UNITAT 2: INSTAL·LACIONS EN EL LABORATORI MICROBIOLÒGIC

Han d’haver dos dependències diferenciades i clarament designades:

 Zona auxiliar (vestuari, magatzem, oficines...)

 Zona d’assaig.

Les àrees han d’estar diferenciades:

 Area de reacció i emmagatzematge.

 Area de preparació de mostres.
 Area analítica diferenciada.
 Area de preparació de cultius, reactius, esterilització, desinfecció, emmagatzematge i
rentat de material.

Recomanacions per reduir la contaminació i facilitar les tasques de neteja.

 Disseny Mantenir netes i ordenades les zones de treball espaioses.

Ventilació. Natural.

Forçada.

Aire acondicionat.

Unions de parets, sols i sostres còncaves.

Espai d’emmagatzematge.

Les canonades no han de passar per llocs de treball.

Les finestres no han de tenir persianes ni cortines, si hi ha, han de tenir un

pla de desinfecció.

Pantalles solars externes.

 Material La superfície ha de ser llisa.

La fusta revestida, robusta i protegida.

  Altres Al realitzar un assaig, evitar corrents d’aire en obrir i tancar portes.
Els armaris han d’estar de manera que no s’acumuli la pols. Han de ser
armaris empotrats i fins al sostre.
Els ordinadors i aparells han d’estar protegits.
Els rentamans han de ser d’accionament NO manual.
Condicions ambientals: 21ºC i 60-80% d’humitat. Aquestes condicions
no han d’invalidar el
resultat.
Un programador
vigila aquestes
condicions.
Es faràn proves per saber si el resultat és tolerable.
 Neteja i desinfecció a fons del laboratori.
 Incrementar operacions de neteja i desinfecció.
 Instal·lar sistemes d’aire acondicionat per filtrar l’aire.
 Equips El laboratori ha de documentar i implantar programes de neteja,

manteniment i calibratge.

Ús general. Material, vidre, plàstic, mostreig i nanses.

 Banys termostàtics, estufes, autoclaus, frigorífics.

 Equips volumètrics.
 Instruments de mesura.

Verificacions.

Balança: amb un pes conegut i en un lloc estable.

pH: amb una solució tampó (el seu pH apenes varia).

Comptador de colònies: es verifica manualment, recomptant.

Manteniment.

Microscòpis: un cop a l’any netejem les lents i els objectius.

Autoclau: verificar la junta i ordenar i netejar la cambra interior (esterilitzar). Un cop al mes

treure la calç.

Bany maria: Un cop al mes igual que l’autoclau. Cada 16 mesos utilitzar el biocida (mata
microorganismes: fongs, bacteris i llevats.).
Medis de cultiu i reactius.

Es prepara el medi mitjançant: Ingredients químics.

Pols deshidratada. Han de complir amb la

Medis de cultiu preparats. norma ISO 9000.

 Especificacions de qualitat:
o Caducitat del producte.
o Condicions d’emmagatzematge.
o Pla i freqüència de mostreig.
o Controls d’esterilitat.
o Control d’eficàcia (inclou microorganismes de referència.).
o D’ata d’emissió d’especificacions.
 Es consumiràn:
o Abans de la data de caducitat.
o Registrar la data de recepció.
o Tapa. Data de recepció.
Data d’obertura de l’envàs.
o Productes deshidratats tancats hermèticament (no presentaràn canvis de color
o grumolls.).
 Aigua per a medis de cultiu:
o Destil·lada o desionitzada o d’osmosis inversa.
o Controls de qualitat (pH, conductivitat, concentració de matèria orgànica.).
o Registrar la data de les proves.
o Verificar l’esterilitat del medi de cultiu.
o Verificar amb un producte que ja coneixem (colònia de fongs.).
o Medis i reactius etiquetats correctament per garantir la seva identificació,
condicions d’emmagatzematge i data.
o Identificar-se la persona que ha preparat el medi, data de preparació i
caducitat, ja sigui per mitjà d’una etiqueta o d’un registre apropiat.

Metodologia i procediments d’assaig.

o Regulats per la norma ISO.

o El laboratori ha de tenir tots els mètodes d’assaig normalitzats i documentats,
mètodes eficients.
o Poden ser interns o oficials.
o El mètode ha de ser vàlid per les determinacions que volem determinar.
1. Material.

1.1. Taps.

Per tubs d’assaig i erlenmeyers.

Asseguren l’esterilitat del que contenen.

Hi han tres tipus:

 Rosca Taps autoclavables de PP (Polipropilé. Aguanten 121ºC)

 Pinça (serotaps) Metàl·lics amb pinça interior. No són hermètics i permeten

l’aireació.

a) Esterilitzar el contingut.
b) Permetre el creixement de microorganismes.
 Gasa o cotó gras Es confeccionen a mida i s’acoblen a qualsevol recipient.

Per evitar que entri humitat al tub amb alumini o paper de kraft.

1.2. Tubs.

Tubs d’assaig de diferents mides (Pyrex.).

Tub petit 15 mL.

Tub gran 25 mL. Tècnica NMP (nombre més probable.).

Vidre borosilicalat molt resistent.

Campana de Durham.

Gas Tancat
Obert

També hi ha de plàstic autoclavables.

1.3. Flascó ISO.

Vidre borosilicalat amb rosca PP destinats a preparar medis de cultiu sòlids i líquids
(brou).

Flascó 350
Verd/Blau 121ºC
Flascó 550
Vermell 200ºC (Resina, Melamina)
 1.4. Plaques de Petri.

Plàstic i PS (poliestirè). Són indeformables fins a 60ºC. diposita el medi adient pel
creixement de microorganismes.

Mides:

 90 mm de diàmetre.
 60mm de diàmetre (25 mm2).
 Rodac o contàcte.

Asèptiques o estèrils:

 Asèptic: en condicions de filtrat d’aire del laboratori.

 Estèrils: irradiada.
1.5. Nansa Kolle.

Solen ser de plàstic ja prèviament autoclavat o bé metàl·liques (Ni-Cr).

Utilització:

 Sembra d’un medi sòlid a un altre medi sòlid o líquid.

 Sembra d’un medi líquid a un medi sòlid o líquid.
 Frotis – portaobjectes.
1.6. Nansa de Digralsky.

Poden ser de plàstic o de vidre.

Vidre: s’esterilitzen en alcohol.

Sembrar: escampar una petita quantitat de mostra en una càpsula de petri.

1.7. Pipetes automàtiques.

S’utilitzen per agafar de manera precissa i exàcta una certa quantitat de líquid

 Volum fixe.
 Volum variable.
1.8. Pipetes de plàstic.

Pipetes autoclavades de diferents volums, on s’utilitza el pi-pump per fer l’aspiració.

2. Aparells.

2.1. Estufes de cultiu.

Són estufes que permeten mantenir les condicions de temperatura adequada per el
creixement dels microorganismes.

La temperatura més comú són 37ºC.

2.2. Banys termostàtics.

Mantenir els medis de cultiu en estat líquid un cop es treuen de l’autoclau.

Cal controlar el nivell d’aigua i així evitar que l’aparell quedi sense aigua.

2.3. Autoclau.

Temperatura Pressió
100ºC 1 atm ≈ 1 bar (1’013 bar)
121ºC 2 atm ≈ 2 bar (2’026 bar)
Esterilitzar el material de vidre, taps de plàstic (PP), plaques de cultiu utilitzades en
l’anàlisi, medis de cultiu i pintes de pipeta.

Com assegurem l’esterilitat:

 Cinta que canvia de color.

 Espores de Geobacillus Stearotermophilus.
2.4. Comptador de colònies.

Aparell electrònic que permet obtenir un resultat del comptatge de les colònies en les
plaques de petri.

2.5. Stomacher.

Aparell per processar mostres sòlides normalment alimentàries.

2.6. Rampa de filtració.

Sistema destinat a la filtració de mostres líquides aplicant microorganismes.

Col·loquem filtres de nitrat de cel·lulosa que reben els microorganismes (0’22-0’43

µm).

2.7. Bunsen de laboratori.

La seva funció és esterilitzar l’ambient de les zones de treball, és a dir, les operacions
es faran sempre al costat de la flama.

Esterilitzar material:

 Nanses de Kolle: posar al roic en picadura.

 Boques de tubs: ampolles de vidre
2.8. Cabines de seguretat biològica.

Són cabines destinades a treballar en condicions esterils. Protegiran la mostra perque

no es contamini amb l’aire i/o operari. També protegeix al treballador en cas de
microorganismes patògens.

 Funcionen amb filtres HEPA.

 Poden tenir làmpada UV.
2.9. Esterilització i desinfecció del material.
 Per obtenir un cultiu axènic.
 No contaminar una mostra que s’està manipulant en el moment.
 És important pendre precaucions, ja que els microorganismes estan a tot
arreu (naturalesa, laboratori, instruments, recipients…)

Esterilització: és el procés que destrueix totes les formes viables de qualsevol

tipus de vida microbiana. Aixó inclou les espores i els virus. Per tant, el terme
esterilització fa referència a l’absència total de microorganismes.

Desinfecció: és el procés en que es destrueixen o inhibeixen les formes

vegetatives dels microorganismes, especialment dels patògens però no
necessàriament les espores.

Asèpsia: es refereix a l’absència de microorganismes en un objecte o àrea.

Antisèpsia: procés en el que es destrueixen o inhibeixen les formes vegetatives

dels microorganismes, però no necessàriament les espores presents sobre el cos,
la pell, els teixits vius, etc.. seria el terme equivalent a la desinfecció aplicat a
essers vius.

Neteja: qualsevol procés mecànic, físic o químic que té per objectiu disminuir les
substàncies externes dipositades o adherides sobre una superficie, siguin
microorganismes o no.

La neteja del material utilitzat al laboratori microbiològic, comprèn els següents

passos:

 Desinfecció: submergir el material en una solució desinfectant adequada i

durant un temps determinat.
 Neteja: manual (escovillons) o mecànica (rentavaixelles).
 Esbandit: aigua abundant i finalment amb aigua desionitzada.
 Secat: si es necessari (ex. Material metàl·lic per evitar la corrosió).

En funció de l’agent esterilitzant els sistemes d’esterilització es poden classificar

en:

 Per calor: és el mètode més simple i efectiu, sempre i quan es tracti de

materials que no es deteriorin a altes temperatures. Aquest procés no és
habil per a termolàbils. L’efecte destructiu de la calor depén de la
temperatura, però també del d¡temps d’exposició. Aquest tractament pot
ser aplicat per a l’esterilització de tres maneres diferents com són calor
humit, calor sec o incineració. Però en qualsevol cas, la calor mata perque
desnaturalitza les proteïnes i desestructura la membrana.
 Per calor humit: el vapor d’aigua és el mètode més eficaç per esterilitzar
per calor. Com esterilització per calor humit utilitzem l’autoclau.
  Per calor sec: l’aire a temperatura elevada també es pot utilitzar per
esterilitzar, però té menys poder de penetració que el vapor, és necessàri
més temperatura i un temps d’exposició més gran (a 160ºC es necessiten
2h i a 140ºC es necessiten 5h). L’aparell més utilitzat és el forn
d’esterilització o Pasteur. S’utilitza sobretot per esterilitzar material de
vidre o altre material termoresistent.
 Per incineració: s’utilitza per destruir material rebutjable contaminat o
mostres biològiques infectades, mitjançant forns crematoris. També és
una de les formes més comuns d’esterilitzar els objectes utilitzats durant
la manipulació asèptica dels microorganismes, ja que l’esterilització
s’aconsegueix mitjançant l’exposició a la flama d’aquest objecte. S’utilitza
per esterilitzar nanses, boques de tub, pinces, etc..
 Per radiacions: algunes radiacions electromagnètiques són letals per les
cel·lules microbianes però el seu efecte depén del tipus de radiació. Les
radiacions ionitzants (x, y) produeixen ions i radicals lliures que alteren els
components essencials per la viabilitat dels microorganismes. Tenen un
gran poder de penetració i s’utilitzen per esterilitzar materials termolàbils.
 Per agents químics: òxid d’etilè: té capacitat d’alterar l’estructura de
proteïnes i l’ADN dels microorganismes. Els aparells són càmeres o
autoclaus d’òxid d’etilè. L’elevada toxicitat a nivell cèl·lular el converteix
en un bon agent esterilitzant.
 Per filtració (0’2 µm): consisteix en fer passar un fluïd per un filtre amb
porus de tamany uniforme, de tal manera que els microorganismes
quedin retinguts en ell. És un mètode adequat per esterilitzar líquids
biològics o aditius de medi de cultiu que siguin sensibles a la calor.
Normalment el tamany de porus és de 0’2 µm per tant reté bacteris i
altres microorganismes d’aquest tamany.

Controls d’esterilització.

 Controls físics: a l’autoclau revisem els indicadors que incideixen l’estat

de l’element en cada moment. A més hi han sistemes de registre
mitjançant gràfiques que verifiquen l’estat de l’element.
 Controls químics: utilitzem aquestes tires identificadores per verificar que
el procés d’esterilització s’ha dit a terme correctament. Són tires
impregnades amb productes químics que exposades a una certa
temperatura i un temps determinat produeix un canvi de color.
 Controls biològics: s’utilitzen preparacions estandaritzades de
microorganismes, relativament resistents al mètode d’esterilització que
s’utilitza. Per l’esterilització per vapor l’indicador més utilitzat són les tires
d’espores amb bacillus stearothermophilus. S’introdueix aquesta tira junt
amb el material a esterilitzar i s’incuba per saber si s’ha esterilitzat
correctament.
 Control d’esterilització de material de forma probabilística.
  Control d’esterilització del medi de cultiu (ja sigui per filtració en
membrana o posant a incubar una mostra).

Mètodes de desinfecció.

 Desinfecció per mètodes físics.

o Ebullició.
o Pasteurització: hi han líquids termolàbils que no es poden
sotmetre a altes temperatures perque es desnaturalitzen els seus
components. En aquest cas el que es persegueix no és l’esterilitat
sinó reduir el número de microorganismes que deterioren aquests
fluïds i eliminar els possibles microorganismes patògens.
o Radiació UV: afecta el material genètic dels microorganismes
provoca errors en la duplicació de l’ADN i per tant afecta a la
viabilitat d’aquests microorganismes. Cam que té una
penetrabilitat molt baixa només s’utilitza a nivell superficial.
 Productes químics molt diversos.
Classificació general dels agents químics emprats com esterilitzants,
desinfectants i antisèptics.
o L’efectivitat depèn de tres factors:
 Temps.
 pH.
 Concentració.
o Tipus:
 Antisèptics (Iode, alcohol, H2O2, sabó)
 Desinfectants i/o esterilitzants: el compost clorat més
utilitzat és l’hipoclorit de sodi (lleixiu), òxid d’etilè.

Medis segons l’estat físic.

 Medi de cultiu: conjunt de substàncies nutritives (nutrients en suspensió) preparades

al laboratori per a desenvolupar i multiplicar microorganismes.
 Cultiu microbià: conjunt de microorganismes que creixen i es multipliquen sobre el
medi de cultiu.

Components dels medis de cultiu.

a) Elements químics: C (carboni). Proteïnes, sucres, greix.

N (nitrogen).

S (sofre). Proteïnes, compostos orgànics.

P (fósfor).

K (potassi), Mg (magnesi), Ca (càlci).

Oligoelements [F (ferro), Cu (coure), Mo (molibdé), Zn (zinc).

 b) Classificació:
A) Segons la composició química:
a) Medis definits: sabem la composició exacta.
b) Medis complexes: no es coneix la composició exacta.

Poden contenir altres sustàncies:

 Fluïds corporals: plasma, suero, sang (s’afegeixen als microorganismes

patògens).
 Agents reductors: s’afegeixen per al cultiu d’anaerobis estrictes ja que
redueixen l’oxigen (cisteína i tioglicat).
 Sistemes amortidors: per mantener el pH dins del rang òptim del
creixement bacteria (fosfats disòdics o biopotàssiques).
 Indicadors de pH: detectar las variacions del pH. Si fermenten lactosa
augmenta l’acidesa. Rojo neutro (vermell).
B) Segons l’estat físic:
a) Medis líquids o brous: contenen només els nutrients disolts en l’aigua.
b) Medis sòlids: contenen nutrients disolts en l’aigua a més d’un agent
solidificant que dóna rigidesa al medi. Els microorganismes són inoculats
sobre la superfície d’aquests medis sòlids on creixen les colònies.
c) Medis semi-sòlids o fluids: contenen menor quantitat d’agent solidificant
donant lloc a una consistència gelatinosa. Utilitzats en estudis de mobilitat
i hidròlisi de gelatina.

Medis de cultiu per aïllament i identificació.

 Medi d’enrequiment: brou lactosat s’utilitza per afavorir el creixement de bacteris del
gènere Salmonella a càrrec d’altres enterobacteris de la mateixa mostra.
 Medi selectiu: brou Selenit inhibeix el creixemend de la majoria d’enterobacteris
excepte de Salmonella i Shigella.
 Medis diferencials o cromogènics: colònies de Salmonella en agar BGA són de color
rosa transparent, amb un halo vermell, en canvi E. Coli formen bacteris groc-verdoses.

Temperatura

Rang de temperatura Temperatura òptima

Termòfils 25-80ºC 50-60ºC
Mesòfils 10-45ºC 20-40ºC
Psicòfils -5-30ºC 10-20ºC

pH.

pH extern pH intern
Acidòfils 1-5 6’5
Neutròfils 5’5-8 7’5
Alcalòfils 9-10 9’5
 La major part de microorganismes creixen entre 6’5 i 7’5. Controlem el pH del medi.

Els fongs creixen entre 4’5 i 6 (àcids).

Pressió osmòtica.

 Generalment es solen cultivar en condicions isotòniques encara que existeixen molts

microorganismes que creixen en medis hipotònics i hipertònics.
 En els medis hipertònics existeixen bacteries.

Oxígen.

 Aerobis estrictes: no poden viure sense oxígen.

 Anaerobis estrictes: no poden viure en presència d’oxígen.
 Anaerobis facultatius: poden viure en presència o absència d’oxígen.
 Anaerobis tolerants (fermentatius): obtenen l’energia per fermentació.
 Microaeròbis: requereixen baixes quantitats d’oxígen.

Conservació i manteniment dels medis de cultiu.

 Medi deshidratat: 2 anys.

 Plaques preparades: 3 mesos.
 Suplements: 30 mesos.
 Plaques filtració: 6 mesos.
 S’han de mantenir a una temperatura entre 2-8ºC i protegits de la llum i fonts de
calor.
 Els medis un cop utilitzats seran estandaritzats a l’autoclau.

Cultiu de microorganismes purs.

 Els laboratoris de microbiologia tenen col·leccions dels diferents microorganismes que

s’analitzen (cultius purs o axènics) per fer els controls pertinents en els medis que
s’utilitzen.

Manteniment a llarg termini.

 Congelació o crioconservació: segons la temperatura els períodes de conservació

poden arribar a superar els 10 anys. Porta un crioprotector.
 Liofilització: es pot arribar a conservar durant més de 20 anys.