ESTUDO DIRIGIDO I FOSFORILAGAO OXIDATIVA 1) Keilin publicou o isolamento de compostos que apresentavam fortes bandas de absorcao nas posicées 615-593 / 567-561 / 554.5-546 / 532-511. Keilin denominou essas substancias "citocromos’ e nomeou-as_como bandas a, b, c, d. Anos mais tarde verificou-se que a banda denominada "banda d" na verdade nao existia como um citocromo separado, sendo formada pela superposicao de picos secundarios das outras 3 bandas. 400 (0 408 €00 298 390 588 580 $78 270 265 560 585 580 543 ° ee wing mace Pig 1. Absorption spesmm of cytochrome in thoracic muscles s ofa bee. Dyliscus: wing muscle Galleno: wing muscle Hela radulo mance Frog heart muscle Gaines pig Peer mance © Yeos) cele Com essa publicacao Keilin clareou uma antiga discussao na literatura. Esses pigmentos foram inicialmente descritos por Mac Munn. Contudo permaneceram anos desacreditados pela comunidade cientifica que alegava tratarem-se de contaminagées por hemoglobina. Com o advento de técnicas mais precisas de microscopia e com os experimentos acima, Keilin conseguiu demonstrar a existéncia de citocromos como compostos diferentes da hemoglobina. Porque esse foi considerado um forte argumento a favor da existéncia de citocromos? Que outros experimentos vocé faria? Olhem agora a estrutura de citocromos nos seus livros. Porque esses pigmentos foram inicialmente confundidos com hemoglobina? 2) Dando continuidade a seu trabalho, Keilin colava insetos (Galleria mellonella - uma mariposa) numa placa que colocava sob um microscopio de Zeiss ¢ uma luz forte, de maneira que 0 torax do inseto ficasse voltado para cima. Sendo o torax amarelo, as bandas pretas eram facilmente visualizadas. Os citocromos apresentam-se como fortes bandas escuras no estado reduzido, enquanto que noestado oxidado apresentam-se como bandas claras tornando-se praticamente invisiveis. Vocé pode prever se as bandas eram visualizadas, quando: a) 0 inseto permanecia em repouso. b) 0 inseto comegava a vibrar as asas tentando voar. c) 0 inseto cessava de se mover e voltava ao repouso. d) 0 inseto em repouso era submetido a vapores de KCN. 3) Ainda continuando os experimentos de Keilin, suspensdes de levedura eram submetidas a correntes de oxigénio, oxidando os citocromos. Quando gotas de KCN eram adicionadas & suspensdo, os citocromos tornavam-se rapidamente reduzidos. Como explica esse experimento? Sera o KCN um agente redutor? Em seu estado normal ou mesmo apés intensa movimentacdo (como no caso do bater de asas acima) as bandas de absoreao dos citocromos nunca se apresentam tao fortes como quando submetidas aos vapores de KCN. O que isso lhe indica sobre 08 estados oxidado ou reduzido dos citocromos na célula? 4) Nos ja vimos que, durante a respiragdo, eletrons podem ser transportados do ciclo de Krebs aos citocromos e ao oxigénio. Acoplado a esse transporte, outro fendmeno ocorre. Em 1939, Belitzer e Tsybakova publicaram um trabalho associando fosforilacéo com respiracéo. Na época conhecia-se sintese de ATP associada a NAD num passo intermediario da glicélise (1,3-bisfosfoglicerato{ 3 fosfoglicerato) . Para demonstrar a existéncia de outros processos de formacao de ATP, ligados a processos oxidantes e nao, diretamente, a passos da via glicolitica, Belitzer e Tsybakova utilizaram musculo peitoral de pombo previamente lavados a frio com salina, publicando os resultados abaixo Resowotion, ul Op Phesphogen,mg P20 Fig. 2, Syuthesis of phoephagen in the presence of pyruvic sci (pieenn muscle) Iz before incubation; IT: in Nz without Dyeavie aeid; IT: the eame with pyruvic acids IV: in Oy with pperuvie acid; V: the same without pyruvie acid. a this and in the Following illustrations phosphagen syathesized is given in mc of P.O, per seam of tissue and respiration is ven in yet UO, per 30 i par ram of tinueNo grafico acima, a palavra "phosphagen" substitui o ATP, Qual a importancia da experiéncia para demonstrar a formacdo de ATP nao diretamente acoplado aos passos de glicdlise? Porque os musculos eram previamente lavados com salina? Que outros experimentos vocé faria para reconfirmar Belitzer e Tsybakova? 5) Analise a tabela abaixo também retirada do trabalho da questo 4. Quais seriam os requisitos para sintese de ATP? Como contribuem? O que vocé esperaria encontrar se medisse concentracao de Pi nesses experimentos? Table 2 Anngric Ac ats Paomenare Acro ce eee ie i ee BE | ok Pee 6) Olhe agora os resultados do grafico abaixo. Procure uma explicagaéo sabendo que arsénio é um veneno respiratorio essen st Op Posohogen, 9 P203 Fig. % Phosphagen eyntheris during oxidation of malic, fare and sociale acids inthe preenee of ssenous ac and [NaF (aba eae) I: prior neabation: IT withou substrate TIL wich malic acd IVs with fame acid; Vs succinic acd7) Na experiéncia a seguir, particulas submitocondriais sao colocadas na presenca de oxigénio e de varios inibidores especificos. Sabendo-se que os citocromos reduzidos podem ser identificados pela formagao de uma banda escura de comprimento de onda diverso, e que os diversos citocromos aparecem ora como banda de citocromos, ora como banda clara, determine qual a ordem dos citocromos na cadeia respiratoria. Justifique. Determine em que passo da cadeia respiratéria entram os diversos substratos. O que vocé proporia para justificar a formacao diferenciada de ATP a partir de NADH e FADH2 como substratos? Substratos | Inibidores | Bandas Bandas | Formacao QO escuras claras de ATP NADH cN-, CO, a,b,c = = = NaNs NADH [Rotenona ou = - ~ amital NADH | Antimicina b = = ~ A FADH2 [Rotenonaou| a, b,c a,b,c 2 ATP/O Sim amital NADH = abe a,b,c 3ATP/O. ‘Sim FADH2 a,b,c a,b,c 2 ATP/O. ‘Sim ‘Acido a a 1 ATP/O ‘Sim ascérbico