TEMA 3: EL MICROSCOPIO

1. EL MICROSCOPIO: Introducción a la microscopía y tipos de

microscopios
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO OPTICO:

 MICROSCOPIO ÓPTICO SIMPLE: una lente que aumenta el tamaño de lo que pongas
debajo. Es una lupa.
 MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO: De campo claro (normal), de campo oscuro, de
contraste de fases, de florescencia y el conf0ocal.

MICROSCOPIO ELECTRONICO

De transmisión, de barrido, digital y efecto túnel o cuántico.

PRINCIPIOS DE OPTICA
Siempre vamos a tener:

 Una muestra
 Una fuente de iluminación: Microscopio óptico usa luz visible y el microscopio
electrónico usa un haz de electrones.
 Un sistema de lentes: Microscopio óptico usa lentes de vidrio y el electrónico usa
electroimanes.

MEDIDAS EN MICROSCOPÍA (diapositiva)

AUMENTO DE MICROSCOPIO
En los microscopios compuestos hay más de una lente (oculares) y que casi siempre nos
proporcionan un aumento de 10x. Hay otra lente en este microscopio que es la lente objetivo,
y que normalmente son de 10x,40x y de 100x.

Por lo tanto, en el microscopio óptico, tendremos aumentos de 100x, 400x y 1000x.

El microscopio electrónico es mucho más potente. El de transmisión nos da un aumento de

200000x, y el de barrido de 10000x.

2. EL MICROSCOPIO ÓPTICO
La fuente de iluminación es luz visible: forma parte de una estrecha franja que va desde
longitudes de onda de 400 nm (luz violeta) hasta los 700 nm (luz roja). Al disminuir la longtus
de onda, aumenta la frecuencia.

La luz es refractada (desviada) cuando pasa de un medio a otro. La luz visible incide sobre la
muestra, y cuando choca con ella, la luz se desvía. Esto es porque ha pasado a otro medio
distinto al aire.

El índice de refracción es el grado en el que esa luz se ha desviado, es decir, el ángulo que se
forma con esa desviación. Esto ocurre porque la velocidad de la luz se reduce.

Amplificación microscópica: Aumento que logra el equipo. Se logra gracias a las lentes (los
objetivos) y a las lentes oculares.

Resolución: Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades
separadas. Depende de:

 El objetivo que se utiliza (de la calidad de la lente): Marca la apertura numérica. Esta
apertura numérica está relacionada con cómo se desvía la luz. Si tenemos aperturas
numéricas más bajas, la resolución va a ser menor. Está relacionada con el
0 ' 5∗λ
denominador de esta fórmula: D= . A mayor D, peor resolución. Θ es lo que la
n∗senθ
luz se desvía. Cuanto mayor sea este ángulo, mejor, porque D será menor y la
resolución será mayor.
 La longitud de onda (λ) que se emplea para iluminar la muestra: Depende de la
fuente de iluminación. Según la formula, a mayor longitud de onda, peor resolución
porque aumenta la distancia. Por lo tanto, si quiero más resolución, es necesario
disminuir la longitud de onda. Pero al disminuir la longitud de onda, la irradiación es
mayor, y puede dañar a las células.
 El índice de refracción del medio (n): Viene dado por la desviación de los rayos al
pasar por el medio que está atravesando. A mayor n, menor distancia y mejor
resolución. En el aire, n=1. Hay veces que se usa un aceite de inmersión, con n=1.5,
que aumenta el índice de refracción, aumentando el ángulo y aumentando n. Cuando
se usa este aceite se denomina preparación húmeda, y se utiliza solamente con el
objetivo de 100 aumentos (con objetivos más bajos no sirve de nada).

PARTES QUE FORMAN EL MICROSCOPIO

SISTEMA DE ILUMINACIÓN: Formado por la fuente de luz y el condensador.

 FUENTE DE LUZ: Lámpara halógena que tiene una intensidad graduable. Está situada
en el pie del microscopio. El microscopio utiliza la refracción de la luz para la formación
de imágenes.
 CONDENSADOR: Es el sistema de lentes situadas bajo la platina. Se ocupa de
concentrar la luz que emite la fuente de tal forma que esté mejor dirigida hacia la
preparación. En la parte de arriba tiene una membrana llamada diafragma, que
elimina rayos en exceso y que no podemos concentrar hacia la muestra.

SISTEMA ÓPTICO: formado por las lentes (los objetivos y los oculares). Sirve para formar la
imagen y amplificarla.
  OBJETIVOS: Aumentar e invertir la imagen. A ellos les llegan los rayos que ha
concentrado el condensador y han atravesado la muestra, y llegan al objetivo.
Tenemos tres objetivos: 10x (mohos), 40x (levaduras) y 100x (bacterias) (hay que usar
el aceite de inmersión. Puede haber más.
 LENTES OCULARES: Captan la imagen que les llega del objetivo y la amplían. Casi
siempre son de 10x.

SISTEMA MECÁNICO: Da soporte a las lentes, acerca y aleja la muestra del objetivo, y mueve
hacia la derecha e izquierda. Formado por:

 BASE: lo que se apoya en la mesa

 BRAZOS: sujeta la platina
 PLATINA: donde ponemos la muestra. Suele tener unos apoyos de sujeción para fijar la
muestra
 TUBO OCULAR
 REVÓLVER: donde están los objetivos
 TORNILLOS MACRO Y MICRO: mueven la platina arriba o abajo para acercarla o alejarla
del objetivo. El MACRO mueve mucho y el MICRO mueve muy poco

FORMACIÓN DE LA IMAGEN
La luz entra por abajo, el condensador concentra la luz e ilumina solo la muestre. La lente
objetivo amplifica la imagen y forma la imagen invertida. La lente ocular amplifica la imagen
anterior y forma una imagen virtual…

TIPOS DE MICROSCOPIOS

 MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO: El contraste, como no es muy grande, casi siempre

hay que aumentarlo con el uso de tinciones. Es el que más se utiliza.
 MICROSOCOPIO DE CAMPO OSCURO: Las células se observan mucho mejor sin
necesidad de teñirlas, porque se ve todo lo de alrededor de la célula muy oscuro y las
células brillan.
 MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES: Gracias a las lentes que tienen, aumenta el
contraste entre el medio y la célula y pone más de manifiesto la diferencia de
densidades que hay entre las partes de la célula.

 MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA: La luz que se emite con este microscopio tiene una
longitud de onda que está en el rango del ultravioleta. Se utiliza para preparaciones
que en alguna parte emiten fluorescencia. Cuando tenemos una parte de una célula
que emite fluorescencia, se denomina fluoroforo. Esto significa que la célula recibe la
luz, la absorbe y la emite con una longitud de onda visible. Hay unas estructuras
llamadas fluorocromos que se fijan a las partes de las células, de forma que absorben
la luz ultravioleta y la emiten en el visible. Las cianobacterias tienen fluoróforos.
Cuando una parte verde se irradia, se emite en rojo. Esta técnica de teñir con
fluorescentes se denomina epifluorescencia, y se utiliza por ejemplo para diferenciar
microorganismos vivos de muertos. Dependiendo del tipo de colorante que utilices, la
emisión será de un color o de otro.
  MICROSCOPIO CONFOCAL: Se suele usar también acoplado a fluorescencia, y se usa
para ver cortes porque es capaz de formar imágenes tridimensionales.

3. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
La fuente de iluminación es un haz de electrones, y en el sistema de lentes tenemos
electroimanes.

TIPOS:

 DE TRANSMISIÓN (TEM): La radiación penetra a las células y somos capaces de ver el

interior celular
 DE BARRIDO (SEM): Permite ver la superficie de las estructuras.

La fuente de iluminación está arriba, y va pasando por una serie de lentes, y al final la señal se
recoge en una pantalla de fluorescencia (TEM) o en una pantalla de televisión (SEM).

4. TIPOS DE OBSERVACIONES. TINCIONES

1. OBSERVACIÓN EN FRESCO
Vemos las observaciones tal cual. Se utilizan cuando necesitamos ver morfologías
alguna característica que se altera con la tinción. Cuando se observan para determinar
la movilidad. Para observar inclusiones celulares como vacuolas y materias grasas. Para
observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular.

 PREPARACIÓN EN FRESCO SIMPLE: Tenemos el portaobjetos donde

depositamos una gotita de agua. A continuación, tomamos la muestra con el
asa de siembra o con un gotero y hacer un frotis (movimiento para dispersarlo
en la gota). Finalmente, cubrimos esto con un cubre.
 PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA PENDIENTE:

2. OBSERVACIÓN CON TINCIONES

Para observar las características morfológicas microbianas. Para identificar y
diferenciar microorganismos de distintas especies…
Un colorante es un compuesto de naturaleza orgánica que tienen alguna afinidad
específica con algún componente de la célula. Pueden ser catiónicos, aniónicos o
neutros.
Pueden ser simples (un solo colorante), diferenciales (más de un colorante).
No se usa agua, se hace directamente el frotis.

El frotis se realiza en ambos casos con el asa de siembra. Los porta tienen que estar limpios y
desengrasados.

La fijación se realiza con calor: pasarlo 3 veces por la llama. Hay otra forma de fijar, que es
mediante una forma química: alcohol metílico y formalina al 5% llamado mezcla de Hoffman.
Después de fijarlo se tiñen (cubrir el frotis con la solución colorante y dejar actuar el tiempo
preciso. Luego se lava y se deja secar). Hay tinciones simples, tinciones diferenciales y tinciones
específicas (dentro de observación con tinciones):

TINCIÓN SIMPLE:

 TINCIÓN POSITIVA: lo que coge el color son las células. Algunos de los más importantes
son el azul de metileno (utilizar sin diluir y dejar actuar entre 3 y 5 minutos, y lavar la
preparación). Otro colorante es la fucsina (coloración rosa/roja), diluir 1/10 y dejar
actuar entre 30 y 60s, lavar con agua, secar y mirar al microscopio).
 TINCIÓN NEGATIVA: Se tiñe todo lo que está alrededor de la célula, pero no la célula.
Esto es porque esta célula en concreto presenta algún tipo de resistencia que evita que
el colorante penetre. Esto es lo que ocurre en aquellas células que tienen cápsula. Se
usa tinta china, nigrosina.

TINCIONES DIFERENCIALES: Dos fases:

 TINCIÓN PRIMARIA: tinción simple (añadir un colorante).

 TINCIÓN DE CONTRASTE O SECUNDARIA: Gram, Ziehl-Neelsen (tinción de ácido-
resistencia), de esporas.

TINCIÓN DE GRAM

Sirve para diferenciar bacterias Gram + de Gram -. Se hace el frotis, fijamos con calor,
añadimos el colorante primario (cristal violeta), lavamos, añadimos el mordiente (es un
compuesto químico que no es un colorante y lo que hace es ayudar a que el colorante primario
se fije mejor; normalmente se usa Lugol) (a veces también puede engrosar algunas estructuras,
como algunas paredes delgadas), decolorar con acetona, añadir el colorante secundario (la
safranina).

En las Gram +, como la capa de peptidoglucano es muy ancha, el cristal violeta se queda muy
adherido a ella, y no se va, aunque se le añada la acetona. Por lo tanto, su color es azul.

En las Gram -, como tienen una capa de peptidoglucano muy fina, al añadir la acetona el cristal
violeta se disuelve. Cuando se añade el colorante secundario, se queda rojo.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (ácido alcohol resistencia)

Algunas bacterias en su pared celular tienen ácidos micólicos, los cuales evitan la decoloración
de la tinción primaria, por lo tanto, mantienen la fucsina y el colorante de contraste no
penetran. Estas son las positivas. Las negativas si se decoloran y al añadir el azul de metileno
quedan azules.

Muchas de las bacterias resistentes al ácido alcohol son patógenas.

TINCIONES ESPECÍFICAS

TINCIÓN DE ESPORAS

Tinción específica. Cuando añadimos el colorante primario, verde malaquita, toda la célula se
tiñe de verde. Luego se realiza una decoloración y se pierde el color de toda la célula menos el
que está en las esporas. Finalmente se añade el colorante secundario, la safranina.

TINCIÓN DE FLAGELOS DE LEIFSON

Tinción específica. Se fija químicamente la suspensión bacteriana mediante formol, y se hace la

extensión de un portaobjetos. Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. Se cubre la
preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina. El ácido tánico engruesa
los flagelos y la rosanilina los tiñe. Se retira el exceso de colorante con agua. Por último, se deja
secar al aire antes de su observación al microscopio.