Gastr Latinoam 2006; Vol 17, N 2: 249-252

MDULO 6: HEPATITIS VIRAL I

Diagnstico serolgico y virolgico de la hepatitis C y B: Aspectos prcticos

Gabriela Muoz G.(1) SEROLOGIC AND VIROLOGIC DIAGNOSIS OF HEPATITIS B AND C INFECTION: PRACTICAL Diagnstico de virus hepatitis B y C El uso de tests virolgicos en el estudio de las hepatitis virales se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnstico de estas infecciones, el lineamiento de las decisiones teraputicas y para la evaluacin de la respuesta al tratamiento antiviral. Si bien ambos agentes producen un cuadro clnico similar, tratndose de dos virus con caractersticas genmicas y estructurales diferentes; la aproximacin para su estudio de laboratorio ser diferente en cada caso y depender de la etapa de la infeccin, del uso o no de tratamiento antiviral y de las herramientas diagnsticas disponibles y sus limitaciones. En trminos generales, existen 2 etapas en el estudio de las hepatitis virales por los virus B y C: la primera es el estudio diferencial que nos dar el diagnstico etiolgico y la segunda se refiere al monitoreo y seguimiento de los pacientes agudos/crnicos, que nos permitir evaluar la persistencia o evolucin a la cronicidad, as como el pronstico de severidad del dao y de respuesta al tratamiento antiviral. Diagnstico etiolgico y seguimiento Los tests virolgicos para el estudio de ambos agentes se pueden dividir en dos grandes aproximaciones: a) tests serolgicos (marcadores serolgicos) para el estudio de anticuerpos y/o antgenos, los que utilizamos principalmente para la identificacin inicial del agente etiolgico y/o la evaluacin de la etapa de la
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infeccin y b) tests moleculares para el estudio cualitativo y/o cuantitativo del RNA o DNA viral y su tipificacin. El uso de cada uno de ellos tiene sus indicaciones precisas, que dependern del agente que estamos estudiando y de la informacin que requiere el clnico en un momento determinado de la infeccin. Virus hepatitis C (VHC) Es un virus perteneciente a la familia Flaviviridae, gnero hepacivirus, que contiene un RNA monohebra de polaridad positiva de 9,4 Kb, el cual se ha logrado identificar y estudiar fundamentalmente a travs de tcnicas de biologa molecular. Se conoce su estructura genmica en su totalidad, a partir de la cual se han desarrollado todas las tcnicas de laboratorio en la actualidad disponibles. El estudio de la infeccin por VHC se realiza inicialmente a travs de la deteccin de los anticuerpos anti VHC (tipo IgG), mediante tcnicas inmunoenzimticas. La sensibilidad de stas es mayor del 98%, y permite detectar una seroconversin entre las 4 y 10 semanas post infeccin (tests de 2 y 3 generacin). Pese a la alta sensibilidad, estos ensayos presentan limitaciones relacionadas con el agente y la condicin del husped: a) No permite discriminar entre los sujetos con infeccin aguda, crnica o pasada con recuperacin. Los anticuerpos perduran de por vida en los pacientes crnicos y por ms de 18-20 aos en aquellos que se recuperan,

Laboratorio de Biologa Molecular. Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

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ya sea en forma espontnea (20-30% de casos) o post tratamiento antiviral. b) Seroconversin tarda: no permite la deteccin precoz de una infeccin aguda. c) Falsos positivos: en poblacin sana y de bajo riesgo como donantes de sangre y pacientes con autoinmunidad. d) Falsos negativos: en pacientes inmuno-comprometidos (VIH, hemodializados). e) Traspaso transplacentario: no discrimina entre una infeccin del recin nacido y los anticuerpos maternos. En cada uno de estos casos particulares, as como en todos los sujetos/pacientes donde se detecte un anti-VHC positivo, es necesario determinar la presencia de viremia circulante. Esta se realiza mediante la deteccin de RNA viral cualitativa (PCR) y nos permite evaluar la existencia de replicacin viral activa y confirmar una infeccin activa o pasada por VHC. Por lo tanto, el estudio de VHC por PCR estar indicado en todo paciente o sujeto anti VHC positivo y en los casos de dudas diagnsticas antes descritos. Adems, por su alta sensibilidad (< 100 copias de RNA/ml, < 50 UI/ ml) es de gran utilidad para la deteccin precoz de una primo-infeccin (deteccin a partir de 2 semanas post infeccin), y para la evaluacin post tratamiento antiviral, cuando la sensibilidad del mtodo sea superior a la de los mtodos de cuantificacin viral disponibles. La deteccin cuantitativa de RNA (carga viral, cuantificacin) y el estudio de genotipo viral (genotipificacin) estn indicados en los casos agudos o crnicos que sern sometidos a terapia antiviral. El primero de ellos permite evaluar el pronstico de una respuesta virolgica: a mayor carga viral basal, menor probabilidad de una respuesta sostenida. El estudio del genotipo viral, por otro lado, constituye un factor importante en la determinacin de una respuesta antiviral favorable: los genotipos 2 y 3 presentan una tasa de respuesta virolgica sostenida mayor que aquellos pacientes infectados con el genotipo 1. Por lo anterior, conocer el genotipo de VHC permitir definir la duracin del tratamiento, dependiendo de la cepa circulante en cada paciente (24 48 semanas, respectivamente). El estudio de labo250

ratorio de los genotipos virales se realiza por diferentes mtodos, todos ellos igualmente especficos y comparables a nivel de genotipo (1 a 6). Algunos de ellos permiten adems subtipificar (1a, 1b, 2a, etc), lo cual, desde el punto de vista clnico no tiene mayor significancia. La respuesta al tratamiento antiviral se evala considerando una carga viral basal (pretratamiento) y al menos una carga viral al trmino de ste y a las 24 semanas post tratamiento. Se considera una buena respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al trmino del tratamiento y una carga viral indetectable y/o RNA cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta viral sostenida). Adicionalmente, se ha determinado que una carga viral temprana (respuesta viral precoz) , con cada de 2 log 10 o ms a las 4 12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar precozmente la probabilidad de obtener una respuesta virolgica sostenida al trmino de la terapia. Debido a que el objetivo de la terapia antiviral es la eliminacin del virus circulante en sangre, el estudio virolgico post tratamiento debiera considerar el mtodo de deteccin cualitativo o cuantitativo que presente los menores lmites inferiores de sensibilidad, adems de presentar un amplio rango de linearidad (lmites inferior y superior de deteccin amplio y reproducible). Los mtodos de cuantificacin de VHC comerciales presentan 2 limitantes importantes: tienen diferentes lmites de deteccin y an no poseen un denominador comn de medicin, por lo tanto no son equivalentes ni comparables. Si bien todos ellos son igualmente confiables, es aconsejable utilizar el mismo mtodo para el seguimiento individual de cada paciente, y no utilizar factores de correccin para equiparar las unidades de medicin. Los mtodos ms utilizados para la cuantificacin viral son aquellos que utilizan la amplificacin del RNA (PCR competitiva; PCR en tiempo real) o la amplificacin de seales (DNA ramificado, bDNA). Los primeros tienen un rango dinmico de 600-850.000 UI/ml y de 30-200.000.000 UI/ml, respectivamente. El bDNA (Versant 3a generacin) se expresa

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en copias/ml (rango 3.200-40 millones) y la versin anterior de este ensayo en equivalentes genmicos/ml (rango desde 200 mil). Finalmente, dado que todos estos mtodos se basan en la acumulacin exponencial de productos amplificados/seales, los nmeros absolutos expresados en ellos son referenciales y la evaluacin de una cada significativa de una carga viral debe ser evaluada siempre en funcin de la diferencia en logs en base 10. Virus hepatitis B Es un virus DNA de doble hebra parcial, semicircular, con envoltura, perteneciente a la familia Hepadnaviridae. Presenta 3 sistemas antignicos principales: el antgeno de superficie (HBsAg) en su estructura ms externa, derivado de los genes S, Pre-S 1 o Pre-S 2-, el antgeno Core HBcAg, derivado del gen C) y el antgeno e (HBeAg, gen pre-Core). Cada uno de ellos dar origen a anticuerpos especficos (anti-HBs, anti- HBc IgM, anti-HBc total, anti-HBe). La presencia o ausencia de cada uno de estos marcadores estar asociada a diferentes etapas de la infeccin por VHB. La deteccin positiva del antgeno de superficie y del anticore IgM, nos orienta en la mayora de los casos al diagnstico de una infeccin aguda por VHB. Ambos marcadores aparecen precozmente y perduran detectables en la sangre entre 3 y mximo 6 meses, respectivamente. La persistencia de HBsAg por ms de 6 meses determina la condicin de infeccin crnica por este agente, la cual se acompaa generalmente de un anticore total positivo y un anticore IgM negativo. El estudio del antgeno e nos permite diferenciar entre una baja (e negativo) y una alta replicacin viral (e positivo), y ste se negativiza precozmente durante el curso de una infeccin aguda, apareciendo el anti-HBe (seroconversin). La deteccin positiva de anti-HBs es indicador de recuperacin de la infeccin e inmunidad (natural o post vacunacin), apareciendo tardamente post desaparicin del antgeno de superficie (alrededor de 6 meses) cuando hay resolucin y no detectndose, en general, en los portadores crnicos.

La deteccin cualitativa de DNA viral (PCR) es otra herramienta de laboratorio que sera de utilidad, siendo su mayor indicacin frente a dudas diagnsticas de un resultado falso positivo de HBsAg (hemodializados, autoinmunidad) o negativo de anti-HBc (inmunodepresin). Infeccin crnica por VHB En los casos de infeccin crnica por este agente, los tests virolgicos han pasado a ser de gran apoyo para evaluar el pronstico de dao heptico y la evolucin de la infeccin natural o post tratamiento. El sistema HBeAg/ anti HBe permite evaluar la magnitud de la replicacin viral e indirectamente evaluar la respuesta al tratamiento antiviral en un paciente antgeno e positivo. La seroconversin en estos casos es indicador de una disminucin de la replicacin viral, objetivo ltimo del tratamiento. Se sabe adems, que la positividad del antgeno e se relaciona estrechamente con la carga viral medida a travs de los mtodos moleculares, siendo sta > a 100.000 copias/ ml en promedio. Este ltimo ensayo permite diferenciar a los pacientes infectados entre aquellos con infeccin crnica activa o inactiva ( > < a 100 mil copias respectivamente). La cuantificacin de VHB es el examen de eleccin para el monitoreo de la terapia antiviral, considerndose una buena respuesta la cada de 2 o ms log10 entre una carga viral basal y una 2 medicin durante o post trmino del tratamiento. Permitir adems, detectar aquellos casos de infeccin con mutantes pre-core (hasta 40% en zonas de alta endemia) donde existe ausencia de antgeno e, a pesar de una alta carga viral y detectar la aparicin de mutantes resistentes a antivirales (aumento significativo de la carga viral). Los ensayos de cuantificacin de VHB tienen las mismas limitaciones descritas para el VHC, en cuanto a rangos de deteccin y uniformidad en las unidades de medicin. La tendencia mundial es unificar todos estos ensayos en un sistema comn de UI/ml. Los ensayos cuantitativos para VHB deben ser de gran sensibilidad y con amplios rangos
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de deteccin para poder evaluar correctamente la respuesta antiviral en estos pacientes, puesto que de ello depende la mantencin, suspensin o cambio de una terapia determinada. Existen en la actualidad varias alternativas, a nivel mundial, que cumplen con estas caractersticas pero pocas de ellas disponibles en nuestro pas. El mtodo de PCR en tiempo real (Taqman Cobas) es uno de los ensayos de eleccin por su alta sensibilidad y mayor linearidad: rango de 30 a 110 millones de UI/ml, desplazando al PCR competitivo (Monitor, rango 1.000 a 40 millones de copias/ml). Otros estudio moleculares Se describen al menos 7 genotipos diferentes para VHB (A-G), cuya distribucin difiere en las distintas regiones geogrficas, los cuales se han relacionado con mayor severidad y/ o menor respuesta al tratamiento. Si bien an se discute su importancia clnica, existen varios mtodos para su estudio: enzimas de restriccin (RFLP), hibridacin reversa, secuenciacin directa. Estudio de mutaciones Las mutaciones descritas en el VHB son de diferentes tipos, cada una de las cuales tiene una aproximacin clnica diferente y para las cuales existen hoy en da ensayos comerciales para su estudio: mutantes pre-core/core promotor; mutantes resistentes a terapia (gen Pol); mutantes del antgeno de superficie, asociadas a vacuna (gen S). Las dos primeras se han relacionado con mayor dao heptico, menor respuesta y/o alta replicacin viral.

Con la creciente disponibilidad de diferentes alternativas de tratamiento contra el VHB, nuevos ensayos moleculares van adquiriendo mayor relevancia, especialmente para la deteccin precoz de mutantes resistentes a lamivudina (YMDD, hibridacin reversa). Su estudio estara indicado en los tratamientos prolongados con este antiviral, detectndose precozmente la mutacin previo al aumento de la carga viral. Los mtodos comerciales de hibridacin reversa tambin permitiran estudiar las mutaciones a nivel de pre-core, cuya indicacin an no est claramente definida desde el punto de vista clnico. Bibliografa
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Correspondencia a: Gabriela Muoz Gmez Seccin Gastroenterologa. Hospital Clnico Universidad de Chile. Santos Dumont 999. E-mail: gmunoz@redclinicauchile.cl

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