MICROSCOPIO

Autor: Prof. Daniel J. Narváez Armas

RESUMEN

El estado actual de los conocimientos sobre las características histológicas de las células y los
tejidos, se ha logrado a partir de experimentos científicos que han sido el producto de la
investigación durante siglos. Para tal fin, uno de los instrumentos más empleados es el
microscopio. El adelanto tecnológico que se ha logrado en el diseño y construcción de
microscopios es el resultado de la interacción de diversas disciplinas que han permitido el
avance de la microscopía, la cual es una disciplina que consiste en ver objetos y especímenes
muy pequeños con la finalidad de formar imágenes aumentadas de los mismos para facilitar
su estudio.

En la Histología, las imágenes de células y tejidos son el material de estudio por excelencia.
Siendo el microscopio el instrumento fundamental para el estudio histológico, se hace
necesario conocer el proceso de formación de las imágenes en los sistemas ópticos y el rol
que desempeña la luz; así como también conocer algunos principios de la óptica y las lentes.
Para formar una imagen se requiere que el objeto sea iluminado por algún tipo de radiación
electromagnética y el microscopio permitirá producir la imagen aumentada, la cual puede ser
copiada como una microfotografía.

Estos conocimientos facilitan la comprensión del funcionamiento y aplicaciones de los

diversos tipos de microscopios presentados en este texto electrónico, desde los más sencillos
hasta los más sofisticados, cuyo poder de aumento es determinado tanto por el tipo de
iluminación empleada como por el sistema de lentes. De igual manera, se mencionan las
nuevas tendencias en microscopía e instrumentos y métodos para la obtención y tratamiento
de imágenes microscópicas.

El presente trabajo consiste en una revisión bibliográfica actualizada sobre la microscopía, sus
principios y aplicaciones, la cual podría ser útil como material de estudio para los estudiantes
que inician sus estudios en el área de Ciencias de la Salud, particularmente de la carrera de
Medicina, en la asignatura Histología, cuyo programa teórico-práctico contempla el estudio del
microscopio. Con este trabajo se pretende aportar un material educativo que podría darle las
pautas al estudiante para utilizar el microscopio como instrumento de trabajo, de una manera
correcta y profesional. Es necesario que el estudiante que inicia la carrera universitaria de
Medicina perciba la importancia de las relaciones interdisciplinarias para resolver las
limitaciones que se presentan tanto en la investigación científica como en la práctica médica y
la microscopía es un tema que resulta ideal para ello.

1.1.-Histología: Definición:
La Histología (del griego histós "tejido") es la ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos
que conforman un individuo, tomando en consideración su estructura microscópica, su
desarrollo y sus funciones. La Histología también se ha denominado anatomía microscópica.
La Biología Celular es una rama de la Citología que estudia más específicamente las células,
en lo que atañe a su estructura, composición química y las funciones que se derivan de ella;
así como también el funcionamiento de los sistemas celulares y sus mecanismos de
regulación y control.

Uno de los principales objetivos de la Histología moderna es permitirle al estudiante la

comprensión de la estructura microscópica de las células, tejidos y órganos, al mismo tiempo
que se relaciona la morfología con la función e incluyendo aspectos de biología celular y
molecular (1).

Todos los seres vivos están constituidos por células, pequeños compartimientos que
contienen sustancias químicas en una solución acuosa y delimitados por una membrana. Las
células están compuestas a partir de moléculas, dispuestas en diferentes niveles de
organización y al cooperar entre ellas conforman los organismos vivos, desde los más simples
hasta los más evolucionados, como el ser humano.

1.2.-Limitaciones para el estudio de las células y tejidos:

Las células son muy pequeñas y complejas, características éstas que dificultan observar su
estructura y descubrir su organización molecular y más difícil aún, comprender el
funcionamiento de sus diversos constituyentes. Lo que podamos conocer de las células
dependerá de los instrumentos disponibles y adecuados para observar y analizar, tanto
células individualizadas (Biología Celular) como los tejidos y órganos (Histología). Las
técnicas de laboratorio son cada vez más específicas y actualizadas; de allí que para
familiarizarse con los conceptos, es necesario conocer los métodos empleados para el estudio
de las células y tejidos.

Una célula animal típica, cuyo diámetro aproximado puede estar entre los 10 y 25 micrómetros
(µm), es mucho más pequeña que una partícula que pueda ser observada a simple vista por
el ojo humano. Se tuvo que esperar entonces a principios del siglo XIX la aparición de
instrumentos ópticos, buenos microscopios fotónicos, para descubrir que los tejidos vegetales
y animales estaban constituidos por agregados de células, independientes desde el punto de
vista estructural, pero interrelacionadas funcionalmente.

Las células no son solamente minúsculas, también son incoloras y translúcidas en su

mayoría. Dilucidar este hecho permitió el desarrollo de un surtido de técnicas colorantes que
asegurarían un contraste suficiente para poder visualizar las células en toda su estructura y
complejidad, y más adelante, en el siglo XX, la observación de detalles de la ultraestructura de
los componentes más finos del citoplasma, gracias al empleo de la microscopía electrónica.

La observación de las células permite estudiar principalmente la estructura; aunque también a

partir de hallazgos en las micrografías, que son imágenes estáticas, se puede inferir sobre
alguna actividad celular o proceso fisiológico. Las células no pueden sobrevivir si son
separadas del organismo al cual pertenecen, por lo que ameritan condiciones especiales para
poder subsistir o perpetuarse y de la simple observación se puede pasar a una intervención
activa, tales como el aislamiento y cultivos celulares, técnicas estas que permiten obtener
datos relacionados directamente con las actividades fisiológicas de las células y sus
relaciones con el entorno.

1.3.-Unidades de medida empleadas en microscopía:

Una unidad de medida es una cantidad estandarizada de una determinada magnitud física.
Para determinarla se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI) también conocido
como sistema métrico, que es el más ampliamente usado. Este sistema se originó a partir del
antiguo sistema métrico decimal mks (metro-kilogramo-segundo), el cual fue mejorado. Fue
creado en 1960 por la Conferencia General de Pesas y Medidas, celebrada en Paris (26, 27,
28).

La longitud es una magnitud creada para medir la distancia entre dos puntos y su unidad es el
metro. La palabra metro proviene de la palabra griega metron (µ?t???). Se representa con la
letra m.

Submúltiplos del metro:

-decímetro (dm): 10-1 metros.
-centímetro (cm): 10-2 metros.
-milímetro (mm): 10-3 metros.
-micrómetro (µm): 10-6 metros.
-nanómetro (nm): 10-9 metros.
-angstrom (Å): 10-10 metros.
-picómetro (pm): 10-12 metros.
-femtómetro o fermi (fm): 10-15 metros.
-attómetro (am): 10-18 metros.
-zeptómetro (zm): 10-21 metros.
-yoctómetro (ym): 10-24 metros.

Conocer las unidades de medida de longitud es relevante para el estudiante de medicina,

porque entre otras cosas, algunas de ellas se emplean en la microscopía:

• El micrómetro (µm) es la unidad de longitud equivalente a una millonésima parte de un

metro, abreviado µ (plural latino: micra). También conocido como micrón.

• El nanómetro (nm) es la unidad de longitud que equivale a una milmillonésima parte de un

metro. Utilizada además para medir las longitudes de onda de las radiaciones
electromagnéticas, la luz entre ellas. Esta unidad se ha hecho importante en campo de la
Nanotecnología, disciplina que estudia materiales cuyas dimensiones son en el orden de
escasos nanómetros.

• El ångström (Å) es la unidad de longitud empleada principalmente para expresar longitudes

de onda, distancias moleculares y atómicas. Su nombre viene dado por el físico sueco Anders
Jonas Ångström. Actualmente su uso en microscopía es restringido, en cierto modo ha sido
sustituido por el nanómetro.
Equivalencias:
Relaciones entre las diferentes unidades de medida empleadas en microscopía:
1 mm = 1000 µm
1 µm = 1000 nm
1 nm = 10 Å
1 Å = 0.1 nm
1 Å = 0.0001µm

Las dimensiones de las células y sus elementos se pueden apreciar y cuantificar tanto al
microscopio fotónico como al microscopio electrónico (Fig. 1-1).

Figura 1-1. Relación de tamaños según el Sistema Métrico Decimal. Algunos ejemplos de
dimensiones y tamaño de las células se presentan en una escala logarítmica; se indica el
tamaño de los elementos que pueden ser visualizados con los microscopios fotónico y
electrónico. Modificado a partir de de Guía del Estudio Celular. El Proyecto Biológico. University Of Arizona (30).

2.1 Lentes, tipos y propiedades. Conceptos Básicos

El término lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plástico u otro material
transparente, generalmente de diámetro circular, que posee dos superficies pulidas y
diseñadas de una manera específica para producir la convergencia o divergencia de los rayos
luminosos que la atraviesan. La acción de una lente depende de los principios de refracción y
reflexión, los cuales pueden entenderse mediante unas sencillas reglas de geometría que
rigen el paso y trayecto de la luz a través de la lente. Estos conceptos son materia de estudio
de la Óptica Geométrica y permiten comprender el proceso de magnificación, las propiedades
de las imágenes real y virtual, así como también los defectos (aberraciones) de las lentes (11,
41).
La palabra lente proviene del latín "lentis" que significa "lenteja" por lo que a las lentes ópticas
se les llama así por su semejanza con la forma de la legumbre (42).
Las lentes son instrumentos ópticos que concentran o dispersan los rayos de luz. Sus dos
superficies pueden ser curvas (biconvexas, bicóncavas o cóncavo-convexas) o una de ellas
puede ser plana (plano-convexas, plano-cóncavas) (fig 2-7). Las lentes de superficies
convexas se denominan positivas, convergentes, recolectoras o de aumento. Las lentes de
superficies cóncavas son conocidas como negativas, divergentes, de dispersión y producen
una imagen reducida (11)
Figura 2-7.-Diversos tipos de lentes. Modificado de Lente. Wikipedia, Enciclopedia Libre (42).

La luz se propaga con una trayectoria rectilínea y con una velocidad constante en cada medio.
Cuando incide en un objeto, el rayo luminoso se comporta de diversas maneras,
produciéndose: Refracción, Reflexión, Difracción, Absorción-Transmisión, Interferencia y
Polarización. Describiremos someramente la refracción y la reflexión por su utilidad en la
formación de las imágenes aumentadas por las lentes.

2.2.-Refracción:
Las propiedades de las lentes se deben gracias a los fenómenos de refracción que
experimentan los rayos luminosos que las atraviesan. Cuando una radiación electromagnética
en la forma de rayo luminoso, denominado incidente, viaja de un medio o una superficie y
atraviesa otro medio, las ondas luminosas sufren el fenómeno conocido como refracción, el
cual se manifiesta mediante una desviación en la dirección de la luz (43). Si el rayo incidente
llega de manera perpendicular a la superficie de una lámina de vidrio, de superficies paralelas,
no es desviado de su trayecto rectilíneo, pasando del aire al vidrio y de este último al aire
nuevamente. Por el contrario, si el rayo incide de manera oblicua sobre la superficie de la
lámina de vidrio, es desviado de su dirección rectilínea, en principio al entrar al vidrio, pues
pasa de un medio menos denso (aire) a otro medio de mayor densidad (vidrio) y es desviado
nuevamente al salir del vidrio hacia el aire (fig. 2-8).
Figura 2-8.-Refracción a través de una lámina de vidrio de superficies paralelas. La flecha
representa el rayo de luz que es desviado al pasar del aire al vidrio y nuevamente al aire.
Modificado de Puig, E. Ciencia y Tecnología de la imagen (44).

Cuando la luz pasa de un medio a otro, la velocidad de la onda disminuye. La nueva dirección
que toma el rayo refractado depende de la densidad del medio que atraviesa. Los efectos de
la refracción son responsables de algunos fenómenos que nos son familiares, por ejemplo, la
aparente deformidad de un objeto parcialmente sumergido en un vaso de agua (fig 2-9). La
refracción de la luz visible en las lentes es de vital importancia, pues les permite concentrar un
haz de rayos luminosos en un punto específico (11).

Figura 2-9.-Refracción de los rayos luminosos en la interfase aire-agua. Tomado de Óptica. Laboratorio de
demostraciones de física. Departamento de Física. Universidad de Los Andes. La Web Del Profesor (45).

El índice de refracción de un medio es una medida para saber cuánto se reduce la velocidad
de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el índice de refracción del agua es n=
1,33, quiere decir que la luz es 1,33 veces más rápida en el vacío que en el agua y es un valor
que tiene que ver con las propiedades de las lentes (5)
(Tabla 2-1).

Material Índice de refracción

Vacío 1
Aire * 1,00029
Agua (a 20°C) 1,333
Hielo 1,31
Diamante 2,417
Glicerina 1,473

Tabla 2-1.-Ejemplos del índice de refracción en algunos medios transparentes. (*) en condiciones normales de presión y
temperatura, se considera 1 el valor. Modificado de García, A. F. Física con ordenador. Curso Interactivo de Física en
Internet. La ley de Snell de la refracción (46).
2.3.-Reflexión:
Cuando la luz (u otro tipo de radiación electromagnética) incide sobre la superficie de un
medio (gas, líquido o sólido) algunos rayos no son absorbidos, por el contrario son rebotados
y se dispersan lejos de la superficie del medio en cuestión. El rayo que llega es denominado
incidente y el que se desvía es denominado reflejado. La dirección en que sale reflejada la luz
será determinada por el tipo de superficie. Si es una superficie brillante o pulida (espejo) se
produce la reflexión regular en la que toda la luz sale en una única dirección denominándose
reflexión regular o especular. Si la superficie es mate la luz sale esparcida en todas
direcciones y se llama reflexión difusa. Sin embargo también puede ser reflexión mixta, en la
que predomina una dirección sobre las demás (papel brillante, superficies metálicas sin pulir)
(43) (Fig. 2-10).

Figura 2-10.-Diferentes tipos de reflexión de los rayos luminosos. La línea azul gruesa continua representa la superficie sobre
la cual el rayo incidente (flechas rojas) se reflecta y los rayos reflejados (líneas negras). La línea azul discontinua representa
la normal (línea imaginaria perpendicular a la superficie, en el punto 0, donde incide el rayo luminoso). En la reflexión
especular el ángulo de incidencia es igual al angulo de reflexión; lo que no ocurre en la reflexión difusa, debido en parte a las
irregularidades de la superficie. Modificado a partir de Molecular expressions. Light and color (47).

2.4.-Refracción en las lentes:

En las lentes convexas la refracción se produce de acuerdo a las mismas leyes. El estudio
resumido de esos fenómenos es indispensable para comprender las propiedades de las lentes
y la formación de las imágenes.
Se tomará primero como ejemplo una lente plano-convexa. Obsérvense tres rayos a, b, y c,
cuya incidencia es normal (perpendicular) en relación a la cara plana de la lente. Al inicio,
estos rayos no serán refractados; atravesarán la lente, llegaran a la cara convexa en donde si
se refractan y su destino será diferente (fig 2-11).

Figura 2-11. Refracción en una lente plano-convexa. a, b, c rayos incidentes paralelos. a’ y c’ rayos refractados. f foco de la
lente. Modificado a partir de Langueron (11).
Dos leyes:

1. Todo rayo que pasa por el centro de la lente NO es refractado.

2. Todo rayo que no pasa por el centro de la lente ES refractado. Mientras más lejos del
centro, la desviación será mayor. Los rayos refractados convergen todos en un punto que es
el foco o punto focal de la lente.
El punto focal es el punto en donde confluyen los rayos luminosos refractados, después de
atravesar la lente. Se puede apreciar, por ejemplo, cuando al recibir los rayos solares sobre
una lupa planoconvexa o biconvexa, se forma un punto muy luminoso y muy caliente. Los
rayos caloríferos siguen el mismo trayecto que los luminosos. La distancia focal es la distancia
que separa el punto focal del centro óptico de la lente (11, 48)
Se verá ahora la refracción en las lentes biconvexas (fig. 2-12). Los fenómenos de refracción
que se acaban de estudiar permitirán explicar cómo las lentes pueden formar las imágenes.

Figura 2-12.-Refracción en una lente biconvexa. a, b, c rayos incidentes paralelos. a’ y c’ primera refracción. e’ y e’’ segunda
refracción. f foco de la lente. Modificado de Langueron (11).

Tómese la lente biconvexa y un objeto. La imagen de este objeto va a variar dependiendo de

si esta cerca o lejos de la lente. Se pueden presentar tres casos:

3.3.1.-Trans-iluminación:
La trans-iluminación ha sido indudablemente el primer método de iluminación en la larga
historia de la microscopía. El rayo electromagnético (luz visible por ejemplo) debe atravesar el
objeto, en éste caso un corte histológico (fig. 3-2). Como condiciones fundamentales para ser
observados al microscopio compuesto, los preparados biológicos deben ser muy delgados y
transparentes. Deben ser rebanados con instrumentos especializados (micrótomos) que
permiten obtener cortes cuyo espesor debe estar en el orden de las micras. Rutinariamente el
espesor del corte puede oscilar en un rango que va de 1 a 5µm, pero su grosor dependerá del
tipo de células y tejidos. Para el estudio de las neuronas se realizan cortes más gruesos
(alrededor de 30 µm), mientras que para el estudio de células del riñón, en ciertos casos son
ideales los cortes de 4 µm. Para la microscopía electrónica se emplean cortes cuyo espesor
está en el orden de los nanómetros (cortes ultra finos) debido al bajo poder de penetración de
los electrones.
La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado histológico). Las células
son incoloras por naturaleza, pero algunas poseen color propio (pigmentos). Para mejorar la
transparencia se emplean ciertas sustancias químicas (agente aclarador) como el xilol, entre
otros. Ser transparente facilita en gran medida el paso del rayo de luz. La estructura de las
células y tejidos es muy heterogénea y crea diferentes densidades en los compartimientos
intra y extracelulares. Para mejorar la visualización de tales variaciones en la concentración
de los constituyentes celulares, se pueden emplear colorantes u otros reactivos químicos que
incrementen el contraste entre ellas y permitan su identificación. Esto no siempre es
necesario, puesto es factible sin ningún tipo de colorantes observar células con algunos
microscopios especiales, cuyo sistema de iluminación crea contrastes muy evidentes, que de
ordinario no se observan con el microscopio compuesto clásico.

La trans-iluminación permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz importante,
resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. El microscopio compuesto
clásico emplea este tipo de iluminación y por ello también se denomina de campo claro. La
microscopía electrónica de transmisión (14) y la mayoría de microscopios especiales también
se fundamentan en este principio.

3.3.2.-Epi-iluminación:
Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra (fig.
3-2). La iluminación puede abarcar simultáneamente todo el campo de visión o por el
contrario, focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden observarse
sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La
transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible
obtener imágenes tridimensionales, complementando de esta manera lo observado con la
microscopía por trans-iluminación. Varios tipos de microscopios emplean este método y como
ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscópicos para microdisecciones, y los
microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrónico de barrido.
Figura 3-2.-Comparación de los mecanismos de iluminación más empleados en microscopía. La flecha amarilla representa el
haz de luz incidente sobre la muestra, que en la transiluminación atraviesa la misma; mientras que en la epi-iluminación el
rayo incide de manera oblicua y en este caso son los rayos reflejados los que se capturan para formar la imagen.

3.4.-Aumento y resolución

Los términos aumento y resolución deben ser bien conocidos por todo usuario del
microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce este fenómeno ha sido estudiado por
siglos y se explica mediante leyes de la física. Considerar únicamente el aumento no es
suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la resolución,
determina lo que se verá.

3.4.1.-Aumento

El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie
y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la
distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio
compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben
colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento.
El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo
juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es
capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x
significa que la imagen está aumentada 10 veces.

Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la

siguiente fórmula:

AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Aunque esta fórmula básica permite obtener el aumento total de una imagen, con las técnicas
de fotografía clásica o fotografía digital y el uso de software de procesamiento de imágenes es
posible lograr un aumento suplementario. Para obtener el aumento definitivo habría que
considerar los factores de ampliación que se realizan en la pantalla del computador (para
luego imprimirla) o al copiar la foto a papel mediante la técnica de fotografía clásica.

El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes
acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Esto puede ser resuelto
mediante otro principio: La resolución.

Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x.

Esta limitación ha sido resuelta empleando un haz de electrones en lugar de un rayo de luz
visible, y se abrió así una nueva era con la microscopía electrónica aplicada al estudio
morfológico.

3.4.2.-Resolución
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy
próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza
de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para
hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como
puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos
serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución,
el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un
indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos
aspectos de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el
tamaño, mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital.

Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos:

• Ojo humano: 0,2 mm.
• Microscopio Fotónico: 0,2 µm.
• Microscopio electrónico: 0,2 nm.

3.4.3.-Factores que determinan el poder de resolución

Al observar pequeños objetos al microscopio, la luz incidente proveniente de ellos es desviada

de su trayectoria inicial y mientras más pequeños sean, mayor será la desviación. Las lentes
del objetivo deben recolectar como sea posible la mayor cantidad de rayos desviados para
formar una imagen nítida; a más rayos capturados, mayor resolución (fig.3-3).

Figura 3-3.-Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son
captados por el objetivo (3). Al formarse el cono de luz proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de
apertura, donde a representa la mitad del mismo. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).

Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, otra posibilidad es
colocar algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos
resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio
cubreobjeto, eliminando toda reflexión de los rayos luminosos (fig. 3-5).
 .

Figura 3-5.-A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (5) y el objetivo (3) es ocupado por el aire; a la derecha el espacio
es ocupado por un líquido de inmersión (6). Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión.
Modificado de de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).

Partes del microscopio compuesto moderno

El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio

óptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas. Está constituido
por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de tal manera que garantizan un
funcionamiento óptimo y ergonómico (19) (ver fig. 4-3):

• Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás
elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).

• Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución

(objetivos y ocular)

• Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y
transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir
sobre el espécimen (lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma).

• Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras
fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

Figura 4-3.-Microscopio compuesto moderno con sus partes. Modificado de District School Board of Niagara (63)

4.4.1.-Los objetivos

Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal función

consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real,
invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar
centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje
óptico del sistema. Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros)
con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento,
resolución y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que
pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.

Clasificación:
Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de
objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En
cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión
(64, 65, 66):

• Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección de
esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales
para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromático cuando no
posee ninguna denominación.

• Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el

azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos colores,
el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados para la
microfotografía en colores.

• Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello,
son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo
y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen
mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un
inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como
curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas
o plan-apocromáticos.

Objetivos secos y objetivos de inmersión:

Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto
de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio
interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio
porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersión el
medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de
refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o
mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1,515) casi idéntico al del
vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la

refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad
de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El
empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución
gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-
5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y
las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee
grabadas las especificaciones y características.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-
apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco
y una lente esférica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).

Nomenclatura de los objetivos:

La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la

nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias
para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa información, generalmente en el idioma inglés,
puede contener (fig. 4-6):

• Nombre del fabricante: Casa comercial

• Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x

• Correcciones ópticas: Achro, Achromat (acromáticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromáticos);

Apo (apocromáticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected
system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-
free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del
fabricante.

• Apertura numérica: Es un valor que indica el ángulo de apertura del cono luminoso.

• Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160,
170, 220) o con el símbolo (8) para objetivos con corrección infinita.

• Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos
espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de corrección en
las lentes internas para realizar la corrección y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener
una escala graduada móvil para el ajuste.

• Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en
milímetros.

• Propiedades ópticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen

resultados óptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).

• Rosca del objetivo: La mayoría de objetivos están estandarizados de acuerdo a la Royal

Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas
RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El diámetro general es
de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca más amplia y sólo funcionan en sus
microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.

• Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersión y para ello se
emplea un código de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous
immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).

• Código de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para
facilitar la identificación del aumento (ver tabla 4-1).
Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades ópticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en
Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en
microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Código de color
Medio de inmersión
de inmersión
Negro Aceite
Naranja Glicerol
Blanco Agua
Rojo Especial o multiuso

Código de color
Aumento
de aumento
Negro 1x, 2.5x
Marrón 2x, 2.5x
Rojo 4x, 5x
Amarillo 10x
Verde 16x, 20x
Azul turquesa 25x, 32x
 Azul celeste 40x, 50x
Azul cobalto 60x, 63x
Blanco, crema 100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos microscópicos. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical
Microscopy. (15).

4.8.-Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los sistemas

de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio óptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para microfotografía). En los
microscopios binoculares la observación se hace con los dos ojos y esto permite una
observación más cómoda y se percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se
fabrican en diferentes tamaños incluyendo microscopios pequeños portátiles o de viaje.
Dentro de los tipos de microscopios se describen:

• Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los

modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. Es
el microscopio de uso más común.

• Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparación al

microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio
de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.
Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación previa y
para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 4-18).
Figura 4-18.-Microscopio invertido con el revólver y objetivos por debajo de la platina. La fuente de luz se ubica en la parte
superior. Tomado de Instrumental Pasteur. Microscopio Olympus. (78).

• Microscopio estereoscópico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen

estereoscópica, en tres dimensiones (3D) del espécimen. Se fundamenta en la visión
binocular convencional, en la que los dos ojos observan el espécimen con ángulos levemente
distintos. El microscopio estereoscópico debe ser binocular. Se utiliza para observar
especímenes de gran tamaño, sin corte o preparación previa puesto que emplea luz incidente
y no funciona por trans-iluminación. Es ideal para realizar microdiseccion (fig. 4-19).

Figura 4-19.-Microscopio estereoscópico. Tomado de Kosmos Scientific de México (79).

• Microscopio quirúrgico: Es un microscopio que se emplea en microcirugía. Proporciona un

campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitándole al
cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más
cuidadosamente y con menores posibilidades de lesión. Algunos modelos más sofisticados
tienen piezas automatizadas robóticas. Se utiliza principalmente en intervenciones quirúrgicas
en las que se amerite una minuciosa disección, como por ejemplo del cráneo y cerebro o del
globo ocular (fig. 4-20) (80, 81).
Figura 4-20.-Cirujano empleando microscopio quirúrgico. Tomado de Cerrón, V (80).

• Microscopios fotónicos especiales: Ciertos especímenes, principalmente las células vivas

o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio común de campo claro,
muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y no aportan datos relevantes, a pesar
del poder de resolución de los objetivos empleados. Para ello se han creado microscopios con
ciertas particularidades que permiten la observación de ese tipo de especímenes con un
incremento muy satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:

Microscopio de campo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta.

Microscopio de fluorescencia.
Microscopio de polarización.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopios interferenciales.

TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

Una de las finalidades de la microscopía es permitir observar los especímenes de la mejor

manera posible, logrando un buen balance entre el contraste y la resolución. Esto es de
extrema utilidad en muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural
son transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen invisibles a
pesar de la resolución. Esto se debe a que las células incoloras absorben muy poca luz y por
lo tanto en un microscopio de campo claro no se ven correctamente. Hay células (eritrocitos
por ejemplo) que poseen pigmentos propios que le confieren color y contraste suficientes,
pero esto es la excepción.

Desafortunadamente, con los microscopios compuestos de campo claro ordinarios, no se

puede lograr un buen contraste de células vivas no coloreadas. Los microscopios de campo
claro se denominan así debido a que las muestras son observadas en un campo brillante muy
iluminado, en el cual, el contraste se sacrifica a expensas de la resolución y viceversa,
limitándose por ejemplo el estudio de células y tejidos vivos, en los cuales la adición de
sustancias químicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones
en la estructura de la célula e incluso producirle la muerte.

El interés de observar células vivas radica en la posibilidad de captar procesos vitales en

pleno desarrollo, tales como la motilidad, la división, la fagocitosis y muchos otros. Estas
particularidades han motivado a los investigadores a buscar métodos para incrementar el
contraste con la finalidad de obtener imágenes de células vivas con más detalles. De
ordinario, en el microscopio convencional, esto se puede lograr de cierta manera si se reduce
la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz; con estas maniobras se
incrementa el contraste, pero lamentablemente también se reduce seriamente la resolución y
la nitidez.

Durante años los investigadores han buscado los procedimientos para resolver estas
limitaciones al estudiar tanto células incoloras como células teñidas, llegando a aplicar
métodos sencillos que logran incrementar el contraste sin afectar tanto la resolución. Por
ejemplo, cuando la finalidad es tomar micrografías en blanco y negro, aplicando las técnicas
de fotografía convencional se aumenta el contraste empleando filtros de colores y esto ha sido
de gran utilidad. En especímenes coloreados de rojo, el empleo de un filtro verde oscurece las
áreas rojas e incrementa el contraste, pero aclara las áreas teñidas con colorantes verdes
(15).

Más recientemente, con el empleo de programas informáticos de digitalización y edición de

imágenes, las micrografías de células incoloras pueden ser tratadas mejorando de manera
significativa el contraste (fig. 6-1), sin embargo, para observar más detalles en los
especímenes vivos necesariamente hay que emplear otros métodos ópticos de contraste más
sofisticados (12).
Figura 6-1.- Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa bucal antes (izquierda) y después (derecha) de
modificación digital para mejorar el contraste. Modificada de Wegerhoff R, Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light
microscopy image. (12).

En este sentido, las limitaciones presentadas por los microscopios compuestos ordinarios han
sido superadas mediante el diseño y fabricación de microscopios particulares o de accesorios
especiales, notablemente en lo que a sistema de iluminación se refiere; ya sea empleando
otro tipo de fuente luminosa o utilizando filtros para modificar la energía lumínica empleada y
modificando la conformación de los condensadores. Estas modificaciones han permitido la
creación de diversos microscopios cuyas funciones amplían las posibilidades del microscopio
compuesto estándar, lo que permite obtener otros datos más allá de los límites de la
microscopía fotónica convencional.

Se han diseñado técnicas microscópicas más complejas que incrementan el contraste sin
afectar la resolución. Son artificios que proporcionan efectos ópticos en la muestra,
permitiendo que aquellos detalles que pasan desapercibidos se traduzcan en cambios de
intensidades luminosas las cuales si pueden ser reconocidas por el ojo humano. Los
principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

• La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de

condensadores y filtros:
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de contraste de fase.
- Microscopio de luz polarizada, Microscopio petrográfico y metalúrgico.
- Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski.

• La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz

ultravioleta o rayos láser:
- Microscopio de luz ultravioleta.
- Microscopio de fluorescencia.
- Microscopio confocal.

Estos microscopios concebidos más recientemente han dado origen a un renacimiento de la

microscopía.

TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

6.1.-Microscopio de campo oscuro

De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una
linterna un cuarto oscuro y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque
reflejan o difractan la luz, los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se
ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).
La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida (trans-
iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para lograr el efecto
se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que normalmente pasa a través y
alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera
más fácil y económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo
círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico
transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra
funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de
aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de 0.25.
Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo
opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua
se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose una
interesante imagen con relieve (15, 96) (fig. 6-2).

El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico que

además mejora la resolución (12, 15) (fig. 6-3). Con este dispositivo se forma un cono hueco
de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos que
son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la célula
aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro (21) (figs. 6-4 y 6-5).

Figura 6-2.-Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación
oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo
que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un disco negro de mayor diámetro.
Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique
and Rheinberg illumination (96).
Figura 6-3.-Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de
forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados,
difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen. Modificado de
Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Figura 6-4.-Células epiteliales observadas en microscopio de campo oscuro. Modificada de Wegerhoff, R., Weildich O,
Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image (12).
Figura 6-5.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de
iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin
interrupción. En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste
con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast
enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

6.1.2.-Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

Aplicaciones del microscopio de campo oscuro (15, 96, 97):

• Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos
acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2
a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa
en la cual se encuentran).

• Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de

la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.

• Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.

6.2.-Microscopio de contraste de fase

Las investigaciones iniciales de Frits Zernike al inicio de la década de 1930 revelaron que en
microscopía, al crear interferencias en la luz empleada para iluminar el espécimen se creaban
condiciones que producían un incremento del contraste. Este descubrimiento le valió el premio
Nobel en física en el año 1953 y revolucionó la investigación en biomedicina al permitir el
estudio de células vivas. Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera
notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes.

El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un cono hueco de luz
pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en forma de anillo que disminuye la intensidad
de la luz y al mismo tiempo provoca un retraso o desfase en la longitud de onda de la luz. Este
método induce variaciones sutiles en el índice de refracción (determinado por el espesor) de
los especímenes translúcidos permitiendo visualizar una riqueza de detalles muy finos en la
estructura, los cuales pasarían desapercibidos con una iluminación de campo claro (15).

Los heterogéneos componentes celulares absorben la luz de diferente manera y causan

pequeñas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir, las retrasan ligeramente
al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso varía según el tipo de estructura. En las
células y tejidos no coloreados, el escaso contraste se mejora y acentúa al transformar las
diferencias de fase (invisibles al ojo humano) en diferencias de intensidad luminosa las cuales
sí son detectables. Este tipo de microscopio también se denomina de Fases o Diferencia de
Fases (98) (figs. 6-9 y 6-10).

Figura 6-9.-Esquema que representa parte del principio de la iluminación en contraste de fases. A representa una onda
luminosa. En A’ al atravesar el objeto transparente C, la onda se retrasa con respecto a la onda A (que no ha pasado por el
objeto). En consecuencia, la onda A’ está desfasada con respecto a la onda A. El ojo humano y las placas fotográficas no son
sensibles a estas diferencias de fase. La onda A’’ al pasar por un medio absorbente E reduce su amplitud (la distancia entre
la cresta y el valle de la onda) y al contrario de las diferencias de fase, las diferencias de amplitud si son visibles. En R se
combinan ondas de igual fase y amplitud las cuales se suman y producen aumento del brillo de la imagen. En S las ondas
combinadas están desfasadas y producen incremento del contraste de las sombras y zonas oscuras de la imagen. Otras
combinaciones producen el contraste de los tonos de gris. Tomado de Bennett A; Jupnik H; Osterberg H; Richards O W.
Phase Microscopy (98).
Figura 6-10.-Esquema que muestra una célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del
núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes
índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa
se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada. El contraste de fases hace
visible esas diferencias al traducirlas en cambios de intensidad (brillo). Compárese el comportamiento de las ondas con la
figura 6-9. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).

Para convertir un microscopio convencional en uno de contraste de fases se sustituye el

condensador y el objetivo por los de contraste de fases, los cuales contienen un filtro en anillo
y una placa de fases respectivamente (fig. 6-11). Los objetivos de contraste de fases se
identifican por sus letras verdes y la indicación del tamaño del anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3
o PhC, PhL, PhP) (12).

Figura 6-12.-Micrografías de una neurona en campo claro (izquierda) con detalles casi invisibles y con iluminación de
contraste de fases oscuro o positivo (derecha) en el que los detalles son más evidentes en un fondo claro. Tomado de
Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).
Figura 6-13.-Micrografía de células epiteliales en cultivo mediante la técnica de contraste de fases brillante o negativo, en la
cual los detalles y bordes de las células aparecen brillantes (debido a un halo de difracción) en un fondo oscuro. Tomada de
Asylum Reseach. Simultaneous Atomic Force and Phase Contrast Microscopy Using the MFP-3D™ AFM. (100).

6.2.1.-Aplicaciones del microscopio de contraste de fases

• Observación de células y tejidos vivos.

• En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo fisiología, parasitología, farmacología

(procesos celulares, identificación y cuantificación de microorganismos y parásitos en fluidos y
tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las células y sus procesos de motilidad,
ciclosis, digestión, entre otros).

• Estudio de alimentos y medicinas.

• Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras sintéticas, plásticos, pigmentos,

emulsiones y suspensiones minerales).

• Estudios geológicos (minerales).

6.3.-Microscopio de luz polarizada

Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. También
se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso inicial en el estudio de
minerales, sin embargo su aplicación se ha extendido al campo de la biología, medicina,
química y muchas otras disciplinas. Esta técnica microscópica puede emplear tanto la luz
transmitida como la luz incidente (trans-iluminación y epi-iluminación respectivamente).
Comparada con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de la luz polarizada es
la más efectiva en el estudio de muestras ricas en materiales birrefringentes, puesto que
mejora de manera incomparable la calidad de la imagen.

Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espécimen, los materiales

anisótropos presentan distintos índices de refracción en relación a la dirección del haz de luz;
por el contrario, los materiales isótropos presentan un índice de refracción constante. Cuando
un rayo de luz incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente se presenta el
fenómeno de la doble refracción o birrefringencia; esto quiere decir que se producen dos
rayos refractados distintos que vibran en planos diferentes que se propagan con diferentes
velocidades en el interior del material.

Este microscopio facilita la investigación de las propiedades ópticas de los especímenes y es

ideal para observar y fotografiar aquellos elementos que son visibles gracias a la anisotropía,
de allí su uso en cristalografía; sin embargo, también se emplea para estudiar el carácter
birrefringente de muchas estructuras celulares anisótropas.

El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz polarizada con los

elementos birrefringentes del espécimen que producen las dos ondas refractadas, cada una
de ellas polarizada en planos perpendiculares. Una vez que las ondas de luz salen del
espécimen lo hacen de manera desfasada (ver fig. 6-9) pero son recombinadas al pasar por
otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio de luz polarizada permite el
estudio comparativo entre minerales tomando en cuenta la absorción del color e índices de
refracción. Sin embargo, en biología su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias
isotrópicas de las anisotrópicas, revelando información detallada sobre la estructura y
composición de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines diagnósticos (102).
El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra la luz y la luz polarizada puede ser
detectada como un incremento en la intensidad luminosa o como un efecto de color. O en lo
cotidiano, por ejemplo, con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el resplandor
de la luz ambiental.

El 90% de las sustancias sólidas son anisotrópicas y como materiales isotrópicos se pueden
enumerar una variedad de gases, líquidos y cristales.

Si no hay espécimen en la platina el campo se observará completamente oscuro. Al colocar

un portaobjeto con alguna muestra, los elementos anisótropos cambian la dirección de la
vibración de la luz polarizada y el contraste se evidencia en la imagen con algunos colores
cuando se emplea otro dispositivo denominado plato lambda (figs. 6-16, 6-17 y 6-18).
Figura 6-16.-Micrografía de cartílago hialino visto con luz polarizada en donde se aprecia la birrefringencia del colágeno que
forma parte del pericondrio, correspondiendo a las estructuras rosadas brillantes. Tomado de Laboratorio de Investigaciones
Histológicas Aplicadas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina (103).

Figura 6-17.-En un paciente con amiloidosis sistémica se realizó un estudio comparativo de dos micrografías de un glomérulo
renal. A la izquierda con tinción de rojo Congo los depósitos son de color rojizo o naranja intenso y a la derecha la muestra es
visualizada al microscopio de luz polarizada que permite apreciar la verdadera positividad con la birrefringencia de color
amarillo. 600x. Tomado de Arias L. Nefropatología (104).
Figura 6-18. Micrografía de luz polarizada de fibrocélulas musculares estriadas en la cual se aprecia el patrón de bandas y
estriaciones transversales. Tomado de Junqueira y Carneiro (2005) (105).

6.3.1.-Aplicaciones del microscopio de luz polarizada

• Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares (como el citoesqueleto) y

extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen
exógeno).

• Identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales.

6.5.-Microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de

inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de
sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la
información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa
desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir

George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por
Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos
denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una
radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada
(por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor
longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno
de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.
Figura 6-21.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una
determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden
emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de
Fluorescencia y fluorocromos (108).

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos:

• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear
contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de

fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y
de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente
(tabla 6-1) (fig.6-22).

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de
absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).

Longitud de onda de Longitud de onda de

Fluorocromo
absorción (nm) emisión (nm)
Cascade blue 374-403 422-430
Fluoresceína (FITC) 494 520
Rodamina (TRITC) 540 570
Naranja de acridina 460-502 526-650
Yoduro de propidio 536 617
Figura 6-22.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La línea negra continua representa el
espectro de excitación, la línea negra punteada muestra el espectro de emisión. La fluoresceína al ser excitada por una luz de
longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de
519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems (110).

También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina

reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas
fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al realizar
esta técnica con marcadores fluorescentes.

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea
muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actúan como
fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la
muestra que se estudia. El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se
realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia (21).
Figura 6-24.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres
fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz
verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de
la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm.
Tomada de wikipedia.org (111).

6.5.2.-Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología

y medicina (112, 113, 114):

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

6.7.-Microscopio confocal: O Microscopio láser de barrido

En la microscopía fotónica clásica el tejido debe cortarse finamente para ser examinado y
mientras más delgado sea, más nítida será la imagen; pero con este método se pierde la
información tridimensional durante el corte. Si una muestra gruesa es observada al
microscopio fotónico, la imagen que se enfoca se ve contaminada por la superposición de los
elementos del tejido que están fuera de foco, tanto por encima como por debajo del plano
enfocado; la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas
o no enfocadas.

Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un instrumento
que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar
reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados. Fue inventado en el año
1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky (116) al estudiar neuronas. Su
mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención de
imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos.

Los detalles de la óptica del microscopio confocal son complejos y complementado por
métodos electrónicos y de computación, este instrumento permite enfocar únicamente un
plano determinado del espécimen, eliminando la luz (fluorescencia) procedente de las
regiones que no están en el plano de enfoque (fig. 6-25).

Figura 6-25.- Comparación entre dos micrografías de una célula en mitosis, contrastada con un doble marcaje fluorescente,
tanto para los cromosomas (verde) y la actina (rojo). A la izquierda se aprecia una imagen donde la profundidad de campo
abarca prácticamente todo el espesor de la célula y en consecuencia la imagen se ve un tanto borrosa a pesar de estar
enfocada. A la derecha se observa una imagen obtenida con el principio confocal, que consiste en un corte óptico de la célula
donde se captura la fluorescencia que proviene exclusivamente de las estructuras que están en el plano de enfoque,
obteniéndose una imagen más nítida. Tomado de Laser Scanning Confocal Microscopy. The Imaging Technology Group
(117).

Este microscopio tiene mucho éxito en el mundo científico gracias a la alta calidad de las
imágenes que proporciona a partir de especímenes preparados con las técnicas de laboratorio
habituales para la microscopía de fluorescencia y por supuesto, al creciente número de
aplicaciones.
6.7.1.-Ventajas del microscopio confocal

• Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia).

• Enfoca un solo plano del espécimen.

• Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.

• Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino
se dificulta.

• Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de

ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.

Figura 6-27.-Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminación convencional o de campo amplio
(serie superior, a, c, e) y la iluminación en microscopía confocal (serie inferior b, d, f). Nótese en la serie superior la cantidad
de señal (fluorescencia) que está fuera de foco y la contrastante nitidez de las imágenes de la serie inferior en las cuales sólo
se obtiene exclusivamente la información del plano de enfoque. Las muestras de la izquierda (hipotálamo de ratón) y centro
(músculo liso de rata) fueron marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). Las imágenes de la derecha
corresponden a un grano de polen de girasol el cual es autofluorescente. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M.
(2008). Laser Scanning Confocal Microscopy (119).
Figura 6-28.-Modelo de microscopio confocal. Tomado de Assessment of Food Ingredient Functionality using Laser
Microscopy (120).

6.7.4.-Cortes ópticos y reconstrucción 3D

Con el microscopio confocal es posible obtener una imagen de un plano determinado del
espécimen. Esta imagen se denomina sección o corte óptico fino y puede estar en el rango de
0.5-1.5 micrómetros. Se pueden obtener de una manera no invasiva a partir de especímenes
fluorescentes cuyo espesor puede variar entre 50-100 micrómetros (121). Las imágenes se
obtienen en una secuencia o serie, de manera manual o mediante un sistema automatizado.
Las imágenes 2D (dos dimensiones) obtenidas a intervalos regulares siguiendo el eje óptico
son combinadas y utilizadas para recrear una estructura en tres dimensiones (3D) mediante el
empleo de software especializados (figs. 6-29, 6-30).
Figura 6-29.-Secciones ópticas seriadas de un grano de polen de Pinus contorta. Cada imagen fue obtenida a un intervalo de
3 micrómetros. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopia (119).
Figura 6-30.-Reconstrucciones tridimensionales a partir de cortes ópticos obtenidos con el microscopio confocal. (a) grano de
polen, (b) muestra de hígado de ratón, (c) corte grueso de corteza cerebral de rata. Se emplearon varios marcadores
fluorescentes. (d) auto fluorescencia de una porción de raíz de helecho. Las reconstrucciones fueron realizadas a partir de
series de 30-45 cortes ópticos. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopy
(119).

6.7.5.-Aplicaciones del microscopio confocal

En comparación a los otros tipos de microscopios, el microscopio confocal proporciona un

método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes.
En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir
procesos dinámicos, realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células
vivas y otras aplicaciones (120, 122, 123, 124, 125, 126):
• Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH
intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares. Electrofisiología.

• Estudios de ADN y ARN.

• Morfología de organoides citoplasmáticos.

• Cirugía y otros métodos clínicos.

• Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología alimentaria