto “seco”).
Entre cada inmersión, las muestras se deshidrataron en un microondas especializado
(PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System). El proceso de deshidratación se
completó con un aparato de secado de punto crítico E3000 para reemplazar el etanol en
la muestra con CO supercrítico2. Los cubreobjetos procesados se montaron en
soportes SEM (ProSciTech) con lengüetas de carbono. Las muestras se recubrieron con
platino de 3 nm para hacerlas conductoras electrónicamente antes de visualizarlas bajo
el microscopio electrónico de barrido (Zeiss 1555 VP-FESEM) en CMCA, UWA. Las
imágenes se tomaron con el detector en la lente a una distancia de trabajo de 2,6 mm,
una apertura de 30 μm y un voltaje de aceleración de 5 kV. Las imágenes fueron
analizadas con el software de análisis de imágenes FIJI (ImageJ)83.
inmunofluorescencia
Se colocaron cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro, Menzel, Thermo Fisher Scientific) en placas de
24 pocillos y se cubrieron con poliamida.L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y luego se lavó dos veces
con agua purificada. Las células SUM159 se sembraron en portaobjetos de vidrio y se incubaron a 37 °C y
5 % de CO2durante 24 h. Las células se trataron durante 30 min con vehículo o el IC50de veneno de abeja,
melitina, RGD1-melitina y la concentración molar equivalente como melitina para DEDE-melitina. Las
células se lavaron dos veces con PBS, luego se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS durante 25 min
y luego se lavaron nuevamente tres veces con PBS. La unión de anticuerpos no específicos se bloqueó
utilizando suero de cabra normal al 5 % (Thermo Fisher Scientific) en PBS durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se añadieron anticuerpos primarios a las células, incluido el anticuerpo monoclonal
antimelitina (5 μg/mL) y 1:500 de anti-EGFR [EP38Y] (Abcam). Las muestras se incubaron con balanceo
suave a 4 °C durante la noche. Las células se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con 1:500 de
anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488, 1:500 de anticuerpo secundario anti-conejo de
cabra Alexa Fluor 594 y Hoechst (1:5000) en PBS. a temperatura ambiente durante 1 h. Las muestras se
lavaron tres veces con PBS y se montaron en cubreobjetos de vidrio con montura antidecoloración de
diamante SlowFade (Thermo Fisher Scientific). Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando el
microscopio invertido Nikon Ti-E de fluorescencia confocal. Las imágenes se tomaron con un objetivo de
aire de 20x (NA 0,75) y excitación secuencial con longitudes de onda de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm
(anticuerpo secundario Alexa Fluor 488) y 561 nm (anticuerpo secundario Alexa Fluor 594). Las imágenes
se recopilaron con el software NIS-C Elements y se procesaron con FIJI (ImageJ) en CMCA y excitación
secuencial utilizando longitudes de onda de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (anticuerpo secundario
Alexa Fluor 488) y 561 nm (anticuerpo secundario Alexa Fluor 594). Las imágenes se recopilaron con el
software NIS-C Elements y se procesaron con FIJI (ImageJ) en CMCA y excitación secuencial utilizando
longitudes de onda de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (anticuerpo secundario Alexa Fluor 488) y 561 nm
(anticuerpo secundario Alexa Fluor 594). Las imágenes se recopilaron con el software NIS-C Elements y se
procesaron con FIJI (ImageJ) en CMCA83.
Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
C Duffy et al.
13
Transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET)
Las interacciones receptor-ligando se evaluaron con BRET, utilizando un método similar
al descrito anteriormente84,85. BRET implica la transferencia de energía no radiativa
(dipolo-dipolo) entre dos proteínas o moléculas de interés marcadas con una luciferasa
donante o un fluoróforo aceptor después de la oxidación del sustrato por la luciferasa y
la posterior emisión de luz.54. Las etiquetas FITC se conjugaron con el extremo N de
melitina (FITCmelitina) y DEDE-melitina (FITC-DEDE-melitina). Las células HEK293 que
expresan de forma estable el antígeno T grande de SV40 (HEK293FT) se sembraron en
placas de 6 pocillos a una densidad de 550.000 células/pocillo durante 24 h. Las células
HEK293FT se transfectaron con plásmidos que contenían ADNc para NanoLuc-EGFR
utilizando FuGENE. Brevemente, el ADNc del plásmido se incubó durante 10 min a
temperatura ambiente con una mezcla de reactivo de transfección y DMEM sin suero en
una proporción de 10 ng/μL NanoLuc-EGFR: 4 μL de FuGENE: 100 μL de SFM. La mezcla
se añadió a las células HEK293FT a una concentración final de 10 ng/μl de NanoLuc-
EGFR por pocillo de la placa de 6 pocillos y las células se incubaron durante 24 h. Las
células se lavaron con PBS y se separaron con tripsina, luego se recogieron en medios
que contenían suero de ternera fetal al 5 % en DMEM sin rojo de fenol. Las células se
sembraron a 50,L-placas blancas de 96 pocillos recubiertas con lisina e incubadas
durante 24 h. Tanto para los ensayos BRET cinéticos como de saturación, se usaron dos
filtros para medir simultáneamente la luminiscencia de longitud de onda corta y larga
correspondiente a las longitudes de onda de emisión de las moléculas donadoras y
aceptoras, respectivamente.
Para los experimentos de cinética de asociación de ligandos en tiempo real, se
extrajo el medio de las células, que luego se incubaron con 50 μl/pocillo del
sustrato de NanoLuc furimazine hasta una concentración final de 10 μM diluida
en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). A continuación, las células se
equilibraron en el lector de placas CLARIOstar (BMG Labtech, Australia) durante 5
minutos para registrar las lecturas basales. Luego se agregaron los ligandos
(TAMRA-EGF, FITC-melitina y FITC-DEDEmelitina) a un rango de concentraciones
finales correctas, y se tomaron registros NanoBRET cada 90 s durante 60 min a 37
°C. Para los experimentos de saturación, se eliminó el medio de las células y se
agregó un rango de concentraciones de TAMRA-EGF, FITC-melitina y FITC-
DEDEmelitina en presencia o ausencia de una concentración competidora (1 µM)
de EGF no marcado y se incubaron. a 37 °C durante 60 min en la oscuridad. Se
añadió furimazine a una concentración final de 10 μM. Las grabaciones se
realizaron con LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australia). Los datos se presentan
como la "proporción BRET sin procesar", derivada de la proporción de la emisión
de longitud de onda larga (aceptor) sobre la emisión de longitud de onda corta
(donante). Los experimentos se realizaron en réplicas biológicas (norte =3).
Análisis de efectos combinados de drogas
Se combinó veneno de abeja o melitina con docetaxel y se administró a las
concentraciones indicadas en una proporción no constante en células T11
durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó usando CellTiter-Glo como se
mencionó anteriormente. El efecto combinado de veneno de abeja o melitina con
docetaxel se evaluó mediante el método de la mediana de la dosis-efecto
utilizando el software CompuSyn (ComboSyn). Este método determina un IC
basado en el efecto de una combinación entre dos agentes (donde IC < 1 es
sinérgico, IC > 1 es antagónico y IC = 1 es aditivo)56. Los experimentos se
realizaron en réplicas biológicas (norte =3).
Modelo animal y tratamientos
Estos experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos
aprobados por el Comité de Ética Animal de la UWA. Para simular un modelo
avanzado de cáncer de mama claudin-low, 2,5 × 105Las células T11 se
suspendieron en medio sin suero y BD Matrigel Matrix High Concentration (BD
Bioscience) en una proporción de 1:1 para un volumen total de 100 μL y se
inyectaron por vía subcutánea en los costados de hembras BALB/cJ de 5 semanas
de edad (Animal Resources Centre, WA, Australia) con una aguja de 26 G. Las
células T11 utilizadas se transdujeron lentiviralmente con la construcción
ZsGreen-luciferasa y se clasificaron tres veces para lograr un enriquecimiento
superior al 99% de células positivas para luciferasa. La melitina se suspendió en
agua Milli-Q + dextrosa al 5%. El docetaxel (en polvo) se suspendió en TWEEN 80
al 25 % (Sigma-Aldrich) y una mezcla al 75 % de una solución 15,25:84,75 (v/v) de
etanol absoluto y agua purificada y se mantuvo a -20 °C. Inmediatamente antes
de los tratamientos, se diluyó docetaxel fresco en agua Milli-Q + dextrosa al 5% a
la concentración final requerida.3), los ratones fueron aleatorizados en 4 grupos (
norte =12 ratones/grupo). Los tratamientos se inyectaron intratumoralmente los
días 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 después de la inoculación de células T11, con vehículo,
melitina (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg) o una combinación de melitina (5 mg/kg)
y docetaxel (7 mg/kg). Los animales fueron monitoreados para el tamaño del
tumor cada 2 días, y
npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
14
volúmenes calculados por la fórmula del elipsoide modificada (volumen = ancho2× longitud/2).
Los animales fueron sacrificados humanamente cuando los tumores alcanzaron los 800 mm.3.
Análisis inmunohistoquímico de los tumores
Los tejidos tumorales se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se lavaron tres veces en
PBS y se dejaron en etanol al 70 %. Los tumores se incluyeron en parafina y se
prepararon secciones de 5 μm. Para la tinción con hematoxilina/eosina, los portaobjetos
se desparafinaron, se hidrataron con un banco de solución decreciente de etanol, se
tiñeron con hematoxilina de Gill, se deshidrataron con etanol al 70 %, se tiñeron con
eosina, se deshidrataron más con etanol al 100 %, se aclararon con tolueno y se
montaron en cubreobjetos con Medios de montaje Acrymount IHC (StatLab). La
apoptosis de las células tumorales se determinó en secciones de tejido mediante el
ensayo TUNEL (Kit de detección de muerte celular in situ, Roche).
Imágenes de bioluminiscencia
Para realizar un seguimiento preciso de los cambios en el crecimiento tumoral in vivo con los
tratamientos, realizamos un análisis de bioluminiscencia utilizando el sistema de imágenes
Caliper IVIS Lumina II en CMCA, UWA. Los análisis se realizaron cada 2 días después de la
generación de tumores. A los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 µL de D-
Luciferin (Cayman Chemical) a la concentración final de 150 mg/kg disueltos en PBS antes de
anestesiarlos con isoflurano al 4%. Una vez anestesiados, los ratones se colocaron dentro de la
cámara precalentada del generador de imágenes de bioluminiscencia y se tomaron imágenes
de 7 a 12 minutos después de la inyección, con isoflurano al 2%, hasta que la intensidad de la
señal de bioluminiscencia alcanzó un estado estable.
análisis estadístico
Todos los datos se derivaron de múltiples experimentos realizados al menos por
triplicado. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism v8
(GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) y SPSS Predictive Analytics
Software (IBM, versión 26). Para los ensayos de viabilidad celular, los datos se
normalizaron a la luminiscencia promedio de la condición del vehículo, que se
consideró 100 % de viabilidad, con el IC50s derivados en GraphPad Prism. Para la
inmunohistoquímica en los tumores T11 tratados para detectar p-HER2 (Tyr1248)
y p-EGFR (Tyr1068), el vehículo se normalizó al 100 %. Cuando correspondía y
como se indica en el texto principal, la significación estadística se determinó
utilizando pruebas t de Student de dos colas no pareadas, ANOVA unidireccional
no pareada con la prueba post hoc HSD de Tukey que corrige comparaciones
múltiples, ANOVA de dos vías con medidas repetidas seguidas de Sidak o Prueba
de comparación múltiple de Tukey, o un modelo lineal generalizado (GLM). Para
todas las pruebas, las diferencias se consideraron significativas enpag <0,05 (*),
pag <0,01 (**), ypag <0,001 (***).
Resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes
de investigación de Nature vinculado a este artículo.
DISPONIBILIDAD DE DATOS
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus
archivos de información complementarios). El anticuerpo anti-melitina desarrollado en la Instalación de
Anticuerpos Monoclonales en el Instituto de Investigación Médica Harry Perkins podría estar disponible
una vez que se establezcan los acuerdos apropiados.
Recibido: 9 de octubre de 2019; Aceptado: 28 de julio de 2020;
REFERENCIAS
1. Hijo, DJ et al. Aplicación terapéutica de los efectos antiartríticos, analgésicos y
anticancerígenos del veneno de abeja y sus compuestos constituyentes.Farmacol. El r.
115,246–270 (2007).
2. Fitzmaurice, C. et al. Incidencia mundial, regional y nacional de cáncer, mortalidad, años de
vida perdidos, años vividos con discapacidad y años de vida ajustados por discapacidad
para 32 grupos de cáncer, 1990 a 2015.JAMA Oncol.3,524 (2017).
3. Parque, S.-C. et al. Investigación del poro toroidal y oligomerización por melitina mediante
microscopía electrónica de transmisión.Bioquímica Biografía. Res. común343, 222–228
(2006).
4. Lyu, Y., Zhu, X., Xiang, N. & Narsimhan, G. Estudio de dinámica molecular de la
formación de poros por melitina en 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y 1,2-Di
npj Oncología de precisión (2020) 24
(9 Z -octadecenoil)- sn -glicero-3-fosfo-(1′-rac -glicerol) Bicapa lipídica mixta. Ing. Ind.
química Res.54,10275–10283 (2015).
5. Terwilliger, TC & Eisenberg, D. La estructura de la melitina. II. Interpretación de la
estructura.J. Biol. química257,6016–6022 (1982).
6. Lee, M.-T., Sun, T.-L., Hung, W.-C. & Huang, HW Proceso de inducción de poros en
membranas por melitina.proc. Academia Nacional. ciencia EE.UU110,14243–14248 (2013).
7. Sun, D., Forsman, J. & Woodward, CE Las simulaciones de dinámica molecular de varios
pasos identifican la actividad altamente cooperativa de la melitina para reconocer y
estabilizar los poros de la membrana.Langmuir31,9388–9401 (2015).
8. Tu, WC, Wu, CC, Hsieh, HL, Chen, CY y Hsu, SL El veneno de abeja induce la muerte celular
apoptótica dependiente del calcio pero independiente de la caspasa en células A2058 de
melanoma humano.Toxicón52,318–329 (2008).
9. Gao, D. et al. La melitina induce la apoptosis del NSCLC a través de la inhibición de miR-183.Onco.
Objetivos Ther.11,4511–4523 (2018).
10. Sisakht, M. et al. El veneno de abeja induce la apoptosis y suprime la expresión de
metaloproteasa-2 de matriz en células de glioblastoma humano.Brasil. J. Pharmacogn.
27,324–328 (2017).
11. Killion, JJ & Dunn, JD La citólisis diferencial de células de bazo murino, médula ósea y
leucemia por melitina revela diferencias en la topografía de la membrana.
Bioquímica Biografía. Res. común139,222-227 (1986).
12. Jo, M. et al. Efecto anticancerígeno de la toxina del veneno de abeja y la melitina en células de cáncer
de ovario mediante la inducción de receptores de muerte y la inhibición de la vía JAK2/STAT3.Toxicol.
aplicación Farmacol.258,72–81 (2012).
13. Zarrinnahad, H. et al. Efecto apoptótico de la melitina purificada del veneno de abeja iraní en
la línea celular Hela del cáncer de cuello uterino humano.En t. J. Pept. Res. El r.24,563–570
(2018).
14. Wang, X. et al. El ARN no codificante largo inducido por melitina NONHSAT105177 inhibe la
proliferación y migración del adenocarcinoma ductal pancreático.Enfermedad de muerte celular.
9,940 (2018).
15. Zhu, HG, Tayeh, I., Israel, L. & Castagna, M. Diferente susceptibilidad de las líneas celulares de pulmón
a los inhibidores de la promoción de tumores e inductores de la diferenciación.J. Biol. Reg.
Homeósteo. Agentes5,52–58 (1991).
16. Yu, X. et al. La modulación inmune de las células endoteliales sinusoidales del hígado por
nanopartículas de melitina suprime la metástasis hepática.Nat. común10,574 (2019).
17. Gajski, G. et al. Efectos antitumorales combinados del veneno de abeja y el cisplatino en células de
carcinoma cervical y laríngeo humano y sus sublíneas resistentes a los medicamentos.Aplicación J.
Toxicol.34,1332–1341 (2014).
18. Choi, K. et al. Efecto inhibidor del crecimiento de células cancerosas del veneno de abeja a través del aumento de
la expresión del receptor de muerte 3 y la inactivación de NF-kappa B en células de NSCLC.toxinas
6,2210–2228 (2014).
19. Shaw, P. et al. Efectos sinérgicos del tratamiento con melitina y plasma: un enfoque
prometedor para la terapia del cáncer.Cánceres11,1109 (2019).
20. IP, SW et al. El papel de las mitocondrias en la apoptosis inducida por veneno de abeja en
células MCF7 de cáncer de mama humano.vivos22,237–245 (2008).
21. Jeong, Y.-J. et al. La melitina suprime la motilidad celular inducida por EGF y la invasión al inhibir la vía
de señalización PI3K/Akt/mTOR en las células de cáncer de mama.Química alimentaria Toxicol.68,
218–225 (2014).
22. Jung, GB et al. Efecto anticancerígeno del veneno de abeja en células de cáncer de mama MDA-MB-231
humanas mediante espectroscopia Raman.biomedicina Optar. Expresar9,5703 (2018).
23. OsaceiteC,NORTE.,Sver, L., Verstovsek, S., TerziC,s y basiC,I. Inhibición de la proliferación de
células de carcinoma mamario in vitro y crecimiento tumoral in vivo por veneno de abeja.
Toxicón41,861–870 (2003).
24. OsaceiteC,N., TerziC,S.,Sver, L. y BasiC,I. Productos de miel de abeja en la prevención y/o terapia de
tumores trasplantables murinos.J. Ciencia. Alimentación Agrícola.85,363–370 (2005).
25. Kohno, M., Horibe, T., Ohara, K., Ito, S. y Kawakami, K. Los péptidos líticos de membrana K8L9 y la
melitina ingresan a las células cancerosas a través de la endocitosis del receptor después de la
exposición subcitotóxica.química Biol.21,1-11 (2014).
26. Lim, H., Baek, S. & Jung, H. El veneno de abeja y su componente peptídico melitina suprimen
el crecimiento y la migración de células de melanoma a través de la inhibición de las vías
PI3K/AKT/mTOR y MAPK.Moléculas24,929 (2019).
27. Van Vaerenbergh, M., Debyser, G., Smagghe, G., Devreese, B. & De Graaf, DC Desentrañando
el proteoma del veneno del abejorro (bombus terrestris)mediante la integración de un
enfoque de biblioteca de ligandos peptídicos combinatoria con FT-ICR MS.Toxicón
102,81–88 (2015).
28. Qiu, Y. et al. Clonación molecular de la proteína fosfolipasa A 2 del veneno de
abejorro Bombus terrestris y sus efectos antileucémicos en las células K562.J. Asia
Pac. Entomol.20,699–704 (2017).
29. Prat, A. & Perou, CM Deconstruyendo los retratos moleculares del cáncer de mama.
mol. oncol.5,5–23 (2011).
30. Lehmann, BD et al. Identificación de subtipos de cáncer de mama humano triple negativo y
modelos preclínicos para la selección de terapias dirigidas.J. Clin. investigando
121,2750-2767 (2011).
31. Mayer, IA, Abramson, VG, Lehmann, BD y Pietenpol, JA Nuevas estrategias para el
cáncer de mama triple negativo: descifrar la heterogeneidad.clin. Cáncer Res.20,
782–790 (2014).
Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota

32. Gelmon, K. et al. Orientación al cáncer de mama triple negativo: optimización de los
resultados terapéuticos.Ana. oncol.23,2223–2234 (2012).
33. Gagliato, D. de M., Jardim, DLF, Marchesi, MSP & Hortobagyi, GN Mecanismos
de resistencia y sensibilidad a las terapias anti-HER2 en el cáncer de mama
HER2+.Oncotarget7,64431–64446 (2016).
34. Shah, SP et al. El espectro de evolución clonal y mutacional de los cánceres de mama triple
negativos primarios.Naturaleza486,395–399 (2012).
35. Costa, R. et al. Dirigirse al receptor del factor de crecimiento epidérmico en el cáncer de mama triple
negativo: nuevos descubrimientos y conocimientos prácticos para el desarrollo de fármacos.
Tratamiento del cáncer. Rdo.53,111-119 (2017).
36. Swain, SM et al. Pertuzumab, trastuzumab y docetaxel en el cáncer de mama
metastásico HER2 positivo.N. ingl. J.Med.372,724–734 (2015).
37. Wright, MH et al. Los tumores de mama Brca1 contienen distintas células CD44+/CD24- y
CD133+ con características de células madre cancerosas.Res. de cáncer de mama.10,R10
(2008).
38. Roberts, PJ et al. La inhibición combinada de PI3K/mTOR y MEK proporciona una
amplia actividad antitumoral en modelos fieles de cáncer murino.clin. Cáncer Res.
18, 5290–5303 (2012).
39. Hall, K., Lee, T.-H. & Aguilar, M.-I. El papel de las interacciones electrostáticas en la
unión de melitina a la membrana.J. Mol. reconocer24,108–118 (2011).
40. Rai, DK, Qian, S. & Heller, WT La interacción de melitina con membranas de
bicapa lipídica de dimiristoil fosfatidilcolina-dimiristoil fosfatidilserina.
bioquimica Biografía. acta1858,2788–2794 (2016).
41. Krauson, AJ et al. Ajuste fino conformacional de la potencia y selectividad del péptido
formador de poros.Mermelada. química Soc.137,16144–16152 (2015).
42. Sharma, SV Resistencia a la melitina: una contraselección para la transformación de ras.
oncogén7,193-201 (1992).
43. Morris, MC, Deshayes, S., Heitz, F. y Divita, G. Péptidos de penetración celular: de los
mecanismos moleculares a la terapéutica.Biol. Celúla100,201–217 (2008).
44. Dong, X., Hudson, NE, Lu, C. & Springer, TA Determinantes estructurales de la especificidad
de la subunidad β de la integrina para el TGF-β latente.Nat. Estructura. mol. Biol.21,
1091-1096 (2014).
45. Li, W., Liu, C., Zhao, C., Zhai, L. & Lv, S. La regulación negativa de la integrina β3 por
miR-30a-5p modula la adhesión celular y la invasión al interrumpir la red Erk/Ets-1 en
cáncer de mama triple negativo.En t. J. Oncol.48,1155-1164 (2016).
46. Sorolla, A. et al. Enfoque terapéutico de triple impacto para los cánceres de mama triple negativos
utilizando nanopartículas de docetaxel, EN1-iPeps y péptidos RGD.nanomed. Nanotecnología. Biol.
Medicina.20,102003 (2019).
47. Kretzmann, JA et al. Supresión tumoral mediante CRISPRa no viral intravenoso dirigido
utilizando polímeros dendríticos.química ciencia10,7718–7727 (2019).
48. Kokot, G., Mally, M. y Svetina, S. La dinámica de la permeabilidad de la membrana inducida
por melitina.EUR. Biografía. j41,461–474 (2012).
49. Carracedo, A. et al. La inhibición de mTORC1 conduce a la activación de la vía MAPK a través de un
ciclo de retroalimentación dependiente de PI3K en el cáncer humano.J. Clin. investigando118,
3065-3074 (2008).
50. Lee, T.-H. et al. El factor de crecimiento endotelial vascular media la supervivencia intracrina en células
de carcinoma de mama humano a través de VEGFR1/FLT1 expresado internamente.PLoS Med.4,e186
(2007).
51. Weigel, MT y col. La combinación de imatinib y vinorelbina mejora la inhibición del crecimiento celular
en células de cáncer de mama a través de la señalización de PDGFR β.Cáncer Lett.273,70–79 (2009).
52. Pasillo, MP et al. Reportero de luciferasa diseñado a partir de un camarón de aguas
profundas que utiliza un sustrato novedoso de imidazopirazinona.ACS química. Biol.7,
1848-1857 (2012).
53. Machleidt, T. et al. NanoBRET: una nueva plataforma BRET para el análisis de interacciones
proteínaproteína.ACS química. Biol.10,1797-1804 (2015).
54. Pfleger, KDG y Eidne, KA Perspectivas esclarecedoras sobre las interacciones proteína-proteína
mediante la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET).Nat. Métodos3, 165–
174 (2006).
55. Beltran, AS, Graves, LM y Blancafort, P. El papel novedoso de Engrailed 1 como factor de
transcripción de supervivencia en el cáncer de mama de tipo basal y la ingeniería de
péptidos de interferencia bloquean su función oncogénica.oncogén33,4767–4777 (2014).
56. Chou, TC & Talalay, P. Análisis cuantitativo de las relaciones dosis-efecto: los efectos
combinados de múltiples fármacos o inhibidores enzimáticos.Adv. enzima Reg.22,
27–55 (1984).
57. Prat, A. et al. Caracterización fenotípica y molecular del subtipo intrínseco de
claudina-baja de cáncer de mama.Res. de cáncer de mama.12,R68 (2010).
58. Sorolla, A. et al. Sensibilización del cáncer de mama de tipo basal a la quimioterapia
utilizando nanopartículas conjugadas con péptido de interferencia.Nanoescala8,9343–9353
(2016).
59. Swoboda, A. & Nanda, R. Bloqueo del punto de control inmunológico para el cáncer de mama.Tratamiento del
cáncer. Rdo.173,155-165 (2018).
60. Sharma, SV Resistencia a la melitina: una contraselección para la transformación ras.
oncogén7,193-201 (1992).
Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota
C Duffy et al.
15
61. Barrajón-Catalán, E. et al. Muerte selectiva de células de cáncer de mama humano por
inmunoliposomas líticos: correlación con su nivel de expresión de HER2.Cáncer Lett.290,
192-203 (2010).
62. Barnabas, N. & Cohen, D. Caracterización fenotípica y molecular de líneas celulares
de cáncer de mama MCF10DCIS y SUM.En t. J. Cáncer de mama2013,1–16 (2013).
63. Hollestelle, A. et al. Perfiles de mutación genética distintos entre líneas celulares de cáncer
de mama de tipo luminal y de tipo basal.Res. de cáncer de mama. Tratar.121,53–64 (2010).
64. Mota, A. et al. Caracterización molecular de líneas celulares de cáncer de mama mediante
marcadores clínicos inmunohistoquímicos.oncol. Letón.13,4708–4712 (2017).
65. Wu, GJ et al. Las amplificaciones de 17q23 en el cáncer de mama involucran los genes PAT1,
RAD51C, PS6K y SIGMA1B.Cáncer Res.60,5371–5375 (2000).
66. Saal, LH et al. Mutaciones macroscópicas recurrentes del gen supresor de tumores PTEN en cánceres
de mama con reparación deficiente de DSB.Nat. Gineta.40,102–107 (2008).
67. Liang, SI et al. Los dímeros de EGFR fosforilados no son suficientes para activar Ras.
representante celular22,2593–2600 (2018).
68. Lee, C., Bae, S.-JS, Joo, H. & Bae, H. La melitina suprime la progresión tumoral al regular los
macrófagos asociados al tumor en un modelo de ratón con carcinoma de pulmón de Lewis.
Oncotarget8,54951–54965 (2017).
69. Muenst, S. et al. La expresión del ligando 1 de muerte programada (PD-L1) se asocia con un
mal pronóstico en el cáncer de mama humano.Res. de cáncer de mama. Tratar.146,15-24
(2014).
70. Qin, T. et al. La alta expresión de PD-L1 se asoció con un mal pronóstico en 870
pacientes chinas con cáncer de mama.Oncotarget6,33972–33981 (2015).
71. Zawlik, I. et al. Puntos de control inmunológico en subtipos de cáncer de mama agresivos.
neoplasma63,768–773 (2016).
72. Hou, Y., Nitta, H., Parwani, AV & Li, Z. PD-L1 y CD8 están asociados con un estado deficiente
de reparación de errores de emparejamiento en cánceres de mama triple negativos y HER2
positivos.Tararear. Patol.86,108–114 (2019).
73. Monypenny, J. et al. ALIX regula la inmunosupresión mediada por tumores al controlar la
actividad de EGFR y la presentación de PD-L1.representante celular24,630–641 (2018).
74. Padmanabhan, R., Kheraldine, HS, Meskin, N., Vranic, S. y Al Moustafa, A.-E. Diafonía
entre HER2 y PD-1/PD-L1 en cáncer de mama: desde aplicaciones clínicas hasta
modelos matemáticos.Cánceres12,636 (2020).
75. Polk, A., Svane, I.-M., Andersson, M. y Nielsen, D. Inhibidores de puntos de control en el cáncer de
mama: estado actual.Tratamiento del cáncer. Rdo.63,122–134 (2018).
76. Chaganty, BKR et al. Trastuzumab aumenta la regulación de PD-L1 como un mecanismo potencial de
resistencia a trastuzumab a través del compromiso de las células efectoras inmunitarias y la
estimulación de la secreción de IFNγ.Cáncer Lett.430,47–56 (2018).
77. Cheng, B., Thapa, B., KC, R. y Xu, P. Nanomelitina de doble seguridad para la erradicación
segura y eficaz de las células cancerosas.J.Mater. química B3,25–29 (2015).
78. Soman, NR et al. Los nanoportadores dirigidos molecularmente entregan el péptido citolítico melitina
específicamente a las células tumorales en ratones, lo que reduce el crecimiento tumoral.J. Clin.
investigando119,2830–2842 (2009).
79. Sun, D. et al. La potencia anticancerígena y el mecanismo de una nueva toxina fusionada activada por
tumores, DLM.toxinas7,423–438 (2015).
80. Sigismund, S., Avanzato, D. & Lanzetti, L. Funciones emergentes del EGFR en el
cáncer.mol. oncol.12,3–20 (2018).
81. Iqbal, N. e Iqbal, N. Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) en
cánceres: sobreexpresión e implicaciones terapéuticas.mol. Biol. En t.2014,1–9 (2014).
82. Goding, J.Anticuerpos monoclonales: principios y práctica. (Prensa Académica, 1996).
83. Schindelin, J. et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas.Nat.
Métodos9,676–682 (2012).
84. Stoddart, LA et al. Aplicación de BRET para monitorear la unión de ligandos a GPCR.Nat.
Métodos12,661–663 (2015).
85. Kilpatrick, LE et al. Análisis en tiempo real de la unión de VEGF 165 a fluorescente a VEGFR2
en células vivas: efecto de los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor y el destino de
los complejos agonista-receptor internalizados.Bioquímica Farmacol.136,62–75 (2017).
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones otorgadas a PB: la beca
FT130101767 del Consejo de Investigación Australiano (ARC), la beca de
investigación del Consejo del Cáncer de Australia Occidental (CCWA) y las
subvenciones del proyecto CCWA 1083745 y 1147435, y el Consejo Nacional de
Investigación Médica y de Salud ( NHMRC) subvenciones 1069308, 1147528 y
1165208. El CD fue apoyado por una beca del Programa de Capacitación en
Investigación (RTP) del gobierno australiano y una beca CCWA PhD Top Up. AS
agradece la beca posdoctoral de la Fundación Nacional del Cáncer de Mama
(PF-15-001) y la Beca de Priming de la Fundación Raine (RPG-004-19). EJ recibió el
apoyo de una beca del Centro de Capacitación en Transformación Industrial de
ARC (IC170100016). KP recibió el apoyo de una beca NHMRC RD Wright (1085842).
El trabajo de BRET fue apoyado en parte por la subvención LP160100857 de ARC.
npj Oncología de precisión (2020) 24
 C Duffy et al.
dieciséis

FT110100528 y la Universidad de California Riverside. Los autores desean INFORMACIÓN ADICIONAL

agradecer el apoyo de Jane Stout (Trinity College Dublin), Mark Brown (Royal Información suplementariaestá disponible para este documento enhttps://doi.org/10.1038/
Holloway, Universidad de Londres), Kevin Li (FACS Facility en el Instituto Harry s41698-020-00129-0.
Perkins de Investigación Médica, UWA) y Paul Rigby (CMCA ).
Correspondenciay las solicitudes de materiales deben dirigirse a PB

CONTRIBUCIONES DE AUTOR Reimpresiones e información de permisosestá disponible enhttp://www.nature.com/

reimpresiones
CD contribuyó al diseño y ejecución de experimentos, análisis de datos, construcción de
figuras, y escribió y editó el artículo. AS y EW contribuyeron a los experimentos in vivo.
nota del editorSpringer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales
EG contribuyó al modelado de péptidos y la ilustración de la membrana plasmática. EW
en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
contribuido a los experimentos de inmunofluorescencia. KD contribuyó a la producción
de anticuerpos contra la melitina. DH contribuido a la microscopía electrónica de
barrido. EJ y KP contribuido a la creación de los ensayos BRET. AR revisó y editó el
documento. KSI contribuyó a la supervisión y revisó el documento. BB y PB contribuido a Acceso abiertoEste artículo tiene una licencia internacional
la conceptualización, supervisión y diseño de experimentos, y editó el documento. Creative Commons Attribution 4.0, que permite usar, compartir,
adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre que dé el
crédito apropiado al autor o autores originales y la fuente, proporcione un enlace a la licencia
Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros
en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se
indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la
CONFLICTO DE INTERESES
licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación
KP recibió fondos de Promega, BMG Labtech y Dimerix como organizaciones participantes de
legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los
ARC Linkage Grant. Estas organizaciones participantes no desempeñaron ningún papel en
derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visitehttp://creativecommons. org/
ningún aspecto de la concepción o el diseño de la investigación, la recopilación, el análisis y la
licenses/by/4.0/.
interpretación de los resultados, o la redacción y edición del documento. KP es el principal
asesor científico de Dimerix, de la que mantiene una participación accionaria. Los autores
restantes declaran no tener intereses en competencia. © El Autor(es) 2020

npj Oncología de precisión (2020) 24 Publicado en asociación con The Hormel Institute, Universidad de Minnesota