CÁTEDRA DE BIOTECNOLOGÍA

2013
Inhibición por retroalimentación
¿ QUÉ SON LAS ENZIMAS ?

• EN ESTADO PURO SON PROTEÍNAS.

ENZIMAS
• CATALIZADORES DE LAS REACCIONES BIOQUÍMICAS.

• CADA PASO DE UNA VÍA METABÓLICA ESTÁ

CATALIZADO POR UNA ENZIMA.
Ing. Omar Brizuela

• LAS CÉLULAS REGULAN LA CANTIDAD Y LA

ACTIVIDAD DE SUS ENZIMAS.
1 2 3

Enzimas Enzimas y sustratos

Inhibición por retroalimentación

Hacen posibles las reacciones,
La sustancia sobre la cual actúa una enzima se conoce como sustrato.
disminuyendo la cantidad de
El sustrato se convierte en uno o más productos nuevos.
energía de activación que se
Las enzimas son reutilizables y cada una puede catalizar de 100 a
30,000,000 de reacciones por min.
necesita.

Pero, una enzima particular actúa solo sobre un sustrato específico.

Controlan la velocidad a la que
Cada enzima particular puede controlar solo un tipo de reacción.
ocurre la reacción, para que la
energía se libere lentamente.

Permiten que las reacciones
ocurran a unas temperaturas
que no hagan daño al
organismo.
¿Cuántas enzimas habrá en un
4
organismo? 5 6

Los modelos de enzimas

Enzimas y coenzimas
La forma y la estructura de una enzima determinan la reacción que
puede catalizar.

La enzima se une al sustrato (S) mediante un área especial, el sitio

Una enzima recibe el nombre del sustrato activo, para formar un complejo enzima-sustrato o E-S.
sobre el cual actúa.
En el sitio activo, la enzima y el sustrato se ajustan perfectamente.

A una parte del nombre del sustrato
se le añade el sufijo –asa. ¿Cuál
será el sustrato de una proteasa?
SITIO ACTIVO

En algunas reacciones, pequeñas
moléculas, llamadas coenzimas, se unen a
las enzimas para controlar las reacciones.

Las coenzimas no son proteínas
pero no sufren cambios durante las
reacciones.

Algunas vitaminas son coenzimas.
B1, B2, B6, K.

Una reacción no ocurrirá si la
coenzima no está presente.
7 8 9
 Los modelos de enzimas

A - Modelo de la llave y la
cerradura.
Clasificación de Enzimas

B - Modelo del ajuste
inducido.
Las enzimas son clasificadas por la Comisión de Significado de la Codificación por números:
Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica. De izquierda a derecha definen:

Cada enzima puede definirse perfectamente de tres
Tipo de reacción general en que interviene la
maneras diferentes: por un nombre sistemático, por enzima.
una denominación trivial y/o por un número de la

Sub clase – Indica el producto dador.
Comisión de Enzimas (EC).

Sub subclase – Indica el producto aceptor.
O sea la enzima α - amilasa (nombre trivial) tiene el
nombre sistemático: α-1,4 – glucan – 4 –
Indica el sustrato el sustrato específico.
glucanohidrolasa y el número EC 3.2.1.1.

10 11 12

ENZYME
Clases de Enzimas:
Base de datos para nomenclatura de Enzimas

1. Oxidorreductasas
1. Oxidoreductasas
ENZYME es un lugar donde se reúne

1.1 Actúa sobre la función alcohol de los sustratos información relativa a la nomenclatura de las
2. Transferasas

1.1.1 Requiere NAD+ ó NADP+ como aceptor de enzimas.
hidrógeno. 3. Hidrolasas Se basa principalmente en las

1.1.1.1 El sustrato específico es el alcohol etílico. recomendaciones deI Comité de
Ejemplo: 4. Liasas
Nomenclatura de la Unión Internacional de

Reacción: CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+
Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB) y
5. Isomerasas se describe cada tipo de enzima

Nombre Sistemático: Alcohol NAD oxidoreductasa
caracterizada por un número asignado por la
(1.1.1.1.)
6. Ligasas Comisión de Enzimas (EC). ENZYME se

Nombre Trivial: Alcohol deshidrogenasa
puede acceder desde el server de ExPASy.
13 14 15

1. Oxidoreductasas 2. Transferasas
1. Oxidoreductasas
No. Clase Tipo de reacción Ejemplo ( Reacciones de oxido-reducción).
No. Clase Tipo de reacción que Ejemplo
que catalizan catalizan
Deshidrogenasas Deshidrogenasas
1 Oxidorreductasas De óxido reducción Peroxidasa 1 Oxidorreductasas De óxido reducción (transferencia de Peroxidasa Oxidasas
e-) Oxigenasas
(transferencia de e-) Oxidasas Reductasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
Reducción: ganancia de electrones (hidrógeno o pérdida de
oxígeno)

Oxidación: pérdida de electrones (hidrógeno o ganancia de

oxígeno).

La Oxidación y la Reducción son reacciones acopladas (REDOX)

Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que se oxide.
16 17 18
 2. Transferasas 3. Hidrolasas 3. Hidrolasas
(Transferencia de grupos funcionales) (Reacciones de hidrólisis)
No. Clase Tipo de reacción que Ejemplo
catalizan
Deshidrogenasas
1 Oxidorreductasas De óxido reducción (transferencia de e-) Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas

Hidrólisis, con transferencia Pirofosfatasa

3 Hidrolasas de grupos funcionales del Tripsina
agua Aldolasa

Transforman polímeros en monómeros.

•grupos aldehídos
Actúan sobre: •enlace éster
•grupos acilos Succinato Deshidrogenasa •enlace glucosídico
•grupos glucosilos Citocromo c oxidasa. •enlace peptídico
19 20 21
•grupos fosfatos (kinasas) •enlace C-N

4. Liasas 5. Isomerasas
4. Liasas
No. Clase Tipo de reacción que Ejemplo (Adición a los dobles enlaces) No. Clase Tipo de reacción que Ejemplo
catalizan catalizan
Deshidrogenasas Deshidrogenasas
1 Oxidorreductasas De óxido reducción (transferencia de e-) Peroxidasa Oxidasas 1 Oxidorreductasas De óxido reducción (transferencia de e-) Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas Oxigenasas
Reductasas Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas 2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas Transaminasas
3 Hidrolasas Hidrólisis, con transferencia de grupos Pirofosfatasa 3 Hidrolasas Hidrólisis, con transferencia de grupos Pirofosfatasa
funcionales del agua Tripsina funcionales del agua Tripsina
Aldolasa Aldolasa

4 Liasas Lisis de un substrato, (Sintasas) 4 Liasas Lisis de un substrato, generando un (Sintasas)

doble enlace, o Descarboxilasa
generando un doble enlace, o Adición de un substrato a un doble pirúvica
Adición de un substrato a un Descarboxilasa enlace de un 2o. substrato
(Sintasa)
doble enlace de un 2o. pirúvica
substrato • Entre C y C
5 Isomerasas Transferencia de grupos en Mutasas
• Entre C y O el interior de las moléculas Epimerasas
para dar formas isómeras Racemasas
22 • Entre C y N 23 24

6. Ligasas
6. Ligasas
5. Isomerasas
(Reacciones de isomerización) No. Clase Tipo de reacción que Ejemplo (Formación de enlaces, con aporte de ATP)
catalizan
Deshidrogenasas
1 Oxidorreductasas De óxido reducción (transferencia de e-) Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
3 Hidrolasas Hidrólisis, con transferencia de grupos Pirofosfatasa
funcionales del agua Tripsina
Aldolasa
4 Liasas Lisis de un substrato, generando un (Sintasas)
doble enlace, o Descarboxilasa pirúvica
Adición de un substrato a un doble
enlace de un 2o. substrato
(Sintasa)
5 Isomerasas Transferencia de grupos en el Mutasas
interior de las moléculas para Epimerasas
dar formas isómeras Racemasas •Entre C y O
6 Ligasas Formación de enlaces C-C,
C-S, C-O y C-N. Mediante Sintetasas •Entre C y S
reacciones de condensación, •Entre C y N
25 acopladas a la ruptura del ATP 26 27

•Entre C y C
 PROPIEDADES GENERALES ¿ CUÁLES SON LOS MECANISMOS DE LA ACCIÓN
ENZIMÁTICA ?

AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN




De 106 to 1012 veces vs sin enzima.
Aún más rápido que los catalizadores químicos. CINÉTICA ENZIMÁTICA SUBSTRATO PRODUCTOS

CONDICIONES DE REACCIÓN

Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC) + +

pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5

Presión atmosférica normal
COMPLEJO

CAPACIDAD DE REGULACIÓN ENZIMA-SUSTRATO
ENZIMA ENZIMA

Por concentración de sustrato

Por concentración de enzima

Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)

Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)

Por regulación alostérica SUBSTRATO: COMPUESTO CUYA TRANSFORMACIÓN
QUÍMICA ES CATALIZADA POR LA ENZIMA.

ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN

Interacción estereoespecífica con el sustrato

No hay productos colaterales 28 29 30

Naturaleza de las Reacciones Enzima-Sustrato

Apoenzima: componente proteico termolábil

de la enzima.

Cofactor, coenzima o grupo prostético:
cocatalizadores que actúan conjuntamente
con la apoenzima para catalizar una
reacción.

Holoenzima: conjunto de porción proteica y
coenzima.

31 32 33

¿ CÓMO SE EXPLICA LA CATÁLISIS ? CARACTERÍSTICAS DE LAS PROTEÍNAS

NIVEL ENERGÍA

DESNATURALIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN POR

ENERGÍA DE
SALES Y DISOLVENTES.
ACTIVACIÓN
ENERGÍA
TIENEN DIMENSIONES COLOIDALES.
LIBERADA

ESPONTÁ
ESPONTÁNEA DE MAGNITUD
SON CONJUGADAS Y SENCILLAS.
REACCIONANTE PRODUCTOS DESCONOCIDA Y ↑ E°
EXTRACELULARES E INTRACELULARES.
SE AFLOJA EL ENLACE ENTRE LAS DOS
PARTES DE LA MOLÉ
MOLÉCULA ORIGINAL
COMPLEJO
REACCIONANTE
ACTIVADO
(POR UN CATALIZADOR) Y ↓ E°

SE ROMPE EL ENLACE EN FORMA

COMPLEJO
34 ACTIVADO PRODUCTOS ESPONTÁNEA Y ↑ E°
ESPONTÁ 35 36
 Los factores que afectan la actividad Los factores que afectan la actividad ACCIÓN DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS
enzimática enzimática
ENZIMAS

pH: la actividad enzimática es óptima en un determinado rango.

Otras causas de modificación de la velocidad por acción del pH son
por protonación o desprotonación, reacciones laterales del sustrato,
pH
etc.

Temperatura: son curvas del tipo asimétricas. El óptimo puede (puede llegar a la
estar a 40°ó 50°C. desnaturalización) Cantidad de
La desnaturalización térmica irreversible a menudo ocurre por formas ionizadas Rango de
procesos polimoleculares tales como agregación o precipitación. (Ej: pepsina) Actividad

También puede inactivarse por cambios conformacionales o

covalentes.
Baja Temperatura: puede aumentar o disminuir la actividad
enzimática. Esto se debe a que puede haber ruptura de las
membranas celulares liberando enzimas y sustratos. Otra causa es
que parte del agua se congela y parte queda líquida y se produce un
efecto de concentración y a mayor concentración mayor velocidad.
37 38 39

Los factores que afectan la actividad Los factores que afectan la actividad
enzimática enzimática

Actividad del agua (aw) : es el agua disponible para las reacciones. A
mayor aw mayor actividad enzimática. Algunas trabajan aún con muy

La temperatura (desnaturalización) (Ej: albúmina) bajo aw.

Iones: todos los aniones tienen el mismo tipo de efecto que es la
variación de la fuerza iónica.
Los cationes son activadores de la enzima.
Si se aumenta la concentración de algunos iones puede aumentar o
disminuir la actividad de la enzima. Un ión puede bloquear los sitios
activos o unirse al sustrato en sus puntos de reacción.
Pueden actuar como quelantes quitando grupos disponibles a la
reacción.
Los cationes activantes son los alcalinos y alcalinotérreos (Na, Ca, Mg,
Cs). Hay que tener cuidado con la inactivación por metales pesados (Fe,
Pb, etc.).

Solubilización: (salting in) o precipitación (salting out) por
concentración salina: hay concentraciones que favorecen la
solubilización, pero a altas concentraciones el efecto se puede revertir e
insolubilizarse la enzima por efecto de las sales pues los iones compiten
40
con la enzima por el agua o sea bajan el aw. 41
Los factores que afectan la actividad
enzimática

Inactivación por efectos de corte: se pueden desnaturalizar por
bombeo, homogeneización, mezclado. Se cree que la inactivación se
debe a una combinación del esfuerzo cortante con fenómenos de
interfase por la presencia de aire principalmente.

Inactivación por efectos de la presión: solo se produce a presiones
muy altas.

Inactivación por efectos de interfase: en interfases como espumas,
agua y aceite, etc., puede destruirse la estructura terciaria y aún la
secundaria.

Concentración de Sustrato: influencia la velocidad de la reacción
hasta un cierto punto a partir del cual la velocidad ya no aumentará.

Presencia de Inhibidores: un modulador es una sustancia que puede
combinarse con las enzimas para alterar sus actividades catalíticas.
Un inhibidor es un modulador que disminuye la actividad enzimática.
Este puede disminuir la velocidad de reacción en forma competitiva, no
competitiva o parcialmente competitiva, dependiendo de su estructura
química y de los sitios sobre los que actúe. Algunos lo hacen en forma
reversible y otros en forma irreversible.
42

Unidad internacional de CINÉTICA ENZIMÁTICA ALTA

actividad enzimática (U). ESPECIFICIDAD
DE REACCIÓN

Cantidad de enzima requerida para liberar INTERACCIÓN

ESTEREO
un micromol de producto por minuto bajo
ESPECÍFICA
las condiciones de ensayo. CON SU
SUSTRATO
Hay mucha heterogeneidad en el reporte de
la actividad enzimática (hidrólisis de
almidón, de tirosina, etc.)
44 45
 Los Substratos
se acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Los reactivos Cambia la
Substratos interaccionan configuración de la
HO- con la enzima
enzima
(sitio activo)

H-

Enzima46 47 48

Substrato
de glucosa

Sitio de Se realiza la
enlace
reacción
catalítica

La unión del sustrato produce un cambio conformacional de la

enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.
49 50 51

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

Leonor Michaelis y Maud Menten (1913) Vo = Vmax [S] Utilizando la

nomenclatura
Concent.

para diseño de
Km + [S] reactores

Tiempo
52 53 54
 Cinética enzimática en función de la Km de algunas enzimas
concentración de sustrato ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5

Orden Cero Anhidrasa carbónicoa HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
Primer orden
N-Benzoiltirosinamida 2.5
β-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
55 56 57

La KM es un parámetro de GRÁFICA DE LANGMUIR

Actividad Enzimática
PARÁMETROS DE
MICHAELIS-MENTEN

La KM es inversamente proporcional con la
actividad de la enzima. ¿Vmax? Pend =

Valor de KM grande, baja actividad (baja

afinidad). ¿KM? 0=

Valor de KM pequeño, alta actividad (alta 0=

afinidad).

58 59
Minimiza los errores experimentales.

Gráfica de Eadie-Hofstee

GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK
Pend
Vmax

Desventaja: que –rA

aparece en ambos
ejes siendo una
variable dependiente.
Pend = - KM

Vo

Pendiente = Km/Vmax V max

A bajas KM
Intercepción eje y = 1/Vmax concentraciones de
Sustrato da mucho
error en la Vo
61 determinación de Km 62
[S] 63
 Inhibidores Inhibidor Irreversible
Cuando:
Reactivos químicos específicos que pueden • Inhibición permanente
Vo= Vmax Todos los sitios activos están inhibir a la mayor parte de las enzimas.
ocupados y no hay moléculas de E libre. • Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
Irreversibles • Modificaciones químicas de los sitios activos.
KM= [S] Sí... ½ V max
INHIBIDORES • Modificada la enzima, está siempre inhibida.
KM representa la cantidad de sustrato Reversibles
necesaria para fijarse a la mitad de la E Para distinguirlo de los reversibles se someten a
disponible y producir la mitad de la Vmax diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es
permanente.

64 65 66

Inhibidor Reversible Inhibición Competitiva

• La unión del inhibidor y la enzima es Antibióticos

reversible.
Insecticidas
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera Herbicidas
la actividad. Inhibición
Venenos enzimática Dolor

Hay 3 tipos: Diferentes Medicamentos Inflamación

Competitiva Infecciones virales

Cáncer
No Competitiva
Parcialmente Competitiva
67 68 69

Cinética de la Inhibición Competitiva

k1
E+S ES CE.CS k 2
k2 = = KS
k3 CES k1
E+I EI
CE.CI k 4
k4 = = KI Como:
CEI k3
KMI > KM
k5
ES E+P
V max.CS
rP = La veloc. de

rP = k5 . CES CS + KMI
reacción es
más lenta Vmax igual
Vmax no cambia
El balance de Enzima da: KM cambia KM diferente
Siendo:
CEo = CE + CES + CEI CI
KMI = KS.(1+ )
KI 70 71 72
 Inhibidores Competitivos Inhibición No Competitiva

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico El inhibidor NO se une al sitio activo

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer (ej. de la piel)

73 74
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
75

Cinética de la Inhibición NO Competitiva

k1
E+S ES k2 k6
k2 = KS = = KIS
k1 k5
k3
E+I EI k4 k8
k4 = KI = = KSI
k3 k7
k5
EI + S EIS
k6 V .C S
rP =
I , max

k7 CS + KS Vmax diferente
ES + I ESI
k8

ES k9 E+P
Siendo:
r I , max =
r max

CI
KM igual
1+
KI
Vmax cambia 76 77 78

KM no cambia

Cinéticas de Inhibición
Competitivo
Vmax igual
1 KM diferente
V TECNOLOGIA UTILIZANDO
No competitivo ENZIMAS
Vmax diferente
KM igual No
Sininhibitor
inhibidor

79
0 1/[S]
80 81

La tecnología de enzimas involucra la
producción, aislamiento, purificación, uso
en forma soluble o la inmovilización de las
enzimas para su utilización en gran
variedad de bioreactores.
82
La utilización de sistemas enzimáticos
libres de células, presenta ventajas y
desventajas respecto de los procesos
fermentativos.
En fermentación, el uso de
microorganismos como catalizadores
puede presentar las siguientes
limitaciones:
83
1. Una alta proporción del sustrato será
utilizada para convertirse en biomasa
2. Pueden ocurrir reacciones secundarias
inútiles
3. Las condiciones para el crecimiento de los
microorganismos pueden ser diferentes de
las requeridas para la formación del
producto
4. El aislamiento y purificación del producto
deseado, a partir de la mezcla de
fermentación, puede ser dificultoso. 84