Machine Translated by Google

Chương 1

Chẩn đoán phân tử: Quá khứ, Hiện tại

và Tương lai

GP Patrino1 , PB Danielson2,3 và WJ Ansorge4

1 2 3
Trường Khoa học Y tế thuộc Đại học Patras, Patras, Hy Lạp; Đại học Denver, Denver, CO, Hoa Kỳ; Trung tâm khoa học pháp y
4
Nghiên cứu và Giáo dục, Willow Grove, PA, Hoa Kỳ; Ecole Polytechnique Federal Lausanne, EPFL, Lausanne, Thụy Sĩ

1.1 GIỚI THIỆU các cơn đau cấp tính tái phát do tắc mạch. Về nguyên tắc,
những phát hiện của họ đặt nền móng cho chẩn đoán phân
Chẩn đoán phân tử (hoặc dựa trên axit nucleic) các rối
tử, mặc dù cuộc cách mạng lớn xảy ra nhiều năm sau đó.
loạn ở người được gọi là phát hiện các biến thể gen gây
Vào thời điểm đó, khi sinh học phân tử mới chỉ phát triển
bệnh và/hoặc lành tính trong các mẫu DNA và/hoặc RNA để
mạnh mẽ, việc cung cấp các dịch vụ chẩn đoán phân tử là
tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện, chẩn đoán,
không thể tưởng tượng được và không khả thi về mặt kỹ thuật.
phân loại phụ, tiên lượng và theo dõi phản hồi cho apy.
Những hạt giống đầu tiên của chẩn đoán phân tử đã được cung
Chẩn đoán phân tử kết hợp y học trong phòng thí nghiệm
cấp vào những ngày đầu của công nghệ DNA tái tổ hợp, với
với kiến thức và công nghệ di truyền phân tử và đã được
nhiều nhà khoa học từ nhiều ngành khác nhau cùng làm việc
cách mạng hóa rất nhiều trong những thập kỷ qua, được
với nhau. Nhân bản và giải trình tự cDNA vào thời điểm đó
hưởng lợi từ những khám phá trong lĩnh vực sinh học phân
là những công cụ vô giá để cung cấp kiến thức cơ bản về
tử và công nghệ gen (Bảng 1.1). Việc xác định và mô tả
trình tự cơ bản của nhiều gen khác nhau. Sau này cung cấp
chi tiết cơ sở di truyền của các bệnh di truyền là rất
một số đầu dò DNA, cho phép phân tích thông qua việc làm
quan trọng để đưa ra chẩn đoán chính xác. Việc phát hiện
mờ các vùng gen ở phía nam, dẫn đến khái niệm và ứng dụng
gen, thông qua các phương pháp hiệu suất cao, chẳng hạn
đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP) để theo dõi một alen
như giải trình tự thế hệ tiếp theo hoặc nghiên cứu liên
biến thể từ bố mẹ dị hợp tử đến mang thai có nguy cơ cao.
kết toàn bộ bộ gen, cung cấp những hiểu biết sâu sắc có
Năm 1976, Kan và các cộng sự lần đầu tiên thực hiện chẩn
giá trị về cơ chế gây bệnh và các dấu hiệu gen cho phép
đoán trước sinh bệnh a-thalassemia bằng phương pháp lai
các bác sĩ không chỉ đánh giá khuynh hướng bệnh mà còn
trên DNA phân lập từ nguyên bào sợi của thai nhi. Ngoài
thiết kế và thực hiện. phương pháp chẩn đoán chính xác.
ra, Kan và Dozy (1978), đã thực hiện phân tích RFLP để xác
Điều thứ hai có tầm quan trọng lớn, vì số lượng lớn và đa
định các alen hồng cầu hình liềm có nguồn gốc từ châu Phi.
dạng các khiếm khuyết phân tử đòi hỏi phải sử dụng nhiều
Bước đột phá này đã cung cấp phương tiện thiết lập các
nền tảng thay vì một nền tảng phát hiện biến thể duy
phương pháp chẩn đoán tương tự để xác định đặc điểm của các
nhất. Chẩn đoán phân tử đã dần trở thành hiện thực lâm
bệnh di truyền khác, chẳng hạn như phenylketonurea (Woo và
sàng với nguồn gốc sâu xa là khoa học cơ bản về biểu hiện gen và chức năng gen.
cộng sự, 1983), bệnh xơ nang (Farrall và cộng sự, 1986), v.v.
Tuy nhiên, vào thời điểm đó, một nút thắt kỹ thuật quan
trọng cần phải được khắc phục. Việc xác định biến thể gây
1.2 LỊCH SỬ CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ: PHÁT HIỆN BÁNH
bệnh chỉ có thể thực hiện được thông qua việc xây dựng thư
XE
viện DNA bộ gen từ cá thể bị ảnh hưởng, để trước tiên nhân
Năm 1949, Pauling và các đồng nghiệp của ông đã giới thiệu bản alen biến thể và sau đó xác định trình tự nucleotide của

thuật ngữ bệnh phân tử trong từ vựng y khoa, dựa trên khám phá nó. Một lần nữa, nhiều đột biến gen globin ở người nằm trong
của họ rằng một thay đổi axit amin duy nhất ở chuỗi b-globin số những đột biến đầu tiên được xác định thông qua các
sẽ dẫn đến bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, đặc trưng chủ yếu là phương
do pháp như vậy (Busslinger và cộng sự, 1981; Treisman và cộng sự,

Chẩn đoán phân tử. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8 Bản

1
quyền © 2017 Elsevier Ltd. Mọi quyền được bảo lưu.
Machine Translated by Google

2 Chẩn đoán phân tử

BẢNG 1.1 Dòng thời gian của những khám phá chính trong lĩnh vực sinh học phân tử, có ảnh hưởng đến
Phát triển chẩn đoán phân tử

Ngày Khám phá

1949 Đặc điểm bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm là một bệnh phân tử

1953 Khám phá chuỗi xoắn kép DNA

1958 Phân lập DNA polymerase

1960 Kỹ thuật lai tạo đầu tiên

1969 Lai giống tại chỗ

1970 Khám phá enzyme giới hạn và enzyme phiên mã ngược

1975 vết rạn phía Nam

1977 xét nghiệm DNA

1983 Sự tổng hợp đầu tiên của oligonucleotide

1985 Phân tích đa hình độ dài đoạn hạn chế

1985 Phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase

1986 Phát triển phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ

1988 Khám phá quá trình tối ưu hóa DNA polymerase bền nhiệt của phản ứng chuỗi polymerase

1992 Quan niệm về phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực

1993 Khám phá các endnuclease đặc hiệu về cấu trúc cho các thử nghiệm phân tách

1996 Ứng dụng đầu tiên của vi mô DNA

2001 Phiên bản phác thảo đầu tiên của trình tự bộ gen người

2001 Ứng dụng hồ sơ protein trong các bệnh ở người

2002 Khởi động dự án HapMap

2005 Giới thiệu công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo thông lượng cao

2008 Khởi động Dự án 1000 bộ gen

2013 Giới thiệu hệ thống CRISPR để chỉnh sửa gen

2014 Thông báo giải trình tự bộ gen người với giá 1000 USD

2015 Tổng thống Mỹ Barack Obama khởi động Sáng kiến Y học Chính xác

1983). Năm 1982, Orkin và cộng sự đã chứng minh rằng được phát triển, tạo cơ sở cho việc sàng lọc biến thể và

số biến thể trình tự được liên kết với cụ thể các phương pháp quét. Các phương pháp đầu tiên liên quan đến sự không phù hợp

các biến thể gen HBB gây bệnh. Những nhóm RFLP này, phát hiện các dị thể DNA/DNA hoặc RNA/DNA

được gọi là haplotypes (cả xen kẽ và nội gen), có (Myers et al., 1985a,b) hoặc sự phân biệt giữa các điểm không khớp

cung cấp một phương pháp sàng lọc đầu tiên để phát hiện một Các dị thể DNA sử dụng phương pháp điện di trên gel, theo

biến thể gây bệnh. Mặc dù cách tiếp cận này cho phép đến đặc tính tan chảy của chúng (Myers et al., 1987). Sử dụng cái này

các nhà nghiên cứu dự đoán alen HBB nào gây bệnh, một số phương pháp tốn nhiều công sức và thời gian

tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho việc sàng lọc đột biến, không có ai tham gia các alen trình tự biến thể đã được xác định, điều này tạo nên

vị trí xác định chính xác bản chất của bệnh gây đột biến, như nhiều có thể thiết kế các oligonucleotide tổng hợp ngắn

biến thể gen HBB khác nhau đã được sử dụng làm các đầu dò đặc trưng cho alen trên bộ gen của miền Nam

được liên kết với một kiểu haplotype cụ thể trong các quần thể khác nhau vết đốm. Thiết kế thử nghiệm này đã nhanh chóng được thực hiện

(thông tin thêm có tại http://globin.bx.psu.edu/ để phát hiện các đột biến beta-thalassemia (Orkin và cộng sự,

hbvar; Patrinos và cộng sự, 2004; Giardine và cộng sự, 2014). 1983; Pirastu và cộng sự, 1983).

Đồng thời, để cung cấp một đường tắt tới DNA Bất chấp những nỗ lực mạnh mẽ từ các phòng thí nghiệm khác nhau

giải trình tự, một số phương pháp thăm dò để xác định chính xác các trên toàn thế giới, việc chẩn đoán các bệnh di truyền trên DNA

biến thể gây bệnh trong DNA của bệnh nhân trình độ vẫn còn kém phát triển và do đó vẫn chưa sẵn sàng
Machine Translated by Google
Chẩn đoán phân tử: Chương quá khứ, hiện tại và tương lai | 1 3
được thực hiện trong các phòng thí nghiệm lâm sàng để phân
tích bệnh nhân thường xuyên do sự phức tạp, chi phí và yêu
cầu về thời gian của công nghệ hiện có. Chỉ sau vài năm,
chẩn đoán phân tử mới bước vào kỷ nguyên hoàng kim với việc
phát hiện ra công cụ sinh học phân tử mạnh mẽ nhất kể từ khi
nhân bản và giải trình tự, phản ứng chuỗi polymerase (PCR).
1.3 CUỘC CÁCH PHẢN ỨNG CHUỖI SAU POLYMERASE
Việc phát hiện ra PCR (Saiki và cộng sự, 1985; Mullis và
Faloona, 1987) và sự tối ưu hóa nhanh chóng của nó, sử dụng
Taq DNA polymerase có khả năng hấp thụ cao nhất từ Thermus
Aquas (Saiki và cộng sự, 1988), đã tạo điều kiện thuận lợi
và về nguyên tắc là một cuộc cách mạng hóa phân tử. chẩn
đoán. Tính năng mạnh mẽ nhất của PCR là số lượng lớn bản sao
của trình tự mục tiêu được tạo ra bằng cách khuếch đại theo
cấp số nhân, cho phép xác định một đột biến đã biết trong
vòng một ngày, thay vì vài tháng. Ngoài ra, PCR đã giảm đáng
kể hoặc thậm chí giảm bớt việc sử dụng chất phóng xạ để chẩn
đoán phân tử thông thường. Điều này đã cho phép chẩn đoán
phân tử được đưa vào phòng thí nghiệm lâm sàng để cung cấp
các dịch vụ di truyền, chẳng hạn như sàng lọc di truyền quần
thể hoặc người mang mầm bệnh, chẩn đoán trước sinh các bệnh
di truyền hoặc, trong những năm gần đây, việc xác định các
biến thể chưa biết, với sự cộng tác chặt chẽ với các phòng
thí nghiệm nghiên cứu. Do đó, bằng cách được chuyển đến môi
trường thích hợp, phòng thí nghiệm lâm sàng, chẩn đoán phân
tử có thể cung cấp các dịch vụ mà chúng đã được hình thành ban đầu. hợp này, sự khác biệt về khả năng di chuyển của điện di
Việc phát hiện ra PCR cũng đã cung cấp nền tảng cho việc
thiết kế và phát triển nhiều phương án phát hiện biến thể,
dựa trên DNA khuếch đại. Nói chung, PCR được sử dụng để tạo
ra các đoạn DNA cần phân tích hoặc là một phần của phương
pháp phát hiện. Nỗ lực đầu tiên là sử dụng enzyme giới hạn
(Saiki và cộng sự, 1985) hoặc đầu dò oligonucleotide, cố
định trên màng màng hoặc trong dung dịch (Saiki và cộng sự,
1986), để phát hiện biến thể di truyền hiện có, đặc biệt là
giống liềm. đột biến gây bệnh tế bào. Trong những năm tiếp
theo, số lượng lớn hơn các phương pháp phát hiện biến thể đã
được phát triển và triển khai (xem thêm Chương 3). Những kỹ
thuật này có thể được chia đại khái thành ba loại, tùy thuộc
vào cơ sở để phân biệt các biến thể alen:
1. Phương pháp dựa trên enzyme. Phân tích RFLP trong lịch
sử là phương pháp được sử dụng rộng rãi đầu tiên, khai
thác những thay đổi ở vị trí của enzyme giới hạn, dẫn
đến tăng hoặc giảm các sự kiện hạn chế (Saiki et al., 1985).
Sau đó, một số phương pháp sử dụng enzyme để phát hiện
các alen biến thể đã được hình thành, dựa trên sự phụ
thuộc của cấu trúc thứ cấp vào trình tự DNA sơ cấp. Các
phương pháp này khai thác
Hoạt động của các enzyme resolvase T4 endonuclease VII
và T7 endnuclease I để tiêu hóa DNA dị vòng được hình
thành bằng cách ủ loại DNA hoang dã và DNA đột biến
(Mashal et al., 1995). Các mảnh tiêu hóa cho thấy sự hiện
diện và vị trí của bất kỳ biến thể nào. Một biến thể của
chủ đề liên quan đến việc sử dụng các tác nhân hóa học
cho cùng một mục đích (Saleeba và cộng sự, 1992). Một
phương pháp enzym khác để phát hiện biến thể là xét
nghiệm thắt oligo nucleotide (Landegren và cộng sự, 1988;
Chương 3); Việc ghép cũng là một trong những nguyên tắc
chính của một trong những phương pháp giải trình tự thế
hệ tiếp theo được sử dụng rộng rãi nhất (xem thêm Chương 8).
2. Kỹ thuật dựa trên điện di. Loại này được đặc trưng bởi
rất nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau được thiết kế
để sàng lọc các đột biến đã biết hoặc chưa biết, dựa
trên khả năng di chuyển điện di khác nhau của các alen
đột biến, trong điều kiện biến tính hoặc không biến tính.
Phân tích đa hình dạng chuỗi đơn (SSCP) và phân tích dị
thể (HDA; Orita và cộng sự, 1989; xem Chương 3) là một
trong những phương pháp đầu tiên được thiết kế để phát
hiện các khiếm khuyết phân tử trong locus gen.
Kết hợp với điện di mao mạch, phân tích SSCP và HDA hiện
cung cấp một nền tảng phát hiện biến thể nhanh chóng,
đơn giản và tuyệt vời với chi phí vận hành thấp và thú
vị nhất là khả năng dễ dàng được tự động hóa, do đó cho
phép phân tích thông lượng cao của bệnh nhân. ADN. Tương
tự, điện di gel gradient biến tính (DGGE) và điện di gel
gradient nhiệt độ có thể được sử dụng tốt như nhau để
phát hiện các alen biến thể (xem Chương 3). Trong trường
giữa kiểu hoang dã và alen biến thể có thể được “hình
dung” theo dải màu của các tác nhân biến tính, chẳng
hạn như urê và formamide, hoặc nhiệt độ tăng dần. Một kỹ
thuật phát hiện biến thể ít phổ biến hơn là quét gen hai
chiều, dựa trên sự phân tách điện di hai chiều của các
đoạn DNA được khuếch đại, theo kích thước và trình tự
cặp bazơ của chúng. Cái sau liên quan đến DGGE, sau bước
phân tách kích thước.
3. Kỹ thuật dựa trên pha rắn. Tập hợp các kỹ thuật này bao
gồm nền tảng cho hầu hết các công nghệ phát hiện đột
biến ngày nay, vì chúng có thêm ưu điểm là dễ dàng tự
động hóa và do đó rất được khuyến khích sử dụng để phát
hiện hoặc sàng lọc đột biến hiệu suất cao. Một phương
pháp nhanh chóng, chính xác và thuận tiện để phát hiện
các đột biến đã biết là đảo ngược dot-blot, được phát
triển ban đầu bởi Saiki et al. (1989) và được triển khai
để phát hiện các biến thể gen HBB dẫn đến bệnh b-
thalassemia. Bản chất của phương pháp này là sử dụng các
oligonucleotide, liên kết với màng tế bào, làm mục tiêu
lai cho DNA khuếch đại.
Một số ưu điểm của kỹ thuật này là một dải màng màng có
thể được sử dụng để phát hiện nhiều đột biến khác nhau
đã biết ở một cá thể (một bệnh nhân một dải một màng).
Machine Translated by Google
4 Chẩn đoán phân tử
loại xét nghiệm), tiềm năng tự động hóa và khả năng
diễn giải kết quả dễ dàng bằng cách sử dụng hệ thống
biotin avidin cổ điển. Tuy nhiên, kỹ thuật này không
thể được sử dụng để phát hiện các đột biến chưa biết.
Sự phát triển liên tục đã dẫn đến sự lai tạo đặc hiệu
alen của DNA khuếch đại [PCR-ASO (Allele Cụ thể
Oligonucleotide), Chương 3] trên các bộ lọc, gần đây
đã mở rộng sang các vi mảng DNA oligonucleotide (xem
Chương 18) để phân tích đột biến thông lượng cao
(Gemignani et cộng sự, 2002; Cremonesi và cộng sự,
2007). Đặc biệt, các oligonucleotide có trình tự đã
biết được cố định trên các bề mặt thích hợp và sự lai
ghép của các mục tiêu với microarray được phát hiện,
chủ yếu sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Việc lựa chọn phương pháp phát hiện biến thể phụ thuộc
vào một số biến số, bao gồm phổ biến thể của một rối
loạn di truyền nhất định, cấu trúc cơ sở hạ tầng sẵn có,
số lượng xét nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm
chẩn đoán và các vấn đề về tài sản trí tuệ (xem thêm Phần
1.5.1). Hầu hết các phòng thí nghiệm chẩn đoán lâm sàng
chưa đầu tư vào cơ sở hạ tầng có công nghệ cao đắt tiền,
vì khối lượng xét nghiệm (số lượng xét nghiệm) dự kiến
thực hiện chưa đủ lớn để bù đắp cho vốn đầu tư. Do đó,
các xét nghiệm sàng lọc “pha chế tại nhà” đơn giản như
SSCP và HDA đã và vẫn là phương pháp được nhiều phòng thí
nghiệm lâm sàng lựa chọn, vì chúng cho phép phát hiện
nhanh chóng và đồng thời các biến thể trình tự khác nhau
với tỷ lệ phát hiện gần 100%. Mặc dù khuếch đại DNA đã
tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho việc mở rộng chẩn
đoán phân tử, nhưng nó vẫn có một số hạn chế, chẳng hạn
như khuếch đại các vùng giàu lặp lại cytidine-guanine,
các đặc điểm dễ bị lỗi của Taq polymerase (ở khoảng 104
đến 105 mỗi nucleotide ) . ), và như thế. Cuối cùng, điều
đáng chú ý là mặc dù có rất nhiều phương pháp phát hiện
biến thể, nhưng giải trình tự DNA, đặc biệt là trong thời
đại giải trình tự toàn bộ bộ gen và những đột phá trong
công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo, vẫn được coi là
tiêu chuẩn vàng và quy trình thử nghiệm dứt khoát để gọi
tên biến thể. Tuy nhiên, chi phí đầu tư ban đầu và những
khó khăn trong việc tiêu chuẩn hóa và giải thích các kết
quả không rõ ràng đã hạn chế việc sử dụng nó, đặc biệt là
đối với các phòng thí nghiệm nghiên cứu cơ bản.
1.4 CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ TRONG THỜI ĐẠI HẬU GEN
Vào tháng 2 năm 2001, với việc công bố trình tự dự thảo
đầu tiên của bộ gen người (Hiệp hội giải trình tự bộ gen
người quốc tế, 2001; Venter và cộng sự, 2001) và sau đó
là trình tự bộ gen của các sinh vật khác, sinh học phân
tử đã bước vào một kỷ nguyên mới. với những cơ hội và
thách thức chưa từng có. Những phát triển to lớn này gây
áp lực lên nhiều
tăng cường nỗ lực nghiên cứu nhằm cải thiện các phương
pháp hiện có để phát hiện biến thể gen, tạo ra các bộ dữ
liệu có sẵn về biến thể gen và phân tích các bộ dữ liệu
này bằng phần mềm chuyên dụng, chuẩn hóa và thương mại
hóa các xét nghiệm di truyền để chẩn đoán thông thường và
cải thiện khả năng công nghệ hiện có để cung cấp các
thiết bị tự động hiện đại để phân tích di truyền thông
lượng cao.
Thách thức lớn nhất, sau khi công bố trình tự dự thảo
bộ gen người, là cải tiến các công nghệ phát hiện biến
thể hiện có để đạt được phân tích biến đổi gen mạnh mẽ,
hiệu quả về chi phí, nhanh chóng và thông lượng cao.
Ngoài ra, tốc độ phát hiện biến thể mới và khám phá gen
ngày càng tăng đã dẫn đến sự hài hòa của danh pháp gen,
một nỗ lực được dẫn đầu bởi Hiệp hội biến đổi gen người
(http://www.hgvs.org; xem thêm Chương 2). Kể từ năm 2005,
công nghệ gen đã được cải thiện nhanh chóng và các kỹ
thuật phát hiện biến thể thông lượng cao mới đã sẵn sàng,
trong khi các phương pháp cũ đã phát triển để phù hợp với
nhu cầu ngày càng tăng về sàng lọc thông lượng cao và
giao phối tự động hoặc dần bị loại bỏ. Việc phát hiện sắc
ký về những thay đổi đa hình của các biến thể gây bệnh
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính
(DHPLC; để đánh giá, xem Xiao và Oefner, 2001) là một
trong những công nghệ mới xuất hiện. DHPLC tiết lộ sự
hiện diện của một biến thể di truyền bằng cách lưu giữ
khác biệt DNA song công đồng nhất và het trên sắc ký pha
đảo trong quá trình biến tính một phần. Sự thay thế, xóa
và thêm bazơ đơn có thể được phát hiện thành công bằng
cách theo dõi tia cực tím hoặc huỳnh quang trong vòng 2
đến 3 phút đối với các sản phẩm PCR chưa tinh khiết có
kích thước lớn tới 1,5 kg bazơ. Những tính năng này cùng
với chi phí thấp khiến DHPLC trở thành một trong những
công cụ mạnh mẽ nhất để phân tích đột biến. Ngoài ra,
phương pháp dập tắt pyrose, một công nghệ xác định kiểu
gen dựa trên nongel, cung cấp một phương pháp rất đáng
tin cậy và là một giải pháp thay thế hấp dẫn cho DHPLC.
Phương pháp pyro xa phát hiện sự kết hợp de novo của các
nucleotide dựa trên mẫu cụ thể. Quá trình hợp nhất giải
phóng pyrophosphate, chất này được chuyển thành ATP và
sau đó là sự kích thích luciferase. Ánh sáng được tạo ra,
được phát hiện bởi camera của thiết bị cặp điện tích,
được “dịch” thành pyrogram, từ đó trình tự nucleotide có
thể được suy ra (Ronaghi và cộng sự, 1998). Cách tiếp cận
này tạo cơ sở cho sự phát triển các phương pháp giải
trình tự thế hệ tiếp theo đầu tiên của 454 Life Technologies (xem thêm Ch
Một trong những tiến bộ chính là việc phát minh ra PCR
thời gian thực và vô số biến thể của chủ đề này (Holland
và cộng sự, 1991; xem Chương 4). Phương pháp này cho phép
phát hiện trực tiếp sản phẩm PCR trong giai đoạn hàm mũ
(giữa log) của phản ứng, do đó kết hợp khuếch đại và phát
hiện trong một bước duy nhất.
Tốc độ PCR thời gian thực tăng lên phần lớn là do chu kỳ
giảm, việc loại bỏ khả năng phát hiện sau PCR.
Machine Translated by Google
Chẩn đoán phân tử: Chương quá khứ, hiện tại và tương lai | 1 5
và việc sử dụng nhãn phát huỳnh quang cũng như các phương
pháp nhạy cảm để phát hiện sự phát thải của chúng. Do đó,
PCR thời gian thực là một phương pháp rất chính xác và nhạy
cảm với nhiều ứng dụng trong chẩn đoán phân tử, cho phép
hiệu suất cao, có thể dễ dàng tự động hóa và thực hiện trên
khối lượng rất nhỏ, khiến nó trở thành phương pháp được lựa
chọn cho nhiều phòng thí nghiệm chẩn đoán hiện đại. .
Trên hết, các phương pháp xác định kiểu gen dựa trên
microarray DNA đưa ra khả năng phân tích đồng thời nhiều
thay đổi trình tự (xem Chương 18). Đặc biệt, các mảng vi mô
bao gồm hàng trăm nghìn đến hàng triệu gonucleotide oli
được gắn trên một bề mặt rắn theo kiểu mảng có trật tự. Mẫu
DNA quan tâm được khuếch đại PCR và sau đó được lai vào
microarray. Mỗi oligonucleotide trong mảng mật độ cao hoạt
động như một đầu dò đặc hiệu của alen và do đó các trình tự
khớp hoàn hảo sẽ lai hiệu quả hơn với các oligonucleotide
tương ứng của chúng trên mảng. Các tín hiệu lai được định
lượng bằng phương pháp quét huỳnh quang có độ phân giải cao
và được phân tích bằng phần mềm máy tính, từ đó xác định
được kiểu gen ở những vị trí tương ứng trong bộ gen. Do đó,
việc sử dụng microarray mật độ cao giúp phát hiện đồng thời
một số lượng lớn các thay đổi DNA, từ đó tạo điều kiện sàng
lọc trên toàn bộ bộ gen.
Đã có sự phát triển đáng kể về proteomics, có tiềm năng
trở thành một công cụ không thể thiếu trong chẩn đoán phân
tử. Hiện có rất nhiều công nghệ proteomic hữu ích, có tiềm
năng trải qua những cải tiến công nghệ đáng kể, điều này sẽ
có lợi cho việc tăng độ nhạy và năng suất trong khi giảm yêu
cầu về mẫu (xem Chương 13). Sự cải tiến của các công nghệ
này là một bước tiến đáng kể hướng tới nhu cầu chẩn đoán
bệnh tốt hơn. Việc phát hiện các tập tin pro protein đặc
hiệu của bệnh bắt nguồn từ việc sử dụng gel protein hai
chiều (Hanash, 2000), khi người ta chứng minh rằng bệnh
bạch cầu có thể được phân loại thành các phân nhóm khác nhau
dựa trên đặc điểm protein khác nhau (Hanash và cộng sự,
2002). Ngày nay, máy quang phổ khối có thể phân giải nhiều
loại protein và peptide trong dịch cơ thể, gần như được
thiết lập để cách mạng hóa việc chẩn đoán bệnh dựa trên
protein (xem Chương 13). Bản chất mạnh mẽ và thông lượng cao
của thiết bị đo phổ khối là vô song và phù hợp ngay lập tức
cho các ứng dụng lâm sàng trong tương lai, như đã được chứng
minh rõ ràng qua nhiều nghiên cứu hồi cứu ở bệnh nhân ung
thư (được xem xét trong Petricoin và cộng sự, 2002) . Ngoài
ra, các vi mô protein thông lượng cao, được xây dựng từ các
protein tái tổ hợp, tinh khiết và có chức năng, cho phép
phân tích thu nhỏ và song song số lượng lớn các dấu hiệu
chẩn đoán trong các mẫu phức tạp. Các nghiên cứu thí điểm
đầu tiên về các mô bệnh, chẳng hạn như đánh giá biểu hiện
protein trong mô có nguồn gốc từ tế bào vảy
ung thư biểu mô khoang miệng (Knezevic và cộng sự, 2001)
hoặc việc xác định các protein gây ra phản ứng kháng thể cấp
tính trong các rối loạn tự miễn dịch, sử dụng mảng kháng
nguyên tự động (Robinson và cộng sự, 2002), xuất hiện vào
đầu những năm 2000, chỉ ra rằng Phân tích mẫu protein cuối
cùng có thể được áp dụng như một công cụ sàng lọc ung thư ở
những nhóm dân số nói chung và có nguy cơ cao.
Sự phát triển của các nền tảng phát hiện biến thể tiên
tiến không chỉ có tác động tích cực đến xét nghiệm gen phân
tử của các rối loạn di truyền mà còn cung cấp phương tiện
kỹ thuật cho các ngành khác, chẳng hạn như để xác định các
sản phẩm biến đổi gen (GM), có thể làm ô nhiễm hạt không
biến đổi gen hoặc thành phần thực phẩm có chứa chất phụ gia
và hương liệu đã được biến đổi gen hoặc được sản xuất từ
sinh vật biến đổi gen hoặc kiểu gen của một chủng động vật.
Thử nghiệm di truyền phân tử cũng được áp dụng trong việc
xác định liều lượng thuốc theo từng cá nhân, còn được gọi là
di truyền dược động học (Chương 16), được gọi là mô tả sự
biến đổi di truyền giữa các cá thể ở các gen chủ yếu liên
quan đến chuyển hóa và vận chuyển thuốc với hiệu quả và tác
dụng phụ của thuốc. Cách tiếp cận này kết hợp chuyên môn
công nghệ từ các phương pháp tiếp cận omics thông lượng
cao, chẳng hạn như genomics, tran scriptomics và genomics
chức năng, để xác định và dự đoán bản chất phản ứng của một
cá nhân đối với việc điều trị bằng thuốc và thiết kế hợp lý
các loại thuốc mới hơn hoặc cải thiện những loại thuốc hiện
có ( Squassina và cộng sự, 2010). Điều tương tự cũng có thể
được áp dụng trong việc cá nhân hóa chế độ ăn uống, trong
một chuyên ngành mới nổi được gọi là Dinh dưỡng học (Chương
17). Cuối cùng, các biến thể trình tự bộ gen đã được xác
định cần phải được tổ chức và lưu trữ trong cơ sở dữ liệu
biến thể chuyên biệt và được quản lý tốt, cho phép bác sĩ
hoặc nhà nghiên cứu truy vấn và truy xuất thông tin liên
quan đến các vấn đề chẩn đoán (xem Chương 20).
Cuối cùng, phân tích và xét nghiệm ADN cũng đã tạo ra
một cuộc cách mạng đáng kể trong ngành khoa học pháp y.
Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh học phân tử và sự hiểu
biết ngày càng tăng về bộ gen người đã có tác động lớn đến
y học pháp y (xem Chương 21). Việc xác định đặc tính di
truyền của các cá nhân ở cấp độ DNA cho phép kiểm tra danh
tính từ một lượng mẫu sinh học tối thiểu, chẳng hạn như tóc,
máu, tinh dịch, xương, v.v., trong các trường hợp tấn công
tình dục, giết người và hài cốt người không xác định cũng
như xét nghiệm quan hệ cha con cũng đang thay đổi từ cấp độ
sản phẩm gen sang cấp độ bộ gen. Xét nghiệm DNA cho đến nay
có lợi thế hơn nhiều so với các phương pháp pháp y thông
thường và trong nhiều năm đã góp phần vào việc tha bổng
những người bị buộc tội sai (cứu hầu hết họ thậm chí khỏi tử
tù), việc xác định những cá nhân đã phạm tội (Cohen, 1995) ,
và thậm chí còn giúp xác định danh tính của những hài cốt
người chưa được biết đến, chẳng hạn như từ các nạn nhân tại
Ground Zero ở New York hoặc từ bộ xương của các thành viên
gia đình Romanov (Gill và cộng sự, 1994; xem Chương 22).
Machine Translated by Google
6 Chẩn đoán phân tử
1.5 TẦM NHÌN TƯƠNG LAI: ĐIỀU GÌ ĐANG SAU
Chẩn đoán phân tử bắt đầu từ mùa xuân năm 1953, khi chuỗi
xoắn kép DNA lần đầu tiên được công bố. Ngày nay, chẩn đoán
phân tử bao gồm một tập hợp các tiến bộ công nghệ có hiệu
suất cao, giúp phát hiện kiểu gen ở hàng nghìn vị trí gen
và toàn bộ bộ gen với độ chính xác rất cao và chi phí giảm
dần. Điều này cũng dẫn đến sự hiểu biết tốt hơn về cơ sở
của các bệnh di truyền, do đó cho phép chẩn đoán phân tử
đóng một vai trò quan trọng trong việc quản lý bệnh nhân
hoặc bệnh tật. Hiện nay, một số lượng lớn mẫu được phân
tích hàng năm trên toàn thế giới ở cả các phòng thí nghiệm
công và tư, đồng thời số lượng xét nghiệm di truyền sẵn có
tăng đều đặn qua từng năm, khiến các phòng thí nghiệm chẩn
đoán phân tử không thể thiếu trong phòng thí nghiệm y học.
Với các dạng nền tảng giải trình tự hiện có, trẻ sơ sinh
có thể được sàng lọc một số bệnh di truyền có thể điều trị
được, đồng thời cũng có thể trong tương lai không xa,
những trẻ có nguy cơ cao mắc bệnh động mạch vành sẽ được
xác định và điều trị để ngăn ngừa những thay đổi trong
thành mạch máu của chúng khi trưởng thành. Tương tự, cha
mẹ sẽ có quyền được thông báo về tình trạng mang mầm bệnh
của nhiều bệnh di truyền trước khi quyết định lập gia đình.
Ngoài ra, đối với nhóm dân số trung niên và lớn tuổi, các
nhà khoa học sẽ có thể xác định hồ sơ rủi ro đối với các
bệnh khởi phát muộn khác nhau, tốt nhất là trước khi xuất
hiện các triệu chứng mà ít nhất có thể ngăn ngừa một phần
thông qua các can thiệp về chế độ ăn uống (Chương 17) hoặc
dược phẩm (Chương 17). 16). Trong tương lai gần, việc xác
định kiểu gen ưu tiên của các gen liên quan đến chuyển hóa
và vận chuyển thuốc sẽ giúp cá nhân hóa phản ứng thuốc và
sẽ trở nên không thể thiếu trong thực hành y tế tiêu chuẩn.
Mặc dù phần lớn những vấn đề này đang dần trở thành hiện
thực nhưng một số vẫn dựa trên những lời hứa, dù khá lạc
quan. Vì vậy, một số quan điểm mới về lĩnh vực này có thể
chỉ còn cách đây một thập kỷ nữa.
1.5.1 Thương mại hóa chẩn đoán phân tử Hiện
nay, di truyền
phân tử lâm sàng là một phần của chăm sóc sức khỏe chính
thống trên toàn thế giới với một đơn vị hoặc khoa chẩn đoán
phân tử trong mỗi đơn vị chăm sóc sức khỏe. Mặc dù khái
niệm chẩn đoán phân tử ngày càng phát triển, các xét nghiệm
di truyền nói chung vẫn không được sử dụng để sàng lọc dân
số mà chỉ để chẩn đoán, sàng lọc người mang mầm bệnh và
chẩn đoán trước sinh và chỉ trên cơ sở hạn chế. Việc thiếu
phân tích hiệu quả chi phí là một trong những lý do (Snyder
và cộng sự, 2014). Do đó, để làm cho chẩn đoán phân tử được
phổ biến rộng rãi, một số trở ngại và vấn đề cần được xem
xét và giải quyết.
Vấn đề quan trọng đầu tiên là lựa chọn công nghệ và nền
tảng phát hiện biến thể. Mặc dù thực tế là một
có sẵn rất nhiều phương pháp phát hiện biến thể, “. nền
tảng tốt nhất là nền tảng hoạt động tốt nhất trong phòng
thí nghiệm của riêng bạn.” Có rất nhiều sự lựa chọn về
kiểu gen, chẳng hạn như bộ lọc, gel, microarrays và tấm
microtiter, cho các công nghệ dựa trên khuếch đại, cho các
kỹ thuật phân tách, chẳng hạn như vết thấm, điện di mao
quản, mảng vi mô và quang phổ khối, và cuối cùng là các
phương tiện khác nhau để ghi nhãn. , chẳng hạn như các
chất phóng xạ, huỳnh quang, tổ hợp chemilumi hoặc các chất
enzym. Sự đa dạng của các phương pháp phát hiện khiến việc
xác định phương pháp nào phù hợp hơn với môi trường phòng
thí nghiệm trở nên khó khăn. Nói chung, giải trình tự DNA,
đặc biệt là trong kỷ nguyên giải trình tự thế hệ tiếp
theo, là tiêu chuẩn vàng để xác định các biến thể trình tự
DNA, nguyên nhân hay lành tính (xem thêm Chương 9), nhưng
sau đó một lần nữa các vấn đề khác nhau phải được giải
quyết như phạm vi giải trình tự, phương pháp làm giàu, gen
được phân tích, v.v. Chi phí đầu tư ban đầu và khối lượng
thử nghiệm dự kiến là một số yếu tố cần được xem xét trước
khi chọn kỹ thuật phát hiện. Các vấn đề liên quan là chi
phí của phần cứng và phần mềm liền kề, thuốc thử và bộ
dụng cụ. Điều thứ hai có tầm quan trọng rất lớn, vì hầu hết
các phòng thí nghiệm chẩn đoán ngày nay đang thực hiện các
xét nghiệm “tự pha tại nhà”, chẳng hạn như không sử dụng
các bộ xét nghiệm di truyền được tiêu chuẩn hóa tốt do rào
cản chi phí, dẫn đến vấn đề kiểm soát chất lượng thuốc thử
(xem Chương 29) và an toàn (xem Chương 28).
Một vấn đề rất quan trọng khác là đào tạo nhân sự của
phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử, thể hiện ở chất lượng
và cách giải thích chính xác kết quả. Giáo dục di truyền
liên tục cho nhân viên của phòng thí nghiệm chẩn đoán là
rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả được
cung cấp, đặc biệt là trong các ngành mới nổi gần đây như
Dược lý học ( Reydon và cộng sự, 2012; Kampourakis và cộng
sự, 2014). Nhiều khi, chẳng hạn như trong trường hợp chẩn
đoán trước khi sinh hoặc tiền cấy ghép, cần phải đưa ra các
quyết định không thể thay đổi, hầu hết đều dựa trên kết quả
xét nghiệm đơn giản. Nhờ các chương trình đào tạo và kiểm
tra trình độ liên tục, số lượng kiểu gen không chính xác
được chẩn đoán đã giảm đáng kể (//www.eurogentest.org). Tại
Hoa Kỳ, có một cuộc kiểm tra trình độ tự nguyện hai năm một
lần dành cho các phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử, trong
khi ở Châu Âu, Mạng lưới Xuất sắc Châu Âu EuroGenTest
(http:// www.eurogentest.org) được thành lập để nâng cao
chất lượng trong thử nghiệm di truyền phân tử thông qua
việc cung cấp đánh giá chất lượng bên ngoài (các chương
trình thử nghiệm thành thạo) và tổ chức các cuộc họp thực
hành tốt nhất và xuất bản các hướng dẫn. Nói chung, đúng
là nhiều nhà di truyền học và các bác sĩ không chuyên về
di truyền học sẽ được hưởng lợi từ việc giáo dục di truyền
liên tục về việc sử dụng thích hợp các xét nghiệm chẩn đoán
phân tử, điều cần thiết để đánh giá phương pháp này về mặt phân tích và diễ
Những cân nhắc về mặt pháp lý và mối quan tâm về đạo
đức cũng là những trở ngại cần phải vượt qua. Một vấn đề là
Machine Translated by Google
Chẩn đoán phân tử: Chương quá khứ, hiện tại và tương lai | 1 7
hoàn trả chi phí chẩn đoán. Hiện tại, rất ít xét nghiệm được
các công ty bảo hiểm hoàn trả và khung pháp lý và quy định cần
thiết vẫn chưa hoàn thiện.
“Hợp pháp hóa” xét nghiệm phân tử bằng cách áp dụng các quy
định liên quan có thể sẽ dẫn đến sự gia tăng số lượng xét
nghiệm, đồng thời có thể tạo ra rào cản to lớn đối với xét
nghiệm di truyền không được kiểm soát. Tương tự, nhu cầu có
được sự đồng ý từ bệnh nhân để phân tích cũng rất quan trọng
và cần được phòng thí nghiệm chẩn đoán khuyến khích và tạo
điều kiện, đặc biệt trong trường hợp các phát hiện ngẫu nhiên
phát sinh từ các phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo
(Roche và Berg , 2015).
Mặt khác, vấn đề sở hữu trí tuệ cản trở việc thương mại
hóa rộng rãi các phương pháp chẩn đoán phân tử. Hầu hết tất
cả các gen liên quan đến lâm sàng đều đã được cấp bằng sáng
chế và các điều khoản mà người nắm giữ bằng sáng chế đưa ra
rất khác nhau. Trong số những khó khăn đó là sự lựa chọn hạn
chế về nền tảng phát hiện biến thể, mức độ trung thành lớn đối
với việc sử dụng thuốc thử và giấy phép phụ độc quyền mà nhiều
công ty cấp cho các phòng thí nghiệm lâm sàng, dẫn đến tình
trạng độc quyền. Do một trong những thách thức lớn nhất mà
phòng thí nghiệm lâm sàng đang phải đối mặt là việc tuân thủ
quy định và bằng sáng chế, nên có thể dự kiến có quan hệ đối
tác và cộng tác để cấp giấy phép công nghệ cho phòng thí nghiệm
chẩn đoán, nơi sau đó sẽ phát triển, tiêu chuẩn hóa và phân
phối các xét nghiệm. Điều này sẽ phần nào giảm bớt một số vấn
đề về sở hữu trí tuệ. Cuối cùng, vấn đề chuyên ngành di truyền
y học trở nên cấp bách hơn bao giờ hết.
Tại Hoa Kỳ, di truyền y học chỉ được chính thức công nhận là
một chuyên ngành y tế trong vòng 15 năm qua và ở Châu Âu, di
truyền y học chỉ mới được chính thức công nhận là một chuyên
ngành gần đây (http://www.eshg. org ) . Việc thực hiện quyết
định này vẫn đang gặp khó khăn đáng kể (http://www.eshg.org/
geneseurope.htm ), mà có lẽ sẽ mất nhiều năm để vượt qua. Với
việc hoàn thành Dự án Bộ gen Người, di truyền đã trở thành
động lực trong nghiên cứu y học và hiện đã sẵn sàng để tích
hợp vào thực hành y tế. Sự gia tăng lực lượng lao động di
truyền y tế, bao gồm các nhà di truyền học và cố vấn di truyền,
sẽ là cần thiết, trong khi điều này cũng đúng với sự xuất hiện
của các ngành mới, chẳng hạn như tin học bộ gen, cần thiết để
giải thích kết quả bộ gen (Potamias et al., 2014; xem thêm
Chương 19). Suy cho cùng, Dự án Hệ gen Người đã cung cấp thông
tin có tầm quan trọng vô cùng lớn về chẩn đoán và điều trị, và
ngành y tế giờ đây có nghĩa vụ phải tận dụng cả những cơ hội
và thách thức mà lượng thông tin di truyền dồi dào này mang
lại.
1.5.2 Y học cá nhân hóa
Thuật ngữ “y học cá nhân hóa” đề cập đến việc thực hành y học
trong đó bệnh nhân nhận được phương pháp điều trị y tế phù hợp
nhất, liều lượng phù hợp và sự kết hợp các loại thuốc.
dựa trên nền tảng di truyền của họ. Một số nguyên nhân gây ra
nhiều loại phản ứng có hại của thuốc đã được biết đến và thường
liên quan đến các alen gen đa hình của các enzyme chuyển hóa
thuốc (Squassina và cộng sự, 2010). Việc áp dụng các công cụ
xác định kiểu gen hiệu suất cao để xác định và sàng lọc các
hình thái đa nucleotide đơn cuối cùng có thể dẫn đến việc xác
định dấu hiệu phân tử duy nhất của một cá thể trong một khoảng
thời gian tương đối ngắn, đặc biệt là với sự ra đời của toàn
bộ trình tự bộ gen và khả năng của nó. ứng dụng trong dược lý
học (Mizzi và cộng sự, 2014; Katsila và Patrinos, 2015).
Bằng cách này, phản ứng của từng loại thuốc có thể được dự
đoán từ các phương sai di truyền được xác định trước có liên
quan đến tác dụng của thuốc. Nói cách khác, điều này sẽ cho
phép bác sĩ kê đơn thuốc có chọn lọc cho bệnh nhân (xem Chương
16). Ngoài ra, các hệ thống công nghệ thông tin chuyên dụng sẽ
cho phép dịch thông tin này sang định dạng có ý nghĩa lâm
sàng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ sử dụng định dạng này để
đánh giá và điều chỉnh liều thuốc cho từng bệnh nhân, từ đó
cho phép phân tích bệnh nhân và đánh giá thuốc đầy đủ, đặc
biệt là trong một bệnh viện. cách phủ đầu (Lakiotaki và cộng
sự, 2016). Ngoài những nỗ lực này, nhu cầu kết hợp khối kiến
thức ngày càng phức tạp này vào thực hành y tế tiêu chuẩn ngày
càng tăng. Việc kết hợp các khóa học liên quan đến dược động
học vào chương trình giảng dạy tiêu chuẩn của các trường y có
thể đảm bảo rằng thế hệ bác sĩ lâm sàng và nhà nghiên cứu sắp
tới sẽ quen thuộc với những phát triển mới nhất trong lĩnh vực
đó và sẽ có khả năng cung cấp cho bệnh nhân những lợi ích mong
đợi của y học cá nhân hóa ( Pisanu và cộng sự, 2014).
Tương tự, gen dinh dưỡng (hoặc gen dinh dưỡng) nghiên cứu
sự tương tác giữa dinh dưỡng và bộ gen của một cá nhân và
những tác động tiếp theo lên kiểu hình của chúng nhằm mục đích
cung cấp lời khuyên dinh dưỡng phù hợp hoặc phát triển các
sản phẩm thực phẩm chuyên biệt (xem Chương 17). Nói cách khác,
dinh dưỡng học nhận ra rằng một lời khuyên về chế độ ăn uống
cụ thể có thể có lợi cho người này nhưng có thể không phù hợp
hoặc thực sự có hại cho người khác. Mặc dù có thể so sánh với
dược động học học, nhưng dinh dưỡng học vẫn được coi là một
ngành khoa học mới nổi, trái ngược với dược động học học được
coi là “đã có tuổi” (Pavlidis và cộng sự, 2015).
Tuy nhiên, ngày càng có nhiều lo ngại về khía cạnh đạo đức
của y học cá nhân hóa. Trước hết, cần phải đảm bảo sự bình
đẳng trong chăm sóc y tế khi di truyền cho bác sĩ lâm sàng
biết bệnh nhân nào sẽ ít được hưởng lợi từ một phương pháp
điều trị bằng thuốc cụ thể. Thứ hai, việc đưa ra các công cụ
hoạt động để ngăn chặn sự kỳ thị và phân biệt đối xử giữa các
nhóm dân cư khác nhau, đặc biệt là trên cơ sở sắc tộc sẽ ngày
càng trở nên quan trọng (van Ommen, 2002), và do đó cần thực
hiện mọi biện pháp phòng ngừa để loại bỏ mọi định kiến và
thành kiến còn sót lại liên quan đến với việc nghiên cứu sự đa
dạng di truyền của con người. Những vấn đề nan giải khác bao
gồm quyền từ chối một phương pháp điều trị sẵn có đối với một số trường hợp cụ t
Machine Translated by Google

8 Chẩn đoán phân tử

quần thể bệnh nhân theo các chỉ định có nguồn gốc từ di chuyển hóa, phiên mã và metagenomics, được điều hòa bởi các
truyền, như trường hợp chẩn đoán trước sinh hiện nay. dịch vụ dịch thuật tin học bộ gen chính xác (Hình 1.1).

1.5.3 Bộ gen cá nhân
Mục tiêu cuối cùng trong chăm sóc sức khoẻ sẽ là sự tích hợp
hiệu quả của chẩn đoán phân tử với phương pháp điều trị. Với
sự ra đời của phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo vào
năm 2005 (Margulies và cộng sự, 2005) và sự phát triển vượt
bậc trong lĩnh vực này kể từ đó (xem Chương 8 và 9), các
chuyên gia tin rằng sẽ sớm có phương pháp giải trình tự gen
của riêng mình. bộ gen được giải trình tự với giá dưới 1000
USD. Trên thực tế, đã có những tuyên bố rằng bộ gen của con
người có thể được giải trình tự với giá 1000 đô la với mức độ
bao phủ thấp. Điều này sẽ liên quan đến công nghệ giải trình
tự rẻ hơn và nhanh hơn nhiều so với các máy móc ngày nay, cả
Mặc dù kỳ vọng rất cao và các công ty đang sử dụng những
công nghệ mới này để cung cấp thông tin cho các cá nhân nhằm
dự đoán kết quả về sức khỏe và bệnh tật, thậm chí cả các đặc
điểm hành vi, nhưng nhìn chung vẫn còn quá sớm để đưa ra
những hứa hẹn về thông tin hữu ích lâm sàng từ các phân tích gen.
Bên cạnh đó, có một mối nguy hiểm cố hữu là đánh giá quá cao
tính hữu ích của các xét nghiệm gen được cá nhân hóa khác
nhau, đặc biệt là những xét nghiệm có thể được người tiêu
dùng đặt hàng trực tiếp, còn được gọi là xét nghiệm di truyền
trực tiếp tới người tiêu dùng (DTC) (Magnus và cộng sự ,
2009). Không giống như các phân tích di truyền khác, các xét
nghiệm này cung cấp một lượng lớn thông tin di truyền, nhưng
giá trị chẩn đoán hoặc tiên lượng của chúng vẫn chưa chắc

trên thị trường lẫn nguyên mẫu, và một số nỗ lực hiện đang chắn do thiếu thông tin về ảnh hưởng của môi trường và các

được tiến hành, thường được khuyến khích bởi nguồn tài trợ lớn.
Trước đây, toàn bộ trình tự DNA của chỉ một số ít cá thể đã
được giải trình tự, chẳng hạn như Craig Venter (Levy và cộng
sự, 2007), Jim Watson (Wheeler và cộng sự, 2008), v.v., trong
khi ngày nay có hàng nghìn các bộ gen đã được giải trình tự,
cung cấp những hiểu biết hữu ích về cơ sở di truyền của các
bệnh ở người. Tuy nhiên, cần phải sắp xếp hàng triệu gen
nome để có thể hiểu rõ hơn về cách cá nhân hóa các phương
thức điều trị tốt hơn (Bảng 1.2). Trong tương lai, một người
có thể xuất hiện tại phòng khám để điều trị, “mang” toàn bộ
bộ gen của mình trong tay, hoặc cách khác, công nghệ nano
cuối cùng có thể cho phép phân tích DNA bằng thiết bị giải
trình tự DNA di động.
yếu tố khác cũng như mối liên hệ yếu ớt giữa phần lớn các cơ
địa di truyền với bệnh tật. . Một số nghiên cứu và phân tích
tổng hợp cho thấy rằng không có đủ bằng chứng khoa học để kết
luận rằng hồ sơ gen hữu ích trong việc đo lường nguy cơ di
truyền đối với các bệnh thông thường hoặc trong việc phát
triển chế độ ăn uống cá nhân hóa (Pavlidis et al., 2015;
2016) và các khuyến nghị về lối sống để phòng ngừa bệnh tật
(Patrinos et al . cộng sự, 2013). Thật khó hiểu khi một số
công ty trong lĩnh vực DTC sử dụng hồ sơ di truyền của khách
hàng để điều chỉnh các khuyến nghị về chế độ ăn uống và lối
sống cá nhân. Ngoài ra, đáng chú ý là một số công ty cung cấp
các xét nghiệm gen cá nhân không có bác sĩ nào tham gia vào
việc yêu cầu các xét nghiệm này, với lập luận rằng “.bệnh

Tương tự, một huấn luyện viên sức khỏe bộ gen cá nhân có thể
cung cấp thông tin kịp thời về sức khỏe của một người, dựa
trên cả thuật toán hỗ trợ trí tuệ nhân tạo và máy học cũng
như lượng dữ liệu gen phong phú có sẵn trong tài liệu (xem
thêm Chương 19). Nhìn chung, việc cung cấp các dịch vụ y tế
được cá nhân hóa chính xác sẽ bao gồm sự tương tác phức tạp
giữa hệ gen (dược phẩm),
nhân xứng đáng được truy cập trực tiếp vào thông tin sức khỏe
của họ mà không cần bác sĩ trung gian” (http://www .
nytimes.com/2008/ 26/06/business/26gene.html). Trong một số
trường hợp, các công ty này đã bị cơ quan quản lý cấm bán
thêm dịch vụ của họ. Nhìn chung, có những câu hỏi đặt ra là
liệu có nên quản lý các xét nghiệm này hay không và làm thế
nào, về mức độ chúng cung cấp thông tin y tế (hữu ích) và những rủi ro khi hiể

BẢNG 1.2 Tác động của việc giải trình tự bộ gen người trong việc nâng cao kiến thức về di truyền người và y học
cá nhân hóa

Số lượng

bộ gen Tác

Hàng ngàn động l Xác định các biến thể gen người l Phát
triển công nghệ để giải trình tự bộ gen người hoàn chỉnh và không có lỗi cho bệnh nhân
và dân số nói chung l Hiểu

Hàng triệu biết về cơ sở phân tử của các bệnh di truyền ở người l Tối ưu hóa mối
tương quan kiểu gen l Phát triển các công cụ phần mềm để
tương quan kiểu gen trong hồ sơ gen của bệnh nhân

hàng tỷ l Y học dự đoán và cá nhân hóa l Cá nhân

hóa điều trị l Cải thiện chất

lượng cuộc sống l Phòng ngừa bệnh

tật cho con người
Machine Translated by Google
Chẩn đoán phân tử: Chương quá khứ, hiện tại và tương lai | 1 9
HÌNH 1.1 Sơ đồ mô tả sự tương tác giữa các nguyên tắc omics khác nhau góp phần thực
hiện y học cá nhân hóa.
1.6 KẾT LUẬN
Trong những năm tới, chẩn đoán phân tử sẽ là một phần không
thể thiếu trong thực hành y tế và y tế công cộng trên toàn
thế giới. Xét nghiệm di truyền phân tử sẽ tạo điều kiện
thuận lợi cho việc phát hiện và mô tả đặc điểm bệnh ở người
cũng như theo dõi phản ứng của thuốc và sẽ hỗ trợ xác định
các yếu tố biến đổi gen và tính nhạy cảm với bệnh. Giải
trình tự toàn bộ bộ gen có khả năng trở thành tiêu chuẩn
vàng trong việc đánh giá sự biến đổi DNA và những thay đổi
trong biểu hiện gen. Tuy nhiên, có những trở ngại lớn cần
vượt qua trước khi triển khai các xét nghiệm này trong phòng
thí nghiệm lâm sàng, chẳng hạn như xét nghiệm nào sẽ được
sử dụng, lựa chọn công nghệ và thiết bị cũng như các vấn đề
như hiệu quả chi phí, độ chính xác, độ tái lập, đào tạo
nhân sự, hoàn phí. bởi người trả tiền bên thứ ba và sở hữu
trí tuệ. Cùng với xét nghiệm dựa trên protein, những tiến
bộ này sẽ cải thiện chẩn đoán phân tử và sẽ đặt ra những
thách thức bổ sung cho việc triển khai công nghệ đó trong
các đơn vị nghiên cứu công hoặc tư nhân, bệnh viện, phòng khám và các công ty dược phẩm.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
Busslinger, M., Moschonas, N., Flavell, RA, 1981. Beta và thalassemia: nối sai lệch
là kết quả của một đột biến điểm đơn trong một intron. Ô 27, 289e298.
Cohen, J., 1995. Gen và hành vi xuất hiện trong Thử nghiệm OJ.
Khoa học. 268, 22e23.
Cremonesi, L., Ferrari, M., Giordano, P., Harteveld, CL, Kleanthous, M., Papasavva,
T., Patrinos, GP, Traeger-Synodinos, J., 2007. Tổng quan về con người dựa trên
microarray hiện tại Phương pháp phát hiện đột biến gen globin Huyết sắc tố 31,
289e311.
Farrall, M., Rodeck, CH, Stanier, P., Lissens, W., Watson, E., Law, HY, Warren, R.,
Super, M., Scambler, P., Wainwright, B., Williamson, R., 1986. Chẩn đoán trước
sinh bệnh xơ nang trong tam cá nguyệt đầu tiên bằng các đầu dò DNA liên kết.
Mũi chích 327, 1402e1405.
Gemignani, F., Perra, C., Landi, S., Canzian, F., Kurg, A., Tonisson, N., Galanello,
R., Cao, A., Metspalu, A., Romeo, G., 2002. Phát hiện đáng tin cậy các đột biến
beta-thalassemia và G6PD bằng microarray DNA. Phòng khám. Chem. 2002 (48),
2051e2054.
Giardine, B., Borg, J., Viennas, E., Pavlidis, C., Moradkhani, K., Joly, P.,
Bartsakoulia, M., Riemer, C., Miller, W., Tzimas, G., Wajcman, H., Hardison, RC,
Patrinos, GP, 2014. Cập nhật cơ sở dữ liệu HbVar về các biến thể huyết sắc tố ở
người và đột biến thalassemia. Axit nucleic Res. 42, D1063eD1069.
Gill, P., Ivanov, PL, Kimpton, C., Piercy, R., Benson, N., Tully, G., Evett, I.,
Hagelberg, E., Sullivan, K., 1994. Xác định nguyên nhân nguồn gốc của gia đình
Romanov bằng phân tích DNA. Nat. Genet. 6, 130e135.
Hanash, SM, 2000. Các ứng dụng y sinh của điện di hai chiều sử dụng gradient pH cố
định: hiện trạng. Điện di 21, 1202e1209.
Hanash, SM, Madoz-Gurpide, J., Misek, DE, 2002. Xác định các mục tiêu mới trong liệu
pháp điều trị ung thư bằng cách sử dụng proteomics biểu hiện. Lê kemia 16,
478e485.
Holland, Thủ tướng, Abramson, RD, Watson, R., Gelfand, DH, 1991.
Phát hiện sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase cụ thể bằng cách sử dụng hoạt động
exonuclease 50 e30 của Thermus Aquas. Proc. Natl.
Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 88, 7276e7280.
Hiệp hội giải trình tự bộ gen người quốc tế, 2001. Giải trình tự và phân tích ban đầu
về bộ gen người. Bản chất 409, 860e921.
Kampourakis, K., Vayena, E., Mitropoulou, C., Borg, J., van Schaik, RH, Cooper, DN,
Patrinos, GP, 2014. Những thách thức chính đối với hệ gen dược động học thế hệ
tiếp theo. Dân biểu EMBO 15, 472e476.
Kan, YW, Dozy, AM, 1978. Tính đa hình của trình tự DNA liền kề với gen cấu trúc beta-
globin của con người: mối quan hệ với đột biến hình liềm.
Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 75, 5631e5635.
Kan, YW, Golbus, MS, Dozy, AM, 1976. Chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia.
Ứng dụng lâm sàng của lai phân tử. N. Anh.
J. Med. 295, 1165e1167.
Katsila, T., Patrinos, GP, 2015. Giải trình tự toàn bộ bộ gen trong dược phẩm
cogenomics. Đằng trước. Dược phẩm. 6, 61.
Knezevic, V., Leethanakul, C., Bichsel, VE, Worth, JM, Prabhu, VV, Gutkind, JS,
Liotta, LA, Munson, PJ, Petricoin 3rd, EF, Krizman, DB, 2001. Hồ sơ proteomic
của bệnh ung thư vi môi trường bằng mảng kháng thể. Proteomics 1, 1271e1278.
Lakiotaki, K., Kartsaki, E., Kanterakis, A., Katsila, T., Patrinos, GP, Potamias, G.,
2016. ePGA: một hệ thống thông tin dựa trên web dành cho dược động học tịnh
tiến. XIN VUI LÒNG MỘT. http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.pone.0162801 (trên
báo chí).
Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L., 1988. Một ligase qua trung gian
kỹ thuật phát hiện gen. Khoa học 241, 1077e1080.
Levy, S., Sutton, G., Ng, PC, Feuk, L., Halpern, AL, Walenz, BP, Axelrod, N., Huang,
J., Kirkness, EF, Denisov, G., Lin, Y. , MacDonald, JR, Pang, AW, Shago, M.,
Stockwell, TB, Tsiamouri, A., Bafna, V., Bansal, V., Kravitz, SA, Busam, DA,
Beeson, KY, McIntosh, TC, Remington, KA, Abril, JF, Gill, J., Borman, J.,
Rogers, YH, Frazier, ME, Scherer, SW,
Machine Translated by Google

10 Chẩn đoán phân tử

Strausberg, RL, Venter, JC, 2007. Trình tự bộ gen lưỡng bội của một cá thể Pavlidis, C., Lanara, Z., Balasopoulou, A., Nebel, JC, Katsila, T., Patrinos, GP,

con người. PLoS Biol. 5, e254. 2015a. Phân tích tổng hợp các dấu ấn sinh học dinh dưỡng cho thấy thiếu mối

Magnus, D., Cho, MK, Cook-Deegan, R., 2009. Trực tiếp đến người tiêu dùng liên hệ với chế độ ăn uống và các bệnh lý liên quan đến dinh dưỡng. OMICS

xét nghiệm di truyền: vượt quá quy định y tế? Bộ gen Med. 1, 17. 19, 512e520.

Margulies, M., Egholm, M., Altman, WE, Attiya, S., Bader, JS, Bemben, LA, Berka, Pavlidis, C., Patrinos, GP, Katsila, T., 2015b. Dinh dưỡng học: một điều ngược

J., Braverman, MS, Chen, YJ, Chen, Z., lại. ứng dụng. Dịch. Bộ gen 4, 50e53.

Dewell, SB, Du, L., Fierro, JM, Gomes, XV, Godwin, BC, Pavlidis, C., Nebel, JC, Katsila, T., Patrinos, GP, 2016. Nutrigenomics 2.0: nhu

Anh ấy, W., Helgesen, S., Ho, CH, Irzyk, GP, Jando, SC, Alenquer, ML, Jarvie, cầu đánh giá và tổng hợp liên tục và độc lập cơ sở kiến thức khoa học của các

TP, Jirage, KB, Kim, JB, Knight, JR, Lanza, JR, Leamon, JH, Lefkowitz, SM, bài kiểm tra di truyền học dinh dưỡng thương mại để đổi mới có trách nhiệm.

Lei, M., Li, J., OMICS 20, 65e68.

Lohman, KL, Lu, H., Makhijani, VB, McDade, KE, McKenna, MP, Myers, EW, Petcoin, EF, Zoon, KC, Kohn, EC, Barrett, JC, Liotta, LA, 2002.

Nickerson, E., Nobile, JR, Plant, R., Puc, BP, Ronan, MT, Roth, GT , Sarkis, Nghiên cứu protein lâm sàng: biến lời hứa bên giường bệnh thành hiện thực

GJ, Simons, JF, Simpson, JW, Srinivasan, M., Tartaro, KR, Tomasz, A., Vogt, bên giường bệnh. Nat. Rev thuốc. Discov. 1, 683e695.

KA, Volkmer, GA, Wang, SH, Wang, Y., Weiner, MP, Yu, P., Begley, RF, Rothberg, Pirastu, M., Kan, YW, Cao, A., Conner, BJ, Teplitz, RL, Wallace, RB, 1983. Chẩn

JM, 2005. Giải trình tự bộ gen trong các lò phản ứng picolit mật độ cao được đoán trước sinh bệnh beta-thalassemia. Phát hiện đột biến nucleotide đơn

chế tạo vi mô. Bản chất 437, 376e380. trong DNA. N. Anh. J. Med. 309, 284e287.

Pisanu, C., Tsermpini, EE, Mavroidi, E., Katsila, T., Patrinos, GP, Squassina, A.,

Mashal, RD, Koontz, J., Sklar, J., 1995. Phát hiện các đột biến bằng cách phân 2014. Đánh giá môi trường giáo dục dược động học ở Đông Nam Âu. Bộ gen y tế

tách các dị thể DNA bằng các phân giải vi khuẩn. Nat. công cộng 17, 272e279.

Genet. 9, 177e183.

Mizzi, C., Mitropoulou, C., Mitropoulos, K., Peters, B., Agarwal, MR, van Schaik, Potamias, G., Lakiotaki, K., Katsila, T., Lee, M., Topouzis, S., Cooper, DN,

RH, Drmanac, R., Borg, J., Patrinos, GP, 2014. Patrinos, GP, 2014. Giải mã dược động học thế hệ tiếp theo: góc nhìn công

Hồ sơ dược động học được cá nhân hóa bằng cách sử dụng toàn bộ trình tự bộ nghệ thông tin. Mở Biol. 4, 140071.

gen. Dược động học 15, 1223e1234.

Mullis, KB, Faloona, FA, 1987. Tổng hợp cụ thể DNA trong ống nghiệm thông qua phản Reydon, TA, Kampourakis, K., Patrinos, GP, 2012. Di truyền, gen và xã hội: trách

ứng dây chuyền được xúc tác polymerase.Phương pháp Enzymol. 155, 335e350. nhiệm của các nhà khoa học đối với truyền thông và giáo dục khoa học. Mỗi.

Myers, RM, Larin, Z., Maniatis, T., 1985a. Phát hiện sự thay thế bazơ đơn bằng Med. 9, 633e643.

cách phân tách ribonuclease khi không khớp trong RNA: song công DNA. Khoa học Robinson, WH, DiGennaro, C., Hueber, W., Haab, BB, Kamachi, M., Dean, EJ, Fournel,

230, 1242e1246. S., Fong, D., Genovese, MC, de Vegvar, HE, Skriner, K. , Hirschberg, DL,

Myers, RM, Lumelsky, N., Lerman, LS, Maniatis, T., 1985b. Phát hiện sự thay thế Morris, RI, Muller, S., Pruijn, GJ, van Venrooij, WJ, Smolen, JS, Brown, PO,

bazơ đơn trong tổng số DNA bộ gen. Thiên nhiên 1985 (313), 495e498. Steinman, L., Utz, PJ, 2002. Vi mảng tự kháng nguyên để xác định đặc tính

ghép kênh của tự kháng thể những phản hồi. Nat. Med. 8, 295e301.

Myers, RM, Maniatis, T., Lerman, LS, 1987. Phát hiện và định vị các thay đổi bazơ

đơn lẻ bằng cách biến tính điện di trên gel gradient. Roche, MI, Berg, JS, 2015. Những phát hiện ngẫu nhiên khi xét nghiệm gen: ý nghĩa

Phương pháp Enzymol. 155, 501e527. đối với thực hành tư vấn di truyền. Curr. Genet. Med. Dân biểu 3 (4), 166e176.

Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi, K., Sekiya, T., 1989.

Phát hiện tính đa hình của DNA người bằng phương pháp điện di trên gel dưới Ronaghi, M., Uhlen, M., Nyren, P., 1998. Phương pháp giải trình tự dựa trên

dạng đa hình hình dạng chuỗi đơn. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. pyrophosphate thời gian thực. Khoa học 281, 363e365.

Hoa Kỳ 86, 2766e2770. Saiki, RK, Bugawan, TL, Horn, GT, Mullis, KB, Erlich, HA, 1986.

Orkin, SH, Kazazian Jr., HH, Antonarakis, SE, Goff, SC, Boehm, CD, Sexton, JP, Phân tích DNA beta-globin và HLA-DQ alpha được khuếch đại bằng enzyme với các

Waber, PG, Giardina, PJ, 1982. Mối liên hệ của đột biến beta-thalassemia và đầu dò oligonucleotide đặc hiệu với alen. Bản chất 324, 163e166.

đa hình gen beta-globin với DNA đa hình trong cụm gen betaglobin của con Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Horn, GT, Mullis,

người. Bản chất 296, 627e631. KB, Erlich, HA, 1988. Khuếch đại DNA bằng enzyme định hướng bằng mồi với DNA

polymerase ổn định nhiệt.

Orkin, SH, Markham, AF, Kazazian Jr., HH, 1983. Phát hiện trực tiếp gen beta- Khoa học 239, 487e491.

thalassemia phổ biến ở Địa Trung Hải bằng đầu dò DNA tổng hợp. Một cách tiếp Saiki, RK, Scharf, S., Faloona, F., Mullis, KB, Horn, GT, Erlich, HA, Arnheim, N.,

cận khác để chẩn đoán trước sinh. J. Lâm sàng. 1985. Khuếch đại enzyme trình tự gen beta-globin và phân tích vị trí hạn chế

Đầu tư. 71, 775e779. để chẩn đoán bệnh hồng cầu hình liềm thiếu máu. Khoa học 230, 1350e1354.

Patrinos, GP, Baker, DJ, Al-Mulla, F., Vasiliou, V., Cooper, DN, 2013.

Các xét nghiệm di truyền có thể đạt được thông qua các hiệu thuốc: tốt, xấu Saiki, RK, Walsh, PS, Levenson, CH, Erlich, HA, 1989. Phân tích di truyền DNA

và xấu. Ừm. Bộ gen 7 (1), 17. khuếch đại bằng đầu dò oligonucleotide đặc hiệu theo trình tự cố định. Proc.

Patrinos, GP, Giardine, B., Riemer, C., Miller, W., Chui, DH, Anagnou, NP, Wajcman, Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 86, 6230e6234.

H., Hardison, RC, 2004. Những cải tiến trong cơ sở dữ liệu HbVar về các biến Saleeba, JA, Ramus, SJ, Cotton, RG, 1992. Phát hiện đột biến hoàn toàn bằng cách

thể huyết sắc tố ở người và đột biến thalassemia cho các nghiên cứu biến đổi sử dụng phân tách hóa học không nhãn. Ừm. Đột biến. 1, 63e69.

dân số và trình tự. Axit nucleic Res. 32, D537eD541. Snyder, SR, Mitropoulou, C., Patrinos, GP, Williams, MS, 2014.

Đánh giá kinh tế về dược động học: một cách tiếp cận dựa trên giá trị để đưa

Pauling, L., Itano, HA, Singer, SJ, Wells, IC, 1949. Bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, ra quyết định thực tế khi đối mặt với sự phức tạp. Bộ gen y tế công cộng 17,

một căn bệnh phân tử. Khoa học 110, 543e548. 256e264.
Machine Translated by Google

Chẩn đoán phân tử: Chương quá khứ, hiện tại và tương lai | 1 11

Squassina, A., Artac, M., Manolopoulos, VG, Karkabouna, S., Lappa Manakou, C., Johnson, J., Kalush, F., Kline, L., Koduru, S., Love, A., Mann, F., May,

Mitropoulos, K., Manchia, M., del Zompo, M., Patrinos, GP, 2010. Dịch D., McCawley, S., McIntosh, T., McMullen, I., Moy, M., Moy, L., Murphy,

thuật di truyền kiến thức vào thực hành lâm sàng: những kỳ vọng và thực tế B., Nelson, K., Pfannkoch, C., Pratts, E., Puri, V., Qureshi, H., Reardon,

của dược động học và y học cá nhân hóa. Dược động học 11, 1149e1167. M., Rodriguez, R., Rogers, YH, Romblad, D., Ruhfel, B., Scott, R., Sitter,

C., Smallwood, M., Stewart, E.,

Treisman, R., Orkin, SH, Maniatis, T., 1983. Khiếm khuyết phiên mã và ghép nối Strong, R., Suh, E., Thomas, R., Tint, NN, Tse, S., Vech, C., Wang, G.,

RNA cụ thể ở năm gen beta-thalassemia nhân bản. Bản chất 302, 591e596. Wetter, J., Williams, S., Williams, M., Windsor , S., Winn Deen, E.,

Wolfe, K., Zaveri, J., Zaveri, K., Abril, JF, Guigo, R., Campbell, MJ,

van Ommen, GJ, 2002. Dự án bộ gen người và tương lai của chẩn đoán, điều trị Sjolander, KV, Karlak, B., Kejariwal, A ., Mi, H., Lazareva, B., Hatton,

và phòng ngừa. J. Kế thừa. Metab. Dis. 25, 183e188. T., Narechania, A., Diemer, K.,

Venter, JC, Adams, MD, Myers, EW, Li, PW, Bức tranh tường, RJ, Sutton, GG, Muruganujan, A., Guo, N., Sato, S., Bafna, V., Istrail, S., Lippert, R.,

Smith, HO, Yandell, M., Evans, CA, Holt, RA, Schwartz, R., Walenz, B., Yooseph, S., Allen, D., Basu, A., Baxendale, J.,

Gocayne, JD, Amanatides, P., Ballew, RM, Huson, DH, Wortman, JR, Zhang, Blick, L., Caminha, M., Carnes-Stine, J., Caulk, P., Chiang, YH, Coyne,

Q., Kodira, CD, Zheng, XH, Chen, L., Skupski, M., Subramanian, G., Thomas , M., Dahlke, C., Mays, A. , Dombroski, M., Donnelly, M., Ely, D., Esparham,

PD, Zhang, J., Gabor Miklos, GL, Nelson, C., Broder, S., Clark, AG, Nadeau, S., Fosler, C., Gire, H., Glanowski, S., Glasser, K., Glodek, A., Gorokhov,

J., McKusick, VA, Zinder, N., Levine, AJ, Roberts, RJ, Simon , M., Slayman, M. , Graham, K., Gropman, B., Harris, M., Heil, J., Henderson, S., Hoover,

C., Hunkapiller, M., Bolanos, R., Delcher, A., Dew, I., Fasulo, D., J., Jennings, D., Jordan, C., Jordan, J., Kasha, J. , Kagan, L., Kraft,

Flanigan, M., Florea, L., Halpern, A., Hannenhalli , S., Kravitz, S., C., Levitsky, A., Lewis, M., Liu, X., Lopez, J., Ma, D., Majoros, W.,

Levy, S., Mobarry, C., Reinert, K., Remington, K., Abu Threideh, J., McDaniel, J., Murphy, S. , Newman, M., Nguyễn, T., Nguyễn, N., Nodell, M.,

Beasley, E., Biddick, K., Bonazzi, V., Brandon, R., Cargill, M., Pan, S., Peck, J., Peterson, M., Rowe, W., Sanders, R., Scott, J. ,

Chandramouliswaran, I., Charlab, R., Chaturvedi, K., Deng, Z., Di Simpson, M., Smith, T., Sprague, A., Stockwell, T., Turner, R., Venter,

Francesco, V., Dunn, P., Eilbeck, K., Evangelista, C. , Gabrielian, AE, E., Wang, M., Wen, M., Wu, D., Wu, M. , Xia, A., Zandieh, A., Zhu, X.,

Gan, W., Ge, W., Gong, F., Gu, Z., Guan, P., Heiman, TJ, Higgins, ME, Ji, 2001. Trình tự bộ gen của con người.

RR, Ke, Z., Ketchum, KA , Lai, Z., Lei, Y., Li, Z., Li, J., Liang, Y.,

Lin, X., Lu, F., Merkulov, GV, Milshina, N., Moore, HM, Naik , AK, Narayan, Khoa học 291, 1304e1351.

VA, Neelam, B., Nusskern, D., Rusch, DB, Salzberg, S., Shao, W., Shue, B., Wheeler, DA, Srinivasan, M., Egholm, M., Shen, Y., Chen, L., McGuire, A., He,

Sun, J., Wang, Z., Wang, A. , Wang, X., Wang, J., Wei, M., Wides, R., W., Chen, YJ, Makhijani, V., Roth, GT, Gomes, X ., Tartaro, K., Niazi, F.,

Xiao, C., Yan, C., Yao, A., Ye, J., Zhan, M., Zhang, W. , Zhang, H., Zhao, Turcotte, CL, Irzyk, GP, Lupski, JR, Chinault, C., Song, XX, Liu, Y.,

Q., Zheng, L., Zhong, F., Zhong, W., Zhu, S., Zhao, S., Gilbert, D., Yuan, Y., Nazareth, L., Qin, X., Muzny, DM, Margulies, M., Weinstock, GM,

Baumhueter, S., Spier, G. , Carter, C., Cravchik, A., Woodage, T., Ali, Gibbs, RA, Rothberg, JM, 2008. Bộ gen hoàn chỉnh của một cá thể bằng trình

F., An, H., Awe, A., Baldwin, D., Baden, H., Barnstead, M., Barrow, I. , tự DNA song song hàng loạt. Bản chất 452, 872e876.

Beeson, K., Busam, D., Carver, A.,

Woo, SL, Lidsky, AS, Guttler, F., Chandra, T., Robson, KJ, 1983.

Gen phenylalanine hydroxylase được nhân bản ở người cho phép chẩn đoán

Center, A., Cheng, ML, Curry, L., Danaher, S., Davenport, L., Desilets, trước khi sinh và phát hiện người mang mầm bệnh phenylketonuria cổ điển.

R., Dietz, S., Dodson, K., Doup, L., Ferriera, S., Garg , N., Gluecksmann, Bản chất 306, 151e155.

A., Hart, B., Haynes, J., Haynes, C., Heiner, C., Hladun, S., Hostin, D., Xiao, W., Oefner, PJ, 2001. Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao: một bài đánh

Houck, J., Howland, T., Ibegwam , C., giá. Ừm. Đột biến. 17, 439e474.