CHROMSYSTEMS indice. Pagina 1 Informacién sobre el pedido .. 3 2 Introdvecién.. 5 3. Sistema LCMS/MS...o0 8 3.1. Equipomiente y pardmetos del equipo de HPLC 8 3.2. Medicién MS/MS 9 3.3 Pesto en funcionamiento, 10 3.4 Pausas en el funcionamianlo. 10 4. Transferencia de masas de los analitos y del esténdar interno n 5 Preparacién de la muestra 14 5:1. Obtencién y conservacién de mesras de pacientes 4 5.2. Reconsitucin del estandor interno 15 5.3 Manipulacién de los controles de sangre seca 15 5.4 Proceso de preporacién de muestras. 16 5.4.1 Preparacién de muestras sn placa firante 16 5.42 Preparocién de muestas con placa fronte 16 5.5. Estabilidad de las muesiras preparadas 7 5.6 Equipamiento adicional necesario, no ineluido en el ki 7 & Registro de datos y eélevlo 7 7 Control de calidad 9 8 Rangos de referencia/ valores de corte... a9 9 Factores de conversién 2d 10. Almacenamiento y caducidad de los reactivos aaen22 11. Tratamiento de los residues. 12. Ejemplos de especiros . a 12.1 Especto de un contol en eldrea del valor de corte de los aminodcides.... 23 12.2 Espectro de la muestra de un paciente con fenilcetonuria 23 12.3. Expectro de un control en el érea del valor de corte de las acileorninas.... 24 12.4. Espectro de la muestra de un paciente con MCADD_ or) 12.5. Espectro de la muestra de un paciente con VLCADD. 25 12.6 Especiro de lo muestra de un paciente con aciduria glutrica tipo | (GA I). 25 13. Interferencias conocidas 14 Localizacién y resolucién de problemas ......sssssusssssssinenenene 28 15. Bibliografia. 29 Apéndice |: Observaciones sobre las sustancias peligrosas.....--~ 30 Apéndice Il: Indicaciones para el célculo manual Apéndice Il, Datos de validacién..... Apéndice IV: Cerffieado.... 2 5700 cite demons 8 042014 V5.1CHROMSYSTEMS 1 Informacién sobre el pedido N° de pedido Producto 57000 57000/F 57001 57002 57004 57004/T 57007 57008 57010 55011 55013 57057 55015 55016 57099 55033 15010 Kit de reactivos MessChon® para el andlsis por LCMS/MS de aminodcidos y acilcarnitinas en sangre seca para el cribado (screening) de neonatos / no derivatizada Contenido del kit para 960 andlisis con placas estindar de 9 pocillos Mobile Phase 2x 1000 ml Internal Standard, lio. 4x25 ml Rinsing Solution 2x 1000 ml Extraction Buffer 1x 100 ml Placas de % poxillos, fondo en V 6x 5 unidades Léminas protectoras para placas de % pocillos 2x 10 unidades Léminas adhesivas perforables para placas de % pocillos 2x 10 unidades Massthecl* Amino Acids, Acylcarnitines Dried Blood Spot Control Level | 1x3 spots Level 1x 3 spots Kit de reactivos Mosshran® para el andlisis por LC-MS/MS de aminodcidos y ‘aclearnitinas en sangre seca para el cribado (screening) de neonatos / no derivatizada Contenido del kit pora 960 onéliss con placos firantes de 96 pocillos: Mobile Phase 2x 1000 ml Internal Standard, lof 4x25 ml Rinsing Solution 2.x 1000 ml 1x 100 ml Extraction Buffer Placasfirantes de 96 pocillos Placos de 96 patillos, fondo en V Léminas protectoras para placas de 96 pocillos 3x5 unidades 3x5 unidades 2x 10 unidades Léminas adhesivas perforables para placas de 9% pocillos 2x 10 unidades Massthike Amino Acids, Acylearnitins Dried Blood Spot Control Level | 1 x3 Spots Level I 1x3 Spots ‘Componentes disponibles por separado Mobile Phase 1000 mi Mobile Phase 10 x 1000 ml Internal Standard, lif. 4x25 mi Internal Standard, lof 1x 25 ml Rinsing Solution 1000 mi Extraction Buffer 100 mi Placas de % pocillos, fondo en V 5 vnidades Léminas protectoras para placas de 96 pocillos 10 unidades Laminas adhesivas perforables para placas de 96 pecillos, 10 unidades Placas firantes de 96 pocillos 5 vnidades ‘Accesorios Startup Restrctor Copillary 1 unidad ‘Adapter Collar para la centifugacién 2 unidades Tuning Mix, contene todos los analitos 2m ‘Membranas del prefitro PEEK, 5 ym 5 unidades Carcasa de PEEK para el prefilro 1 unided Pagina 3 1157000 cide denen tS 04/2014 VSCHROMSYSTEMS: 2 Introduccién El objetivo del cribado en neonatos es la deteccién de alteraciones metabélicas congénilas antes de que as causen dafios en el ergenismo. Tras la normal se ho establecido por ley el andlsis orienlado a la doteccién de doce enfermedades, de las evales ocho se detectan mediante la espectrometria de masas en tandem. Enire ellas se encuentran los trastornos del metabolismo de los aminodcidos como la fenlcetonuria y la enfermedad dela orina con olor a jarabe de ‘rce (MSUD], trastormos del metabolismo de los écidos grasos (entre olros las insuficiencias de acibCoA- deshidrogenasa de cadena media y muy larga: MCAD y VLCAD], asi como acidurias orgénicas como la cecidemia isovaléric. Estas enfermedades son ocasionadas por defectos congénitos en determinadas enzimas que limitan 0 suprimen por completo su actividad. La consecvencia es que el sustrato de la reaccién enzimética ya no es transformado en el cuerpo, con lo que el producto de la reaccién se formard en niveles demasiado bojos «no se formard en absolute, dependiendo de la gravedad del trastorno. También se produce una CHROMSYSTEMS: ‘Material de control de Chromsystems, sangre seca sobre papel fillrante 0191 Mass(hake Amino Acids, Acylcarnitines Dried Blood Spot Control Bilevel (I+ Il) 2x3 spots 0192 Mass(hatke Amino Acids, Acylcarnitines Dried Blood Spot Control, level | 1x 3 spots 0193 MassChuke Amino Acids, Acylearnitines Dried Blood Spot Control, Level I! 1 x3 spots |CHROMSYSTEMS- 2 Introduccién El objetivo del cribado en neonatos es la deteccién de alleraciones metabélicas congénitas antes de que éstas causen dafios en el organismo, Tras la normativa infantil del 21 de diciembre de 2004, en Alemania s¢ ha establecido por ley el andliss orientado a la deteccién de doce enfermedades, de las cuales ocho se detectan mediante Io espectrometria de masas en tandem. Ene ellas se encuentran los irastornos del imetabolismo de los aminodcides como la fenilcetonuria y la enfermedad de la orina con olor a jarabe de ‘arce (MSUD], trastornos del metabolismo de los écidos grasos [entre otros las insuficiencias de acilCoA deshidrogenasa de cadena media y muy larga: MCAD y VLCAD], asi como acidurias orgénicas como la acidemia isovalérica. Estas enfermedades son ocasionadas por defecios congénitos en determinadas enzimas que limitan o suprimen por completo su actividad. La consecvencia es que el sustrato de la reaccién enzimatica ya no es transformado en el cuerpo, con lo que el producto de la reaccién se formard en niveles demasiado bajos © no se formard en absoluto, dependiendo de la gravedad del trastorno. También se produce una cecumulacién de metabolites potencialmente téxicos, lo que puede generar dafos en el orgonismo y enfermedades mulisistémicas (aminoacidopatias, organoacidopatias). Sino se diagnostican, estos trastornos metabélicos pueden ocasionar desde los primeros dias de vide dafios graves ¢ irreversibles al recién nacido. Por ejemplo, en el caso de la fenilcetonuria, ésta resulta en retardos en el desarrollo fisico y Psiquico del niio afectado. Dado que son fallos congéritos, estas enfermedades son incurable y la terapia se limita a compensar los sintomas. Los nifios que padecen fenilcstonuria, sin embargo, pueden llevar a cabo una vida normal siguiendo una dieta libre de fenilalanina, siempre y cuando la enfermedad sea delectada a tiempo durante los primeros dias de vida. La incidencia de estos trastornos metabélicos ronda entre 1:9.000 (ferilcetonuria) y 1:200.000 en el caso de algunas lipodistrofias (VICAD, CPT | y Il; por término medio, 1 de cada 3.000 recién nacidos padece alguna de estas enfermedades exceso 0 defecto de los El diagnéstico en laboratorio de estas enfermedades se realiza midiendo correspondientes morcadores en la sangre del neonato. Para ello se extrae la sangre del talén, haciendo que gotee sobre papel fitrante para que se seque, y después se envia al laboratorio, la técnica de la espectrometria de masas en tandem permite detectar un amplio espectro de trastornos metabélicos con un solo andlisis. Este procedimiento permite determinar simulténeamente y con fiabilidad las concentraciones de toda una serie de marcadores. La alta selectvidad del proceso permite prescindir en este caso de una columna de HPLC, lo que acorta considerablemente la duracién del andliss (2 min). Para compensar las interferencias causadas por efectos de supresién iénica y lograr una cvantificacién precisa de los analitos, es imprescindible el uso de esténdares marcados isolSpicamente. Dependiendo del papel filtrante empleado en la extraccién de sangre y del hematocrit de lo muestra, el volumen de sangre variaré en el punto de sangre seca a analizar, de 3 mm de didmetro, entre 2,2 y 3,3 pl de sangre. Esto permite una determinacién semicvaniitativa de los analtos, sin embargo, este ctibade no deberia usarse como método de diagnosis en laboratorio, Los resultados del cribado de eonatos mediante espectrometria de masas en téndem deben, por lo tanto, garantizarse mediante un diagnéstco de confirmacién genéticomolecular, enzimélico o basado en analizadores de aminodcidos. Uso previsto: EL kit de reactivos Chromsystems MassChrom® Aminodcides y acilcarnitinas en sangre seca /no derivaizada es un producto para el diagnéstico in vitro de uso en laboratories clinicos, y sive pra la determinacién semicuantitativa de los siguientes metabolites: Aminoécidos Alanina (Ala], arginina (Arg), écido aspérico (Asp), citrulina (Ci), écido glutimico (Glu), glicina (Gly, leucina (Lev), metionina (Mel), oritina (Orn, fenilalanina (Phe), prolina (Pro],tirosina (Tyr), valina (Val) Pagina 5 wi s7000 cAtado de ncoston 5 04/2014 VS)CHROMS;, ina (C2), propionilcarnitina (C3), butrilearnitina (CA], isovalerilearniting nailearnitina (C8), decanoilcarntina (C10), hexanailearnitina (Cé), oct i varolearnna (C1, hexedecanoilcarnina (C16), Carina libre y aclearitinas Corina libre (C0), acetleari (C5), gltorlcortina (CDC), dodecanoilcarnitina (C12), telrades ‘octadecanoilearnitina (C18) Se analizan mvestras de sangre seca de los pacientes, el método de andlisis es LC-MS/MS ‘ramotegaf lida acoplad ol expecrometia de masa). lise vsa como mélodo de cribado para la a temprana de raslonos del metabolismo de los aminodcidos y de los cidos grasos en recién nacides NH OH Ee Is LOH aA I Fenilalanina Ti ; : He ws ' yop aye Ay . on J j Ld Glicina Alaning Valin : mT sant nl c : ° Ne 0 X wa ye Oe J a) Acido ass | (Cr . “~ ‘Carnitina libre 2 Figure 1: Férmulas estructurales de aminoacid il os, acearitinas y carina libre gina & sa s260 cid ramacstso/2014 v5)CHROMSYSTEMS jo del kit de reactivos: Este ki de reactivos de Chromaystems permite, mediante Ia espectrometria de masas en téndem, el rapido andlisis semicvantitativo de aminodcidos y acilcaritinas en muesiras de sangre seca dentro del marco del cribado de neonatos para la deteccién de trastornos del metabolismo de los dcidos grasos. lo preparacién de muestras es muy simple y esté basada en una extraccién efectiva de analitos del papel filtrante, sin ningtn otro paso adicional. Para garantizar la cvaniificacién segura y precisa de los analitos, ‘este método emplea esténdares internos estables deuterados para la calibracién y medicién Este kit es un dispositive para el diagnéstico in vitro {IVD}. Por favor, tenga en cuenta que se trata de un procedimiento de cribado cuyos resultados pueden variar de aparato a aparato. Por ello, los datos obtenidos mediante este kit deben contemplarse en conjunto con otros datos de laboratorio y requieren obligatoriamente una interpretacién médica emitida por un facultative 0 un experto en metabolismo. No existe ningun estudio clinico sistemético sobre la frecuencia de resultados falsos positvos y falsos negatives.SSNS yp, N My las observaciones acerca de las sustancias 3. Sistema LC-MS/MS ‘Nota: fn el manejo de los reacivos, presar atencién a | peligrosos mencionadas en el Apéndice | 3.1 Equipamiento y pardmetros del equipo de HPLC Paracas cd le ennai, accom amt Ubes praca un sea con ieee HPLC, un inyector y un espectrémetro de masas en Kéndem con la sufciente sensibilidad. ee mantener la fase mévilcerrada o tapada también durante el funcionamiento. No se requiere ni columna HPLC, ri horne para columas. Para acoplr el equipo HPLC cone sistema MS/MS se requare ce Resticlor Copillary (copilar restrictor} (n° de pedido 55015) con un prefilro PEEK (n® de pedido 55033 y 15010) Ajustes del aparato: Autoinyector: Volumen de inyeccién 10 pl Duracién del andi 17 min Gradiente de flujo: de 20 a 600 pl/min Flido de lmpieza de la agua del inyector: Rinsing Solution (solucién de enjvague) Gradiente: {stadiente deberé ojstarse, eventualment, debido alos diferentes volimenes muertos de los sistemas de HPLC. For eso, el gradione indicado debe tomarse como base para la optininacién Hey que svar la ventana temporal de mecicién del sistema MS en tandem durante el ntervalo temporal or el que las itensidades de sofolalcanzan al nivel maximo (aprox. 0.25 ¢ 1.25 wi ° by 1.25 y - 9:55 ONG 4.2 2s 0 0,24 Flujo (yl/min) | 200 200 0 20 00 200 +4 nO! 600 200 260 Ratt tema de HPLC no puede mantener un fio constante de 20 p/min, se puede trabojar entonces de forma scedica 0 100-150 pl/min, Sin embargo, hay que tener en cuenlo aur con al care isocratico la sensibilidad seré menor. Favra 2: Crometograma con un gradient de fo Mere buemchtenmmnsenin — THC (Total a UNUnnumsr1Ems 3.2 Medicién MS/MS Principio del proceso de medi Las moléculas son analizadas en el espectrdmhetro de masas mediante la relacién masacarga (m/z). Para ello hay que ionizar primero las moléculas. El uso de la ionizacién por electrospray en la técnica LC-MS, hha demostrado ser un método especialmente suave para generar iones moleculares, La espectrometria de masas en tindem (sistema MS/MS) utiliza dos espectrémetros de masas conectados consecutivamente. En el primero (MS 1), los iones son separados segin la relacién masa-carga. A confinuacién, los iones llegan a una celda de calisién en la que son fragmentados mediante la colisién con tn gas inerte (argén o nitrégeno). En el segundo espectrémetro (MS 2) se vuelven a analizar los fragmentos caracterizados segin su relacién maso-carga En la técnica MS/MS se contemplan varios lipos de medicién segin el patrén de fragmentacién: Neutral Loss Scan: Una serie de ominodcidos se fragmentan en la celda de colisién , desprendiendo écido férmico con una maze de 46 Dalton (véase fig. 3). En el andlisis de aminodcidos en modo Neutral loss Sean, el primer y el Segundo espectrémelro escanean con una distancia de 46 unidades de masa. De esta forma se genera un spectro de masas muy selective para toda una serie de aminodcidos neviros y acidos. Pero no todos los aminoécidos son detectables con este método de medicién. Por ejemplo, la citulina y la cmitina desprenden amoniaco ademas del dcido férmico, por lo que es mejor analizar estos aminoscidos con un Neutral Loss Sean de 63 (46+17). Por el contrario, la arginina forma un fragmento caracterisico de 70 Dalton, mientras que el dcido asparice y el écido glutémico disocian agua con facilidad. Por ello recomendamos cuantificar todos los aminodcides en modo MRM. ye Ny on — + HCOOH 6 166 (nv2) 120 (me) Neutral Loss 46 Figura 3: Fragmentacién del ién de ferilalanine, desprendiendo acide férmico Multiple Reaction Monitoring (MRM): En el modo MRM ambos selecciona Gnicament pectrSmetros estén ajustados estéticamente @ una masa determinada. MS 1 ‘én molecular, mientras que los iones de diferente masa son suprimidos. El ién molecular se fragmenta a continuacién en la celda de colisién y el fragmento caracterisico es detectado por MS 2. El modo MRM garantiza la mayor selectividad, junto con una alta sensibilidad. Por ello recomendamos cuantificar los aminodcides y tam! las acilearnitinas en modo MRM. Pagina 9 1157000 citode de nena 8 04/2014 V5.1CHRON Parent lon Scan: Jorisico de m/z™ 85 |véose ‘ inas forman un ién fragmento muy carac! En cao de coin fos cleans eran unin Hoge Tamed ae on San, MS 2 Sola) Pere tees TiS 1 escanea los iones moleculares. De esta a m/z = 85, mientras que ech oe eee para las acilearitinas forma se genera un espectro de masas muy selective Debide ola mejor slectvdad y sentbilidod,recomendamos cuanifcar as aciearilinas en modo MRM y Jebido « la mejor selectvidad y sensibilidad, ‘no en modo Parent lon Scan. 0 ou i (CHyyNS — wy eX - ncen=cnX oH oH noo én fragmento m/z = 85 Figura 4: Fragmentacién de las acilcaritinas por pérdida del caracteristico ién fragmento m/z = 85 R= Grupos olauilos (p.ej. R= CH: para la acetilearitina) 3.3. Puesta en funcionamiento Antes de iniciar la serie de andlisis: 1. Antes de iniciar una secuencia de andlisis, las bombas de vacio del sistema LC-MS/MS deben llevar ya 8 horas en funcionamiento. 2. A continuacién, hay que lavar el equipo con unos 10 ml de fase mévil, con una velocidad de Ajo de 200 pl/min, 3. Después, inyectar varias veces los dos controles procesados haste que dos cromatogramas por cada une de los controles sean casi idénicos en sus valores de concentracine intensidades de sefal 4, Después de esto ya se pueden inicia los ands Para un correcto uso del sistema LCMS/MS, es necesaro leer sus insucciones de uso y, en caso necesatio, recibir formacién on el manejo del equipo por parte del fabricante. 3.4 Pausas en el funcionamiento Durante las pausas en el funcionamiento se puede apagar la bomba de HPLC, dejando que la fase mévil ppermanezca en ol sistema de HPLC. Es imposible que se produzca una erstaizacién salina en las guorniciones del émbolo de la bomba de HPLC. Las bombas de vacio del sistema LCMS/MS deberian for constantemente en funcionamiento. Para proteger la fuente de ionizacisn y el mulplicador, el sistema MS/MS debe conectarse en modo Standby. Pagina 10 5700 coe de nena 04/2004 VE?4 Transferencia de masas de los analitos y del estandar interno Los siguientes tablas contienen las transiciones recomendadas y modos de medicién de los analitos y de los estindares internos marcados isotépicamente Aminodcidos Sustancia Modo de medicién Transicién ‘Alanine v MRM 90> Ad Alanine-D4 MRM 94> 48 Arginina MRM 175 >70 ‘ArgininaD7 MRM 182>77 Keido aspartico MRM 134> 116 Acido aspértico -D3 MRM 137>119 Gitrulina MRM 176> 113 Girulina -D2 MRM 178> 115 Acido glutamico / ‘MRM 148 > 130 Acido glutamico -D5 MRM 153 > 135 Glicina vo MRM 76> 30 Glicina -!C2-'SN MRM 79 > 32 Leucina v MRM. 132 > 86 leucine D3 MRM 135 > 89 Metionina MRM 150 > 133 Metionina D3 MRM 153 > 136 Ornitina v MRM 133 >70 Ornitina D6 MRM 139>76 Fenilalanina MRM 166 > 120 Fenilalanina -D5 MRM 171 > 125 Prolina v MRM. 116>70 ProlinaD7 MRM 123577 Tirosing MRM 182 > 136 Tirosina D4 MRM 186 > 140 Valina MRM 118>72 Valine D8 RM 126 > 60 las masas indicadas deben tomarse como punto de partida para la optimizacién. La situacién exacta del maximo de la sefal varia ligeramente en cada sistema MS, y debe determinarse con exaciitud dentro del marco de la ofnacién de la méquina (por lo menos en un decimal después de la coma). Para ello 6 Puede emplear el Tuning Mix (n® de pedido 57099), que contiene todos los analitos y esténdares internos. Pégina 11 157000 crtado de neonon ES 04/2014 V5.)Acilearnitinas y carnitina libre: Ee - Transicién = RM 162> fe CarnitinaD? MRM Zaz v C2Camitina MRM = = _ MRM : ao (acai MRM 218 > 85 ptoprowlorttind €3-CamitineD3 MRM 221 > 85 V Cé.Carnitina MRM 232 > 85 CACarnitineD3 MRM 235 > 85 VC5Camitna MRM 246 > 85 €5-CamitineD9 MRM 255 > 85 « / C5DCCamnitina MRM 276 > 85 C5DCLarnitina-D6 MRM 282 > 85 CéCamitina MRM 260 > 85 CéCaritin-D3 MRM 263 > 85 / C8-Carnitina ‘MRM 288 > 85 C8-CarnitinaD3 MRM 291 > 85 / C10Carnitina MRM 316 > 85 C10-Carnitina D3 MRM 319> 85 S C12Carnitina MRM 344 > 85 C12-Carnitina-D3 MRM 347 > 85 V C14Caritina MRM 372 > 85 C14-Carnitina-D3 MRM. 375 > 85 V_C16Carnitina MRM 400 > 85 C16CerniineD3 MRM 403 > 85 V C18Carnitina MRM 428 > 85 C18-CarnitinaD3 MRM 431 > 85 la cuanfificacién de los analitos se realiza mediante la comparacién de la intensidad de las sefales con el del correspondiente esténdar interno marcado isotépicamente. Ademas, este kit de reaclivos permite el andlisis de un buen némero de acilcarnitinas, interesantes desde el punto de vista diagnéstco, para las que @clualmente no existen esténdares internos marcados isolépicamente. Las acilcarnitinas que poseen la misma longitud de cadena presentan factores de respuesta casi idénticos. Por eso recomendamos cvantifcar estos marcadores de enfermedad con los estéindares devterados de la misma longitud de cadena. Sin embargo, este kit de reactivos sélo esta validado para aquellos analitos que van ‘2compafiados por un esténdar intemo deuterado idéntico (véase la tabla precedente) Pagina 12 m1 57000 ciboda de aonin ES 4/2014 V5.1y CHROMSYSTEMS La tabla siguiente contiene mas acilcarnitinas, sus transiciones y los estandares inlernos mareados isctépicamente recomendados. Estos datos son Gnicamente una recomendacién basada en la praxis cotidiana de varios laboratories de cribado. El kit de reactivos no ha sido validado para estos analites. ‘Aeilearnitinas sinestandares explicitos: Transici6n Exténdar interno recomendado 248 > 85 C3.-Carnitine-D3 Halo wl annitina V C4OHCarmitina 248 > 85 C4-Camnitina-D3 3 HIRROXIOUTIRICARET A, Y_CAdCLemitina 262 > 85 t Hehlwolonleratno. ( C5:1-Carnitina 244 > 85 ‘C5.Carnitina D9 Tiehleorat { _C50HCarnitina 262> 85 C5.CarnitineD9 3 Htbrorn sovaceencana ( €8:1Carntina 286 > 85 C8-Carnitine DS ¥_C10:1-Carnitina 314 >85 10-Carnitina-D3 J G14:2arnitina 368 > 85 C14Carnitine D3 | C14 1-Camitina 370 > 85 C1 ACarnitine D3 V_C14OHCamnitina 388 > 85 C1ACarnitine D3 V_€16:1-Caritina 398 > 85 C16Camitine D3 V_C161OHCarnitina 14> 85 C16 Carnitine D3 ¢_C16OHCaritina B16 > 85 C16CarnitinaD3 —¥ C18:1-Carnitina 426 > 85, €18-Camnitina-D3 <=. “C18:20H-Carniting 440 > 85 C18Camitine D3 V CIBAOHCamitina 442 > 85 C18CamnitineD3 y C18OHCarnitina aad > 85 C18Carnitine DS he MH ceasy cence GO:R — MCad watont one Cl2:4 VLC qumsntore , morn HIM"! oven ch CPE ways | Pagina 13 1 57000 cabo be eonson 5 04/2014 V5.1racién de la muestra 5 Prepai stancias wones acerca de las su: jar atencién a las observar' indice | jo de los reactvos, Pi Nota: En al maneo de los rooclten peligrosas mencio 5.1 Obtencién y conservacién de muestras de pacientes arse entre las 48 y 72 horas de total se deja gotear y seco" robado por la FDA © lo de neonatos debe sit 1004). La sangre ‘de un papel filrante ap: cangre para el cribad I del 21 de diciembre de 2 Recomendamos el uso El momento de extraccién de 5: vida (véase la normativa infant Sobre una tarjeta de papel fitrante. Similar (por ejemplo, Whatman 903) cién nacido, No se puede usar sangre con EDTA 0 fvos 0 falsos positivos en Jobo extraerse del talén del rmncee la aparicién de falsos negoti La muestra de sangre 10 se puede descortar con heparina, ya que entonces nm los resultados de la prueba. ‘A confinuacién se describe brevemente la extraccién de sangre: 1. timpior la zona prevsta de puncién en el alén del neonato con un preparade alcohélico estéril. Secar el falén con una gasa esti 2. Reakizar la puncién con uno lanceta eséril. La punta de [a lanceta debe medir menos de 2 mm, ya que de lo contrario existe el riesgo de dafiar al neonato. 3, Limpiar la primera gota de sangre con una gasa estéri lo de sangre con el papel de fro. Esperar a que la sangre ‘9 ello previsto. No deben apilorse gotas de sangre unas ye que esto provocaria cambios en el volumen de 4, Rozar svavemente la siguiente gota grand gotee y llene completamente el circulo par sobre otras o mojar la tarjeta por ambas caras, sangre por punto y resultados erréneos en el andlisis. 5, Ulenar el resto de los citculos de la tarjeta de papel de filtro con una gota de sangre cada uno. 6. El cvidado de la puncién debe realizarse acorde a los procedimientos establecidos en el hospital. 7. Dejar secor los puntos de sangre durante 4 horas o temperatura ambiente sobre una superti horizontal, seca y no absorbent. 8. Enviar las tarjetas de papel de filro secas al laboratorio en las siguientes 24 horas, Los fabricantes de tarjetas de papel de filtro faciltan instrucciones detalladas sobre la extraccién de muestras; también se pueden extraer de la normativa infantil del 21 de diciembre de 2004. Las muestras de sangre seca se conservan estables 0 ! “ i 9 conserv lemperatura ambiente (+20 a +25 °C) 0 refrigeradas (+2.a +8 °C) hasta 21 dias. En caso de almacenamiento més prolongado, las muestras det enarvorecongolads y protgias henle ola humedd a tempertas de menos de-18 °C. Evite tamparauras de més de 37 °C Eto puede provocar la radvecin de la concentracién de algunos Péigina 14 m1 57000 citade de nanan ES 04/2014 V5.1CHROMSYSTEMS 5.2 Reconstitucién del estandar interno Elesténdar interno (n° de pedido $7004) sive como calibrador de coda muestra individual. s razable o Patrones de sustancias puras marcadas isotépicamente abtenidas de un proveedor cerficado, tl ectandey interno se afiade, tras su reconstiucién, en cantidades definidas a cada muesivay es sometide o todo al Proceso de preparacién de muestas. El estindar intern lifilizado se reconsiuye con exactamente 25 ml de Extraction Buffer (n° de pedido 57008). Para ello es necesario abrir un frasco de ‘estandar interno y disolver el contenido en 5 ml de Extraction Buffer. Dejar reposar unos 5 min. a temperatura ambiente agitando ocosionalmente el frasco. Inroducir el contenido de la botella en un matraz oforade de 25 Enjuagar 2 veces més el frasco de esténdar inferno con 5 ml de Extraction Buffer y verter en el matron Ulenar el matraz con Extraction Buffer hasta los 25 ml y mezclar. (Evitar la luz del sol direciol Los concentraciones dependen del lote de fabricacién y deben consultarse en la hoja de informacién del esténdar interno correspondiente Estabilidad del estindar interno reconstituido: El estindar interno reconstituido es estable hasta 3 semanas, si se protege de la luz, se cierra herméticamente y se almacena en frio (+2 hasta +8 °C) 5.3. Manipulacién de los controles de sangre seca Los controles de Dried Blood Spot Level | (n° de pedido 0192) y Level Il (n® de pedido 0193) son somelidos a los mismos procesos de preparacién de muestras que las muestras de los pacientes. Los controles procesades se incluyen en cada serie para controlar la exacitud y la precsién del sistema, El embalaie con ci fe de cremallera contiene el material de control, un desecante y un indicador de humedad. Se debe controlar el nivel de humedad cada vez que se abre el embalaje. Si el indicador de humedad cambia sv color de azul « rosado al 50 % de nivel, entonces hay que regenerar el desecante colenténdolo durante 4 horas a 60 *C. Para prategerlo del agua de condensacién, el embalaje debe abrirse cuando los controles congelados se hayan colentado temperatura ambiente. Hay que introducir el material de control sobrante en el embalaje nada més terminar de usarlo, cerrar la cremallera y calmacenarlo a temperaturas de menos de -18 °C. Elembalaje con cierre de cremallera esté provisto de un indicador de temperatura. La coloracién irreversible del indicador de blanco a negro indica que se ha alcanzado la temperatura correspondiente. Evite temperaturas de més de 37 °C. Esto puede provocar la reduccién de la concentracién de algunos ‘naltos (aminodcidos). Evitar la luz del sol directa sobre los controles. Las concentraciones dependen del lote de fabricacién y deben consultarse en la hoja de informacién del control correspondiente, Atenciénl: Este producto ha sido producido a partir de un pel de sangre total humana al que se le han practicado onélisis para detectar anticuerpos de VIH 1/2, ADN de VIH, VCH y VBH (PCR), antigenos HBs, ‘anticuerpos HBc y también un ensayo TPHA, sis posible descortar totalmente un riesgo de infec: do el resultado del andlisis negative. Sin embargo, no es n al usar este producto, ya que no existe ningin método de anélisis absolutamente seguro, ni métodos de andlisis para todas las enfermedades, ademas de poder conter agentes patégenos actualmente desconocidos, Por estos motives recomendames que todos los Productos que contengan materiales humanos sean considerados como potencialmente infecciosos. Al usar ‘estos productos 50 lienen que cumplir las mismas medidas de precaucién que en el manejo de muestras de pacientes potencialmenteinfecciosas 15 0157000 ceded rena ts 04/2014 ¥51CHROMSYSTENS 5.4. Proceso de preparacién de muestras 5.4.1 Preparacién de muestras sin placa filtrante 1 amzonde emt od ltl conn ma de 3mm sobre ne placa depois Ti anisi00 ic é Jaca con una lamina ‘adit cesténdor interno reconsituido (véase cap. 5.2). Cubrt la placo pee ease alt} {urante 20 min a temperatura ambiente a 600 rpm. protectora (n® de pedido 55011) y agitar di 3, Trasvate: Ratner le liming de la placa, Posar lo fraccién sobrenadante o una nueva placa. Sellar la placa con una lamina adhesiva perforable(n® de pedido $5013). 4, Inyeccién Inyectar 10 pl del eluato en el sistema de LC-MS/MS. 5. Control de calidad: En cada serie de andlsis se deberian realizar controles para documentar la precisin y la exaciitud. 5.4.2 Preparacién de muestras con placa filtrante 1, Punzonado de la muestra: Posicionar una placa de 96 pocllos sobre una placa con fondo en V. Recortar el punto de sangre seca de la tarjeta, con un didmetro de 3 mm, sobre una placa fitrante, 2. Extraccién: Ajiadir 100 pl del esténdar interno reconstitvido (véase cap. 5.2) a cada muestra. Cubrir la placa filrante con una kimina protectora (n° de pedide 55011) y agitar las placas superpuestas durante 20 «2 600 rpm. min o lemperatura ambi 3. Centrifugado: Retirar la lémina de Ia placa filrante. Centrifugar durante 2 min a 4.000 rpm la fraccién sobrenadante ‘al fondo en V de la placa. Retirar la placa fitrante y sellar la placa con una Idmina adhesiva perforable (n° de pedido 55013) 4, Inyeccién: Inyectar 10 pl del eluato en el sistema de LCMS/MS. 5. Control de calidad: En cada serie de andlsis se deberian realizar controles para documentar la precisién y la exacttud. = Use para la preparacién de muestas Gnicamente los reactvos, placas y Kiminas recubridoras suminisradas. Los cambios en la preparacién de muestras alteran el rendimiento del kit de reactivos. = Sise uilizan léminas adhesivas perforables (n° de pedido 55013) para la inyeccién, se recomienda un autoinyector para minimizar la evaporacién de la muestra. Nota! Pagina 16 11570 cron de mont 0/2014 V5)CHROMSYSTEMS 5.5 Estabilidad de las muestras preparadas ‘Los elvatos/muestras procesadas se conservan hasta 10 dias a temperatura ambiente (+20 °C hasta +25 *C) 0 en el frigorifico (+2 hasta +8 °C] (en recipientes herméticos y protegidos de la luz). 5.6 Equipamiento adicional necesario, no incluido en el kit El kit de reactivos para el andlsis por LC-MS/MS de aminodcidos y acilearntinas en sang cribado (screening) de neonaios / no derivatizado req ~ Espectrémetro en tandem con software de eélculo = Sistema de HPLC con bomba, inyector y autoinyector Perforador manual o avtométice para punzonar la muest Un agitador de placas para la extraccién de la muestra, Lab4you Rodilo de cierre de goma para sellar las placas con las laminas = Pipetas o pipetas mulicanal, 100 1 ~ Putas de pipeta Motraz aforado de 25 ml Opcional: contfugadora para placas firantes de 96 pocillos eco para el 2 el siguiente equipamiento no incluido en el kit: tra, 3 mm de diémetro pe), Thermo Shaker PST-6OHL-4 de 6 Registro de datos y calculo El estandar interno sive como calibrador individual para cada muestra, de forma que los efectos de matriz se reduzcan a vn minimo, Para ello se afadiré « la muestra (control, muestra del paciente) una cantided definida del estindar interno. Las concentraciones de los compuestos marcados isotépicamente en ol esténdar interno dependen del lote de fabricacién y se deben consultar en lo hoja de informacién adjunta «al esténdar de calibracién correspondiente. Para poder cuanifcar una muestra se requier l volumen de sangre empleada. El volumen de sangre que hay en un disco de papel fitrante depende del diémetro punzonado, del hematocrito de la muestra y del material del papel fitrante, Con vn diémetro de punzonado de 3 mm, un hematocrito de 0,35 a 0,45 y un papel fitrante de la marca Whatman 903, el volumen medio de sangre es de 3,1 pl. Dado que el volumen varia en cada muestra, este cribado es un proceso de andlisis semicuantitativo. Por ello, para confirmar resultados de cribado positives hay que realizar pruebas de laboratorio adicionales. Antes de onalizar muestras de pacientes hay que realizar ciclos de prueba. Para ello, se inyecta varias ‘veces una alicuota de los controles procesados, hasta que dos espectros de masas consecutivos sean casi idénticos en sus valores de concentracién e intensidades de sefal Dependiendo del software, se necestarén la concentracién del estindar interno y el volumen de sangre o las concentraciones del estandar interno referidas a la muestra. En el cuadro de célculo, introducir las concentraciones correspondientes (véase hoja de informacién) del estandar interno: Pagina 17 1 57000 cata de maraon 5 04/2014 V5.1eee eae CHROMSYSTENS Aminodcidos: ~ Concentracién referida« fa muestra para 100 pl 18/3,1 l do sangre Concentracién Internal Stondard Alonina-Da ArgininoD? Acido asparticoD3 irvine? : Acide glurimico DS Glicina-"C2°N Levcine-d3 Metionino-D3 Omitine D6 Fenilolanina-D5 Prolina-D7 Tirosina-D4 Volina.D8 ver hoja informativa ver hoje informativa iSien su laberatorio se usa otro tamaiio de punzonado (volumen de muestra, hay que corregir correspondientemente las concentraciones de esténdar interno referidas « la muecl Acilcarnitinas y carnitina libre ‘Concentracién Concentracién referida a la muestra Internal Standard Para 100 pl IS/3,1 pl de sangre. (pmol/l) (pmol) COCarnitinaD9 ver hoja informativa hoja informativa C2.CamitinaD3 oes C3-CamitinaD3 ae CACarnitino-D3 ae C5Carnitina D9 : ts C5DC-Carnitine-D6 C6Carnitina-D3 8-Carnitine-D3 C10Carnitino-D3 C12Larnitino D3 C14Carnitine D3 C16-Carnitine-D3 C18-CamitinaD3 oe {Si en su laboratorio se usa otro tamaio de punzonado (volumen de muestra], hay que corregir 36h 38-42 SG, >36h todas las SG, >0h ‘Alanina 583 564 736 Arginina - 52 49 ‘55 Acido aspartic 420 402 420 Gitrulina + 50 51 50 Acido glutamico 1074 1087 1073 Glicina 1003 962 1001 Leucine © 27 299 276 Metionina 35 35 7 Omnitina * 454 455 453 /Fenilalanina + 127, 124 141 Prolina ‘ain no establecido ‘ain no establecido ‘ain no establecido Tirosina + 248 217 248 1 Valin 192 199 212 Péigina 19 1157000 Cibado de neonates 04/2014 V5.1CHROMSYSTEMS q 55,87 54,96 (C2.Camitina TAZ 73,40 C3.Carnitina 6,35 641 Cé.Carnitina 1,07 1,18 (C5Camitina 0,43 0,37, (C5DCCarnitina 0,56 0,58 (CéCamitina 0,17 017 (C8-Camitina 0,24 0,24 C10Carnitina 0,35 0,29 C12Carnitina 0,35 0,31 Cl4-Carnitina 0,50) 0.49, C16Carnitina 9,90 10,03 C18Carnitina 2,06 2,07 Estos valores de corte son sélo valores orientativos y pueden variar dependiendo del colectivo de pacientes o del sistema MS/MS empleado. Cada laboratorio de cribado deberia establecer sus propios valores de corte en un estudio piloto y en colaboracién con un experto en metabolismo. Péigina 20 1157000 cibada de reo 04/2014 V5.1CHROMSYSTEMS 9 Factores de conversion La siguiente tabla conti iene los factores de conversié ent molares, y a la inversa. ee noi Aminodcides: pmol/l en mg/l pmol/l x 0,0891 x11,223, Arginina x0,1742 x 5,7405 Acido aspartico x0,1331 x7,5126 Cirulina x0,1752 5,708) Acido glutémico x0,1471 x 6,7967 Glicina x 0,0751 x 13,321 Leucina x0,1312 x7,6237 Metionina x0,1492 x 6,7020 Omnitina x0,1922 x7,5666 Fenilalanina x0,1652 x 6,0536 Prolina x0,1151 x 8,6858 Tirosina x0,1812 x5,5191 Valina x0,1172 x 8,5361 Acilcarnitinas y carnitina libre: Analito pmol/l CO-Carnitina €2-Camitina x 0,2032 C3-Carnitina x0,2172 (CACarnitina x0,2312 (C5.Larnitna x 0,2452 C5DCCamnitina 0,2753 Cé-Camitina x0,2593 C8Larnitina x 0,2874 C10-Carnitina x0,3154 C12-Carnitina x0,3435 C14Cornitina x0,3715 C16Carnitina x0,3996 C18Cornitina x 0,4276 Pigina 21 1157000 creado de eons 5 04/2014 V5.1| CHROMSYSTEMS y caducidad de los reactivos 10 Almacenamiento umplan las los reactivos no abierios son extables hasta la fecha indicada en la etiqueta mientras s° ¢ condiciones de almacenamiento indicadas en la misma Condiciones de almacenamiento: Producto i Mobile Phase Temperatura ambiente Rinsing Solution Temperatura ambiente Temperatura ambi Extraction Buffer Placas de 96 pocillos Placas fitrantes de 96 pocillos Temperatura ambiente Léminas protectoras Temperatura ambiente Tuning Mix +Zhasta +8 °C Internal Standard bajo -18°C bajo -18°C Dried Blood Spot Control, Level | and Il Los reactives se deben cerrar y almacenar correciamente inmediatamente después de su uso. Sino se indica lo contrario, la estabilidad es de un aio después de la fecha de apertura, no obstante, nunca més alld de la fecha de caducidad indicada. Para el estindar interno y los controles, ver los capitulos 5.2 y 5.3, 11 Tratamiento de los residuos La Mobile Phase, Rinsing Solution, Extraction Buffer y Tuning Mix, asi como los restos de las muestras cextraidas, contienen solventes orgénicos y deben ser eliminadas correctamente segin establezcan las normas locales, Pagina 22 1 57000 cibed dence ES 04/2014 V5.1y CHROMSYSTEMS 12 Ejemplos de espectros 12.1 Espectro de un control en el Grea del valor de corte de los aminodcidos Fenilcetonuria: 418 pmol/l fenilalanina (m/z = 166) 200 pmol/l fenilalanina-DS (m/z = 171) Pagina 23 wi s7000 cated de minis 04/2014 V5.1a = corte de las 12.3 Espectro de un control en el drea del valor de c acilcarnitinas MCAD: — 9,93 pmol/l C8-Carnitina (m/z = 288) 1,25 pmol/l C8.Carniting-D3 (m/z = 291) Péigina 24 1 57000 crtdo demeanor 5 04/2014 V5.1CHROMSYSTEMS 12.5 Espectro de la muestra de un Paciente con VLCADD VICAD: 3,11 pmol/l C14-comitina (m/z = 372); 18,89 pmol/l C1écamitina (m/z = 400) 1,25 pmol/l C1 4-carnitina-D3 (m/z = 375); 2,25 pmol/l Cl 6-carnitine-D3 (m/z = 403) 12.6 Espectro de la muestra de un paciente con aciduria glutarica tipo | (GA}) GAL: 5,43 pmol/l C5DC-Carnitina (m/z = 276) 1,25 pmol/l C5DC-Carnitina (m/z = 282) Pagina 25 misracn cin de aonacn ts 04/2014 V5carouststens © 13 Interferencias conocidas Por favor, tenga en cuenta lo siguiente: Le concentracién medida en la muestra es una suma de ambos ‘+ La isoleucina interfiere con la leucina. compuestos. ir jdroxiprolina son despreciables 1a hidroxiprolina interfere con Ia leucina. Los valores normales de hidroxiprol P a ‘lor de la loucina Por ello, en los mediciones de rtina la hidroiprolina no deberia ocasionar riveles de leucine falsamente elevados. ‘© Lo metioninsulfona interfere con la lirosina. La metioninsulfona es un producto de la descomposicién de la metionina. El nivel normal de metionina en recién nacidos ronda los 20 pmol/l. Las concentraciones de metioninsulfona se deberian hallar en este rango como méximo. El nivel patoligico de la firosina es de aproximadamente 300 pmol/l. Por ello, en las mediciones de rutina la metioninsulfona no deberia contribuir en exceso a obtener niveles de tirosina falsamente elevados. ‘+ El metionin-sulféxido interfiere con la tirosina y la fenilalanina. El metionin-sulféxido es un producto de la oxidacién de la metionina. El nivel normal de metionina en recién nacidos ronda los 20 ymol/|, Las concentraciones de metionin-sultéxido se deberian hallar en este rango como maximo. El nivel patolégico de la firosina y fenilalanina es de aproximadamente 100-300 pmol/l. Por ello, en las mediciones de rutina el metionin-sultéxido no deberia contribuir en exceso a obtener niveles falsamente elevados. + La asparagina interiere con la ornitina. Los niveles normales de asparagina en recién nacidos alcanzan un méximo de 140 pmol/l. Es necesaria una concentracién de asparagina de més de 300 pmol/| para provocar un aumento del 20% en Ia concentracién de ornitina. Por ello, en las mediciones de rutina la esparagina no deberia ocasionar niveles de ornitina falsamente elevados. la sarcosina interfiere con la alanina. Los valores normales de sarcosina son despreciables frente a los ria ocasionar concentraciones de la alanina, Por ello, en las mediciones de rutin la sarcosina no del falsamente elevadas. lo creatina, un suplemento alimenticio para el desarrollo muscular, intefiere con la alanina y la leucina, 4-aminoantipirina, un metabolito del analgésico Metamizol (p. ej. Novalginat], interfere con C2- caritina, *+ Las acilcarnitinas isobaras con fragmentacién idéntica se caleulan como una suma. Aqui corresponden los siguientes pares de acilcarnitinas: C3DC/C40H; C4DC/CSOH; C5DC/C6OH ete. tas de plastco (placas, Iéminas) que son usados en la preparacién de muestras + Los aditivs en recipi pueden interfrir considerablemente con algunas acilearitnas y arrojar as flsos positives entre los ¢ fodos los reactvos y recipientes de resultados. Por este motivo, este kit de reactvos cont preparacién de muestras necesarios para realizar una analtica libre de interferencias En aquellos pacientes que reciben alimentacién parenteral, en la que la frosina es sustivida por aceti- war el coc firosina, la concentracién de frosina puede ser baja. Esto p ‘parentando ser una fenilcetonuria, aunque la concentracién de fenilalanina e normal, Pagina 26 1157000 citmda deren ES 04/2004 V5.). CHROMSYSTEMS + Enlos pacientes que han recibido tratamiento antibidico a pivailearnitina, un isémero de la isovalerilearitina, C5-carntina. Esto puede llegar a inferpretarse orré aunque no haya ningén trastorno metabslico, base de dcido pivélico, la formacién de puede provocar un aumento de la concentracién de neamente como una acidemia isovalérica (IVA, En caso de que tuviera preguntas sobre posiblesinterferencios, ‘externa o llame a nuestra linea directa en Munich: Phone: +49 89 18930-300 Email: mailbox@chromsystems.com. éngase en contacto con nuestro servicio Pagina 27 mi svooncitosederanaon€5 04/2014 V5.1Problema No se puede generar el perfil gradval Seales de interferencia No hay sefiales Baja intensidad de sefial No hay vacio No hay gas Causa posible Bomba de HPLC Aire en el sistema La velocidad de flujo no es constante Sistema de inyeccién sucio Viales del autoinyector sucios Septum del recipiente de muestras Inyector averiado Bomba averiada EI sistema LC-MS/MS no esié listo para su uso Fuente de iones sucia Espectrémetro de masas sucio La valvula de inyeccién te fugas El multiplicador esté viejo Desplazamiento de masas on el espectrémetro de masas Bomba de vacio averiada Fuga en ol sistema de vacio Generador de nirdgeno averiado Compresor averidado Bombona de gas vacia la presién de entrada de gas no st6 dentro del rango nominal Comprobar la bomba (aire, estanqueidad) Desgasificar (purgar) el equipo de HPLC Comprobar la bomba Limpiar con metanol, o inyectar 10 veces Mobile Phase Usar viales nuevos o limpiarlos con metanol Usiizar otro septum Comprobar el inyector Comprobar la bomba ‘Comprobar el sistema MS/MS Limpiar la fuente de iones ‘Massenspektrometer reinigon Comprobar el inyector Cambiar e! muliplicador Calibracién del expectrémetro Comprobar las bombas anterior y superior de vacio Comprobar los tubos y conexiones de vacio Comprobar el generader de nitrégono ‘Comprobar el compresor Cambiar la bombona de gas Regular la presién de entrada de gos Pagina 28 1157000 crtmds dando ES 04/2004 V5 1CHROMSYSTEMS 15 Bibliografia 1. 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Nociva) $1636/37 Conservar alejado de toda llama o fuente de chiapas - No fumar Usense indumentaria y guantes de proteccién adecuados, F (Féicimenteinflamable) Rinsing Solution (n° de pedido 57007) R11-20/21/22.96 Fécilmenteinflamable "Nocivo por inhelacién, por ingesisn y en contacto con la piel Inita los ojos. $1636/37 Conservar alejado de toda lama o fuente de chispas - No fumor. Usar indumentaria y guantes de proteccién adecuados. F (Fécmente infamable) Extraction Buffer (n° de pedido 57008) R11-23/24/25-39/23/24/25 Fécilmenteinflamable. Téxico por inhalacién, por ingestién y en contacto con la pie T México) Téxico: peligro de efectos irreversbles muy graves por inhalacién, contacto con la piel ¢ ingestén $7.1636/97-45 ‘Mantener el recipionte bien cerrado, Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar. pr scree smoratll 21 sc indormrbaiay guntos du pssodss eiscecon En caro de accdente © malestar,acudirnmediatamenie ol mécico (ses posible, moskor le efqueta) Pagina 30 57000 Crt demon ES 04/2014 V5CHROMSYSTEMS simbolos de peligro | Frases Ry S Tuning Mix (n® de pedido 57099) R11-20/21/22-36 Facimente inflamable Nocivo por inhalacién, por ingestién y en contacto con la piel. Inrita los ojos. $16-36/37 Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar. Usar indumentaria y guantes de proteccién adecuados. F (FéciImenteinflamable) Estos elementos han sido clasificados como no peligrasos acorde a la legislacién de la Unién Europea: intemal Standard (n® de pedido 57004) MessCheck* Dried Blood Spot Controls (n° de pedido 0191, 0192, 0193) Apéndice Il: Indicaciones para el calculo manual Las concentraciones de analitos on las muestras se calculan acorde al siguiente principio: + Intensidad de sefial de la sustancia A en el espectro de la muestra = Amuesra + Intensidad de sefial del esténdar interno en el espectro de la muestra = ElMuesra + Concentracién C del estindar interno referida a la muestra = Ceténdor La concentrackn Cis, amie on Ta muestra se colula de ka siguinie fra: om Crete, meesra (pmol/l) = —————_ x Cinder eeeCHROMSYSTEMS \ Apéndice Ill: Datos de validacion idas de In de comprobar la lineadady validr el método, se afadieron canidades conc CP canny Veomitnas a muesas de songre lls alesis de ccs preporacoes © a minodcides y aciearniinas a mues : a re sometidas al proceso de preparacién de musstras. Las mediciones en oy ioe API 3200 masas Waters Micromass Quattro Micro API (sino se indica lo con Pora todos las mediciones se usé Ia ionizacién por electrospray (ES!) jonentes del kit los datos se caleularon en nuestros laborateros con los correspondientes component i exclsivamente pare el compliion dels requstsrelomeriarios. Los datos no represnton ningin Ho de evaluacién sobre el rendimiento general de los correspondientes espectrémetros de masas, ni implican ningén tipo de valoracién sobre dichos espectrémetros de masas Tasas de recuperacién: . {a recuperacién analtca se determiné o pari de la pendiente de las lineas de calibracién de varias muestas de sangre y diluciones de soluciones esténdar: Acilearitinas y carnitina libre: Aminodcidos Tasas de recuperacién E Tasos de a a [Teese Ci es Quatro Micro Quatro Micro ‘Alanina of 79 CoCemiina |S ‘Aginina 1 20 C2.Camitna 26 Aeide aspartco €8 C3Comitina 9 Gitrling 94 CéLamnitina 88 Acido glutamico 81 ‘C5-Caritina 92 Glicina a1 €5DC-Camitina | 91 Leucina 86 C6-Carnitina I 90 Metioning 90 C8.Caritina 91 Orniing 86 ClOCamitina 92 Fenilalanina 94 C12-Carnitina 94 Prolina® 89 Cl4Camitina 4 Tiresina 93 C16Caritina 94 Valina’ 90 C18Carmtina 87 * Estos datos se calcularon en un AB Sciex AP! 4000. Pagina 32 115700 cron de neat 04/2014 ¥51CHROMSYSTEMS Aminodcidos: Acilcarnitinas y carnitina libre: | P1820 Alanina 73 COCarnitina Aiginina 4 C2-Carniina 80 Acido aspartico 74 C3-Carnitina 72 Citrine 80 (CACamiina 7% Acido glutamico 68 C5-Carnitina 88 Glicina 78 C5DCCamitina 102 Levcina | 7 C6Camitina | 73 Metionina 73 C8.Carnitina| 72 Ornitina 85 C1OCaritina 70 Ferilalanina 77 (C12-Carnitina 64 Proling 74 C14Caritina 63 Tirosina 78 C16Camitina 66 Valine 74 C18Carnitna 65 inealidad / Lis Ellimite del onélisisy la linealidad se determiné diluyendo el eluato de una muestra de sangre procesada con esténdar interno. E| método se desarrolla linealmente a partir del limite inferior hasta, por lo menos, el Vimite superior de ondlisis indicado. Aminoécidos: ‘Alanine 2000 Argini é 2000 Acido aspartico 15,6 2000 Giratina 78 2000 Acido glutamico 15,6 2000 Glicina 156 2000 eucina 15,6 2000 Metionina 78 2000 Ornitine 7.8 2000 Fenilalanina 7.8 2000 Prolina® 48 2400 Tirosine 156 2000 Valing 15,6 2000 * Estos datos se calcularon en un AB Sciex API 4000. Pagina 33 sco cade denen ES 04/7014 V4.1Alanina Arginina Acido aspéirtico Citrulina Acido glutmico Glicina 10.5 2000 Leucina 13,0 2000 Metionina 5 2000 Ornitina 8,0 2000 Fenilalanina 6,0 2000 Prolina 5,0 2400 Tirosina 12,0 2000 Valina 165 2000 Acilearnitinas y carnitina libre: esas Limite de cuantificacién ponee teal (ymol/) aprox. fei | Quattro CO-Carnitina 16 200 C2-Camitina 16 200 €3-Camitina 02 50 CACamitina 02 25 C5.Carnitina 02 25 C5DC-Carnitina 02 25 CéCamitina 02 25 C8-Carnitina 0,2 25 C10-Carnitine 0,2 25 C12-Camitina 0,2 25, C14Cornitina On 25. C16Camitina 1 aa (C18-Camnitina 1 2 Péigina 34 1157000 Crbmdo de neni 04/2014 V5.1y CHROMSYSTEMS Analito COCamitina 15 700 C2Camnitina 1,0 700 C3.Camnitina 0,1 0 Cé-Carnitina 02 7 C5Carnitina 02 7 C5DC-Camitina 01 5 (CéCarnitina 0,1 5 C8Carnitina 02 25 C10-Carnitina 01 25 C12-Comiting| On 25 C14Carnitina 0,1 25 C16-Carnitina 1 33 C18-Carnitina 0) 33 Reproducibilided Intra-ensayo: os coeficientes de variacién se caleularon mediante un procesamiento maliple (n= 10] de la misma prueba; usando tres concentraciones diferentes: ‘Aminodcidos: = “Coeficiente de variacién (94) n= 100 ee S (Goncsem uc had pacl Quatro Micro Alonina 5,2 (281) 4,7 (390) 4,6 (745) 4217) Toatiay | 3,4 (125) 47 (96) 5,1 (147), 5.8 (345) 7,161) 3,0 (388) 6,0 (336) 2,9 (281) 4,0 (62) * Estos datos se calcularon en un AB Sciex API 4000. Pagina 35 1 7010 cited eons 0/204 V5. 5,0 (256) 3,8 (749)CHROMSYSTEMS © Cosficonte de variacién(%)n= 1000 ‘AP13200 5 Asginina 2,5 (19) 1,7 (80) 3,3 (167) Acido aspértico 3,9 (180) 2,5 (231) 4,0 (461) Citrulina 3,8 (26) 4,6 (73) 3,8 (275) Acido glutimico 2,0 (482) 3,8 (433) 4,3 (876) Glicina 8,3 (285) 5,9 (389) 7,2 (1032) Leucina 3,4 (348) 2,0 (351) 4,3 (637) Metionina 4,7 (36) 3,3 (73) 4,3 (238) Ornitina 2,3 (251) 1,9 (220) 4,0 (677) Fenilalanina 1,8 (117) 2,1 (196) 4,2 (572) Prolina 3,5 (332) 2,6 (481) 4,2 (716) Tirosina 2,2 (96) 1,9 (192) 4,3 (585) Valina 3,1 (221) 1,9 (267) 4,0 (520) Acilearnitinas y carnitina libre: Coeficiente de variacién (%) n = 10 goat (concenracién en pmol} Quattro Micro CO-Carnitina 4,7 (26,4) (48,0) 4,1 (105) C2.Carnitina 5,5 (15,2) 2,7 (39,5) 2,6 (81,6) C3-Carnitina 6,1 (1,78) 2,7 (6,54) 2,7 (15,1) C4-Caritina 6,2 (0,34) 4,9 (1,15) 4,0 (4,42) C5-Carnitina 8,1 (0,14) 4,0 (0,60) 3,9 (2,35) C5DC-Cornitina 12,2 (0,19) 12,2 (0,66) 9,0 (2,38) C6Carnitina 9,6 (0,06) 3,2 (0,48) 4,1 (2,11) C8-Carnitina 8,5 (0,10) 3,9 (0,57) 4,2 (2,31) C10-Carniting 8,2 (0,16) 3,7 (0,63) 3,1 (2,44) C12Carnitina 8,1 (0,07) 3,8 (0,52) 3,5 (2,25) Cl4Carnitina 10,3 (0,10) 4,6 (0,50) 3,8 (2,00) C16Carnitina 5,7 (0,72) 4,9 (4,56) 3,3 (12,2) C18-Camitina 6,6 (0,54) 4,9 (2,26) 5,2 (7,69) Pagina 36 157000 Cibde de nena £5 04/2014 V8)CHROMSYSTEMS ‘Analito res de variacién (%) n= 10 APL3200 CO-Camitina 4,0 (26,5) 3,1 (40,7) 4,5 (108) (C2-Carnitina 2,8 (10,3) 3,2 (28,5) 4,4 (75,4) C3-Camitina 5,5 (1,30) 3,1 (5,84) 4,9 (16,7) Cé-Carnitina 3,5 (0,19) 3,3 (1,04) 5,5 (4,84) (C5.Carnitina 6,6 (0,09) 2,9 (0,60) 4,9 (2,70) C5DC-Cornitina 9,0 (0,16) 8,7 (0,58) 5,1 (2,16) CéCarnitina 9,4 (0,04) 2,5 (0,49) 47 (2,43) C8&Carnitina 3,0 (0,04) 4,6 (0,51) 4,1 (2,53) C10Carnitina 3,1 (0,08) 4,9 (0,50) 6,0 (2,47) €12-Carnitina 6,8 (0,04) 4,1 (0,47) 5,8 (2,36) (C1ACarnitina 7,8 (0,08) 4,6 (0,52) 3,9 (2,45) C16Carnitina 2,9 (0,79) 42 (4,91) 5,5 (14,3) C18Camnitina 5,1 (0,56) 2,8 (2,54) 5,5 (9,38) Reproducibilidad Inter-ensayo: \a reproducibilidad inter-ensayo se calculé mediante un procesamiento multiple (n= 10] de 3 concentraciones disintas de la misma muestra en 10 dias diferentes: Aminodcidos Coeficiente de variacién (%) n= 1 Aoali ( Sree Alanine 6,6 (281) 7,9 (390) 5,6 (745), Arginina 9,3 (7) 17,6 (12) 10,3 (125) Acido aspértico 6,4 (96) 6,7 (147) 6,1 (345) iru 11,4 (20) 7,6 (61) 5,7 (256) Acido glutémico 6,1 (218) 7,0 (388) 5,4 (749) Glicina 8,4 (241) 8,3 (336) 6,0 (1085) Leucina 5,8 (181) 6,3 (281) 5,5 (592) Metionina 67 (19) 6,3 (62) 5,4 (268) Orting 9,4 (95) 8,8 (217) 8,6 (626) Fenilalonina 5,9 (69) 66 (129) 5,0 (566) 7.7 (2a) 8,2 (562) 7,1 (869) 5,3 169) 5,8 (158) 4,9 (488) 7.3() 8,2(171) 5,7 (365) Estos datos se calcularon en un AB Sciex API 4000. Pagina 37 1 57000 cite de ents 8 0472014 V1CHROMSYSTEMS ‘Alaina 10,1 (392) 10,2 (411) 7.7 (752) 42 (18) 3,6 (80) 3,5 (167) Arginine E an) Feido expérico 62177) 6,3 (231) Aa Girtna 61 (25) 46,73) 5,2 (275) eid ghtdmico 5,7 (469) 5,1 (433) 5,9 (876) Giicina 12,0 (295) 11,9 (389) 10,3 (1032) Leucina 5,1 (345) 5,5 (351) 5,2 (637) Mefionina 5,7 (35) 5,3 (73) 5,0 (238) Ornitina 4,8 (236) 3,8 (220) 5,0 (677) Fenilalanina 5,2 (118) 7,0 (196) 5,4 (572) Prolina 6,3 (330) 5,3 (481) 5,2 (716) Tirosina 4,1 (96) 7,3 (192) 5,5 (585) Valina 62 (214) 5,0 (267) 5,4 (520) Acilearnitinas y carnitina libre: 7,1 (48,0) 6,1 (105) 6,1 (15,2) 6,5 (39,5) 5,1 (81,6) 5,8 (1,78) 6,8 (6,54) 5,3(15,1) 7,0 (0,34) 6,8 (1,15) 5,2 (4,42) 85 (0,14) 7,0 (0,60) 5,8 (2,35) C5DC-Camitina 14,3 (0,19) 11,7 (0,66) 9,0 (2,38) CéCarnitina 13,3 (0,06) 7,4 (0,48) 5,6 (2,11) (C8-Camitina 9,30,10) 7,6 (0,57) 5,6 (2,31) ClOCarnitina 7.8 (0,16) 7,0 (0,63) 5,5 (2,44) C12-Camitna 9.1 (0,07) 9 (0,52) 57 (2,25) (C14Caritna 8,8 (0,10) 7,1 10,50) 6,1 (2,00) C16Carniina 640,72) 6,6 (4,56) 5,5 (12,2) 18-Comiting 63 (0,54) 68 (2,26) 557,69) Pigina 38 15700 Cadden 42014 V5CHROMSYSTEMS Coeficiente de variacién (%) n= ace + (eoncentracién en Act i API3200 C2.Carritina 5,4 (10,2) 5.1 (28) SADE C3-Carnitina 5,9 (1,27) 5,3 (5,84) 5,8 (167) Se 6,6(0,18) 5:2 (1,04) 58 (484) C5.Camitina 7,6 (0,08) TT) oa C5DC-Comifina 13,7 (0,18) 8,9 (0,58) 6,6 (2,16) CoCamitina 9.8 (0,04) 5,6 (0,49) 5,5 (2,43) C8-Carnitina 6,8 (0,04) 5,8 (0,51) 5,4 (2,53) C10-Comitina 6,1 (0,08) 6,1 (0,50) 57 (2,47) C12-Carnitina 7,2 (0,04) 6,0 (0,47) 5,7 (2,36) C1 4Carnitina 7,0 (0,08) 5,9 (0,52) 5,0 (2,45) C16-Camitina 57 (0,771 5,149) 48 (14,3) C18Carnitina 5,1 (0,54) 4,8 (2,54) 4,9 (9,38) Pagina 39 sy sre cide demos 47014 VS